JPH0440340B2

JPH0440340B2 -

Info

Publication number: JPH0440340B2
Application number: JP2074827A
Authority: JP
Inventors: Yoshitsugu Sakata; Masaaki Kida
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1990-03-23
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1992-07-02
Also published as: JPH03227967A

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の利用分野］本発明は、特定酵素活性測定用の色素体基質の
合成原料として有用なアルギニン誘導体に関す
る。［発明の背景］各種酵素の作用や力価を測定するには、その酵
素により特異的な作用を受ける物質にその酵素を
作用させ、作用前後の状態を比較する方法が通常
行われる。この際に使用される酵素に特異的な作
用を受ける物質、即ち基質として天然に存在する
物質や種々の合成ペプチド誘導体が開発され報告
されている。カブトガニの血球抽出液（アメボサイト・ライ
セート）が微量の細菌内毒素と反応してゲル化す
る現象をもとにした内毒素の微量検出法が開発さ
れ実用化されている。この原理に基づく検出方法
としては、米国薬局法［U.S.Pharmacopeia
XX.888（1980）］に採用されたゲルの固さを肉眼
的に判定する方法をはじめ、濁度測定法、クロツ
ト蛋白定量法等があるが、いずれもゲル化現象に
基づくため精度が良くない。又「新規な色素体酵素基質」（特開昭51−83535
号公報）の発明は、R₁−A₁−A₂−Gly−Arg−
NH−R₂で示される色素体基質を用い酵素作用を
受けて遊離した発色体を分光光度計で測定するこ
とを特徴としているが、本法では血液試料中の色
素成分による妨害を受けやすい欠点がある。［発明の目的］本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたも
ので、特定酵素（プロテアーゼ）の活性を簡便に
且つ高感度に測定することができ、しかも血液試
料中の色素成分の影響を受け難い色素体基質を合
成するための中間原料を提供することを目的とす
る。［発明の構成］本発明は、一般式［］（式中、Ｒは水素原子又はアミノ酸のＮ−末端保
護基を表わし、R¹は水素原子又はメチル基を表
わす。）で示されるアルギニン誘導体又はその酸付加塩の
発明である。即ち、本発明者らは、特定酵素（プロテアー
ゼ）の活性を簡便に且つ高感度に測定することが
でき、しかも血液試料中の色素成分による影響を
受け難い性質を有する、色素体基質を求めて鋭意
研究を重ねた結果、アルギニン残基のＣ−末端側
に、フエノール、ナフトール等と酸化縮合させる
ことにより長波長側に極大吸収（λmax）を有す
る色素を生成する４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−
（β−ヒドロキシエチル）アニリン又は４−アミ
ノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロ
キシエチル）アニリンが結合している一般式
［］で示されるアルギニン誘導体を原料として
得られるペプチド誘導体が該目的を達成し得るこ
とを見出し、本発明を完成するに至つた。即ち、
例えば一般式［］で示されるアルギニン誘導体
を原料として得られるペプチド誘導体を特定酵素
（プロテアーゼ）、例えばカブトガニのアメボサイ
ト・ライセートが細菌内毒素と反応した結果生ず
るアミダーゼ様酵素の基質として用いた場合に
は、該酵素の活性を簡便で高感度に、且つ血液試
料中の色素成分による影響を殆ど受けずに測定す
ることができる。一般式［］のＲに於けるアミノ酸のＮ−末端
保護基としては、アミノ酸やペプチドのＮ−末端
の保護基として通常用いられているものであれば
特に測定されることなく挙げられるが、例えばア
セチル基、ベンゾイル基等のアシル基、カルボベ
ンゾキシ基、第３アルキルオキシカルボニル基、
トシル基、グルタリル基等が好ましく挙げられ
る。また、一般式［］のアルギニン残基のグアニ
ジノ基は、ペプチド合成において用いられる、例
えばニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼン
スルホニル基、４−メトキシ−２，６−ジメチル
ベンゼンスルホニル基等のＮ−グアニジノ保護基
により保護されていてもよい。一般式［］で示されるアルギニン誘導体は、
また、酸付加塩となつていてもよく、そのような
酸付加塩としては例えば塩酸、硫酸、硝酸、リン
酸等の無機酸、例えば酢酸、シユウ酸、酒石酸、
コハク酸、クエン酸、トルエンスルホン酸等の有
機酸等の酸付加塩が挙げられる。本発明のアルギニン誘導体は、例えば以下のよ
うにして合成し得る。即ち、適当な保護基によりアミノ基が保護され
たアルギニン又は適当な保護基によりアミノ基及
びグアニジノ基が保護されたアルギニンをペプチ
ド誘導体の合成に於いて通常用いられている溶
媒、例えばジメチルホルムアミド（DMF）、ジメ
チルスルホキシド（DMSO）、テトラハイドロフ
ラン（THF）、水或はこれらの混合物等に溶解
し、これに窒素気流下、４−アミノ−Ｎ−エチル
−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン又は４
−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−
ヒドロキシエチル）アニリンと、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（DCCD）等のペプチド合成に
慣用される縮合剤とを添加した後、室温、要すれ
ば加熱下に適当な時間反応させる。反応終了後
は、反応液を濃縮乾固し、次いでこれをペプチド
誘導体の精製法として通常用いられている方法、
例えばシリカゲルカラムクロマトグラフイ、イオ
ン交換カラムクロマトグラフイ等により精製し、
要すれば脱保護の処理を行うことにより、本発明
のアルギニン誘導体が得られる。尚、得られたア
ルギニン誘導体の保護基を脱保護するには、通常
のペプチド合成に慣用される方法、例えばカルボ
ベンゾキシ基やベンジル基が保護基として用いら
れている場合には例えばアルコール等の溶媒中で
水素添加処理を行う方法、第３ブチルオキシカル
ボニル基が保護基として用いられている場合には
例えば酢酸等の溶媒中でトルエンスルホン酸と反
応させる方法等によりこれを行えば足りる。本発明のアルギニン誘導体は種々のペプチド誘
導体の中間原料として有用なものである。本発明
のアルギニン誘導体を中間原料としたペプチド誘
導体の合成方法の一例を示すと以下の如くにな
る。即ち、上記の方法により得られた本発明のアル
ギニン誘導体（通常、アミノ酸のＮ−末端が適当
な保護基により保護されたものが用いられる。）
をペプチド誘導体の合成に於いて通常用いられて
いる溶媒、例えばジメチルホルムアミド
（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、テ
トラハイドロフラン（THF）、水或はこれらの混
合物等に溶解し、これに窒素気流下、Ｎ−末端が
適当な保護基により保護されたグリシン、ロイシ
ル−グリシン、バリル−グリシン、バリル−ロイ
シル−グリシン或はこれらの活性エステル体［例
えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、
Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジ
カルボキシイミドエステル（HONB）、１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾールエステル、ｐ−ニトロ
フエニルエステル等が前記した如きアミノ酸又は
ペプチドのＣ−末端側に結合したもの。］と、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（DCCD）等のペ
プチド合成に慣用される縮合剤とを添加した後、
室温、要すれば加熱下に適当な時間反応させれば
よく、反応終了後は、反応液を濃縮乾固し、次い
でこれをペプチド誘導体の精製方法として通常用
いられている方法、例えばシリカゲルカラムクロ
マトグラフイ、イオン交換カラムクロマトグラフ
イ等により精製し、必要に応じて脱保護を行えば
目的とするペプチド誘導体が容易に得られる。
尚、得られたペプチド誘導体の保護基を脱保護す
るには、通常のペプチド合成に慣用される方法、
例えばカルボベンゾキシ基やベンジル基が保護基
として用いられている場合には例えばアルコール
等の溶媒中で水素添加処理を行う方法、第３ブチ
ルオキシカルボニル基が保護基として用いられて
いる場合には例えば酢酸等の溶媒中でトルエンス
ルホン酸と反応させる方法等によりこれを行えば
足りる、かくして得られたペプチド誘導体は、カ
ブトガニのアメボサイト・ライセートが細菌内毒
素と反応した結果生ずるアミダーゼ様酵素の基質
として有用なものである。即ち、このようにして
得られたペプチド誘導体は、アミダーゼ様酵素の
作用によりアルギニン残基のＣ−末端側のペプチ
ド結合が容易に加水分解される性質を有している
ので、この結果遊離される４−アミノ−Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン又は
４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β
−ヒドロキシエチル）アニリンを適当な酸化剤の
存在下、フエノール、ナフトール等と酸化縮合さ
せ、生成する青色のインドフエノール型色素に起
因する吸光度の変化を測定することにより、アミ
ダーゼ様酵素量、言い換えれば試料中の細菌内毒
素（エンドトキシン）の量を定量的に検出するこ
とが出来る（下記カスケード参照。）。

【表】ドロキシエチトール
ル)アニリン
青色色素
（カスケード中、R′は、Ｎ−末端に保護基を有
していてもよいロイシル基、バリル基又はバリル
−ロイシル基を表わす。）以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。［実施例］参考例１ (a) カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−グリシン
エチルエステルの合成カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシン26ｇとグリ
シンエチルエステル塩酸塩14ｇをTHF400mlに
溶解させた溶液に、氷浴冷却下トリエチルアミ
ン15ml、HONB18ｇ及びDCCD22ｇを添加し
た。次いでこれを室温にて20時間撹拌反応させ
た後、沈殿物を瀘去し、溶媒を留去した。得ら
れた残渣を酢酸エチル500mlに溶解し、飽和重
炭酸ソーダ水溶液、1N−塩酸、水の順で洗浄
した後、有機層を無水硫酸ソーダで乾燥した。
乾燥剤を瀘去後、有機層を減圧濃縮乾固し、得
られた残渣に石油ベンジンを加え、ゲル状固体
を得、これを更に酢酸エチル／石油ベンジンよ
り再結晶して、カルボキシ−Ｌ−ロイシル−グ
リシンエチルエステルを得た。収量 30.1ｇ（83％）。融点 114〜115℃。比旋光度［α］²¹ _D＝−26.1（Ｃ＝1.05、エタノ
ール）。元素分析値（C₁₈H₂₆N₂O₅として）計算値(%)：Ｃ 61.70、Ｈ 7.48、Ｎ 7.99、実測値(%)：Ｃ 62.07、Ｈ 7.50、Ｎ 7.91。 (b) ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−
Ｌ−ロイシル−グリシンの合成 (a)で得たカルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−
グリシンエチルエステル10.5ｇとｐ−トルエン
スルホン酸5.7ｇをエチルアルコール200mlに溶
解し、これに５％パラジウム黒触媒５ｇを加え
て、水素ガスを通じながら室温で３時間撹拌反
応させた。反応終了後、反応液から触媒を瀘去
し、次いで溶媒を減圧下に留去した。得られた
油状物とｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バ
リン6.5ｇ及びHONB5.4ｇをTHF300mlに溶解
し、これに氷浴冷却下トリエチルアミン4.2ml
及びDCCD7.4ｇを添加して室温にて20時間撹
拌反応させた。反応終了後、不溶物を瀘去し、
溶媒を留去した。得られた残渣を酢酸エチル
500mlに溶解し、飽和重炭酸ソーダ水溶液、10
％クエン酸、水の順で洗浄した後、有機層を無
水硫酸ソーダで乾燥した。乾燥剤を瀘去後、有
機層を減圧濃縮乾固した。残渣に石油エーテル
を加え固化させ、これを更に酢酸エチル／石油
エーテルより再結晶し、ｔ−ブチルオキシカル
ボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グリシン
エチルエステルを得た。収量 10ｇ（83％）。融点 113〜114℃。比旋光度［α］²¹ _D＝−56.3（Ｃ＝0.95、エタノ
ール）。元素分析値（C₂₀H₃₇N₃O₆として）計算値（％）：Ｃ 57.81、Ｈ 8.98、
Ｎ 10.11、実測値（％）：Ｃ 57.97、Ｈ 8.91、
Ｎ 9.92。次いでこのｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ
−バリル−Ｌ−ロイシル−グリシンエチルエス
テル4.1ｇをメチルアルコール30mlに溶解させ、
氷浴冷却下1N−水酸化ナトリウム水溶液20ml
を加えて２時間撹拌反応させた、反応終了後、
反応液に1N−塩酸18mlを加えて中和し、減圧
濃縮した後、更に1N−塩酸２mlを加え、これ
を酢酸エチル300mlで抽出した。抽出液を無水
硫酸ソーダで乾燥し、乾燥剤を瀘去後、有機層
を減圧濃縮乾固した。残渣に石油エーテルを加
えて固化させた後、これを酢酸エチル／石油エ
ーテルより再結晶し、ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グリシンを
得た。収量 3.6ｇ（93％）。融点 104〜108℃。比旋光度［α］²¹ _D＝−54.6（Ｃ＝0.99、エタノ
ール）。 (c) ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−
Ｌ−ロイシル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５
−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
エステルの合成 (b)で得たｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−
バリル−Ｌ−ロイシル−グリシン15ｇを
THF50mlに溶解し、これに氷浴冷却下
HONB0.84ｇ及びDCCD1.0ｇを添加して室温
にて20時間撹拌反応させた。反応終了後、沈殿
物を瀘去し、溶媒を留去してｔ−ブチルオキシ
カルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グリ
シン−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミドエステルを得た。収量 1.9ｇ（90％）。実施例１４−［（N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニ
ル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキ
シエチル）アニリンの合成 N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニン3.0ｇ
をDMF80mlに熱時溶解し、これに窒素気流中、
氷浴冷却下、４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−（β
−ヒドロキシエチル）アニリン2.75ｇとDCCD4.0
ｇを加えて室温にて20時間撹拌反応させた。反応
終了後、不溶物を瀘去し、溶媒を留去して、得ら
れた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフイ
（カラム：15×５cm、溶出液：酢酸エチル：ピリ
ジン：水：酢酸＝60：20：10：５。）により精製
し、主溶出分の濃縮乾固物を水に溶解したものを
凍結乾燥して、４−［（N〓−カルボベンゾキシ−
Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β
−ヒドロキシエチル）アニリン・２酢酸塩を得
た。収量 1.45ｇ（25％）。比旋光度［α］²¹ _D＝−17.2（Ｃ＝0.95、メタノー
ル）。元素分析値（C₂₄H₃₅N₆O₄・2CH₃COOHとして）計算値（％）：Ｃ 56.83、Ｈ 7.33、
Ｎ 14.20、実測値（％）：Ｃ 57.02、Ｈ 7.05、
Ｎ 14.14。実施例２４−［（N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニ
ル）アミノ］−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−
（β−ヒドロキシエチル）アニリンの合成 N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニン2.0ｇ
をDMF20mlに熱時溶解し、これに窒素気流中、
氷浴冷却下４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル
−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン1.8ｇと
DCCD1.4ｇを加えて室温にて20時間撹拌反応さ
せた。反応終了後、沈殿物を瀘去し、溶媒を留去
して、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマト
グラフイ（カラム：40×２cm、溶出液：酢酸エチ
ル：ピリジン：水：酢酸＝120：20：10：５。）に
より精製し、主溶出分の濃縮乾固物を水に溶解し
たものを凍結乾燥して、４−［（N〓−カルボベン
ゾキシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−３−メチル
−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）ア
ニリン・２酢酸塩を得た。収量 0.86ｇ（22％）。比旋光度［α］²¹ _D＝−10.1（Ｃ＝0.88、メタノー
ル）。元素分析値（C₂₅H₃₇N₆O₄・2CH₃COOHとして）計算値（％）：Ｃ 57.51、Ｈ 7.49、
Ｎ 13.87、実測値（％）：Ｃ 57.22、Ｈ 7.18、
Ｎ 13.65。参考例２４−［（ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリ
ル−Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−アルギニ
ル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキ
シエチル）アニリンの合成実施例１で得られた４−［（N〓−カルボベンゾ
キシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−
Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン・２酢酸
塩1.45ｇの接触還元物４−［（Ｌ−アルギニル）ア
ミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンのTHF溶液30mlに参考例１(c)で得
たｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ
−ロイシル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノ
ルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステ
ル0.95ｇのDMF溶液30mlを加え、室温で72時間
撹拌反応させた。反応終了後、反応液を濃縮乾固
し、得られた残渣を水120mlに溶解し、アンバー
ライトIRA−410（酢酸型）を通して、イオン交換
カラムクロマトグラフイ（CMセルロース、0.2M
酢酸アンモニウム）にて精製し、その主溶出分を
凍結乾燥して４−［（ｔ−ブチルオキシカルボニル
−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−ア
ルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒド
ロキシエチル）アニリン・２酢酸塩・1/2水和物
を得た。収量 110mg（11％）。融点 115〜122℃。比旋光度［α］²¹ _D＝−37.1（Ｃ＝0.42、メタノー
ル）。元素分析値（C₃₄H₅₉N₉O₇・2CH₃COOH・1/2H₂Oとして）計算値（％）：Ｃ 54.66、Ｈ 8.21、
Ｎ 15.09、実測値（％）：Ｃ 54.54、Ｈ 8.02、
Ｎ 15.54。参考例３４−［（Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−
グリシル−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ−エ
チル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン
の合成参考例１(a)で得られたＮ−カルボベンゾキシ−
Ｌ−ロイシル−グリシンエチルエステル4.1ｇを
メチルアルコール30mlに溶解し、これに氷浴冷却
下1N−水酸化ナトリウム水溶液20mlを加えて２
時間撹拌反応させた。反応終了後、反応液に1N
−塩酸18mlを加えて中和し、減圧濃縮した後、更
に1N−塩酸２mlを加え、これを酢酸エチル300ml
で抽出した。抽出液を無水硫酸ソーダで乾燥し、
乾燥剤を瀘去後、有機層を減圧濃縮乾固した。残
渣に石油エーテルを加え固化させた後、これを更
に酢酸エチル／石油エーテルより再結晶し、Ｎ−
カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−グリシンを得
た。このＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−グ
リシンを原料とし、参考例１(c)と同様の反応及び
操作を行つてＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシ
ル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネ
ン−２，３−ジカルボキシイミドエステル0.85ｇ
を得た。このDMF30ml溶液に、実施例１と同様
の方法により得られた４−［（N〓−カルボベンゾ
キシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−
Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン・２酢酸
塩1.5ｇの接触還元物４−［（Ｌ−アルギニル）ア
ミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンのTHF溶液30mlを加え、室温で72
時間撹拌反応させた。反応終了後、反応液を濃縮
乾固し、得られた残渣を水120mlに溶解し、アン
バーライトIRA−410（酢酸型）を通して、イオン
交換カラムクロマトグライ（CMセルロース、
0.2M酢酸アンモニウム）にて精製し、その主溶
出分を凍結乾燥して４−［（Ｎ−カルボベンゾキシ
−Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−アルギニル）ア
ミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリン・２酢酸塩を得た。収量 311mg（15％）。融点 119℃。比旋光度［α］²¹ _D＝−12.2（Ｃ＝0.41、エタノー
ル）。元素分析値（C₃₂H₄₈N₈O₆・2CH₃COOHとして）計算値（％）：Ｃ 56.82、Ｈ 7.42、
Ｎ 14.70、実測値（％）：Ｃ 56.50、Ｈ 7.11、
Ｎ 14.50。参考例４４−［（ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリ
ル−グリシル−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ
−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニ
リンの合成ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリン26ｇ
とグリシンエチルエステル塩酸塩14ｇをTHF400
mlに溶解させ、これに氷浴冷却下トリエチルアミ
ン15ml、HONB18ｇ及びDCCD22ｇを加え室温
にて20時間撹拌反応させた。反応終了後、沈殿物
を瀘去し、溶媒を留去して、得られた残渣を酢酸
エチル500mlに溶解し、飽和重炭酸ソーダ水溶液、
1N−クエン酸、水の順で洗浄した後、有機層を
無水硫酸ソーダで乾燥した。乾燥剤を瀘去後、有
機層を減圧濃縮乾固し、残渣に石油ベンジンを加
え、ゲル状固体を得た。これを酢酸エチル／石油
ベンジンより再結晶し、ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−Ｌ−バリル−グリシンエチルエステルを得
た。収量 18.1ｇ（50％）。融点 98〜99℃。上で得たｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バ
リル−グリシンエチルエステル4.1ｇをメチルア
ルコール30mlに溶解し、これに氷浴冷却下1N−
水酸化ナトリウム水溶液20mlを加えて２時間撹拌
反応させた。反応終了後、反応液に1N−塩酸18
mlを加えて中和し、減圧濃縮した後、更に1N−
塩酸２mlを加え、これを酢酸エチル300mlで抽出
した。抽出液を無水硫酸ソーダで乾燥し、乾燥剤
を瀘去後、有機層を減圧濃縮乾固した。残渣に石
油エーテルを加え固化させた後、これを酢酸エチ
ル／石油エーテルより再結晶し、ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−Ｌ−バリル−グリシンを得た。このｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル
−グリシンを原料とし、参考例１(c)と同様の反応
及び操作を行つてｔ−ブチルオキシカルボニル−
Ｌ−バリル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノ
ルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステ
ル0.95ｇを得た。このDMF20ml溶液に、実施例
１と同様の方法により得られた４−［（N〓−カル
ボベンゾキシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ−
エチル−（β−ヒドロキシエチル）アニリン・２
酢酸塩1.5ｇの接触還元物４−［（Ｌ−アルギニル）
アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンのTHF溶液50mlを加えた後、室温
で72時間撹拌反応させた。反応終了後、反応液を
濃縮乾固し、得られた残渣を水120mlに溶解し、
アンバーライトIRA−410（酢酸型）を通して、イ
オン交換カラムクロマトグラフイ（CMセルロー
ス、0.2M酢酸アンモニウム）にて精製し、その
主溶出分を凍結乾燥して４−［（ｔ−ブチルオキシ
カルボニル−Ｌ−バリル−グリシル−Ｌ−アルギ
ニル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキ
シエチル）アニリン・２酢酸塩を得た。収量 387mg（12％）。融点 101〜102℃。比旋光度［α］²¹ _D＝−0.7（Ｃ＝0.35、DMF）。元素分析値（C₂₈H₄₈N₈O₆・2CH₃COOHとして）計算値（％）：Ｃ 53.92、Ｈ 7.92、
Ｎ 15.71、実測値（％）：Ｃ 53.72、Ｈ 7.82、
Ｈ 15.46。参考例５参考例２で得られたペプチド誘導体を基質と
し、以下の試液を用いてエンドトキシン濃度の測
定を行つた。（試液） (1) LAL溶液リムルス・アメボサイト・ライセート
（LAL）（凍結乾燥品、５ml用）を注射用蒸留
水５mlで溶解したものをLAL溶液とした。 (2) 標準エンドトキシン溶液標準エンドトキシン（凍結乾燥品、0.5μｇ／
vial）を所定濃度となるように注射用蒸留水に
溶解したものを標準エンドトキシン溶液とし
た。 (3) 基質緩衝液１−ナフトール−２−スルホン酸カリウム
（0.2ｍＭ）及び参考例２で得られたペプチド誘
導体（0.2ｍＭ）を含む0.1Mトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン・塩酸緩衝液（PH
8.26、0.03M MgCl₂含有、オートクレーブ中で
滅菌済み。）を基質緩衝液とした。 (4) 発色液 0.2％過ヨウ素酸及び0.3Mホウ酸を含有する
溶液を発色液とした。（測定操作）所定濃度の標準エンドトキシン溶液0.05mlと
LAL溶液0.1mlとを混合し、37℃で10分間インキ
ユベイトし、次いでこれに基質緩衝液2.0mlを加
えて、更に37℃で15分間インキユベイトした。こ
の溶液に発色液1.0mlを加えて発色させた後、極
大吸収波長（660nｍ）に於ける吸光度を測定し
た。（結果）結果を表１に示す。比較例１参考例２で得られたペプチド誘導体の代りに、
これと類似の構造を有する既存のペプチド誘導体
である４−［（ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−
バリル−Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−アルギニ
ル）アミノ］−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン・２酢
酸塩を基質として用いた以外は、参考例５と同じ
試薬及び試液を用い、同様の操作を行つてエンド
トキシンの測定を行つた。結果を表１に併せて示
す。尚、吸光度の測定は、極大吸収波長（675n
ｍ）に於けるそれを測定した。

【表】表１から明らかな如く、参考例２で得られたペ
プチド誘導体を基質としてエンドトキシン濃度の
測定を行つた場合には、既存の類似のペプチド誘
導体を用いた場合と比べて感度が２倍以上となる
ことが判る。［発明の効果］以上述べた如く、本発明は、アルギニン残基の
Ｃ−末端側に、フエノール、ナフトール等と酸化
縮合させることにより長波長側に極大吸収
（λmax）を有する色素を生成する４−アミノ−
Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニ
リン又は４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−
Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリンが結合し
ているアルギニン誘導体を提供するものであり、
これを原料として得られるペプチド誘導体を特定
酵素（プロテアーゼ）の基質として用いた場合に
は、該酵素の活性を簡便で高感度に、且つ血液試
料中の色素成分による影響を殆ど受けずに測定す
ることが可能となる点に顕著な効果を奏する発明
であり、斯業に貢献するところ大なる発明であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式［］（式中、Ｒは水素原子又はアミノ酸のＮ−末端保
護基を表わし、R¹は水素原子又はメチル基を表
わす。）で示されるアルギニン誘導体又はその酸付加塩。２アミノ酸のＮ−末端保護基がアシル基、カル
ボベンゾキシ基、第３アルキルオキシカルボニル
基、トシル基又はグルタリル基である特許請求の
範囲第１項に記載のアルギニン誘導体又はその酸
付加塩。