JPH0366319B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
［発明の利用分野］
本発明は、特定酵素活性測定用の色素体基質と
して有用な新規なペプチド誘導体に関する。 ［発明の背景］ 各種酵素の作用や力価を測定するには、その酵
素により特異的な作用を受ける物質にその酵素を
作用させ、作用前後の状態を比較する方法が通常
行われる。この際に使用される酵素に特異的な作
用を受ける物質、即ち基質として天然に存在する
物質や種々の合成ペプチド誘導体が開発され報告
されている。 カブトガニの血球抽出液（アメボサイト・ライ
セート）が微量の細菌内毒素と反応してゲル化す
る現象をもとにした内毒素の微量検出法が開発さ
れ実用化されている。この原理に基づく検出方法
としては、米国薬局法［U.S・Pharmacopeia
XX.888（1980）］に採用されたゲルの固さを肉眼
的に判定する方法をはじめ、濁度測定法、クロツ
ト蛋白定量法等があるが、いずれもゲル化現象に
基づくため精度が良くない。 又「新規な色素体酵素基質」（特開昭51−83535
号公報）の発明は、R1−A1−A2−Gly−Arg−
NH−R2で示される色素体基質を用い酵素作用を
受けて遊離した発色体を分光光度計で測定するこ
とを特徴としているが、本法では血液試料中の色
素成分による妨害を受けやすい欠点がある。 ［発明の目的］ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたも
ので、特定酵素（プロテアーゼ）の活性を簡便に
且つ高感度に測定することができ、しかも血液試
料中の色素成分の影響を受け難い色素体基質を提
供することを目的とする。 ［発明の構成］ 本発明は、一般式［］ （式中、R1はＮ−末端に保護基を有する、ロ
イシル基、バリル基又はバリル−ロイシル基を表
わす。また、式中のアルギニン残基のグアニジノ
基は保護基を有していても、酸付加塩の状態とな
つていてもよい。） で示されるペプチド誘導体又はその酸付加塩の発
明である。 即ち、本発明者らは、特定酵素（プロテアー
ゼ）の活性を簡便に且つ高感度に測定することが
でき、しかも血液試料中の色素成分による影響を
受け難い性質を有する、色素体基質を求めて鋭意
研究を重ねた結果、アルギニン残基のＣ−末端側
に、フエノール、ナフトール等と酸化縮合させる
ことにより長波長側に極大吸収（λmax）を有す
る色素を生成する４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−
（β−ヒドロキシエチル）アニリン又は４−アミ
ノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロ
キシエチル）アニリンが結合している一般式
［］で示されるペプチド誘導体が該目的を達成
し得ることを見出し、本発明を完成するに至つ
た。即ち、一般式［］で示されるペプチド誘導
体を特定酵素（プロテアーゼ）、例えばカブトガ
ニのアメボサイト・ライセートが細菌内毒素と反
応した結果生ずるアミダーゼ様酵素の基質として
用いた場合には、該酵素の活性を簡便で高感度
に、且つ血液試料中の色素成分による影響を殆ど
受けずに測定することができる。 一般式［］のR1に於けるＮ−末端の保護基
としては、アミノ酸やペプチドのＮ−末端の保護
基として通常用いられているものであれば特に限
定されることなく挙げられるが、例えばアセチル
基、ベンゾイル基等のアシル基、カルボベンゾキ
シ基、第３アルキルオキシカルボニル基、トシル
基、グルタリル基等が挙げられる。 また、一般式［］のアルギニン残基のグアニ
ジノ基の保護基としては、例えばニトロ基、トシ
ル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、４−
メトキシ−2.6−ジメチルベンンゼンスルホニル
基等のＮ−グアニジノ保護基として通常用いられ
ているものが挙げられる。 一般式［］で示されるペプチド誘導体は酸付
加塩となつてもよく、そのような酸付加塩として
は例えば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、
例えば酢酸、シユウ酸、酒石酸、コハク酸、クエ
ン酸、トルエンスルホン酸等の有機酵等の酸付加
塩が挙げられる。 本発明のペプチド誘導体は、例えば以下の如く
して合成し得る。 即ち、一般式［］ （式中、Ｒは水素原子、又はアミノ酸のＮ−末
端保護基を表わす。） で示されるアルギニン誘導体（通常、アミノ酸の
Ｎ−末端が適当な保護基により保護されたものが
用いられる。）をペプチド誘導体の合成に於いて
通常用いられている溶媒、例えばジメチルホルム
アミド（DMF）、ジメチルスルホキシド
（DMSO）、テトラハイドロフラン（THF）、水
或はこれらの混合物等に溶解し、これに窒素気流
下、Ｎ−末端が適当な保護基により保護されたグ
リシン、ロイシル−グリシン、バリル−グリシ
ン、バリル−ロイシル−グリシン或はこれらの活
性エステル体［例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボル
ネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル
（HONB）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
エステル、ｐ−ニトロフエニルエステル等が前記
した如きアミノ酸又はペプチドのＣ−末端側に結
合したもの。］と、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（DCCD）等のペプチド合成に慣用される縮
合剤とを添加した後、室温、要すれば加熱下に適
当な時間反応させればよく、応終了後は、反応液
を濃縮乾固し、次いでこれをペプチド誘導体の精
製方法として通常用いられている方法、例えばシ
リカゲルカラムクロマトグラフイ、イオン交換カ
ラムクロマトグラフイ等により精製し、必要に応
じて脱保護を行えば本発明のペプチド誘導体が容
易に得られる。かくして得られた本発明のペプチ
ド誘導体は、特定酵素（プロテアーゼ）、例えば
カブトガニのアメボサイト・ライセートが細菌内
毒素と反応した結果生ずるアミダーゼ様酵素の基
質として有用なものである。即ち、このようにし
て得られた本発明のペプチド誘導体は、アミダー
ゼ様酵素の作用によりアルギニン残基のＣ−末端
側のペプチド結合が容易に加水分解される性質を
有しているので、この結果遊離される４−アミノ
−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチルエチ
ル）アニリン又は４−アミノ−３−メチル−Ｎ−
エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン
を適当な酸化剤の存在下、フエノール、ナフトー
ル等と酸化縮合させ、生成する青色のインドフエ
ノール型色素に起因する吸光度の変化を測定する
ことにより、アミダーゼ様酵素量、言い換えれば
試料中の細菌内毒素（エンドトキシン）の量を定
量的に検出することが出来る（下記カスケード参
照。）。
して有用な新規なペプチド誘導体に関する。 ［発明の背景］ 各種酵素の作用や力価を測定するには、その酵
素により特異的な作用を受ける物質にその酵素を
作用させ、作用前後の状態を比較する方法が通常
行われる。この際に使用される酵素に特異的な作
用を受ける物質、即ち基質として天然に存在する
物質や種々の合成ペプチド誘導体が開発され報告
されている。 カブトガニの血球抽出液（アメボサイト・ライ
セート）が微量の細菌内毒素と反応してゲル化す
る現象をもとにした内毒素の微量検出法が開発さ
れ実用化されている。この原理に基づく検出方法
としては、米国薬局法［U.S・Pharmacopeia
XX.888（1980）］に採用されたゲルの固さを肉眼
的に判定する方法をはじめ、濁度測定法、クロツ
ト蛋白定量法等があるが、いずれもゲル化現象に
基づくため精度が良くない。 又「新規な色素体酵素基質」（特開昭51−83535
号公報）の発明は、R1−A1−A2−Gly−Arg−
NH−R2で示される色素体基質を用い酵素作用を
受けて遊離した発色体を分光光度計で測定するこ
とを特徴としているが、本法では血液試料中の色
素成分による妨害を受けやすい欠点がある。 ［発明の目的］ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたも
ので、特定酵素（プロテアーゼ）の活性を簡便に
且つ高感度に測定することができ、しかも血液試
料中の色素成分の影響を受け難い色素体基質を提
供することを目的とする。 ［発明の構成］ 本発明は、一般式［］ （式中、R1はＮ−末端に保護基を有する、ロ
イシル基、バリル基又はバリル−ロイシル基を表
わす。また、式中のアルギニン残基のグアニジノ
基は保護基を有していても、酸付加塩の状態とな
つていてもよい。） で示されるペプチド誘導体又はその酸付加塩の発
明である。 即ち、本発明者らは、特定酵素（プロテアー
ゼ）の活性を簡便に且つ高感度に測定することが
でき、しかも血液試料中の色素成分による影響を
受け難い性質を有する、色素体基質を求めて鋭意
研究を重ねた結果、アルギニン残基のＣ−末端側
に、フエノール、ナフトール等と酸化縮合させる
ことにより長波長側に極大吸収（λmax）を有す
る色素を生成する４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−
（β−ヒドロキシエチル）アニリン又は４−アミ
ノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロ
キシエチル）アニリンが結合している一般式
［］で示されるペプチド誘導体が該目的を達成
し得ることを見出し、本発明を完成するに至つ
た。即ち、一般式［］で示されるペプチド誘導
体を特定酵素（プロテアーゼ）、例えばカブトガ
ニのアメボサイト・ライセートが細菌内毒素と反
応した結果生ずるアミダーゼ様酵素の基質として
用いた場合には、該酵素の活性を簡便で高感度
に、且つ血液試料中の色素成分による影響を殆ど
受けずに測定することができる。 一般式［］のR1に於けるＮ−末端の保護基
としては、アミノ酸やペプチドのＮ−末端の保護
基として通常用いられているものであれば特に限
定されることなく挙げられるが、例えばアセチル
基、ベンゾイル基等のアシル基、カルボベンゾキ
シ基、第３アルキルオキシカルボニル基、トシル
基、グルタリル基等が挙げられる。 また、一般式［］のアルギニン残基のグアニ
ジノ基の保護基としては、例えばニトロ基、トシ
ル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、４−
メトキシ−2.6−ジメチルベンンゼンスルホニル
基等のＮ−グアニジノ保護基として通常用いられ
ているものが挙げられる。 一般式［］で示されるペプチド誘導体は酸付
加塩となつてもよく、そのような酸付加塩として
は例えば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、
例えば酢酸、シユウ酸、酒石酸、コハク酸、クエ
ン酸、トルエンスルホン酸等の有機酵等の酸付加
塩が挙げられる。 本発明のペプチド誘導体は、例えば以下の如く
して合成し得る。 即ち、一般式［］ （式中、Ｒは水素原子、又はアミノ酸のＮ−末
端保護基を表わす。） で示されるアルギニン誘導体（通常、アミノ酸の
Ｎ−末端が適当な保護基により保護されたものが
用いられる。）をペプチド誘導体の合成に於いて
通常用いられている溶媒、例えばジメチルホルム
アミド（DMF）、ジメチルスルホキシド
（DMSO）、テトラハイドロフラン（THF）、水
或はこれらの混合物等に溶解し、これに窒素気流
下、Ｎ−末端が適当な保護基により保護されたグ
リシン、ロイシル−グリシン、バリル−グリシ
ン、バリル−ロイシル−グリシン或はこれらの活
性エステル体［例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボル
ネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル
（HONB）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
エステル、ｐ−ニトロフエニルエステル等が前記
した如きアミノ酸又はペプチドのＣ−末端側に結
合したもの。］と、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（DCCD）等のペプチド合成に慣用される縮
合剤とを添加した後、室温、要すれば加熱下に適
当な時間反応させればよく、応終了後は、反応液
を濃縮乾固し、次いでこれをペプチド誘導体の精
製方法として通常用いられている方法、例えばシ
リカゲルカラムクロマトグラフイ、イオン交換カ
ラムクロマトグラフイ等により精製し、必要に応
じて脱保護を行えば本発明のペプチド誘導体が容
易に得られる。かくして得られた本発明のペプチ
ド誘導体は、特定酵素（プロテアーゼ）、例えば
カブトガニのアメボサイト・ライセートが細菌内
毒素と反応した結果生ずるアミダーゼ様酵素の基
質として有用なものである。即ち、このようにし
て得られた本発明のペプチド誘導体は、アミダー
ゼ様酵素の作用によりアルギニン残基のＣ−末端
側のペプチド結合が容易に加水分解される性質を
有しているので、この結果遊離される４−アミノ
−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチルエチ
ル）アニリン又は４−アミノ−３−メチル−Ｎ−
エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン
を適当な酸化剤の存在下、フエノール、ナフトー
ル等と酸化縮合させ、生成する青色のインドフエ
ノール型色素に起因する吸光度の変化を測定する
ことにより、アミダーゼ様酵素量、言い換えれば
試料中の細菌内毒素（エンドトキシン）の量を定
量的に検出することが出来る（下記カスケード参
照。）。
【表】
本発明のペプチド誘導体の合成原料となる一般
式［］で示されるアルギニン誘導体は、例えば
以下のようにして容易に合成し得るので、それを
用いれば足りる。 即ち、適当な保護基によりアミノ基が保護され
たアルギニン又は適当な保護基によりアミノ基及
びグアニジノ基が保護されたアルギニンをペプチ
ド誘導体の合成に於いて通常用いられている溶
媒、例えばジメチルホルムアミド（DMF）、ジメ
チルスルホキシド（DMSO）、テトラハイドロフ
ラン（THF）、水或はこれらの混合物等に溶解
し、これに室素気流下、４−アミノ−Ｎ−エチル
−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン又は４
−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−
ヒドロキシエチル）アニリンと、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（DCCD）等のペプチド合成に
慣用される縮合剤とを添加した後、室温、要すれ
ば加熱下に適当な時間反応させる。反応終了後
は、反応液を濃縮乾固し、次いでこれをペプチド
誘導体の精製法として通常用いられている方法、
例えばシリカゲルカラムクロマトグラフイ、イオ
ン交換カラムクロマトグラフイ等により精製し、
要すれば脱保護の処理を行うことにより、一般式
［］で示されるアルギニン誘導体が容易に得ら
れる。 以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。 ［実施例］ 参考例 １ (a) カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−グリシン
エチルエステルの合成 カルボベンゾシキ−Ｌ−ロイシン26ｇとグリシ
ンエチルエステル塩酸塩14ｇをTHF400mlに溶解
させた溶液に、氷浴冷却下トリエチルアミン15
ml、HONB18ｇ及びDCCD22ｇを添加した。次
いでこれを室温にて20時間攪拌反応させた後、沈
殿物を瀘去し、溶媒を留去した。得られた残渣を
酢酸エチル500mlに溶解し、飽和重炭酸ソーダ水
溶液、1N−塩酸、水の順で洗浄した後、有機層
を無水硫酸ソーダで乾燥した。乾燥剤を瀘去後、
有機層を減圧濃縮乾固し、得られた残渣に石油ベ
ンジンを加え、ゲル状固体を得、これを更に酢酸
エチル／石油ベンジンより再結晶して、カルボキ
シ−Ｌ−ロイシル−グリシンエチルエステルを得
た。 収量 30.1ｇ（83％）。 融点 114〜115℃。 比旋光度［α］21 D＝−26.1（Ｃ＝1.05、エタノー
ル）。 元素分析値（C18H26N2O5として） 計算値（％）：C61.70、H7.48、N7.99、 実測値（％）：C62.07、H7.50、N7.91。 (b) ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−
Ｌ−ロイシル−グリシンの合成 (a)で得たカルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−グ
リシンエチルエステル10.5ｇとｐ−トルエンスル
ホン酸5.7ｇをエチルアルコール200mlに溶解し、
これに５％パラジウム黒触媒５ｇを加えて、水素
ガスを通じながら室温で３時間攪拌反応させた。
反応終了後、反応液から触媒を瀘去し、次いで溶
媒を減圧下に留去した。得られた油状物とｔ−ブ
チルオキシカルボニル−Ｌ−バリン6.5ｇ及び
HONB5.4ｇをTHF300mlに溶解させ、これに氷
浴冷却下トリエチルアミン4.2ml及びDCCD7.4ｇ
を添加して室温にて20時間攪拌反応させた。反応
終了後、不溶物を瀘去し、溶媒を留去した。得ら
れた残渣を酢酸エチル500mlに溶解し、飽和重炭
酸ソーダ水溶液、10％クエン酸、水の順で洗浄し
た後、有機層を無水硫酸ソーダで乾燥した。乾燥
剤を瀘去後、有機層を減圧濃縮乾固した。残渣に
石油エーテルを加え固化させ、これを更に酢酸エ
チル／石油エーテルより再結晶し、ｔ−ブチルオ
キシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グ
リシンエチルエステルを得た。 収量 10ｇ（83％）。 融点 113〜114℃。 比旋光度［α］21 D＝56.3（Ｃ＝0.95、エタノール）。 元素分析値（C20H37N3O6として） 計算値（％）：C57.81、H8.98、N10.11、 実測値（％）：C57.97、H8.91、Ｎ 9.92。 次いでこのｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−
バリル−Ｌ−ロイシル−グリシンエチルエステル
4.1ｇをメチルアルコール30mlに溶解させ、氷浴
冷却下1N−水酸化ナトリウム水溶液20mlを加え
て２時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液に
1N−塩酸18mlを加えて中和し、減圧濃縮した後、
更に1N−塩酸２mlを加え、これを酢酸エチル300
mlで抽出した。抽出液を無水硫酸ソーダで乾燥
し、乾燥剤を瀘去後、有機層を減圧濃縮乾固し
た。残渣に石油エーテルを加えた固化させた後、
これを酢酸エチル／石油エーテルより再結晶し、
ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−
ロイシル−グリシンを得た。 収量 3.6ｇ（93）％。 融点 104〜108℃。 比旋光度［α］21 D＝−54.6（Ｃ＝0.99、エタノー
ル）。 (c) ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−
Ｌ−ロイシル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５
−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
エステルの合成 (b)で得たｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バ
リル−Ｌ−ロイシル−グリシン1.5ｇをTHF50ml
に溶解し、これに氷浴冷却下HONB0.84ｇ及び
DCCD1.0ｇを添加して室温にて20時間攪拌反応
させた。反応終了後、沈殿物を瀘去し、溶媒を留
去してｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル
−Ｌ−ロイシル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５
−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエ
ステルを得た。 収量 1.9ｇ（90％）。 参考例２ ４−［N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−ア
ルギニン）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒ
ドロキシエチル）アニリンの合成 N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニン3.0ｇ
をDMF80mlに熱時溶解し、これに窒素気流中、
氷浴冷却下、４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−（β
−ヒドロキシエチル）アニリン2.75ｇとDCCD4.0
ｇを加えて室温にて20時間攪拌反応させた。反応
終了後、不溶物を瀘去し、溶媒を留去して、得ら
れた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフイ
（カラム：15×５cm、溶出液：酢酸エチル：ピリ
ジン：水：酢酸＝の60：20：10：５。）により精
製し、主溶出分の濃縮乾固物を水に溶解したもの
を凍結乾燥して、４−［（N〓−カルボベンゾキシ
−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−
（β−ヒドロキシエチル）アニリン・２酢酸塩を
得た。 収量 1.45ｇ（25％）。 比旋光度［α］21 D＝−17.2（Ｃ＝0.95、メタノー
ル）。 元素分析値（C24H35N6O4・2CH3COOHとして） 計算値（％）：C56.83、H7.33、N14.20、 実測値（％）：C57.02、H7.05、N14.14。 参考例３ ４−［（N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−
アルギニル）アミノ］−３−メチル−Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリンの
合成 N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニン2.0ｇ
をDMF20mlに熱時溶解し、これに窒素気流中、
氷浴冷却下４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル
ーＮー（β−ヒドロキシエチル）アニリン1.8ｇ
とDCCD1.4ｇを加えて室温にて20時間攪拌反応
させた。反応終了後、沈殿物を瀘去し、溶媒を留
去して、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマ
トグラフイ（カラム：40×２cm、溶出液：酢酸エ
チル：ピリジン：水：酢酸＝120：20：10：５。）
により精製し、主溶出分の濃縮乾固物を水に溶解
したものを凍結乾燥して、４−［N〓−カルボベン
ゾキシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−３−メチル
−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）ア
ニリン・２酢酸塩を得た。 収量 0.86ｇ（22％）。 比旋光度［α］21 D＝−10.1（Ｃ＝0.88、メタノー
ル）。 元素分析値（C25H37N6O4・2CH3COOHとして） 計算値（％）：C57.51、H7.49、N13.87、 実測値（％）：C57.22、H7.18、N13.65。 実施例１ ４−［（ｔ−ブチルオキシカルボニル−
Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−ア
ルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒ
ドロキシエチル）アニリンの合成 参考例２で得られた４−［（N〓−カルボベンゾ
キシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−
Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン．２酢酸
塩1.45ｇの接触還元物４−［（Ｌ−アルギニル）ア
ミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンのTHF溶液30mlに参考例１(c)で得
たｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ
−ロイシル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノ
ルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステ
ル0.95ｇのDMF溶液30mlを加え、室温で72時間
攪拌反応させた。反応終了後、反応液を濃縮乾固
し、得られた残渣を水120mlに溶解し、アンバー
ライトIRA−410（酢酸型）を通して、イオン交換
カラムクロマトグラフイ（CMセルロース、0.2M
酢酸アンモニウム）にて精製し、その主溶出分を
凍結乾燥して４−［ｔ−ブチルオキシカルボニル
−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グリシン−Ｌ−ア
ルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒド
ロキシエチル）アニリン・２酢酸塩・１／２水和
物を得た。 収量 110mg（11％）。 融点 115〜122℃。 比旋光度［α］21 D＝−37.1（Ｃ＝0.42、メタノー
ル）。 元素分析値 （C34H59N9O7・2CH3COOH・１／2H2Oとし
て） 計算値（％）：C54.66、H8.21、N15.09、 実測値（％）：C54.54、H8.02、N15.54。 実施例２ ４−［（Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロ
イシル−グリシン−Ｌ−アルギニル）アミノ］
−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）
アニリンの合成 参考例１(a)で得られたＮ−カルボベンゾキシ−
Ｌ−ロイシル−グリシンエチルエステル4.1ｇを
メチルアルコール30mlに溶解し、これに氷浴冷却
下1N−水酸化ナトリウム水溶液20mlを加えて２
時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液に1N
−塩酸18mlを加えて中和し、減圧濃縮した後、更
に1N−塩酸２mlを加え、これを酢酸エチル300ml
で抽出した。抽出液を無水硫酸ソーダで乾燥し、
乾燥剤を瀘去後、有機層を減圧濃縮乾固した。残
渣に石油エーテルを加え固化させた後、これを更
に酢酸エチル／石油エーテルより再結晶し、Ｎ−
カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−グリシンを得
た。 このＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−グ
リシンを原料とし、参考例１(c)と同様の反応及び
操作を行つてＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシ
ル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネ
ン−２，３−ジカルボキシイミドエステル0.85ｇ
を得た。このDMF30ml溶液に、参考例２と同様
の方法により得られた４−［（N〓−カルボベンゾ
キシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−
Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン・２酢酸
塩1.5ｇの接触還元物４−［（Ｌ−アルギニル）ア
ミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンのTHF溶液30mlを加え、室温で72
時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を濃縮
乾固し、得られた残渣を水120mlに溶解し、アン
バーライトIRA−410（酢酸型）を通して、イオン
交換カラムクロマトグラフイ（CMセルロース、
0.2M酢酸アンモニウム）にて精製し、その主溶
出分を凍結乾燥して４−［（Ｎ−カルボベンゾキシ
−Ｌ−ロイシル−グリシン−Ｌ−アルギニル）ア
ミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリン・２酢酸塩を得た。 収量 311mg（15％）。 融点 119℃。 比旋光度［α］21 D＝−12.2（Ｃ＝0.41、エタノー
ル）。 元素分析値（C32H48N8O6・2CH3COOHとして） 計算値（％）：C56.82、H7.42、N14.70、 実測値（％）：C56.50、H7.11、N14.50。 実施例３ ４−［（ｔ−ブチルオキシカルボニル−
Ｌ−バリル−グリシル−Ｌ−アルギニル）アミ
ノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンの合成 ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリン26ｇ
とグリシンエチルエステル塩酸塩14ｇをTHF400
mlに溶解させ、これに氷浴冷却下トリエチルアミ
ン15ml、HONB18ｇ及びDCCD22ｇを加え室温
にて20時間攪拌反応させた。反応終了後、沈殿物
を瀘去し、溶媒を留去して、得られた残渣を酢酸
エチル500mlに溶解し、飽和重炭酸ソーダ水溶液、
1N−クエン酸、水の順で洗浄した後、有機層を
無水硫酸ソーダで乾燥した。乾燥剤を瀘去後、有
機層を減圧濃縮乾固し、残渣に石油ベンジンを加
え、ゲル状固体を得た。これを酢酸エチル／石油
ベンジンより再結晶し、ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−Ｌ−バリル−グリシンエチルエステルを得
た。 収量 18.1ｇ（50％）。 融点 98〜99℃。 上で得たｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バ
リル−グリシンエチルエステル4.1ｇをメチルア
ルコール30mlに溶解し、これに氷浴冷却下1N−
水酸化ナトリウム水溶液20mlを加えて２時間攪拌
反応させた。反応終了後、反応液に1N−塩酸18
mlを加えて中和し、減圧濃縮した後、更に1N−
塩酸２mlを加え、これを酢酸エチル300mlで抽出
した。抽出液を無水硫酸ソーダで乾燥し、乾燥剤
を瀘去後、有機層を減圧濃縮乾固した。残渣に石
油エーテルを加え固化させた後、これを酢酸エチ
ル／石油エーテルより再結晶し、ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−Ｌ−バリル−グリシンを得た。 このｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル
−グリシンを原料とし、参考例１(c)と同様の反応
及び操作を行つてｔ−ブチルオキシカルボニル−
Ｌ−バリル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノ
ルボルネン２，３−ジカルボキシイミドエステル
0.95ｇを得た。このDMF20ml溶液に、参考例２
と同様の方法により得られた４−［（N〓−カルボ
ベンゾキシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−エチル
−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン・２酢
酸塩1.5ｇの接触還元物４−［（Ｌ−アルギニル）
アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンのTHF溶液50mlを加えた後、室温
で72時間攪拌反応せた。反応終了後、反応液を濃
縮乾固し、得られた残渣を水120mlに溶解し、ア
ンバーライトIRA−410（酢酸型）を通して、イオ
ン交換カラムクロマトグラフイ（CMセルロー
ス、0.2M酢酸アンモニウム）にて精製し、その
主溶出分を凍結乾燥して４−［（ｔ−ブチルオキシ
カルボニル−Ｌ−バリル−グリシン−Ｌ−アルギ
ニル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキ
シエチル）アニリン・２酢酸塩を得た。 収量 387mg（12％）。 融点 101〜102℃。 比旋光度［α］21 D＝−0.7（Ｃ＝0.35、DMF）。 元素分析値（C28H48N8O6・2CH3COOHとして） 計算値（％）：C53.92、H7.92、N15.71、 実測値（％）：C53.72、H7.82、N15.46。 参考例 ４ 実施例１、２又は３で得られたペプチド誘導体
を基質とし、以下の試液を用いてエンドトキシン
濃度の測定を行つた。 （試液） (1) LAL溶液 リムルス・アメボサイト・ライセート（LAL）
（凍結乾燥品、５ml用）を注射用蒸留水５mlで溶
解したものをLAL溶液とした。 (2) 標準エンドトキシン溶液 標準エンドトキシン（凍結乾燥品、0.5μg／
vial）を所定濃度となるように注射用蒸留水に溶
解したものを標準エンドトキシン溶液とした。 (3) 基質緩衝液 １−ナフトール−２−スルホン酸カリウム
（0.2mM）及び実施例１、２又は３で得られた本
発明のペプチド誘導体（0.2mM）を含む0.1Mト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩酸緩
衝液（PH8.26、0.03M MgCl2含有、オートクレー
ブ中で滅菌済み。）を基質緩衝液とした。 (4) 発色液 0.2％過ヨウ素酸及び0.3Mホウ酸を含有する溶
液を発色液とした。 （測定操作） 所定濃度の標準エンドトキシン溶液0.05mlと
LAL溶液0.1mlとを混合し、37℃で10分間インキ
ユベイトし、次いでこれに基質緩衝液2.0mlを加
えて、更に37℃で15分間インキユベイトした。こ
の溶液に発色液1.0mlを加えて発色させた後、極
大吸収波長（660nm）に於ける吸光度を測定し
た。 （結果） 結果を表１に示す。 比較例１及び2. 実施例１、２又は３で得られた本発明のペプチ
ド誘導体の代りに、これと類似の構造を有する既
存のペプチド誘導体である４−［（ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グリ
シル−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ，Ｎ−ジエ
チルアニリン・２酢酸塩又は４−［（ｔ−ブチルオ
キシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グ
リシル−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ，Ｎ−ジ
エチル−ｍ−トルイジン・２酢酸塩を基質として
用いた以外は、参考例４と同じ試薬及び試液を用
い、同様の操作を行つてエンドトキシンの測定を
行つた結果を、表１に併せて示す。尚、吸光度の
測定は、夫々の極大吸収波長（675nm又は
690nm）に於けるそれを測定した。
式［］で示されるアルギニン誘導体は、例えば
以下のようにして容易に合成し得るので、それを
用いれば足りる。 即ち、適当な保護基によりアミノ基が保護され
たアルギニン又は適当な保護基によりアミノ基及
びグアニジノ基が保護されたアルギニンをペプチ
ド誘導体の合成に於いて通常用いられている溶
媒、例えばジメチルホルムアミド（DMF）、ジメ
チルスルホキシド（DMSO）、テトラハイドロフ
ラン（THF）、水或はこれらの混合物等に溶解
し、これに室素気流下、４−アミノ−Ｎ−エチル
−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン又は４
−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−
ヒドロキシエチル）アニリンと、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（DCCD）等のペプチド合成に
慣用される縮合剤とを添加した後、室温、要すれ
ば加熱下に適当な時間反応させる。反応終了後
は、反応液を濃縮乾固し、次いでこれをペプチド
誘導体の精製法として通常用いられている方法、
例えばシリカゲルカラムクロマトグラフイ、イオ
ン交換カラムクロマトグラフイ等により精製し、
要すれば脱保護の処理を行うことにより、一般式
［］で示されるアルギニン誘導体が容易に得ら
れる。 以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。 ［実施例］ 参考例 １ (a) カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−グリシン
エチルエステルの合成 カルボベンゾシキ−Ｌ−ロイシン26ｇとグリシ
ンエチルエステル塩酸塩14ｇをTHF400mlに溶解
させた溶液に、氷浴冷却下トリエチルアミン15
ml、HONB18ｇ及びDCCD22ｇを添加した。次
いでこれを室温にて20時間攪拌反応させた後、沈
殿物を瀘去し、溶媒を留去した。得られた残渣を
酢酸エチル500mlに溶解し、飽和重炭酸ソーダ水
溶液、1N−塩酸、水の順で洗浄した後、有機層
を無水硫酸ソーダで乾燥した。乾燥剤を瀘去後、
有機層を減圧濃縮乾固し、得られた残渣に石油ベ
ンジンを加え、ゲル状固体を得、これを更に酢酸
エチル／石油ベンジンより再結晶して、カルボキ
シ−Ｌ−ロイシル−グリシンエチルエステルを得
た。 収量 30.1ｇ（83％）。 融点 114〜115℃。 比旋光度［α］21 D＝−26.1（Ｃ＝1.05、エタノー
ル）。 元素分析値（C18H26N2O5として） 計算値（％）：C61.70、H7.48、N7.99、 実測値（％）：C62.07、H7.50、N7.91。 (b) ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−
Ｌ−ロイシル−グリシンの合成 (a)で得たカルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−グ
リシンエチルエステル10.5ｇとｐ−トルエンスル
ホン酸5.7ｇをエチルアルコール200mlに溶解し、
これに５％パラジウム黒触媒５ｇを加えて、水素
ガスを通じながら室温で３時間攪拌反応させた。
反応終了後、反応液から触媒を瀘去し、次いで溶
媒を減圧下に留去した。得られた油状物とｔ−ブ
チルオキシカルボニル−Ｌ−バリン6.5ｇ及び
HONB5.4ｇをTHF300mlに溶解させ、これに氷
浴冷却下トリエチルアミン4.2ml及びDCCD7.4ｇ
を添加して室温にて20時間攪拌反応させた。反応
終了後、不溶物を瀘去し、溶媒を留去した。得ら
れた残渣を酢酸エチル500mlに溶解し、飽和重炭
酸ソーダ水溶液、10％クエン酸、水の順で洗浄し
た後、有機層を無水硫酸ソーダで乾燥した。乾燥
剤を瀘去後、有機層を減圧濃縮乾固した。残渣に
石油エーテルを加え固化させ、これを更に酢酸エ
チル／石油エーテルより再結晶し、ｔ−ブチルオ
キシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グ
リシンエチルエステルを得た。 収量 10ｇ（83％）。 融点 113〜114℃。 比旋光度［α］21 D＝56.3（Ｃ＝0.95、エタノール）。 元素分析値（C20H37N3O6として） 計算値（％）：C57.81、H8.98、N10.11、 実測値（％）：C57.97、H8.91、Ｎ 9.92。 次いでこのｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−
バリル−Ｌ−ロイシル−グリシンエチルエステル
4.1ｇをメチルアルコール30mlに溶解させ、氷浴
冷却下1N−水酸化ナトリウム水溶液20mlを加え
て２時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液に
1N−塩酸18mlを加えて中和し、減圧濃縮した後、
更に1N−塩酸２mlを加え、これを酢酸エチル300
mlで抽出した。抽出液を無水硫酸ソーダで乾燥
し、乾燥剤を瀘去後、有機層を減圧濃縮乾固し
た。残渣に石油エーテルを加えた固化させた後、
これを酢酸エチル／石油エーテルより再結晶し、
ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−
ロイシル−グリシンを得た。 収量 3.6ｇ（93）％。 融点 104〜108℃。 比旋光度［α］21 D＝−54.6（Ｃ＝0.99、エタノー
ル）。 (c) ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−
Ｌ−ロイシル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５
−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
エステルの合成 (b)で得たｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バ
リル−Ｌ−ロイシル−グリシン1.5ｇをTHF50ml
に溶解し、これに氷浴冷却下HONB0.84ｇ及び
DCCD1.0ｇを添加して室温にて20時間攪拌反応
させた。反応終了後、沈殿物を瀘去し、溶媒を留
去してｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル
−Ｌ−ロイシル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５
−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエ
ステルを得た。 収量 1.9ｇ（90％）。 参考例２ ４−［N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−ア
ルギニン）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒ
ドロキシエチル）アニリンの合成 N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニン3.0ｇ
をDMF80mlに熱時溶解し、これに窒素気流中、
氷浴冷却下、４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−（β
−ヒドロキシエチル）アニリン2.75ｇとDCCD4.0
ｇを加えて室温にて20時間攪拌反応させた。反応
終了後、不溶物を瀘去し、溶媒を留去して、得ら
れた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフイ
（カラム：15×５cm、溶出液：酢酸エチル：ピリ
ジン：水：酢酸＝の60：20：10：５。）により精
製し、主溶出分の濃縮乾固物を水に溶解したもの
を凍結乾燥して、４−［（N〓−カルボベンゾキシ
−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−
（β−ヒドロキシエチル）アニリン・２酢酸塩を
得た。 収量 1.45ｇ（25％）。 比旋光度［α］21 D＝−17.2（Ｃ＝0.95、メタノー
ル）。 元素分析値（C24H35N6O4・2CH3COOHとして） 計算値（％）：C56.83、H7.33、N14.20、 実測値（％）：C57.02、H7.05、N14.14。 参考例３ ４−［（N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−
アルギニル）アミノ］−３−メチル−Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリンの
合成 N〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニン2.0ｇ
をDMF20mlに熱時溶解し、これに窒素気流中、
氷浴冷却下４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル
ーＮー（β−ヒドロキシエチル）アニリン1.8ｇ
とDCCD1.4ｇを加えて室温にて20時間攪拌反応
させた。反応終了後、沈殿物を瀘去し、溶媒を留
去して、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマ
トグラフイ（カラム：40×２cm、溶出液：酢酸エ
チル：ピリジン：水：酢酸＝120：20：10：５。）
により精製し、主溶出分の濃縮乾固物を水に溶解
したものを凍結乾燥して、４−［N〓−カルボベン
ゾキシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−３−メチル
−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）ア
ニリン・２酢酸塩を得た。 収量 0.86ｇ（22％）。 比旋光度［α］21 D＝−10.1（Ｃ＝0.88、メタノー
ル）。 元素分析値（C25H37N6O4・2CH3COOHとして） 計算値（％）：C57.51、H7.49、N13.87、 実測値（％）：C57.22、H7.18、N13.65。 実施例１ ４−［（ｔ−ブチルオキシカルボニル−
Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−ア
ルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒ
ドロキシエチル）アニリンの合成 参考例２で得られた４−［（N〓−カルボベンゾ
キシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−
Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン．２酢酸
塩1.45ｇの接触還元物４−［（Ｌ−アルギニル）ア
ミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンのTHF溶液30mlに参考例１(c)で得
たｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ
−ロイシル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノ
ルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステ
ル0.95ｇのDMF溶液30mlを加え、室温で72時間
攪拌反応させた。反応終了後、反応液を濃縮乾固
し、得られた残渣を水120mlに溶解し、アンバー
ライトIRA−410（酢酸型）を通して、イオン交換
カラムクロマトグラフイ（CMセルロース、0.2M
酢酸アンモニウム）にて精製し、その主溶出分を
凍結乾燥して４−［ｔ−ブチルオキシカルボニル
−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グリシン−Ｌ−ア
ルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒド
ロキシエチル）アニリン・２酢酸塩・１／２水和
物を得た。 収量 110mg（11％）。 融点 115〜122℃。 比旋光度［α］21 D＝−37.1（Ｃ＝0.42、メタノー
ル）。 元素分析値 （C34H59N9O7・2CH3COOH・１／2H2Oとし
て） 計算値（％）：C54.66、H8.21、N15.09、 実測値（％）：C54.54、H8.02、N15.54。 実施例２ ４−［（Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロ
イシル−グリシン−Ｌ−アルギニル）アミノ］
−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）
アニリンの合成 参考例１(a)で得られたＮ−カルボベンゾキシ−
Ｌ−ロイシル−グリシンエチルエステル4.1ｇを
メチルアルコール30mlに溶解し、これに氷浴冷却
下1N−水酸化ナトリウム水溶液20mlを加えて２
時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液に1N
−塩酸18mlを加えて中和し、減圧濃縮した後、更
に1N−塩酸２mlを加え、これを酢酸エチル300ml
で抽出した。抽出液を無水硫酸ソーダで乾燥し、
乾燥剤を瀘去後、有機層を減圧濃縮乾固した。残
渣に石油エーテルを加え固化させた後、これを更
に酢酸エチル／石油エーテルより再結晶し、Ｎ−
カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−グリシンを得
た。 このＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−グ
リシンを原料とし、参考例１(c)と同様の反応及び
操作を行つてＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシ
ル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネ
ン−２，３−ジカルボキシイミドエステル0.85ｇ
を得た。このDMF30ml溶液に、参考例２と同様
の方法により得られた４−［（N〓−カルボベンゾ
キシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ−エチル−
Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン・２酢酸
塩1.5ｇの接触還元物４−［（Ｌ−アルギニル）ア
ミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンのTHF溶液30mlを加え、室温で72
時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を濃縮
乾固し、得られた残渣を水120mlに溶解し、アン
バーライトIRA−410（酢酸型）を通して、イオン
交換カラムクロマトグラフイ（CMセルロース、
0.2M酢酸アンモニウム）にて精製し、その主溶
出分を凍結乾燥して４−［（Ｎ−カルボベンゾキシ
−Ｌ−ロイシル−グリシン−Ｌ−アルギニル）ア
ミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリン・２酢酸塩を得た。 収量 311mg（15％）。 融点 119℃。 比旋光度［α］21 D＝−12.2（Ｃ＝0.41、エタノー
ル）。 元素分析値（C32H48N8O6・2CH3COOHとして） 計算値（％）：C56.82、H7.42、N14.70、 実測値（％）：C56.50、H7.11、N14.50。 実施例３ ４−［（ｔ−ブチルオキシカルボニル−
Ｌ−バリル−グリシル−Ｌ−アルギニル）アミ
ノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンの合成 ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリン26ｇ
とグリシンエチルエステル塩酸塩14ｇをTHF400
mlに溶解させ、これに氷浴冷却下トリエチルアミ
ン15ml、HONB18ｇ及びDCCD22ｇを加え室温
にて20時間攪拌反応させた。反応終了後、沈殿物
を瀘去し、溶媒を留去して、得られた残渣を酢酸
エチル500mlに溶解し、飽和重炭酸ソーダ水溶液、
1N−クエン酸、水の順で洗浄した後、有機層を
無水硫酸ソーダで乾燥した。乾燥剤を瀘去後、有
機層を減圧濃縮乾固し、残渣に石油ベンジンを加
え、ゲル状固体を得た。これを酢酸エチル／石油
ベンジンより再結晶し、ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−Ｌ−バリル−グリシンエチルエステルを得
た。 収量 18.1ｇ（50％）。 融点 98〜99℃。 上で得たｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バ
リル−グリシンエチルエステル4.1ｇをメチルア
ルコール30mlに溶解し、これに氷浴冷却下1N−
水酸化ナトリウム水溶液20mlを加えて２時間攪拌
反応させた。反応終了後、反応液に1N−塩酸18
mlを加えて中和し、減圧濃縮した後、更に1N−
塩酸２mlを加え、これを酢酸エチル300mlで抽出
した。抽出液を無水硫酸ソーダで乾燥し、乾燥剤
を瀘去後、有機層を減圧濃縮乾固した。残渣に石
油エーテルを加え固化させた後、これを酢酸エチ
ル／石油エーテルより再結晶し、ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−Ｌ−バリル−グリシンを得た。 このｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル
−グリシンを原料とし、参考例１(c)と同様の反応
及び操作を行つてｔ−ブチルオキシカルボニル−
Ｌ−バリル−グリシン−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノ
ルボルネン２，３−ジカルボキシイミドエステル
0.95ｇを得た。このDMF20ml溶液に、参考例２
と同様の方法により得られた４−［（N〓−カルボ
ベンゾキシ−Ｌ−アルギニル）アミノ］−エチル
−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン・２酢
酸塩1.5ｇの接触還元物４−［（Ｌ−アルギニル）
アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンのTHF溶液50mlを加えた後、室温
で72時間攪拌反応せた。反応終了後、反応液を濃
縮乾固し、得られた残渣を水120mlに溶解し、ア
ンバーライトIRA−410（酢酸型）を通して、イオ
ン交換カラムクロマトグラフイ（CMセルロー
ス、0.2M酢酸アンモニウム）にて精製し、その
主溶出分を凍結乾燥して４−［（ｔ−ブチルオキシ
カルボニル−Ｌ−バリル−グリシン−Ｌ−アルギ
ニル）アミノ］−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキ
シエチル）アニリン・２酢酸塩を得た。 収量 387mg（12％）。 融点 101〜102℃。 比旋光度［α］21 D＝−0.7（Ｃ＝0.35、DMF）。 元素分析値（C28H48N8O6・2CH3COOHとして） 計算値（％）：C53.92、H7.92、N15.71、 実測値（％）：C53.72、H7.82、N15.46。 参考例 ４ 実施例１、２又は３で得られたペプチド誘導体
を基質とし、以下の試液を用いてエンドトキシン
濃度の測定を行つた。 （試液） (1) LAL溶液 リムルス・アメボサイト・ライセート（LAL）
（凍結乾燥品、５ml用）を注射用蒸留水５mlで溶
解したものをLAL溶液とした。 (2) 標準エンドトキシン溶液 標準エンドトキシン（凍結乾燥品、0.5μg／
vial）を所定濃度となるように注射用蒸留水に溶
解したものを標準エンドトキシン溶液とした。 (3) 基質緩衝液 １−ナフトール−２−スルホン酸カリウム
（0.2mM）及び実施例１、２又は３で得られた本
発明のペプチド誘導体（0.2mM）を含む0.1Mト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩酸緩
衝液（PH8.26、0.03M MgCl2含有、オートクレー
ブ中で滅菌済み。）を基質緩衝液とした。 (4) 発色液 0.2％過ヨウ素酸及び0.3Mホウ酸を含有する溶
液を発色液とした。 （測定操作） 所定濃度の標準エンドトキシン溶液0.05mlと
LAL溶液0.1mlとを混合し、37℃で10分間インキ
ユベイトし、次いでこれに基質緩衝液2.0mlを加
えて、更に37℃で15分間インキユベイトした。こ
の溶液に発色液1.0mlを加えて発色させた後、極
大吸収波長（660nm）に於ける吸光度を測定し
た。 （結果） 結果を表１に示す。 比較例１及び2. 実施例１、２又は３で得られた本発明のペプチ
ド誘導体の代りに、これと類似の構造を有する既
存のペプチド誘導体である４−［（ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グリ
シル−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ，Ｎ−ジエ
チルアニリン・２酢酸塩又は４−［（ｔ−ブチルオ
キシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−グ
リシル−Ｌ−アルギニル）アミノ］−Ｎ，Ｎ−ジ
エチル−ｍ−トルイジン・２酢酸塩を基質として
用いた以外は、参考例４と同じ試薬及び試液を用
い、同様の操作を行つてエンドトキシンの測定を
行つた結果を、表１に併せて示す。尚、吸光度の
測定は、夫々の極大吸収波長（675nm又は
690nm）に於けるそれを測定した。
【表】
表１から明らかな如く、実施例１、２又は３で
得られた本発明のペプチド誘導体を基質としてエ
ンドトキシン濃度の測定を行つた場合には、既存
の類似のペプチド誘導体を用いた場合と比べて明
らかに感度が高くなる。ことが判る。 ［発明の効果］ 以上述べた如く、本発明は、アルギニン残基の
Ｃ−末端側に、フエノール、ナフトール等と酸化
縮合させることにより長波長側に極大吸収
（λmax）を有する色素を生成する４−アミノ−
Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニ
リン又は４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−
Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリンが結合し
ているペプチド誘導体を提供するものであり、こ
れを特定酵素（プロテアーゼ）の基質として用い
た場合には、該酵素の活性を簡便で高感度に、且
つ血液試料中の色素成分による影響を殆ど受けず
に測定することが可能となる点に顕著な効果を奏
する発明であり、斯業に貢献するところ大なる発
明である。
得られた本発明のペプチド誘導体を基質としてエ
ンドトキシン濃度の測定を行つた場合には、既存
の類似のペプチド誘導体を用いた場合と比べて明
らかに感度が高くなる。ことが判る。 ［発明の効果］ 以上述べた如く、本発明は、アルギニン残基の
Ｃ−末端側に、フエノール、ナフトール等と酸化
縮合させることにより長波長側に極大吸収
（λmax）を有する色素を生成する４−アミノ−
Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニ
リン又は４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−
Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリンが結合し
ているペプチド誘導体を提供するものであり、こ
れを特定酵素（プロテアーゼ）の基質として用い
た場合には、該酵素の活性を簡便で高感度に、且
つ血液試料中の色素成分による影響を殆ど受けず
に測定することが可能となる点に顕著な効果を奏
する発明であり、斯業に貢献するところ大なる発
明である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式［］ （式中、R1はＮ−末端に保護基を有する、ロ
イシル基、バリル基又はバリル−ロイシル基を表
わす。また、式中のアルギニン残基のグアニジノ
基は保護基を有していても、酸付加塩の状態とな
つていてもよい。） で示されるペプチド誘導体又はその酸付加塩。 ２ Ｎ−末端の保護基がアシル基、カルボベンゾ
キシ基、第３アルキルオキシカルボニル基、トシ
ル基又はグルタリル基である特許請求の範囲第１
項に記載のペプチド誘導体又はその酸付加塩。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12867882A JPS5890535A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | 新規な発色性ペプチド誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12867882A JPS5890535A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | 新規な発色性ペプチド誘導体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56062819A Division JPS57176940A (en) | 1981-04-25 | 1981-04-25 | Novel color-developing peptide derivative |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2074827A Division JPH03227967A (ja) | 1990-03-23 | 1990-03-23 | アルギニン誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5890535A JPS5890535A (ja) | 1983-05-30 |
| JPH0366319B2 true JPH0366319B2 (ja) | 1991-10-16 |
Family
ID=14990733
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12867882A Granted JPS5890535A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | 新規な発色性ペプチド誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5890535A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS605424A (ja) * | 1983-06-22 | 1985-01-12 | Sharp Corp | 磁気テ−プの記録および再生装置 |
-
1982
- 1982-07-23 JP JP12867882A patent/JPS5890535A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5890535A (ja) | 1983-05-30 |
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