JPH08131165A - 新規なグリセロールキナーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ７０℃、１０分間の熱処理で８０％以上の活
性を保持することを特徴とするグリセロールキナーゼ、
およびフラボバクテリウム属に属するグリセロールキナ
ーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物からグリセロー
ルキナーゼを採取してなるグリセロールキナーゼの製造
法。 【効果】 熱安定性の良いグリセロールキナーゼおよび
その微生物学的製造法を提供できるものであり、本酵素
を用いるグリセライドやリパーゼ活性などの測定のため
の有用かつ熱安定性の良い液状化試薬を可能とする測定
用酵素を提供できた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は７０℃、１０分間の熱処
理で８０％以上の活性を保持することを特徴とするグリ
セロールキナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｓｅ）
およびフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）属に属するグリセロールキナーゼ生産菌を培地に
培養し、その培養物からグリセロールキナーゼを採取し
てなるグリセロールキナーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来技術】グリセロールキナーゼはグリセロールを基
質としてグリセロール１モルおよびＡＴＰ１モルから１
モルのＡＤＰおよび１モルのグリセロール−３−リン酸
を生成する反応を触媒する酵素（酵素番号２．７．１．
３０）として知られており（酵素ハンドブック３４１〜
３４２頁、（株）朝倉書店、１９８２年発行）、また、
グリセロールキナーゼ生産菌としては従来からストレプ
トマイセス・キャナス（特開昭５５−１６２９８７号公
報）、セルロモナス・エスピー（特開昭５６−１２１４
８４号公報）、バチルス・ステアロサーモフィラス（特
開昭５３−２６３８９号公報）、アルスロバクター・エ
スピー（特開昭５９−２６８８号公報）などが知られて
おり、臨床診断薬の分野で使用されている。

【０００３】また、本発明者らは臨床診断薬分野におい
て優れたグリセロールキナーゼをスクリーニングしたと
ころセラチア・マセセンス・ＩＦＯ−３７３６株、シュ
ードモナス・フルオレッセンス・ＩＦＯ−３９２５株、
シュードモナス・プチダ・ＩＦＯ−１２６５３株を後述
する参考例の培地にて培養したところ、それぞれ、０．
５Ｕ／ｍｌ、０．８Ｕ／ｍｌ、１．３０Ｕ／ｍｌの培養
力価でグリセロールキナーゼを生産することを見い出し
たが、いずれもＫｍ値や熱安定性に優れるものではなか
った。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】グリセロールキナーゼ
は従来、臨床診断薬分野、例えばリパーゼまたはグリセ
リドの存在下にグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
やグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼと組み合
わせてグリセリドまたはリパーゼ活性の測定試薬に使用
され、その他同様の酵素反応によりグリセロールの測定
試薬などに使用されてきた。

【０００５】しかし、近年、臨床診断薬分野では試薬を
凍結乾燥品ではなく、液状で製品とすることが求められ
ており、液状化試薬に対応できるような保存安定性の優
れたグリセロールキナーゼや工業生産に対応できるよう
な熱安定性の優れたグリセロールキナーゼの開発が望ま
れていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、熱安定性
が優れ、さらに、好適には液状化試薬に対応できる安定
性の優れたグリセロールキナーゼおよびその工業的生産
の可能な製造法を求めて鋭意研究を重ねた結果、静岡県
田方郡大仁町の畑土壌から単離したフラボバクテリウム
・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株と同定した微生物
が安定性の優れたグリセロールキナーゼの生産能を有す
ることを初めて見いだし、本発明を完成した。

【０００７】本発明は上記の知見に基づいて完成された
もので、７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を
保持する熱安定性の良いグリセロールキナーゼ、また好
適には安定化剤を添加せず、３７℃、２週間で８０％以
上の活性を保持する保存安定性の良いグリセロールキナ
ーゼおよびフラボバクテリウム属に属するグリセロール
キナーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物からグリセ
ロールキナーゼを採取することを特徴とするグリセロー
ルキナーゼの製造法である。

【０００８】以下に本発明について詳細に説明する。ま
ず、本発明のグリセロールキナーゼ生産菌について、フ
ラボバクテリウム属に属するグリセロールキナーゼを生
産する能力を有する微生物であれば何ら限定されるもの
ではなく、グリセロールキナーゼ生産能を有する変種や
変異株であってもよく、好ましくはフラボバクテリウム
属に属するＧＫ−５４株が挙げられる。本菌株の菌学的
性質を示すと次の通りである。

【０００９】なお、本菌株の同定に当たっては、同定実
験は医学細菌同定の手引（第２版）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（３巻）に準じて行
い、実験結果を医学細菌同定の手引（第２版）、Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１，Ｖｏｌ．
２，Ｖｏｌ．３、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙに対比して同定を行った。

【００１０】生育の特徴 普通寒天平板培地 線上に良好に生育する。表面は滑らか。縁は丸い。黄色
〜オレンジ色を呈する。不透明。光沢あり。 普通寒天斜面培地 線上に良好に生育する。表面は滑らか。縁は丸い。黄色
〜オレンジ色を呈する。不透明。光沢あり。 液体培地 生育良好で一様に生育する。 リトマスミルク培地およびＢＣＰ培地 リトマスを還元しないが、液化および凝固が観察され
た。 ＤＮＡのＧＣｍｏｌ％ ３５．７±１．０％（ＨＰＬＣ） 主たるイソプレノイドキノン ＭＫ−６ 形態の特徴 単独で端の丸いまっすぐな長桿菌で大きさは０．４〜
０．７Ｘ１．８〜２．５μｍ。運動性はない。芽胞非形
成。 生理、生化学的性状 グラム染色 − ＫＯＨ反応テスト ＋ 抗酸性染色 − ＯＦテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ） ０ ＯＦテスト（Ｎ源にＮＨ₄ Ｈ₂ ＰＯ₄ ） ０ 好気での生育 ＋ 嫌気での生育 − 生育温度１２．３℃ − １６．０℃ ＋ ４０．４℃ ＋ ４３．６℃ − 至適温度は２５〜３９℃ 食塩耐性０％ ＋ ３．０％ ＋ ５．０％ − 生育ｐＨ４．４０ − ４．７６ ＋ １０．４１ ＋ １０．８０ − 至適ｐＨは７．５〜８．０ ゼラチン分解 ＋ デンプン分解 − カゼイン分解 ＋ エスクリン分解 ＋ セルロース分解 − チロシン分解 − アルギニン分解 − Ｔｗｅｅｎ８０分解 − カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ フォスファターゼ産生 ＋ ウレアーゼ産生（ＳＳＲ） − ウレアーゼ産生（Ｃｈｒｉｓ．） − インドール産生 − 硫化水素産生（ＴＳＩ） − ＤＮａｓｅ産生 ＋ アセトイン産生 − ＭＲテスト − ＬＶ反応テスト − 硝酸塩還元テスト − 亜硝酸塩還元テスト ＋ シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 − リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 − クリステンゼン培地での利用性 クエン酸塩 （＋） リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 ＋ グルコン酸塩 − コハク酸塩 − グルコースよりガス産生 − 糖より酸の産生 アドニトール − Ｌ（＋）−アラビノース − セロビオース − ズルシトール − メソ−エリスリトール − フルクトース ＋ Ｄ−フコース ＋ Ｄ−ガラクトース − Ｄ−グルコース ＋ グリセロール ＋ イノシトール − イヌリン − ラクトース ＋ マルトース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ メレジトース − メリビオース ＋ ラフィノース − Ｌ（＋）−ラムノース − Ｄ−リボース − サリシン − Ｌ−ソルボース − ソルビトール − スターチ ＋ サッカロース − トレハロース ＋ Ｄ−キシロース − エタノール（３％） ＋ 色素の産生 フルオレッセンを産生 ＰＨＢの蓄積 − 無機窒素源の利用 硝酸塩 − アンモニウム塩 ＋ 以上のように本菌株の主性状はグラム陰性の桿菌で非運
動性であり、カタラーゼ、オキシダーゼ、フォスファタ
ーゼ陽性でグルコースを酸化的に分解し、酸を産生し、
ＧＣｍｏｌ％は３５．７±１．０％、キノンタイプはＭ
Ｋ−６、芽胞非形成であり、これらの主性状をＢｅｒｇ
ｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１，Ｖｏｌ．
２，Ｖｏｌ．３に対比した結果、フラボバクテリウム属
に属する微生物と判明した。そこで、フラボバクテリウ
ム属の中から本菌株と似た４菌種を選び本菌株と比較し
た。 Ａ；フラボバクテリウム・ブレブ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）。 Ｂ；フラボバクテリウム・グレウム（Ｆｌａｖｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｇｌｅｕｍ）。 Ｃ；フラボバクテリウム・インドロゲネス（Ｆｌａｖｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ）。 Ｄ；フラボバクテリウム・メニンゴセプティクム（Ｆｌ
ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉ
ｃｕｍ）。

【００１１】 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ 本菌 ＧＣ含量（％） ３２．４ ３７．６ ３３．８ ３７．０ ３５．７ ±０．６ ±１．０ ±０．５ ±１．０ カゼイン分解 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ エスクリン分解 − ＋ ＋ ＋ ＋ インドール産生 ＋ ＋ ＋ ｄ − 硝酸還元 − ｄ − ｄ − ウレアーゼ産生 − ｄ − ｄ − ５℃での生育 − − ＋ − − 糖の資化性 グルコース ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ アラビノース − ＋ − ｄ − セロビオース − − − − − エタノール − − − ｄ ＋ フルクトース − ＋ − ｄ ＋ グリセロール − ｄ − ｄ ＋ ラクトース − − − ｄ ＋ マルトース ｄ ＋ ＋ ＋ ＋ マンニトール − − − ｄ ＋ ラフィノース − − − − − サリシン − − − − − サッカロース − − − − − トレハロース − ＋ − ｄ ＋ キシロース − ｄ − − − （＋：９０％以上が陽性、ｄ：１１〜８９％が陽性、−：９０％以上が陰性） 性状の比較から本菌株はフラボバクテリウム・メニンゴ
セプティクムに属すると判断された。さらに、ＤＮＡ−
ＤＮＡハイブリダイゼイション法によりＤＮＡ相同性
（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）測定を行った。測定方法はマ
イクロプレートを用いて蛍光法により分光光学的に定量
測定を行った。また、ハイブリダイゼイションの反応温
度はＧＣ含量からＤＮＡの融解温度を計算し４０℃で行
った。比較対象として以下の菌株を用いて行った。 Ｎｏ．１株：フラボバクテリウム・ブレブＩＦＯ−１４
９３株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｂｒｅｖｅＩＦＯ−１４９３：タイプカルチャ
ー）。 Ｎｏ．２株：フラボバクテリウム・グレウムＩＦＯ−１
５０５４株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｇｌｅｕｍ ＩＦＯ−１５０５４：タイプカ
ルチャー）。 Ｎｏ．３株：フラボバクテリウム・インドロゲネスＩＦ
Ｏ−１４９４４株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ ＩＦＯ−１
４９４４：タイプカルチャー）。 Ｎｏ．４株：フラボバクテリウム・メニンゴセプティク
ムＩＦＯ−１２５３５株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕ
ｍＩＦＯ−１２５３５：タイプカルチャー） 以上の結果から本菌株は、ＤＮＡ相同性がフラボバクテ
リウム・メニンゴセプティクムＩＦＯ−１２５３５株：
タイプカルチャー（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕ
ｍ ＩＦＯ−１２５３５：タイプカルチャー）と判断基
準である７０％以上であることから前記知見と合わせて
同種と判定し、本菌株をフラボバクテリウム・メニンゴ
セプティクムＧＫ−５４株と同定命名し、工業技術院生
命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６８
として寄託したものである。

【００１２】次いで、フラボバクテリウム属に属するグ
リセロールキナーゼ生産菌からのグリセロールキナーゼ
の精製および、諸性質の検討を行った。本発明を実施す
るにあたり、その培養形態としては液体培養、個体培養
いずれも可能であるが工業的には通気撹拌培養を行うの
が有利である。また使用する培養源としては一般に微生
物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩及びその他
の微量栄養源の他、フラボバクテリウム属に属する微生
物の利用できる栄養源であればすべて使用できる。

【００１３】炭素源としては、例えばグルコース、フル
クトース、サッカロース、キシロース、マルトース、グ
リセロール、デキストリン、でんぷん、アミノ酸等の
他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わ
せて用いられる。窒素源としては、例えば無機窒素源、
有機窒素源のいずれも使用可能であり、無機栄養源とし
ては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸
ソーダ、塩化アンモニウム等が挙げられる。また有機窒
素源としては、例えば大豆、米、トウモロコシ、小麦等
の粉、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、
カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、バクトソイトン等が
挙げられる。

【００１４】無機塩及び微量栄養素としては、例えばリ
ン酸、マグネシュウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜
鉛等の塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性剤、消泡
剤等の菌の生育やグリセロールキナーゼの生産を促進す
るものであれば必要に応じて使用できる。培養は好気的
条件で、培養温度は菌が発育し、グリセロールキナーゼ
が産生する範囲であればよく、通常１５℃〜３７℃、好
ましくは２５℃〜３５℃である。培養時間は条件により
異なるがグリセロールキナーゼが最も産生される時間ま
で培養すればよく、通常２４〜１００時間程度である。

【００１５】グリセロールキナーゼは主としてその菌体
内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すれば
よい。グリセロールキナーゼの抽出法を例示すればまず
培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液
やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム
処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処
理などの種々の菌体処理手段を適宜選択組み合わせて、
粗製のグリセロールキナーゼ含有液を得る。

【００１６】粗製のグリセロールキナーゼ含有液から公
知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を用いて精
製グリセロールキナーゼを得る。例えば、粗製のグリセ
ロールキナーゼ含有液にアセトン、メタノール、エタノ
ールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫安、食塩など
による塩析法などを適用してグリセロールキナーゼを沈
澱させ、回収する。

【００１７】さらに、この沈澱物を必要に応じ透析、等
電点沈澱を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示す
まで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いる
カラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、
これらの方法を適当に組み合わせることによりグリセロ
ールキナーゼの精製度が上がる場合は適宜組み合わせて
行うことができる。

【００１８】これらの方法によって得られる酵素は安定
化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界
面活性剤などを加えあるいは加える事なく、限外濾過濃
縮、凍結乾燥の方法により、液状または固形のグリセロ
ールキナーゼを得ることができ、また、適宜凍結乾燥を
行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、
マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５〜１０％
程度添加してもよい。

【００１９】つぎに本発明で得られるグリセロールキナ
ーゼの理化学的性質及び酵素活性測定法を述べる。 グリセロールキナーゼの活性測定法 ０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．２
ｍｌ、５％のグリセロールを０．１ｍｌ、０．１ＭのＡ
ＴＰを０．０２ｍｌ、０．１ＭのＭｇＣｌ₂を０．０４
ｍｌ、４５Ｕ／ｍｌのペルオキシダーゼ（シグマ社製）
を０．１ｍｌ、０．３％の４−アミノアンチピリンを
０．１ｍｌ、０．２５％のフェノールを０．１ｍｌ、１
００Ｕ／ｍｌのグリセロホスフェイトオキシダーゼ（旭
化成社製）を０．２ｍｌ、および蒸留水を０．１４ｍｌ
よりなる反応液１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した
後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させ
る。反応後、０．５％のＳＤＳを２ｍｌ添加して反応を
停止させ、５分以内に層長１ｃｍセルを用いて波長５０
０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また、盲検
として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同
一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素
液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光
度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１
単位は３７℃で１分間に１μモルのグリセロホスフェイ
トを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りであ
る。

【００２０】

【数１】

【００２１】理化学的性質 （１）酵素作用：基質としてグリセロールを用いた酵素
作用を以下に示す。

【００２２】

【化１】

【００２３】（２）基質特異性：グリセロールに基質特
異性を示す。各種基質に対する特異性は表１の通りであ
る。

【００２４】

【表１】

【００２５】（３）Ｋｍ値：３．９ｘ１０^-2±０．５ｘ
１０^-2ｍＭ（グリセロールに対して）、５．３ｘ１０^-2
±０．５ｘ１０^-2ｍＭ（ＡＴＰに対して） （４）等電点：４．４±０．５（キャリアー−アンホラ
インを用いた電気泳動法にて） （５）分子量：１４５０００±５０００（ＴＳＫ Ｇ−
３０００ＳＷによるゲル濾過法にて）、５００００±５
０００（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
て） （６）至適ｐＨ 前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求めたもの
で、その結果を図１に示した。ｐＨ４．５〜６．５の範
囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．５
の範囲は１００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ
６．５〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７．０〜８．５の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩
衝液、ｐＨ８．５〜１１．０の範囲は１００ｍＭのグリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合の活性値
を示すもので、至適ｐＨは７．５〜８であった。 （７）ｐＨ安定性 １００ｍＭ各種緩衝液（グリセロールキナーゼ１Ｕ／ｍ
ｌ）を３７゜Ｃ、６０分間処理し、その残存活性を前記
酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図２に示
す。ｐＨ０．５〜４．０は１００ｍＭのクラークアンド
ルブス緩衝液、ｐＨ３．５〜７．０は１００ｍＭの酢酸
緩衝液、ｐＨ６．５〜８．０は１００ｍＭのリン酸緩衝
液、ｐＨ８．０〜９．０は１００ｍＭのトリス−塩酸緩
衝液、ｐＨ９．０〜１１．０は１００ｍＭのグリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。ｐＨ３〜１１の範
囲で最も良好な安定性を示した。 （８）至適温度 前記酵素活性測定法に従って、温度を３７゜Ｃ〜９５゜
Ｃの範囲で変化させて至適温度を求めた結果は図３に示
すとおりであり、本酵素の至適温度は８０゜Ｃであっ
た。 （８）熱安定性 １００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）（グリ
セロールキナーゼ１Ｕ／ｍｌ）を各温度で１０分間加熱
処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測
定した。その結果、図４に示すとおり少なくとも６０゜
Ｃまで１００％安定で、７０℃、１０分間の処理では８
０％以上の残存活性を保持していた。 （９）金属イオンの影響 各種金属イオン（１ｍＭ）の本酵素活性への影響につい
て調べた結果は表２に示すとおりで、カルシウムイオン
による弱い阻害がみられた。

【００２６】

【表２】

【００２７】（１０）Ｎ末端アミノ酸配列 Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｈｒ− （１１）保存安定性 液状化試薬の対応を目的として、０．０５％のＮａＮ₃
（防腐剤）を含む、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に、本発明グリセロールを０．８Ｕ／ｍｌの
濃度となるように調製し、３７℃で２日後、１週間後、
２週間後、３週間後、４週間後に残存活性を前記活性測
定法で測定した結果、それぞれ、９４％、９１％、８１
％、７１％、６０％の活性を保持していた。このことか
ら、本酵素は安定化剤（例えばＢＳＡや糖類）の非存在
下、３７℃、２週間で８０％以上の活性を保持してい
た。

【００２８】以上の結果から、本発明グリセロールキナ
ーゼと従来から知られているグリセロールキナーゼとの
性質を比較すると、次のようになる。 （ＡＴＰに対するＫｍ値） 本酵素：０．０５３ｍＭ ストレプトマイセス・キャナス由来：０．２ｍＭ セルロモナス・エスピー由来：０．４３ｍＭ アルスロバクター・アルトロシアネウス由来：３．７ｍ
Ｍ （熱安定性） 本酵素：７０℃１０分間の熱処理で８０％以上の活性を
保持していた。

【００２９】セルロモナス・キャナス由来：ｐＨ７．
５、４５℃、１５分間の処理で、９６％の残存活性を保
持する。７０℃の処理では完全に失活する。 アルスロバクター・アルトロシアネウス由来：ｐＨ７．
０、１５分間の処理で４５℃以下の温度で安定。 バチルス・ステアロサーモフィラス由来：６５℃、１０
分間の熱処理で１０％の残存活性であった（図５）。 （至適温度） 本酵素：８０℃ セルロモナス・エスピー由来：５０℃付近 アルスロバクター・エスピー由来：５０℃付近 バチルス・ステアロサーモフィラス由来：６５℃±５℃ 上記のように本発明グリセロールキナーゼは従来より知
られている酵素とは明かに異なる性質を持っており、特
に熱安定性に関しては最も優れた安定性を保持してい
た。

【００３０】

【実施例】ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、
本発明は何らこれにより限定されるものではない。

【００３１】

【実施例１】フラボバクテリウム・メニンゴセプティク
ムＧＫ−５４株を１．０％のグリセロール、３．０％の
肉エキス、０．５％のバクトソイトン（ディフコ社製）
からなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラス
コに１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した後、２８
℃、３０時間培養を行い、種培養液を得た。

【００３２】種培養液を上記と同一組成培地に消泡剤を
加えた培地（ｐＨ７．０）２０ｌのジャーファーメンタ
ー４基にそれぞれ２本ずつ添加し、２８℃で２２時間培
養した。培養終了後、培養物を４０００ｒｐｍで遠心
し、菌体３．０Ｋｇを回収した。この菌体に１０ｍＭの
ＥＤＴＡ、０．３％のトリトンＸ−１００、２０ｍＭの
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）を含む、０．１％の
リゾチーム溶液９ｌを加え、３７℃で９０分間反応させ
て可溶化を行った。その後、これを４０００ｒｐｍで２
０分間遠心し、不溶物を除去してその上清９ｌ（７２０
００Ｕ）を得た。

【００３３】ついでこの上清に５．０％の硫酸プロタミ
ン９０ｍｌを加えて沈澱物を遠心除去し、さらにその上
清を５０℃で３０分間加熱し、沈澱物を遠心除去した。
その遠心上清を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）にて一夜透析し、Ｑ−セファロース（２．７×
３０ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグ
ラフィーを行った。溶出は塩化ナトリウムの０〜０．５
Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍ
の塩化ナトリウム溶出画分（２９０００Ｕ）を回収し
た。

【００３４】この酵素溶液に２．５Ｍの濃度となるよう
に塩化ナトリウムを溶解し、オクチルセファロース
（２．６×２０ｃｍ）（ファルマシア社製）の疎水クロ
マトグラフィーを行った。溶出は２．５Ｍ〜０Ｍの塩化
ナトリウムのリニアグラジエントにより行い、０Ｍの塩
化ナトリウムの溶出画分（２５０００Ｕ）を回収した。
ついでこの酵素液を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）にて一夜透析し、ハイドロキシアパタイト
（１．６×２６．５ｃｍ）（ペンタックス社製）クロマ
トグラフィーを行った。溶出は５〜０．２Ｍのリン酸緩
衝液によるリニアグラジエントにより行い、０．１〜
０．１２Ｍのリン酸緩衝液の溶出画分（１６３００Ｕ）
を回収した。

【００３５】ついでこの酵素液を２０ｍＭのトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて一夜透析し、ＤＥＡＥ−セ
ファロース（１．６×２０ｃｍ）（ファルマシア社製）
イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０〜
０．５Ｍの塩化ナトリウムによるリニアグラジエントに
より行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウムの溶出画
分（１２０００Ｕ）を回収し、２０ｍＭのトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）に一夜透析後、ＢＳＡを１％とな
るように添加して、凍結乾燥し、精製グリセロールキナ
ーゼ（１２０００Ｕ、９．９Ｕ／ｍｇ）を得た。

【００３６】このようにして得られたグリセロールキナ
ーゼの理化学的性質は前記した通りである。

【００３７】

【参考例１】セラチア・マセセンス・ＩＦＯ−３７３６
株を２．０％のグリセロール、２．０％の酵母エキスか
らなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコ
に１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した後、２８℃、
３０時間培養を行った。培養終了後、培養物を８０００
ｒｐｍで遠心し、菌体３０ｍｇを回収した。得られた菌
体を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０
ｍｌに懸濁し、超音波破砕によって可溶化を行った。

【００３８】その後、可溶化液を１６０００ｒｐｍで遠
心し、不溶物を除去した上清２９ｍｌ（７０Ｕ）を得
た。次いで、遠心上清を８ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸
緩衝液に一夜、透析した後、Ｑ−セファロース（２ｘ８
ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフ
ィーを行った。溶出は塩化ナトリウムの０〜０．５Ｍの
リニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍの塩
化ナトリウム溶出画分（６７Ｕ）を回収し、粗製グリセ
ロールキナーゼ（６７Ｕ、２５Ｕ／ｍｇ）を得た。 理化学的性質 （１）酵素作用および基質特異性：グリセロールに対す
る本酵素の酵素作用および基質特異性はフラボバクテリ
ウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４８６８）株と同じであった。 （２）Ｋｍ値：２．４ｘ１０^-2±０．５ｘ１０^-2ｍＭ
（グリセロールに対して）、５．０ｘ１０^-1±０．５ｘ
１０^-1ｍＭ（ＡＴＰに対して） （３）至適ｐＨ：７．５（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝
液）

【００３９】

【参考例２】シュードモナス・フルオレッセンス・ＩＦ
Ｏ−３９２５株を２．０％のグリセロール、２．０％の
酵母エキスからなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの
三角フラスコに１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した
後、２８℃、３０時間培養を行った。

【００４０】培養終了後、培養物を８０００ｒｐｍで遠
心し、菌体３０ｍｇを回収した。得られた菌体を１０ｍ
Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０ｍｌに懸濁
し、超音波破砕によって可溶化を行った。その後、可溶
化液を１６０００ｒｐｍで遠心し、不溶物を除去した上
清２９ｍｌ（１３０Ｕ）を得た。次いで、遠心上清を８
ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液に一夜、透析した
後、Ｑ−セファロース（２ｘ８ｃｍ）（ファルマシア社
製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は塩
化ナトリウムの０〜０．５Ｍのリニアグラジエントによ
り行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウム溶出画分
（１１４Ｕ）を回収し、粗製グリセロールキナーゼ（１
１４Ｕ、３０Ｕ／ｍｇ）を得た。 理化学的性質 （１）酵素作用および基質特異性：グリセロールに対す
る本酵素の酵素作用および基質特異性はフラボバクテリ
ウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４８６８）株と同じであった。 （２）Ｋｍ値：２．０ｘ１０^-2±０．５ｘ１０^-2ｍＭ
（グリセロールに対して）、２．４±０．５ｍＭ（ＡＴ
Ｐに対して） （３）至適ｐＨ：７．５（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝
液）

【００４１】

【参考例３】シュードモナス・プチダ・ＩＦＯ−１２６
５３株を２．０％のグリセロール、２．０％の酵母エキ
スからなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラ
スコに１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した後、２８
℃、３０時間培養を行った。培養終了後、培養物を８０
００ｒｐｍで遠心し、菌体３０ｍｇを回収した。得られ
た菌体を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
３０ｍｌに懸濁し、超音波破砕によって可溶化を行っ
た。その後、可溶化液を１６０００ｒｐｍで遠心し、不
溶物を除去した上清２９ｍｌ（１９０Ｕ）を得た。

【００４２】次いで、遠心上清を８ｌの１０ｍＭのトリ
ス−塩酸緩衝液に一夜、透析した後、Ｑ−セファロース
（２ｘ８ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマ
トグラフィーを行った。溶出は塩化ナトリウムの０〜
０．５Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜
０．３Ｍの塩化ナトリウム溶出画分（１１０Ｕ）を回収
し、粗製グリセロールキナーゼ（１１０Ｕ、３０Ｕ／ｍ
ｇ）を得た。 理化学的性質 （１）酵素作用および基質特異性：グリセロールに対す
る本酵素の酵素作用および基質特異性はフラボバクテリ
ウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４８６８）株と同じであった。 （２）Ｋｍ値：２．０ｘ１０^-2±０．５ｘ１０^-2ｍＭ
（グリセロールに対して）、２．０±０．５ｍＭ（ＡＴ
Ｐに対して） （３）至適ｐＨ：７．５（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝
液）

【００４３】

【発明の効果】本発明により、熱安定性の良いグリセロ
ールキナーゼおよびその微生物学的製造法を提供できる
ものであり、本酵素を用いるグリセライドやリパーゼ活
性などの測定のための有用かつ熱安定性の良い液状化試
薬を可能とする測定用酵素を提供できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明のグリセロールキナーゼの至適ｐ
Ｈ曲線を示す。

【図２】図２は本発明のグリセロールキナーゼのｐＨ安
定曲線を示す。

【図３】図３は本発明のグリセロールキナーゼの至適温
度曲線を示す。

【図４】図４は本発明のグリセロールキナーゼの熱安定
曲線を示す。

【図５】図５は本発明のグリセロールキナーゼおよびバ
チルス・ステアロサーモフィラス由来グリセロールキナ
ーゼの熱安定曲線を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ７０℃、１０分間の熱処理で８０％以上
   の活性を保持することを特徴とするグリセロールキナー
   ゼ。
2. 【請求項２】 グリセロキナーゼが安定化剤の非存在
   下、３７℃、２週間で８０％以上の活性を保持してなる
   請求項１記載のグリセロールキナーゼ。
3. 【請求項３】 フラボバクテリウム属に属するグリセロ
   ールキナーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物からグ
   リセロールキナーゼを採取することを特徴とするグリセ
   ロールキナーゼの製造法。
4. 【請求項４】 フラボバクテリウム属に属するグリセロ
   ールキナーゼ生産菌がフラボバクテリウム・メニンゴセ
   プティクムＧＫ−５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６８）株
   である請求項３記載のグリセロールキナーゼの製造法。