JPH088859B2 - シェードモナスkwi−56菌株 - Google Patents

シェードモナスkwi−56菌株

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JPH088859B2
JPH088859B2 JP62269985A JP26998587A JPH088859B2 JP H088859 B2 JPH088859 B2 JP H088859B2 JP 62269985 A JP62269985 A JP 62269985A JP 26998587 A JP26998587 A JP 26998587A JP H088859 B2 JPH088859 B2 JP H088859B2
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acid
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pseudomonas
agar
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太郎 飯泉
孝一 中村
哲朗 深瀬
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Kurita Water Industries Ltd
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Kurita Water Industries Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は耐熱性リパーゼを生産するシュードモナス属
の細菌に関するものである。
(従来技術) リパーゼはトリグリセリドを基質とし、脂肪酸とグリ
セリンに加水分解する酵素である。また、反応水中の水
分含量を減少させると脂肪酸とアルコールよりエステル
を合成する反応も知られている。
現在、リパーゼの工業的利用が盛んに試みられており
特に脂肪酸生産プロセスへのリパーゼの導入が期待され
ている。
すなわち、工業的に油脂を分解し、脂肪酸を生産させ
るプロセスは、現在、高温、高圧下での化学的加水分解
法によって行われている。しかし、酵素反応を導入する
事により、常温、常圧下で反応を進ませることができる
ため、化学的加水分解法では分解されることが多かった
不飽和脂肪酸も分解することなく得ることができるとと
もに大量のエネルギー消費を節約できる。また、酵素反
応の基質特異性を利用し、エステル交換反応を用いて、
価格の安価な油脂を原料とし、希少な油脂を改良するこ
とも可能である。
しかし、脂肪酸生産の主な原料である牛脂、豚脂は、
主に長鎖の飽和脂肪酸より構成されており、常温では固
体である。このために油脂を融点以上の温度で反応させ
るか、有機溶剤の添加により液状化したのち反応させな
ければならない。よって脂肪酸生産用に使用されるリパ
ーゼは、耐熱性を持ち、しかも高温下で最適反応性を持
つものかまたは、有機溶剤に対し耐性を持ち、その存在
下で反応を進められるものでなくてはならない。このよ
うなリパーゼの検索は盛んに行われてきたが、工業的レ
ベルでその需要に適した酵素は、現在まで得られていな
い。
耐熱性リパーゼという点においては、特にシュードモ
ナス属細菌がこれらのリパーゼを生産しうることが報告
されている。
すなわち、シュードモナス・メフィティカ・バリュタ
ス・リポリティカ(Pseudomonas mephitica Var.lipoly
tica)が生産する、作用最適温度70℃、60℃14時間の熱
処理においても失活をおこさないリパーゼ(特公昭50−
25553)、シュードモナス・フラジー(Pseudomonas fra
gi)が生産する、作用最適温度75〜80℃、70℃20分間の
熱処理によっても95%以上の活性を保持するリパーゼ
(Agric.Biol.Chem.第41巻、第1353〜1358頁、1977
年)、シュードモナス.フルオレセンス・バイオタイプ
I(Pseudomonas fluorescens)が生産する、作用最適
温度67℃、60℃20時間の熱処理によつても86.9%の活性
を保持するリパーゼ(特開昭57−58885)などの報告が
知られている。
(発明が解決しようとする問題点) しかし、上記の細菌が生産するリパーゼだけでは、リ
パーゼの種類数として不十分なため、各種の耐熱性リパ
ーゼを生産する他の細菌が数多く求められている。
(問題点を解決するための手段) 本発明者らは、耐熱性を持つリパーゼを生産する微生
物を広く自然界より探索した結果、神奈川県厚木市の土
壤より分離したシュードモナス属に属するKWI−56菌株
が、極めて高い耐熱性を持ち、70〜80℃に最適反応温度
を持つリパーゼを生産する事を見い出した。
本発明の菌株の菌学的性質を以下に示す。この菌学的
性質の検討には、「微生物の分類と同定」(長谷川武治
著、学会出版センター)、「医学細菌同定の手びき」
(S.T.Cowan著、坂崎利一訳、近代出版)、「新細菌培
地学講座」(坂崎利一著近代出版)に記載された方法、
培地組成を用いた。
a)形態 細胞の形及び大きさ:長さ2.2〜3.0ミクロン、幅0.5
〜0.7ミクロンの桿菌 細胞の双形性:単独または短連鎖 運動性:あり、1本の極鞭毛を持つ 胞子:なし グラム染色:陰性 抗酸性:なし b)生育状態 肉汁寒天平板培養:円形、とつ円状、表面は滑らかで
光沢がある。わずかに黄色を帯びた白色。
肉汁寒天斜面培養:糸状、生育は普通、表面は滑らか
で光沢がある。色素生成せず。わずかに黄色を帯びた白
色。
肉汁液体培養:生育は普通、混濁、色素生成せず。
肉汁ゼラチン穿刺培養:生育は普通、液化。
リトマスミルク:微アルカリ性、液化。
c)生理学的性質 硝酸塩の還元:陽性。
脱窒反応:陰性。
MRテスト:陰性。
VPテスト:陰性。
インドールの生成:陰性。
硫化水素の生成:わずかに陽性。
デンプンの加水分解:陰性。
クエン酸の利用:コーサーの培地;陽性。
クリステンセンの培地;陽性。
無機窒素源の利用:硝酸ナトリウムは利用しないが硫
酸アンモニウムは利用する。
色素の生成:シュードモナスFアガー、シュードモナ
スPアガー(ディフコ社製)、クリグラーの培地(指示
薬は含まず)、TSI寒天培地(指示薬は含まず)におい
て、色素の生成はみられない。
ウレアーゼ:陽性。
オキシダーゼ:陽性。
カタラーゼ:陽性。
生育の範囲 pH:4.5〜8.5で生育。5.5〜7.0で最適。
温度:15〜37℃で生育。10℃および40℃で生育はみられ
ない。33℃前後が最適。
酸素に対する態度:好気性 OFテスト:好気的に酸を生成。
糖類からの酸およびガスの生成の有無 Hugh−Leifson法による。
L−アラビノース,D−キシロース,D−グリコース,D−マ
ンノース,D−フラクトース,D−ガラクトース,麦芽糖シ
ョ糖、乳糖,トレハロース,D−ソルビット,D−マンニッ
ト,イノシット、グリセリンからガスは発生しないが酸
を生成する。デンプンからはガスも糖も生成しない。
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積:陽性。
プロトカテキン酸の分解:オルト型。
グリコン酸の酸化:陽性。
アルギニン脱炭酸:陰性。
リジン脱炭酸:陽性。
リパーゼの生産:陽性。
炭素化合物の利用:Stanierらの方法による。
グリコース,ガラクトース,ラクトース,アラビノー
ス,マルトース,ソルビトールL−スルオニン,L−アル
ギニン,L−アラニン,D−アラニン,アセトアミド,DL−
β−ヒドロキシ酪酸で生育するが、グリシン,イヌリ
ン,イタコン酸,メタコン酸では生育せず。
以上の菌学的性質からバージイのマニュアルロオブ.
ディタミネイテイブ.バクテリオロジー第8版(Berge
y's Manual of Determinative Bacteriolgy 8ed)およ
び、バージイのマニュアル.オブ.システマティック.
バクテリオロジー(Bergey's Manual of Systematic Ba
cteriology)に基づき検索した結果、シュードモナス.
セパシアにほぼ一致した。しかし、従来のシュードモナ
スセパシアは、40℃において生育可能であるが、本菌株
は37℃以下の温度下でなければ生育はできない。また、
従来のシュードモナス.セパシアは非螢光性の色素を生
産するにもかかわらず、本菌株では色素の生産を見るこ
とはできない。
さらに、既知の耐熱性リパーゼを生産するシュードモ
ナス属細菌、すなわち前記のシュードモナス.メフィテ
ィカ.バリエタス.リポリティカ,シュードモナス.フ
ラジー,シュードモナス・フルオレセンス.バイオタイ
プIと比較しても、少なくとも以下の菌学的性質に関し
て差異がみられる。
以上の知見より、本菌株はシュードモナス.セパシア
と極めて近い分類学的関係にありながらも新菌株である
と判断し、シュードモナス.KWI−56株と命名した。本菌
株は昭和62年10月15日に通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託した。微生物受託番号は、微工研条
寄第3178号(FERM BP−3178)である。
(作用及び効果) 本菌株を用いて耐熱性リパーゼを生産することができ
る。培養条件は次のとおりである。
まず培地組成であるが、本菌株はオリーブ油等の油脂
が培地中に存在する時にのみ誘導的にリパーゼを生産す
る。このため、炭素源としてはオリーブ油などの油脂を
用いるか、もしくはグリセリン、各種糖類などの本菌株
が資化しうる物質に、適当な量の油脂を添加させたもの
を使用すればよい。窒素源には、硫酸アンモニウム,肉
エキス,ポリペプトン,大豆粉などが利用できる。さら
に無機塩として、カリウム,ナトリウム,リン酸,マグ
ネシウム,カルシウムなどの各塩類を添加する必要があ
る。
以上述べた培地組成でpHを7.0に調整し、30℃におい
て、好気的に培養をおこなえば、培養開始後1日〜2日
間で培地中のリパーゼ生産量は最大となる。得られる培
養液は遠心分離によって菌体を除去した後、その上澄液
を酵素液として使用できる。また、上澄液を部分精製の
後に使用してもさしつかえない。すなわち、低温下にお
いて上澄液に、冷却したアセトンの最終濃度80%(V/
V)となるよう加え、その沈殿物を遠心分離などで回収
する。さらにこの沈殿物を適当な緩衝液で溶解し酵素液
として使用すればよい。
次に菌株が生産する耐熱性リパーゼの若干の性質を以
下に述べる。なお、リバーゼ活性の測定は山田一町田法
(日本農芸化学会誌、第36巻第860〜864頁、1962年)を
用いた。すなわち、2%オリーブ油,ポリビニルアルコ
ールエマルジョンを基質として、37℃において1分間に
1マイクロモルの脂肪酸を遊離せしめる酵素量を1単位
(以下Uと表示。)とした。
作用 トリグリセリドを基質として脂肪酸とグリセリンにま
で加水分解する。
作用最適温度 第1図に示す様に、作用最適温度は70℃〜80℃であ
る。
耐熱性 第2図は酵素液を各温度下で12時間熱処理したもので
ある。第3図は酵素液を60℃の温度下で各時間熱処理し
たものである。60℃24時間の熱処理で残存活性は85%以
上、74℃12時間の熱処理で28%の残存活性を示す。
次に実施例によって本発明を詳細に説明する。
(実施例) 肉エキス1%(W/W),ポリペプトン1%(W/W),塩
化ナトリウム0.5%(W/W),オリーブ油1%(W/W)よ
りなる液体培地を水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH7.
0に調節し、その50mlを500ml容の坂口フラスコに加え、
オートクレーブによって加圧滅菌した。この培地にシュ
ードモナスKWI−56株を植菌し、ロータリーシューカー
を用いて30℃、150回転毎分の条件下で50時間の振盪培
養をおこなった。培養終了後の培養液のリパーゼ活性は
34.8U/mlであった。さらに、この培養液から遠心分離に
よって菌体を除去しその上澄液を得た。上澄液のリパー
ゼ活性は30.8U/mlであった。
【図面の簡単な説明】
第1図はシュードモナスKWI−56株が生産するリパーゼ
の作用最適過度を示す図である。各温度条件で20分間の
活性測定反応をおこなった。第2図は同リパーゼの耐熱
性を示す図である。酵素液を各温度で12時間熱処理し、
残存活性を求めた。第3図も同リパーゼの耐熱性を示す
図である。酵素液を60℃の温度下で各時間熱処理し、残
存活性を求めた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:38)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】シュードモナス(Pseudomonas)属に属
    し、かつ下記の菌学的性質をするシュードモナスKWI−5
    6菌株。 a)形態 細胞の形及び大きさ:長さ2.2〜3.0ミクロン、幅0.
    5〜0.7ミクロンの桿菌 細胞の双形性:単独または短連鎖 運動性:あり、1本の極鞭毛を持つ 胞子:なし グラム染色:陰性 抗酸性:なし b)生育状態 肉汁寒天平板培養:円形、とつ円状、表面は滑らか
    で光沢がある。わずかに黄色を帯びた白色。 肉汁寒天斜面培養:糸状、生育は普通、表面は滑ら
    かで光沢がある。色素生成せず。わずかに黄色を帯びた
    白色。 肉汁液体培養:生育は普通。混濁、色素生成せず。 肉汁ゼラチン穿刺培養:生育は普通、液化。 リトマスミルク:微アルカリ性、液化。 c)生理学的性質 硝酸塩の還元:陽性。 脱窒反応:陰性。 MRテスト:陰性。 VPテスト:陰性。 インドールの生成:陰性。 硫化水素の生成:わずかに陽性。 デンプンの加水分解:陰性。 クエン酸の利用:コーサーの培地;陽性。 クリステンセンの培地;陽性。 無機窒素源の利用:硝酸ナトリウムは利用しないが
    硫酸アンモニウムは利用する。 色素の生成:シュードモナスFアガー、シュードモ
    ナスPアガー(ディフコ社製)、クリグラーの培地(指
    示薬は含まず)、TSI寒天培地(指示薬は含まず)にお
    いて、色素の生成はみられない。 ウレアーゼ:陽性。 オキシダーゼ:陽性。 カタラーゼ:陽性。 生育の範囲 pH:4.5〜8.5で生育。5.5〜7.0で最適。 温度:15〜37℃で生育。10℃および40℃で生育はみられ
    ない。33℃前後が最適。 酸素に対する態度:好気性。 OFテスト:好気的に酸を生成。 糖類からの酸およびガスの生成の有無 Hugh−Leifson法による。 L−アラビノース、D−キシロース、D−グリコース、
    D−マンノース、D−フラクトース、D−ガラクトー
    ス、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、D−ソルビ
    ット、D−マンニット、イノシット。グリセリンからガ
    スは発生しないが酸を生成する。デンプンからはガスも
    糖も生成しない。 ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積:陽性。 プロトカテキン酸の分解:オルト型。 グリコン酸の酸化:陽性。 アルギニン脱炭酸:陰性。 リジン脱炭酸:陽性。 リパーゼの生産:陽性。 炭素化合物の利用:Stanierらの方法による。 グリコース、ガラクトース、ラクトース、アラビノー
    ス、マルトース、ソルビトール、L−スレオニン、L−
    アルギニン、L−アラニン、D−アラニン、アセトアミ
    ド、DL−β−ヒドロキシ酪酸で生育するが、グリシン、
    イヌリン、イタコン酸、メタコン酸では生育せず。
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