JPH0441996B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はDNA断片及びその調製法に関する。 本発明のDNA断片は、ブレビバクテリウム属
の微生物の染色体DNAに由来しジアミノピメリ
ン酸脱炭酸酵素に対応する遺伝子をもつものであ
る。このものの分子量は2.0メガダルトンであり、
制限酵素Bclにより２個所以上切断されて少な
くとも1.15メガダルトンと0.65メガダルトンの断
片を生じ、制限酵素Cla、Hind及びSalに
よりそれぞれ１個所切断され、1.1メガダルトン
と0.9メガダルトンの断片、1.3メガダルトンと0.7
メガダルトンの断片、1.25メガダルトンと0.75メ
ガダルトンの断片をそれぞれ生じ、Bgl及び
Xbaにより切断されない。 このようなNDAは、ブレビバクテリウム属の
微生物の染色体DNAを制限酵素Pstで切断し、
得られたDNA断片をコリネホルム・グルタミン
酸生産菌を宿主として増殖しうるプラスミド中に
挿入し、得られた組換えプラスミドをジアミノピ
メリン酸脱炭酸酵素が欠損しているコリネホル
ム・グルタミン酸生産菌に導入してジアミノピメ
リン酸脱炭酸酵素活性を有するように形質転換さ
れた形質転換された形質転換菌を分離し、分離さ
れた形質転換株より組換えプラスミドを分離し、
ついで分離された組換えプラスミドを制限酵素
Pstで切断して生成した短断片のDNAを採取す
ることより得られる。 ブレビバクテリウム属の微生物としては具体的
には例えば以下のものがある。 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
ATCC13745 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826 ブレビバクテリウム・イマリオフイラム
ATCC14068 ブレビバクテリウム・ケトグルタミクム
ATCC15887 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サツカロリテイカム
ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC19240 これらのブレビバクテリウム属の微生物より染
色体DNAを抽出分離するには、例えば
Bacteriol、89、1065（1965）に記載されている方
法等の通常の方法で行うことができる。 染色体DNAは制限酵素Pstで切断されても本
酵素遺伝子は分断されないので、切断は十分に行
なつてよい。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌は、好気
性、グラム陽性桿菌であり、非抗酸性でバーヂー
ス・マニユアル・オブ・デターミネイテイブバク
テリオロジー第８版599頁（1974）に記載されて
いる。コリネホルム・グルタミン酸生産菌の野生
株の例としては前記ブレビバクテリウム属の微生
物のほかに次のようなものがあげられる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC1599 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032 13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ
ATCC17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC15354 コリネホルム・グルタミン酸生産菌にはグルタ
ミン酸生産性を失なつた変異株、あるいは、リジ
ン、アルギニン等のアミノ酸、イノシン等のプリ
ンヌクレオシド、イノシン５−モノりん酸等のプ
リンヌクレオチド、又はその他の生産物を生産す
る変異株も含まれる。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌を宿主とし
て増殖しうるプラスミドとしては、例えば以下の
ものがある。 (1) pAM330： (a) 分離源：ブレビバクテリウム・ラクトフエ
ニルメンタムATCC13869 (b) 分子量：3.0メガダルトン（アガロースゲ
ル電気泳動上の移動距離と電子顕微鏡観察下
でのDNA鎖長から計算した） (c) 制限酵素による切断箇所：第１表参照 (d) 制限酵素切断地図：第１図参照 【表】 【表】 (2) pAM286： (a) 分離源：コリネバクテリウム・グルタミカ
ムAJ11560（FERM−P5485） (b) 分子量：3.0メガダルトン（アガロースゲ
ル電気泳動上の移動距離と電子顕微鏡観察下
でのDNA鎖長から計算した） (c) 制限酵素による切断箇所：第２表参照 (d) 制限酵素切断地図：第２図参照 【表】 【表】 (3) pHM1519： (a) 分離源：コリネバクテリウム・グルタミカ
ムATCC13058 (b) 分子量：1.8メガダルトン (c) 制限酵素による切断箇所：第３表参照 (d) 制限酵素切断地図：第３図参照 【表】 (4) pAJ655： (a) 分子量：6.6メガダルトン (b) 制限酵素切断地図：第４図に示す。 (c) 製造法：pAJ655はpBR325とpAM330との
複合プラスミドである。その製造法は以下の
通りである。 (1) プラスミドpBR325はエシエリヒア・コ
リ内でアンピシリン、クロラムフエニコー
ル、テトラサイクリン耐性を発現する分子
量3.6メガダルトンのベクタープラスミド
である〔Boliver、F.Gene、４、121
（1978）〕。実験に使用したプラスミド
pBR325は（ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリー）（BRL）から購入した。 (2) プラスミドpAM330DNAは次の様にし
て調製した。 蒸留水１あたりペプトン10ｇ、粉末酵
母エキス10ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グル
コース５ｇを含むCMG培地（PH7.2）１
中に温度30℃でブレビバクテリウム・ラク
トフエニルメンタムATCC13869を対数増
殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得ら
れた菌体を、リゾチームとSDSにより溶菌
させる簡便法により溶菌せしめた後、
30000×ｇで30分間遠心分離し64mlの上澄
液中のプラスミドDNAは、上澄液にポリ
エチレングリコール（最終濃度10％）を添
加し沈降させた後、10mlのTEN緩衝液に
溶解した。 DNAをリボヌクレアーゼで処理した後
（リボヌクレアーゼ150μｇ／mlで37℃、30
分間反応）、フエノール抽出し、ついで２
倍量のエタノールを加え−20℃でDNAを
沈澱させ、沈澱を１mlのTEN緩衝液に溶
解した。このDNA溶液をアガロースゲル
電気泳動にかけ、ゲルから約74μｇの純粋
なプラスミドDNAを分離した。 (3) 複合プラスミドの作成、分離、同定 () プラスミドpBR325 0.2μｇに１ユニツト
の制限酵素BamH（BRLから購入）
を37℃で60分間反応させ、DNAを充分
分解した。 () プラスミドpAM330（1.2μｇ）に0.2
ユニツトの制限酵素MbOを37℃で15
分間反応させ、DNAを部分分解した。 () （）と（）で得たDNAを混合
し制限酵素を不活化するため65℃で10分
間熱処理した後、ATPとジチオスレイ
トール存在下22℃で２時間0.01ユニツト
のT4 DNA リガーゼを作用させた。 T4 DNA リガーゼを65℃、10分間
の処理で不活化し、２倍量のエタノール
を加えた後、15000ｇ 15分間の遠心分
離によりDNAを回収した。 このようにして得た複合プラスミドを
トランスフオーメイシヨン（）に使用
した。 () エツシエリヒア・コリＣ−600
（thr^-、leu^-、thiamine^-、r^-、m^-）
（Meselson、M.and Yuan、R.Nature、
217、1110（1968））を20mlのCMG培地に
30℃で対数増殖期中期まで培養し、菌体
を集めた。Kushner等（“Geneted
Eugineering”、p.17（1978）、Elsevier／
North Holland Biomedical Press）の
方法に従つて（）で得られたDNAを
用いてＣ−600を形質転換した。 形質転換株は20μｇ／mlのクロラムフ
エニコールを含むCMG培地で37℃、24
時間培養し選択した。形質転換株の中か
らAJ11882（FERM−BP136）を選択し、
次の実験に用いた。 複合プラスミドpAJ655は、次のよう
な方法によりAJ11882の溶菌液から分離
した。AJ11882をCMG培地で培養後、
簡便法（Tanaka et al.、J.Bacteriol.、
121、354（1975））により溶菌せしめ、溶
菌液をアガロースゲルにかけ、電気泳動
にかけた（Sharp et al.、Biochemistry
12、3055（1973））。 プラスミドの制限酵素切断地図を第４
図に示した。プラスミドはpBR325と
pAM330のフラグメントから成ること
を、K.J.Dannaの方法（Methods in
Enzymology 65、449、Academic
Press（1980））により確認した。 pAJ655は、以下に示すようにブレビ
バクテリウム・ラクトフエルメンタム内
で複製し、pAJ655上のpBR322に由来す
る抗生物質耐性マーカーが発現しうるも
のである。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメ
ンタムATCC13869を親株とする三重栄
養要求（リジン、メチオニン、スレオニ
ン）突然変異株ブレビバクテリウム・ラ
クトフエルメンタムNo.64をDNA受容菌
として実験に用いた。 プロストプラストの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフエニル
メンタムNo.64（ATCC39134）を５mlの
CMG培地で対数増殖期の初期まで培養
し、ペニシリンG.0.6ユニツト／mlを添
加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心
分離により菌体を集め、菌体を0.5Mシ
ユークロース、20ｍＭマレイン酸、20ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、3.5％ペナツセイ
ブロス（Difco）からなるSMMP培地
（PH6.5）0.5mlで洗浄した。次で10mg／
mlのリゾチームを含むSMMP培地に懸
濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図
つた。6000ｇ10分間遠心分離後、プロト
プラストをSMMPで洗浄し0.5mlの
SMMPに再度懸濁した。トランスフオ
ーメーシヨン、形質転換体の選択、プラ
スミドの同定 得られたプロトプラストを、実施例１
で調製したpAJ655 DNA 2μｇと混合
し、ポリエチレングリコールを最終濃度
が30％になるように添加した後、DNA
をプロトプラストに取り込ませるために
室温に２分間放置した。細胞をSMMP
培地１mlで洗浄後、DNAを取り込んだ
プロトプラストをSMMP培地１ml中に
再懸濁し、薬剤耐性を発現させるため
に、30℃で３時間培養した。この培養液
をPH7.0のプロトプラスト再生培地上に
塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸
留水１あたりトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン12ｇ、KCl0.5ｇ、グ
ルコース10ｇ、MgCl₂・6H₂O8.1ｇ、
CaCl₂・2H₂O2.2ｇ、ペプトン４ｇ、粉
末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸（Difco
社）１ｇ、K₂HPO₄0.2ｇ、コハク酸ナ
トリウム135ｇ、寒天18ｇ及びクロラム
フエニコール5μｇ／mlを含む。 30℃で３〜10日間培養後に出現したコ
ロニー中の５株を選びこれらを20μｇ／
mlのクロラムフエニコールを含むCMG
培地で培養し、薬剤（クロラムフエニコ
ール）耐性株であることを確認した。 さらにプラスミドの存在を確認するた
め、ここで生育したクロラムフエニコー
ル耐性株を溶菌せしめ、溶菌液を実施例
１と同様の方法によりアガロースゲル電
気泳動にかけ、PAJ655と同じ分子量と
制限酵素切断地図を持つプラスミドを認
めた。 (5) pAJ611： pAJ611はpBR325とpAM286から構成された
複合プラスミドであり、その製造法、性質は以
下に示すとおりである。 (1) pBR325は、pAJ655の場合と同じものを使
用した。 (2) pAM286は、コリネバクテリウム・グルタ
ミクム）AJ11560（FERM−P5485）から新
しく分離された分子量3.0メガダルトンのプ
ラスミドでその制限酵素地図は、第２図に示
してある。pAJ655の場合と同様の方法によ
り約20μｇのpAM286が単離された。 (3) 複合プラスミドpAJ611の造成、単離およ
び同定は、pAM330のかわりにpAM286を使
用したこと以外は、すべてpAJ655の場合の
方法に従つた。 分子量が6.6メガダルトンの、第５図に示
すような制限酵素地図をもつ複合プラスミド
pAJ611は、エシエリヒア・コリＣ−600を宿
主として、pAJ655の場合と同様の手法で選
別された。pAJ611のDNAの単離は、エシエ
リヒア・コリAJ11884株（FERM−BP138）
（pAJ611を含む株）よりpAJ655の場合の方
法によつて行つた。 以下に、プラスミドpAJ611がコリネバク
テリウム・グルタミカム中で複製し、
pBR325由来の抗生物質耐性マーカーを発現
するものであることを示す。 コリネバクテリウム・グルタミカム
ATCC13060を受容菌株として使用し、エシ
エリヒア・コリAJ11884から抽出した
pAJ611 DNAを用いてpAJ655について示し
た通りにプロトプラストトランスフオーメイ
シヨンを行なつた。 SR−8201（ATCC39135）と名付けた形質
転換株は、CMG培地中でクロラムフエニコ
ール耐性を示し、かつその保有するプラスミ
ドの分子量と制限酵素切断地図からこのプラ
スミドがpAJ611と同一のものといえること
が判明した。 (6) pAJ440： pAJ440はpUB110とpAM330から構成される
複合プラスミドであり、その性質及び製造法は
以下のとおりである。 (1) pUB110は、スタヒロコツカスオーレウス
由来の分子量3.0メガダルトンのプラスミド
であり、バチルス・ズブチリスの中で増殖
し、カナマイシン耐性を示す。〔Keggins、
Ｋ、Ｍ、Lovett、Ｐ、Ｓ、and Duval、E.
J.、Proc、Natl、Acad、Sci.、75、1423
（1978）〕、pUB110は、Bethesda Research
Laboratory（BRL）から購入し、複合プラス
ミドのマーカーとして使用した。 (2) 複合プラスミドの造成、単離そして同定。 () pUB110（0.2μｇ）は制限酵素Bam Ｈ
（BRL製）１ユニツトを使用して37
℃60分で完全に切断した。 () pAM330（1.2μｇ）は制限酵素Mboを
0.2ユニツト使用して37℃15分部で分的に
切断した。 () 酵素的に切断された両DNAを混合し、
実施例１の方法で結合させた。結合させた
DNAは0.8％のアガロースゲルを使用し
て、トリス−酢酸バツフアー中で5V／cm、
２時間電気泳動にかけた。pUB110よりも
泳動度の低いDNA画分をゲルから抽出し、
フエノール処理し、エタノールで沈澱させ
単離した。 () バチルス・ズブチリスPM125（arg^-、
leu^-、r^-、m^-）〔Vozumi、T.et.al.、
Molec.Gen.Genet、152、65（1975）〕は、
（）で得られたDNA混合物を用いて
Dabnauらの方法〔Dabnau、D.、et al.、
J.Mol.Biol.、56、209（1971）〕で形質転換
を行なつた。形質転換株は、カナマイシン
5μｇ／ml入りのCMG寒天プレート上に37
℃にて24時間培養して生育してくるものと
して、選択された。 カナマイシン5μｇ／mlのCMG寒天プレ
ート上に生育したトランスフオーマントの
うち20個を選び、それらの菌体中のプラス
ミドの存在を調べた。明瞭なプラスミドの
バンドが検出された菌の一つをKS440と命
名しATCC39139として寄託した。KS440
中に含まれるプラスミドは、pAJ440と命
名した。pAJ440をゲルから抽出し、いく
つかの制限酵素で切断した。分子量が6.0
メガダルトンであり、また第７図に示す様
な制限エンドヌクレアーゼ地図が得られた
ことから、pAJ440はpUB110とpAM330か
ら構成されている複合プラスミドである。 pAJ440は、以下に示すようにブレビバ
クテリウム・ラクトフアーメンタム中で増
殖し、またpAJ440上のpUB110由来の抗
生物質耐性マーカーが発現し得るものであ
る。 宿主として、Brevibacterium lactofer
−mentumNo.64を使用した。pAJ440によ
るNo.64株のプロトプラスト形質転換法は実
施例２に記載されている方法で行なつた。
ただし、今回は、1μｇのpAJ440を形質転
換に使用し、プロトプラストの再生培地に
は、形質転換株を選択する為に、100μ
ｇ／mlのカナマイシンを添加した。３〜10
日で生育してきた形質転換株のうち２株を
20μｇ／mlのカナマイシンが入つている
CMG培地で培養し、プラスミドを調べる
ために、前述の手法により溶菌せしめ、そ
の溶菌液をアガロースゲル電気泳動にかけ
た。プラスミドの分子量とその制限酵素切
断地図は、実施例４のpAJ440と同じであ
つた。 (7) pAJ1844： pAJ1844は、pBR325とpHM1519から構成さ
れる複合プラスミドであり、その性質、製造法
は以下のとおりである。 (1) pHM1519はコリネバクテリウム・グルタ
ミクムATCC13058から新しく分離された分
子量1.8メガダルトンのプラスミドでその制
限酵素切断地図は、第３図に示してある。
pAM330と同様の方法により約24μｇの
pHM1519が単離された。 (2) 複合プラスミドpAJ1844の造成、分離およ
び同定。 () 0.2μｇのpBR325は実施例１の方法で
切断した。 () 1.0μｇのpHM1519は制限酵素Bgl
（Boehringer Manheim GmbH製）５ユ
ニツトを使用して37℃60分で切断した。 () 形質転換株は、pAJ655の場合に示し
た方法に従いエシエリヒア・コリＣ−600
に複合プラスミドを導入することにより得
た。pAJ1844と命名された複合プラスミド
は、形質転換株のうちの一株、エシエリヒ
ア・コリAJ11883（FERM−BP137）から
分離された。pAJ1844の分子量は5.4メガ
ダルトンで、その制限酵素切断地図は第６
図に示した。 複合プラスミドpAJ1844は、以下に示す
ようにコリネバクテリウム・グルタミクム
中で増殖し、pAJ1844上のpBR325由来の
抗生物質耐性マーカーが発現しうるもので
ある。 受容菌として、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムATCC13032を用いた。プロト
プラスト形質転換法に従い、エシエリヒ
ア・コリAJ11833株から得られたpAJ1844
をコリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032に導入することができた。さ
らにこの形質転換株の中のプラスミドはエ
シエリヒア・コリAJ11883由来のpAJ1844
と同じプラスミドであることが確認され
た。SR8202（ATCC39136）は、pAJ1844
を保持しているコリネバクテリウム・グル
タミクムの代表的な形質転換株である。 (8) pAJ3148： pAJ3148はpUB110及びpHM1519より造成さ
れた複合プラスミドであり、その製造及び性質
は以下に示すとおりである。 (1) pUB110はBamHで切断した。 (2) pHM1519はBglで切断した。 (3) (1)及び(2)で得られた切断されたDNAを混
合し連結した。連結したDNAは電気泳動に
かけた。pUB110モノマーよりも大分子量の
DNAを採取し、バチルス・ズブチリス
RM125に導入した。pUB110よりも大分子量
のプラスミドを、トランスホーマントNo.1129
中で確認した。このプラスミドpAJ3148は、
分子量6.6メガダルトンで、その切断地図を、
第８図に示す。第８図に示すように、本プラ
スミドは、１分子のpUB110と、２分子の
pHM1519より成る。 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032をDNA受容菌として使用し、プ
ロトプラスト形質転換法を用い、バチルス・
ズプチリスNo.1129より得られた
pAJ3148DNAを、ATCC13032に導入するこ
とができた（SR8203 ATCC39137）。
pAJ3148は複製し、かつカナマイシン耐性を
発現した。分子量及び制限酵素切断地図は
pAJ3148と同じであつた。 前記DNA断片を上記コリネホルム・グル
タミン酸生産菌を宿主として増殖しうるプラ
スミド中に挿入する方法は、プラスミドを
Pstで切断し、切断点において両者を接続
せしめればよい。Pstによる切断反応は、
37℃、10分間〜１時間行う。 ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素を欠損して
いるコリネホルム・グルタミン酸生産菌を得
る方法は、例えば、紫外線やニトロソグアニ
ジンで変更処理した細胞を完全培地に接種し
てコロニーを形成せしめ、これらをリジンを
除去した培地（最少培地でも可）ヘレプリ
カ、生育のみられないコロニーとして採取で
きる。検定は、最少培地におけるリジンの要
求性や該酵素活性の検出不能（野生株と比較
して）ということで行いうる。 ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素欠損株とし
て具体的には、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン
及びＬ−メチオニン要求性のブレビバクテリ
ウム・ラクトフアーメンタムNo.64、
ATCC39134がある。 前記組換えプラスミドを上記ジアミノピメ
リン酸脱炭酸酵素株に導入するには、エシエ
リヒア・コリＫ−12について報告されている
様に（Mandel、M.and Higa、A.、J.Mol.
BIOL.、53、159（1979））受容菌細胞を塩化
カルシウムで処理してDNAの透過性を増す
方法、またはバチルス・ズブチリスについて
報告されている様に（Duncan、C.H.、
Wilson、G.A.and Young、F.E.、Gene、
１、153（1977））細胞がDNAを取り込み得る
様になる増殖段階（いわゆるコンビテントセ
ル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類およ
び酵母について知られている様に（Chang、
S.and Choen、S.N.、Molec.Gen.Genet.、
168、111（1979）Bibb、M.J.、Ward、J.M.
and Hopwood、O.A.、Nature、274、398
（1978）；Hinnen、A.、Hicks、J.B.and
Fink、G.R.、Proc.Natl.Acad.USK、75、
1929（1978））、DNA受容菌を、プラスミド
DNAを容易に取り込むプロトプラストまた
はスフエロプラストにしてプラスミドを
DNA受容菌に導入することも可能である。 形質転換株よりジアミノピメリン酸脱炭酸
酵素が挿入されている組換えプラスミドを有
する菌株を選択するには例えばベクタープラ
スミドが有している表現形質とジアミノピメ
リン酸脱炭酸酵素活性とを有している菌株を
選別すればよい。 選別された形質転換株よりジアミノピメリ
ン酸脱炭酸酵素に対応するDNA断片が挿入
されている組換えプラスミドを抽出分離する
には、採取した菌体をリゾチームおよびSDS
にて溶菌し、その遠心上清をとり、アガロー
スゲル電気泳動により低分子DNAバンドと
して分離し、これを切り出して抽出する方法
のほか、遠心上清を、セシウム・クロライ
ド、エチジウム・ブロマイド密度勾配遠心法
などを用いて分離すればよい。 得られた組換えプラスミドよりジアミノピ
メリン酸脱炭酸酵素に対応するDNA断片を
得る方法は、Pst切断を行い、ベクターブ
パルスミドのPst切断DNAを対照実験区と
してアガロースゲル電気泳動を行い、ベクタ
ープラスミドの切断DNAとは異なつた大き
さのDNAバンドを切り出し、抽出する。 得られたジアミノピメリン酸脱炭酸酵素に
対応するDNA断片は、コリネホルム・グル
タミン酸生産菌を宿主として増殖しうるプラ
スミド中に挿入し、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に導入すれば、ジアミノピメリン
酸よりＬ−リジンの生産活性が著しく高めら
れる。 またＬ−リジン生産能が高い菌株、例えば
Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン等のＬ
−リジンアンタゴニストに耐性を有する菌株
に上記組換えプラスミドを導入したときに
は、グルコース等の炭水化物からのＬ−リジ
ン生産能が大巾に改善されると期待できる。 実施例 １ (1) ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素の遺伝子をも
つた染色体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869を１のCMG培地（ペプトン１
ｇ／dl、酵母エキス１ｇ／dl、グルコース0.5
ｇ／dl及びNaCl0.5ｇ／dlを含み、PH7.2に調製
したもの）に植菌し、30℃で約３時間振盪培養
を行い、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体
よりフエノール法（通常法）によつて染色体
DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを
得た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとして、pAJ655（分子量6.6×10⁶ダ
ルトン）のDNAを次の様にして調製した。ま
ず、pAJ655をプラスミドとして保有するブレ
ビバクテリウム・ラクトフアーメンタムNo.64
（ATCC39134）を100mlのCMG培地に接種し、
30℃で対数後期まで培養したのち、リゾチー
ム・SDS処理によつて溶菌させ、30000×ｇ、
30分の超遠心により上清を得た。これよりプラ
スミドDNAを濃縮後、アガロースゲル電気泳
動により、染色体DNAと分離・抽出して、最
終的に80μｇのpAJ655プラスミドDNAを採取
した。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNAと(2)で得たプラスミド
DNAをそれぞれ10μｇとり、制限エンドヌク
レアーゼPstでそれぞれを37℃、１時間処理
し、完全に切断した。65℃10分の熱処理後、両
反応液を混合し、ATP及びジチオスレイトー
ル存在下、T₄フアージ由来のDNAリガーゼに
よつて10℃、24時間DNA鎖の連結反応を作つ
た。65℃５分の熱処理後、反応液に２倍容のエ
タノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈
澱採取した。 (4) ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子
（LysAと略称）のクローニング 三重要求性（lys^-、thr^-、met^-）を持つブレ
ビバクテリウム・ラクトフアーメンタムNo.64
（ATCC39134）は、ジアミノピメリン酸脱炭酸
酵素が欠損している株であり（表１）、LysA遺
伝子のクローニング実験に、この菌株を受容菌
として使用した。形質転換の方法としては、プ
ロトプラストトランスフオーメーシヨン法を用
いた。まず、菌株を５mlのCMG液体培地で対
数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを
0.6ユニツト／ml添加後、さらに1.5時間振盪培
養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を
0.5Mシユークロース、20ｍＭマレイン酸、20
ｍＭ塩化マグネシウム、3.5％ペナツセイブロ
ス（Difco）からなるSMMP培地（PH6.5）0.5
mlで洗浄した。次いで10mg／mlのリゾチームを
含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時間プロト
プラスト化を図つた。 6000×ｇ、10分間遠心分離後、プロトプラス
トをSMMPで洗浄し、0.5mlのSMMPに再度懸
濁した。この様にして得られたプロトプラスト
と(3)で調製したDNA5μｇを５ｍＭ EDTA存
在下で混合し、ポリエチレングリコールを最終
濃度が30％になる様に添加した後、DNAをプ
ロトプラストに取り込ませる為に室温に２分間
放置した。このプロトプラストをSMMP培地
１mlで洗浄後、SMMP培地１mlに再懸濁し、
形質発現の為、30℃で２時間培養した。この培
養液をPH7.0のプロトプラスト再生培地上に塗
布した。プロトプラスト再生培地は蒸留水１
あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン12ｇ、KCl0.5ｇ、グルコース10ｇ、
MgCl₂・6H₂O8.1ｇ、CaCl₂・2H₂O2.2ｇ、ペ
プトン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸
（Difco社）１ｇ、K₂HPO₄0.2ｇ、コハク酸ナ
トリウム135ｇ、寒天８ｇ及びクロラムフエニ
コール3μｇ／mlを含む。 30℃で２週間培養後、2000個のクロラムフエ
ニコール耐性のコロニーが生育してきたので、
リジン用バイオアツセイ培地40％、寒天濃度
1.8％のMM培地にレプリカした。２日培養後、
１株だけ生育してきたので、その菌株をクロラ
ムフエニコール（10μｇ／ml）入りのリジン用
バイオアツセイ培地で培養し、クロラムフエニ
コール耐性でかつリジン要求性が回復している
ことを確認した。AJ12031（FERM−BP 277）
と命名。 (5) 形質転換株のプラスミド解析 AJ12031（FERM−BP277）より、(2)の方法
に従つてプラスミドを調製し３mgのプラスミド
DNAを得た。このプラスミドDNA1μｇを制限
酵素Pstで切断し、アガロース電気泳動にか
けたところ、pAJ655プラスミド（6.6Md）と
LysAを含んでいると思われる1.8Mdのフラグ
メントを検出した。 (6) 再トランスフオーメーシヨン (5)で検出された1.8Mdのフラグメントを含む
複合プラスミドpA65501にLysA遺伝子が存在
することを確認する為に、このプラスミド
pAJ65501をブレビバクテリウム・ラクトフア
ーメンタムNo.64（ATCC39134）株に再度、形質
転換を試みた。(4)の方法に従い形質転換を行つ
たところ、プレート１枚に30個のコロニーが生
育してきたので、それらをクロラムフエニコー
ル10μｇ／ml入りのリジン用バイオアツセイ培
地にレプリカしたところ、30℃２日間培養で30
コロニーすべてが生育してきた。またその菌体
中には、形質転換に用いたプラスミドDNAと
同じ大きさのDNAが検出された。このことか
ら、たしかにLysA遺伝子がこのプラスミド上
に存在していると結論できる。 (7) 形質転換株のジアミノピメリン酸脱炭酸酵素
活性の回復 受容菌No.64（ATCC39134）と形質転換株
FERM−BP277そして野生株ATCC13869をそ
れぞれCMG培地で一晩培養後、菌体を超音波
破砕器で破砕し、粗酵素液を得た。 この粗酵素液を10％、基質のジアミノピメリン
酸を１mg／ml、リン酸バツフアーを0.25Mとした
反応液を作成し、37℃、3hr静置反応せしめた。 反応終了後、酵素反応液中のジアミノピメリン
酸とリジンを液体クロマトグラフイーで定量し、
ジアミノピメリン酸からリジンへの転換で酵素活
性を表示した（表１）。 【表】 表１の実験の結果、No.64株の粗酵素液では、ジ
アミノピメリン酸からリジンへの転換はほとんど
みられず、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素が欠如
していることが明らかである。そのNo.64株にプラ
スミドpAJ65501を導入した形質転換株No.6401
（FERM−BP277）では野生株の約２倍の速度で
ジアミノピメリン酸からリジンへの転換がおこな
われた。したがつてプラスミドpAJ65501の導入
によりジアミノピメリン酸脱炭酸酵素欠失変異株
のジアミノピメリン酸脱炭酸酵素活性が回復し、
転換速度は２倍に改善されたわけである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pAM330の制限酵素切断地図を示
す。第２図は、pAM286の制限酵素切断地図を示
す。第３図は、pHM1519の制限酵素切断地図を
示す。第４図は、複合プラスミドpAJ655の制限
酵素切断地図を示す。第５図は、複合プラスミド
pAJ611の制限酵素切断地図を示す。第６図は、
複合プラスミドpAJ1844の制限酵素切断地図を示
す。第７図は、複合プラスミドpAJ440の制限酵
素切断地図を示す。記号は以下の制限酵素を示
す。 Ａ：Ava、Bc：Bcl、Bg：Bgl、Ｅ：
EcoR、：Hind、：Hind、Ｘ：Xba
。 第８図は、複合プラスミドpAJ3148の制限酵素
切断地図を示す。記号は以下の制限酵素を示す。 Bc：Bcl、Bg：Bal、Ｅ：EcoR、Ｈ：
Hae、：Hind、：Hind、Ｘ：Xba
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ブレビバクテリウム属の微生物の染色体
   DNAに由来しジアミノピメリン酸脱炭酸酵素
   （4.1.1.20 meso−２，６−diamino pimelate
   carboxy−lyase）に対応する遺伝子をもつDNA
   断片であつて、以下に示す制限酵素切断点を有す
   るもの。 すなわち、両端がPstにより切断され、制限
   酵素BClIによる切断点が２個所以上であつて切
   断により少なくとも1.15メガダルトンと0.65メガ
   ダルトンの断片を生じ、制限酵素Calによる切
   断点が１個所であつて切断により1.1メガダルト
   ンと0.9メガダルトンの断片を生じ、制限酵素
   Hindによる切断点が１個所であつて切断によ
   り1.3メガダルトンと0.7メガダルトンの断片を生
   じ、制限酵素SIaによる切断点が１個所であつ
   て切断により1.25メガダルトンと0.75メガダルト
   ンの断片を生じ、制限酵素Bgl及びXbaによ
   る切断点がなく、かつ分子量が2.0メガダルトン
   であるもの。 ２ コリネホルム・グルタミン酸生産菌を宿主と
   して増殖しうるプラスミドであつて、ブレビバク
   テリウム属の微生物の染色体DNAに由来しジア
   ミノピメリン酸脱炭酸酵素（4.1.1.20 meso−２，
   ６−diamino pimelate carboxy−lyase）に対応
   する遺伝子をもつDNA断片を有するもの。ただ
   し、該DNA断片は、以下に示す制限酵素切断点
   を有するものとする。 すなわち、両端がPstにより切断され、制限
   酵素Bclによる切断点が２個所以上であつて切
   断により少なくとも1.15メガダルトンと0.65メガ
   ダルトンの断片を生じ、制限酵素Claによる切
   断点が１個所であつて切断により1.1メガダルト
   ンと0.9メガダルトンの断片を生じ、制限酵素
   Hindによる切断点が１個所であつて切断によ
   り1.3メガダルトンと0.7メガダルトンの断片を生
   じ、制限酵素Salによる切断点が１個所であつ
   て切断により1.25メガダルトンと0.75メガダルト
   ンの断片を生じ、制限酵素Bal及びXbaによ
   る切断点がなく、かつ分子量が2.0メガダルトン
   であるもの。 ３ ブレビバクテリウム属の微生物の染色体
   DNAを制限酵素Pstで切断し、得られたDNA
   断片をコリネホルム・グルタミン酸生産菌を宿主
   として増殖しうるプラスミド中に挿入し、得られ
   た組換えプラスミドをジアミノピメリン酸脱炭酸
   酵素（4.1.1.20 meso−２，６−diamino pime−
   late carboxy−lyase）が欠損しているコリネホ
   ルム・グルタミン酸生産菌に導入してジアミノピ
   メリン酸脱炭酸酵素活性を有するように形質転換
   された形質転換菌を分離し、分離された形質転換
   菌より組換えプラスミドを分離し、ついで分離さ
   れた組換えプラスミドを制限酵素Pstで切断し
   て生成した短断片のDNAを採取することよりな
   る、ブレビバクテリウム属の微生物の染色体
   DNAに由来しジアミノピメリン酸脱炭酸酵素
   （4.1.1.20 meso−２，６−diamino pimelate
   carboxy−lyase）に対応する遺伝子をもつDNA
   断片の調製法。ただし、該DNA断片は以下に示
   す制限酵素切断点を有する。 すなわち、両端がPstにより切断され、制限
   酵素Bclによる切断点が２個所以上であつて切
   断により少なくとも1.15メガダルトンと0.65メガ
   ダルトンの断片を生じ、制限酵素Claによる切
   断点が１個所であつて切断により1.1メガダルト
   ンと0.9メガダルトンの断片を生じ、制限酵素
   Hindによる切断点が１個所であつて切断によ
   り1.3メガダルトンと0.7メガダルトンの断片を生
   じ、制限酵素Salによる切断点が１個所であつ
   て切断により1.25メガダルトンと0.75メガダルト
   ンの断片を生じ、制限酵素Bgl及びXbaによ
   る切断点がなく、かつ分子量が2.0メガダルトン
   である。