JPH0476678B2 - - Google Patents
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- JPH0476678B2 JPH0476678B2 JP60221592A JP22159285A JPH0476678B2 JP H0476678 B2 JPH0476678 B2 JP H0476678B2 JP 60221592 A JP60221592 A JP 60221592A JP 22159285 A JP22159285 A JP 22159285A JP H0476678 B2 JPH0476678 B2 JP H0476678B2
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- tryptophan
- plasmid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
産業上の利用分野
この発明は、組換えDNAを有するコリネ型細
菌に関する。 従来の技術 Ｌ−トリプトフアンは、アントラニル酸がアン
トラニル酸ホスホリボシルトランスフエラーゼ、
Ｎ−（5′−ホスホリボシル）アントラニル酸イソ
メラーゼ、インドール３−グリセロールリン酸シ
ンターゼ、トリプトフアンシンターゼの順に各酵
素の作用を受け、生産される。 以下、Ｎ−（5′−ホスホリボシル）アントラニ
ル酸イソメラーゼをPRAI、インドール３−グリ
セロールリン酸シンターゼをInGPと記す。 一方、組換えDNA法を用いて、コリネ型細菌
におけるＬ−トリプトフアン生産菌を育種するこ
とは、特開昭59−156292で報告されているが、
PRAI−InGPをコードする遺伝子（以下、PRAI
−InGP遺伝子と記す）が組込まれたものではな
い。 発明が解決しようとする問題点 この発明は、Ｌ−トリプトフアンの生産性がよ
り高い微生物を得ること、及びそれによつてＬ−
トリプトフアンのより効率のよい製造法を見い出
すことにある。 問題点を解決するための手段 本発明者等は、叙上の問題点を解決するため研
究の結果、コリネ型細菌細胞内で発現し、PRAI
−InGPをコードする遺伝子がコリネ型細菌細胞
内で増殖しうるプラスミドベクターに接続されて
いる組換えDNAを有するコリネ型細菌を分離す
ることに成功し、得られたコリネ型細菌がＬ−ト
リプトフアンの高い生産性を有することを見い出
した。 即ち本願発明は、コリネホルム・グルタミン酸
生産菌に属するDNA供与菌より得られ、Ｎ−（５
−ホスホリボシル）アンスラニル酸イソメラーゼ
−インドール−３−グリセロールリン酸合成酵素
をコードするDNA断片が、コリネホルム・グル
タミン酸生産菌の菌体内で自律複製できるベクタ
ープラスミドに接続されて、コリネホルム・グル
タミン酸生産菌に属しｍ−フルオロフエニルアラ
ニン及び５−フルオロトリプトフアンに耐性を示
すDNA受容菌に導入されて得られるＬ−トリプ
トフアン生産能を有する微生物を培養し、培養液
中に蓄積されたＬ−トリプトフアンを採取するこ
とを特徴とするＬ−トリプトフアンの製造法であ
る。 本発明にいうコリネ型細菌（Coryneform
bactria）は、バージース・マニユアル・オブ・
デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bargeys Manual of Determinative
Bacteriology）第８版599頁（1974）に定義され
ている一群の微生物であり、好気性、グラム陽
性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であ
る。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述
べるようなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本
発明においては、最も好ましいものである。 コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性株の例
としては次のようなものがあげられる。
菌に関する。 従来の技術 Ｌ−トリプトフアンは、アントラニル酸がアン
トラニル酸ホスホリボシルトランスフエラーゼ、
Ｎ−（5′−ホスホリボシル）アントラニル酸イソ
メラーゼ、インドール３−グリセロールリン酸シ
ンターゼ、トリプトフアンシンターゼの順に各酵
素の作用を受け、生産される。 以下、Ｎ−（5′−ホスホリボシル）アントラニ
ル酸イソメラーゼをPRAI、インドール３−グリ
セロールリン酸シンターゼをInGPと記す。 一方、組換えDNA法を用いて、コリネ型細菌
におけるＬ−トリプトフアン生産菌を育種するこ
とは、特開昭59−156292で報告されているが、
PRAI−InGPをコードする遺伝子（以下、PRAI
−InGP遺伝子と記す）が組込まれたものではな
い。 発明が解決しようとする問題点 この発明は、Ｌ−トリプトフアンの生産性がよ
り高い微生物を得ること、及びそれによつてＬ−
トリプトフアンのより効率のよい製造法を見い出
すことにある。 問題点を解決するための手段 本発明者等は、叙上の問題点を解決するため研
究の結果、コリネ型細菌細胞内で発現し、PRAI
−InGPをコードする遺伝子がコリネ型細菌細胞
内で増殖しうるプラスミドベクターに接続されて
いる組換えDNAを有するコリネ型細菌を分離す
ることに成功し、得られたコリネ型細菌がＬ−ト
リプトフアンの高い生産性を有することを見い出
した。 即ち本願発明は、コリネホルム・グルタミン酸
生産菌に属するDNA供与菌より得られ、Ｎ−（５
−ホスホリボシル）アンスラニル酸イソメラーゼ
−インドール−３−グリセロールリン酸合成酵素
をコードするDNA断片が、コリネホルム・グル
タミン酸生産菌の菌体内で自律複製できるベクタ
ープラスミドに接続されて、コリネホルム・グル
タミン酸生産菌に属しｍ−フルオロフエニルアラ
ニン及び５−フルオロトリプトフアンに耐性を示
すDNA受容菌に導入されて得られるＬ−トリプ
トフアン生産能を有する微生物を培養し、培養液
中に蓄積されたＬ−トリプトフアンを採取するこ
とを特徴とするＬ−トリプトフアンの製造法であ
る。 本発明にいうコリネ型細菌（Coryneform
bactria）は、バージース・マニユアル・オブ・
デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bargeys Manual of Determinative
Bacteriology）第８版599頁（1974）に定義され
ている一群の微生物であり、好気性、グラム陽
性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であ
る。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述
べるようなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本
発明においては、最も好ましいものである。 コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性株の例
としては次のようなものがあげられる。
【表】
本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌には
上記のようなグルタミン酸生産性を有する野性株
のほかにグルタミン酸生産性を有するまたはグル
タミン酸生産性を失つた変異株も含まれる。 PRAI−InGP遺伝子を単離する方法は、コリ
ネ型細菌のPRAI−InGP遺伝子を有している株
より、まず染色体遺伝子を抽出し（例えばH.
Saito and K.Miura Biochem.Biphys.Acta72，
619，（1963）の方法が使用できる。）、これを適当
な制限酵素で切断する。ついで、コリネ型細菌細
胞内で増殖し得るプラスミドベクターに接続し、
得られた組換えDNAを用いてコリネ型細菌の
PRAI−InGP遺伝子の欠損変異株を形質転換せ
しめ、PRAI−InGP生成活性を保育するにいた
つた菌株を単離し、これよりPRAI−InGP各遺
伝子を分離できる。 染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間
等を調節して切断の程度を調節すれば、巾広い種
類の制限酵素が使用できる。 本発明にて使用されるプラスミドベクターは、
コリネ型細菌細胞内において増殖し得るものであ
ればどのようなものでも良い。具体的に例示すれ
ば、以下のものがあげられる。 (1) pAM 330 特開昭58−67699参照 (2) pAM 1519 特開昭58−77895参照 (3) pAJ 655 特開昭58−192900参照 (4) pAJ 611 同上 (5) pAJ 1844 同上 (6) pCG １ 特開昭57−134500参照 (7) pCG ２ 特開昭58−35197参照 (8) pCG ４ 特開昭57−183799参照 (9) pCG 11 同上 プラスミドベクターDNAの開裂は、当該DNA
を一箇所で切断する制限酵素を用いて切断する
か、複数部位を切断する制限酵素を用いて部分的
に切断することにより行う。 ベクターDNAは染色体遺伝子を切断した際に、
用いられた制限酵素により切断され、または染色
体DNA切断フラグメント及び切断されたベクタ
ーDNAのそれぞれの両端に相補的な塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを接続せしめて、つい
でプラスミドベクターと染色体DNAフラグメン
トとのライゲーシヨン反応に付される。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの組換えDNAをコリネ型細菌
に属する受容菌へ導入するには、エシエリヒア・
コリＫ−12について報告されている様な
（Mandel.M.and Higa.A.，J.Mol.，Biol.，53，
159（1970））受容細菌胞を塩化カルシウムで処理
してDNAの透過性を増す方法、またはバチル
ス・ズブチリスについて報告されている様に
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.
E.，Gene.１，153（1977））細胞がDNAを取り込
み得る様になる増殖段階（いわゆるコンピテント
セル）に導入する方法により可能である。あるい
は、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母
について知られている様に（Chang，Ｓ，and
Choen，Ｓ，N.，Molec.Gen.，Genet.，168，
111（1979）；Bibb，M.j，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A.，Nature，274，398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R，
Proc.Natl.Acad.Sei.USA，75，1929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエロプラストにして
プラスミドをDNA受容菌に導入することも可能
である。 プロトプラスト法では上記のパチルス・ズブチ
リスにおいて使用されている方法でも充分高い頻
度を得ることができるし、特開昭57−183799に記
載されたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属のプロトプラストにポリエチレングリ
コールまたはポリビニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にDNAをとり込ませる方法も当
然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールの代りに、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、フイコール、ブルロ
ニツクF68（セルバ社）などの添加によつてDNA
のとり込みを促進させる方法でも同等の結果が得
られる。 Ｌ−トリプトフアン生産菌として、PRAI−
InGP欠損株を宿主として形質転換した株を用い
ることができるが、以下に示すような宿主を用い
ればよりＬ−トリプトフアンの生産性が高い菌株
が得られることがある。 即ち、ブレビバクテリウム属のフエニルアラニ
ン、チロシンを要求し、５−メチルトリプトフア
ンに耐性を有する変異株（I.Shiio，H.Sato，M.
Nakagawa.，Agric.Biol.Ctem.36，2315
（1972））、ブレビバクテリウム属のフエニルアラ
ニンを要求し、ｍ−フルオロフエニルアラニン、
５−フルオロトリプトフアンに耐性を有する変異
株（I.Shiio，S.Sugimoto，M.Nakagawa.，
Agrie.Biol.Chem.，39，627（1975））、ブレビバク
テリウム属のチロシンを要求し、５−フルオロト
リプトフアン、アザセリンに耐性を有する変異
株、コリネバクテリウム属のフエニルアラニン、
チロシンを要求し、５−メチルトリプトフアン、
４−メチルトリプトフアン、６−フルオロトリプ
トフアン、トリプトフアンヒドロキサメート、ｐ
−フルオロフエニルアラニン、チロシンヒドロキ
サメート、フエニルアラニンヒドロキサメートに
耐性を有する変異株（H.Hagino，K.
Nakayama.，Agric.Biol.Chem.，39，345
（1975））等がある。最も好ましいものは、コリネ
ホルム・グルタミン酸生産菌に属しｍ−フルオロ
フエニルアラニン及び５−フルオロトリプトフア
ンに耐性を示す微生物である。 このようにして得られたＬ−トリプトフアン生
産能を有するコリネ型細菌を培養してＬ−トリプ
トフアンを生成蓄積せしめる方法は、従来コリネ
型細菌によるＬ−トリプトフアンの製造のために
使用されていた方法と特に大きく違う点はない。
即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオ
ン、更に必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有
機微量栄養素を含有する通常のものである。炭素
源としては、グルコース、シユクロース、ラクト
ース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホ
エイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、ア
ンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩そ
の他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−トリプトフアンの生産
蓄積が停止するまで行なわれる。 実施例 (1) PRAI−InGP遺伝子を含む染色体DNAの調
製 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12036（FERM−P7559）を１のCMG培地
（ペプトン１ｇ/dl、酵母エキス１ｇ/dl、グル
コース0.5ｇ/dl、及びNaCl0.5ｇ/dlを含み、PH
7.2に調整したもの）に植菌し、30℃で約３時
間振盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集め
た。 この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたの
ち、通常のフエノール処理法により、染色体
DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを
得た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（分子量5.4メガダル
トン）を用い、そのDNAを次の様にして調製
した。 まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12037（FERM−P7234）を100mlのCMG培
地に接種し、30℃で対数増殖期後期まで培養し
たのち、リゾチームSDS処理により溶菌させ、
30000×ｇ、30分の超遠心により上清を得た。
フエノール処理ののち、２容のエタノールを加
えてDNAを沈澱回収した。これを少量のTEN
緩衝液（20mMトリス塩酸塩、20mM NaCl，
1mM EDTA（PH8.0）に溶解後、アガロースゲ
ル電気泳動にかけ分離後、切り出してpAJ1844
プラスミドDNA約15μｇを得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇと(2)で得たプラ
スミドDNA5μｇとを制限エンドヌクレアーゼ
PstIでそれぞれ37℃に１時間保持し、切断し
た。65℃に10分間加熱した後、両反応液を混合
し、ATP及びジチオスレイトール存在下、T4
フアージ由来のDNAリガーゼによつて10℃に
24時間保持しDNA鎖を連結せしめた。ついで
反応液を、65℃にて５分間加熱し、反応液に２
倍容のエタノールを加えて連結されたDNAの
沈澱を採取した。 (4) コロニーバンクの作成 アントラニル酸シンターゼが欠損したブレビ
バクテリウム・ラクトフアーメンタムAS60（ブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12036を親株として、Ｎ−メチル−Ｎ−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジンにより変異処理す
ることにより、アントラニル酸を生育に要求す
る変異株として選択した。）を受容菌として用
いた。 形質転換の方法としては、プロトプラストト
ランスフオーメーシヨン法を用いた。まず、菌
株を５mlのCMG液体培地で対数増殖期の初期
まで培養し、ペニシリンＧを0.6ユニツト／ml
添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離
により菌体を集め、菌体を0.5Mシユークロー
ス、20mMマレイン酸、20mM塩化マグネシウ
ム、3.5％ペナツセイブロス（Difco）からなる
SMMP培地（PH6.5）0.5mlで洗浄した。次いで
10mg/mlのリゾチームを含むSMMP培地に懸濁
し30℃で20時間プロトプラスト化を図つた。
6000×ｇ、10分間遠心分離後、プロトプラスト
をSMMPで洗浄し0.5mlのSMMPに再度懸濁し
た。この様にして得られたプロトプラストと(3)
で調製したDNA10μｇを5mMEDTA存在下で
混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が
30％になる様に添加した後、DNAをプロトプ
ラストに取り込ませるため室温に２分間放置し
た。このプロトプラストをSMMP培地１mlで
洗浄後、SMMP培地１mlに再懸濁し、形質発
現のため、30℃で２時間培養した。この培養液
をPH7.0のプロトプラスト再生培地上に塗布し
た。プロトプラスト再生培地は蒸留水１あた
りトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン12
ｇ、KCl0.5ｇ、グルコース10ｇ、MgCl2・
6H2O8.1ｇ、CaCl2・2H2O2.2ｇ、ペプトン４
ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸（Difco
社）１ｇ、K2HPO40.2ｇ、コハク酸ナトリウ
ム135ｇ、寒天８ｇ及びクロラムフエニコール
3μｇ／mlを含む。 30℃で２週間培養後、50000個のクロラムフ
エニコール耐性コロニーが出現してきたのでこ
れを全てかきあつめ、コロニーバンクを作成し
た。 (5) トリプトフアン生合成系遺伝子が増幅された
クローンの選択 コロニーバンクを適当に希釈したもの（約
103〜104／ml）とアンピシリン耐性のプラスミ
ドpUC8（Messing，J.，Gene19，259（1982））
を有する大腸菌の生育にトリプトフアンを要求
する変異株を最少培地（２％グルコース、１％
硫酸アンモニウム、0.3％尿素、0.1％リン酸二
水素カリウム、0.04％硫酸マグネシウム７水
塩、2ppm鉄イオン、2ppmマンガンイオン、
200μｇ／サイアミン塩酸塩、50μｇ／ビオ
チン、10μｇ／mlクロラムフエニコール、100μ
ｇ／mlアンピシリン、３％カザミノ酸（Difco
社製）、100mg／アントラニル酸、PH7.0、寒
天1.8％）上に塗布した。 トリプトフアン生合成系遺伝子が増幅され、
トリプトフアンが蓄積するようになつた形質転
換株の周辺には、トリプトフアン要求性の大腸
菌が増殖する。すると大腸菌が保持しているプ
ラスミドpUC8にコードされるβ−ラクタマー
ゼにより培地中のアンピシリンが分解され、形
質転換株はさらに増殖し、コロニーを作る。一
方、トリプトフアンを蓄積しない形質転換株
は、その周辺に大腸菌を増殖させない。したが
つてアンピシリンが分解されないので、増殖で
きず、コロニーを形成しない。このような考え
をもとに大腸菌とコロニーバンクを適当に希釈
したものとを混合して最少培地に塗布し、30℃
にて40日間培養した。周囲に大腸菌が増殖して
いるコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、
(2)で用いた方法によりプラスミドを分離した。
本プラスミドをpAJ234と名付けた。pAJ234は
明らかにベクタープラスミドpAJ1844よりも大
きく、トリプトフアン生合成系遺伝子が挿入さ
れていると考えられた。 (6) pAJ234が有するトリプトフアン生合成系遺
伝子の同定 (6)−１ アンスラニル酸ホスホリボシルトラン
スフエラーゼ（PRT）遺伝子、及び及びトリ
プトフアン合成酵素（TS）遺伝子の同定 PRT遺伝子、TSAサブユニツト遺伝子（以
下TSA遺伝子と記す）、TSBサブユニツト遺伝
子（以下TSB遺伝子と記す）が欠損した各菌
株ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
T13（NRRLB−1534T）、ブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムNo.21、ブレビバクテ
リウム・ラクトフアーメンタムB5、pAJ234を
(4)で述べた方法を用いて形質転換した。30℃に
て１週間再生培地にて培養後生じたクロラムフ
エニコール耐性コロニーのうちそれぞれ10個を
釣り上げトリプトフアン要求性をテストしたと
ころ、これらはいずれも要求性を消失してお
り、上記組換えプラスミド上にPRT遺伝子、
TSA遺伝子、TSB遺伝子が存在することが明
らかになつた。 (6)−２ PRAI−InGP遺伝子の同定 大腸菌trpC欠損株CGSCNo.5889（trpC60.pyrF
287，hisG１，IacZ53，rpsL８，λ-）に
pAJ234を導入した。DNA受容菌細胞を塩化カ
ルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法
を用いてpAJ234を形質転換し、生じたクロラ
ムフエニルコール耐生コロニーのうちそれぞれ
10個を釣り上げトリプトフアン要求性を調べ
た。いずれもが要求性を消失しており、上記組
換えプラスミド上にPRAI−InGP遺伝子が存
在することが明らかとなつた。 (7) PRAI−InGP遺伝子のサブクローニング pAJ234を組換えに用いた制限酵素PstIで切
断すると2.1kb，2.0kb，1.75kb，1.2kb，
0.8kb，0.5kbの６種の挿入PstI断片が検出され
た。このうち2.0kbのPstI断片を分画し、
pAJ1844のPstIサイトに連結し、ブレビバクテ
リウムラクトフアーメンタムT13，B5，No.21
及びE.coliCGSCNo.5889（trpC）を形質転換し
た。その結果、2.0kbのPstI断片を有する組換
プラスミドはT13の要求性を消失させたが、No.
21，B5，及びE.coliCGSCNo.5889の要求性は消
失させなかつた。次にこの2.0kbのPst断片を
Bglで切断し1.6kbのPst−Bgl断片をPst
，BamHIで切断したpAJ224に連結し、T13
を形質転換したところ、その要求性は消失し
た。従つてPRT遺伝子は1.6kbのPst−Bgl
断片上に存在すると考えられる。 次に2.1kb.のPst断片をpAJ1844のPstサ
イトに連結しブレビバクテリウムラクトフアー
メンタムB5に形質転換したところクロラムフ
エニコールを含む再生培地上に生じたコロニー
はいずれもトリプトフアン要求性を消失してい
た。代表的なコロニーからプラスミドを調製
し、再度B5及びブレビバクテリウムラクトフ
アーメンタムT13，No.21，E.coliCGSCNo.5889
（trpC）を形質転換した。その結果B5の要求性
は消失したが、T13，No.21及びE.coliの要求性
は消失しなかつた。 従つて2.1kb.のPst断片上にTSB遺伝子が
存在すると考えられる。さらに分画した2.0kb
と2.1kbのPst断片とPstで切断した
pAJ1844を(3)の方法により連結し、E.
coliCGSCNo.5889の要求性を消失させる組換え
プラスミドを得た。本プラスミドは2.0kbと
2.1kbのPst断片を有しており、T13，B5に
形質転換したところいずれの要求性をも消失さ
せた。 次にPRAI−InGP遺伝子のサブクローニン
グを行なうため、2.0kb，2.1kbのPst断片を
有する組換えプラスミドから第１図に示した約
2kb.のSst−EcoRI断片を分画しSstI，EcoRI
で切断したpUC19（Messing，J.，et al.，
Gene，33 103−119，1985）に連結し、lacプ
ロモーターからの転写が可能になるように配置
した。或いは第１図の約2.6kbのSst−Hind
断片を分画しSst，Hindで切断した
pUC18（Messing，J.，et Al.，Gene，33，103
−119（1985））に連結しlacプロモーターからの
転写が可能になるように配置し、E.coliCGSC
No.5889を形質転換した。その結果、Sst−
EcoRI断片、或いはSst−Hind断片を有す
る組換えプラスミドは、E.coliの要求性を消失
させた。 以上の結果からPRT遺伝子、PRAI−InGP
遺伝子、TSB遺伝子は2.0kb，2.1kbのPst断
片上に第１図に示す位置に存在していると考え
られる。 尚PRT遺伝子のサブクローニングの際用い
たプラスミドpAJ224は以下の様にして造成し
た。 pAJ224はトリメトプリム耐性を有するベク
タープラスミドpAJ228から造成した。pAJ228
の造成は以下の通りである。 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12036より変異誘導されたトリメトプリム耐
性変異株AJ12146（FERM−P7672）から(1)で
述べた方法により染色体DNAを調製した。一
方、プラスミドベクターpAM330を保有するブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869から(2)で述べた方法により
pAM330を調製した。 次に、染色体DNA20μｇとpAM330 10μｇと
を制限エンドヌクレアーゼMboでそれぞれ
を37℃、30分間処理し、部分切断した。65℃、
10分の熱処理後、両反応液を混合し、ATP及
びジチオスレイトール存在下、T4フアージ由
来のDNAリガーゼによつて10℃、24時間DNA
鎖の連結反応を行つた。65℃、５分の熱処理
後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結
反応終了後のDNAを沈澱採取した。 DNAの沈澱を適当量TENバツフアーに溶解
後、トリメトプリム感受性のAJ12036を受容菌
として、形質転換に用いた。 形質転換の方法としては、(4)で述べた方法を
用いた。トリメトプリム（Sigma社）25μｇ／
mlを含む再生培地にて、30℃で１週間培養後、
約100個のコロニーが出現してきたので、これ
をトリメトプリム50μｇ／mlを含む最小培地に
レプリカし、トリメトプリム耐性１株を得た。 この株の有するプラスミドDNAを検出した
ところ、ベクターのpAM330よりも明らかに大
きなプラスミドが検出された。 このプラスミドをpAJ228と名付け、再度
AJ12036を形質転換した。 生じたトリメトプリム耐性を有するコロニー
のうちそれぞれ10個を釣り上げアガロース・ゲ
ル電気泳動法によりプラスミドDNAを検出し
たところ、これらのいずれにもpAJ228と同じ
大きさのプラスミドが存在していた。上記組換
えプラスミド上にトリメトプリム耐性を表現す
る遺伝子が存在することが明らかとなつた。 pAJ228からpAJ224の造成は第２図に示した
通りである。 pAJ211より制限酵素PstIによる部分切断で
切り出した2.9kbのDNA断片の両端にBamHI，
SalI，PstIの切断部位をもつた第１図に示した
ような合成オリゴヌクレオチドリンカーをT4
フアージ由来のDNAリガーゼを用いて連結さ
せた後、制限酵素BamHIで切断した。得られ
たDNA混合物をアガロース・ゲル電気泳動に
かけ、約2.9kbのDNA断片を分離抽出し、エタ
ノール沈澱によりDNA断片を回収した。こう
して得られたDNA断片は2.9kbのHK遺伝子を
含むDNAの両端にPatI，SalI，BamHIの切断
部位が並んだ構造になつている。 pAJ211はpAJ1844のPatIサイトに2.9kbの
HK（ホモセリンキナーゼ）遺伝子を有する
PatI断片が挿入されたものでAJ12079（FERM
−P7237）として寄託されている。 一方、pAJ228は制限酵素MboIで部分切断し
た後65℃、10分の熱処理をした。この反応液に
前述の方法で得たHK遺伝子を含むDNA断片
を加え、T4DNAリガーゼでDNA鎖の連結反
応を行つた。反応後、65℃、５分の熱処理を
し、２倍容のエタノールの添加により沈澱採取
されるDNAを、(4)と同様の方法によりトリメ
トプリム感受性で、かつ、HK遺伝子が欠損し
たブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12078を受容菌としてプロトプラストランフ
オーメーシヨンを行つた後、トリメトプリム
100μｇ／mlを含むプロトプラスト再生培地で
培養した結果約200個の再生コロニーが出現し
てきた。 これをトリメトプリムを200μｇ／mlを含み
受容菌の要求物質であるスレオニンを含まない
最少培地にレプリカし、トリメトプリム耐性
で、かつスレオニン要求性が消失した菌株４株
を得た。これらの株より(2)に示した方法により
溶菌液を調製し、アガロース・ゲル電気泳動に
よりプラスミドDNAを検出したところ14.9kb，
12.2kb，9.6kb，6.5kbのプラスミドが検出され
た。このうち最も分子量の小さい6.5kbのプラ
スミドをpAJ212と名付けた。pAJ212を保持す
る株を12078−HK株と名付けた。 pAJ212は、PstIで切断することによりHK遺
伝子を除いて、pAJ224として、ブレビバクテ
リウム・ラクトフアーメンタムAJ12196
（FERM−P8015）として寄託されている。 (8) PRAI−InGP遺伝子のブレビバクテリウム
内で複製可能なベクターへの移し変え (8)−１ pAJ82の造成 pAJ43（特開昭58−192900）5μｇに0.25ユニ
ツトの制限酵素HPaを37℃、５分間反応さ
せた。一方pUB110（Gryczan，T.J.etal J.
Bacteriol.，134，318（1978））5μｇに５ユニツ
トのHpaを37℃、120分間反応させた。両者
を混合後、(3)の方法により連結し、AJ12036に
(4)の方法を用いて形質転換した。 クロラムフエニコール3μｇ／ml、カナマイ
シン100μｇ／mlを含む再生培地上に生じたコ
ロニーを分離した。代表株からプラスミドを分
離し、再度AJ12036を形質転換したところ、再
生培地上に生じたコロニーはいずれもがカナマ
イシン耐性でかつクロラムフエニコール耐性を
示した。本プラスミドをpAJ82と名付けた。そ
の制限酵素切断地図を第３図に示した。 (8)−２ PRAI−InGP遺伝子のpAJ82への移し
変えPRAI−InGP遺伝子を有するSstI−EcoR
断片とpUC19から成る組換えプラスミドを
EcoRで切断し、pAJ82のクロムフエコール
耐性遺伝子内に位置するEcoRサイトに連結
した後、ｍ−フルオロフエニルアラニン及び５
−フルオロトリプトフアン耐性株ブレビバクテ
リウムラクトフアーメンタムM247へ(4)で述べ
た方法により形質転換した。この菌株を
AJ12258（FERM、Ｐ−8470）とした。 カナマイシン100μｇ／mlを含む再生培地上
に生じたコロニーの中からクロラムフエニコー
ル感受性となつた株を分離し、プラスミドを抽
出した。このプラスミドをpAJ235と名付けた
（第４図）。pAJ235を制限酵素EcoR，Hind
，PstI，Bgl等で切断し約2.0kbのPRAI−
InGP遺伝子を有するDNA断片が挿入されてい
ることを確認した。 (9) 形質転換株のトリプトフアン生産能 (8)−２で得た形質転換株AJ12258（FERM Ｐ
−8470のトリプトフアン生産能を調べたところ
第１表に示す結果を得た。 培養はトリプトフアン生産培地（グルコース
130ｇ、（NH4）2SO425ｇ、フマル酸12ｇ、酢酸
３ml、KH2PO41ｇ、MnSO4・4H2O10mg、
MgSO4・7H2O1ｇ、ｄ−ビチオン50μｇ、サイ
アミン塩酸塩200μｇ、メチオニン400mg、チロ
シン650mg、大豆蛋白酸加水分解液「味液」50
ml、CaCO350gを水１に含む、PH6.5。）20ml
を500mlの坂口フラスコに入れたものに被検菌
株を植えつけ、30℃にて72時間、振盪下に行な
つた。培養後、遠心上清中のＬ−トリプトフア
ンをロイコノストツク・メセントロイデス
（Leuconostoc mesenteroides）ATCC8042を
定量菌株として用いるバイオアツセイ法によつ
て求めた。
上記のようなグルタミン酸生産性を有する野性株
のほかにグルタミン酸生産性を有するまたはグル
タミン酸生産性を失つた変異株も含まれる。 PRAI−InGP遺伝子を単離する方法は、コリ
ネ型細菌のPRAI−InGP遺伝子を有している株
より、まず染色体遺伝子を抽出し（例えばH.
Saito and K.Miura Biochem.Biphys.Acta72，
619，（1963）の方法が使用できる。）、これを適当
な制限酵素で切断する。ついで、コリネ型細菌細
胞内で増殖し得るプラスミドベクターに接続し、
得られた組換えDNAを用いてコリネ型細菌の
PRAI−InGP遺伝子の欠損変異株を形質転換せ
しめ、PRAI−InGP生成活性を保育するにいた
つた菌株を単離し、これよりPRAI−InGP各遺
伝子を分離できる。 染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間
等を調節して切断の程度を調節すれば、巾広い種
類の制限酵素が使用できる。 本発明にて使用されるプラスミドベクターは、
コリネ型細菌細胞内において増殖し得るものであ
ればどのようなものでも良い。具体的に例示すれ
ば、以下のものがあげられる。 (1) pAM 330 特開昭58−67699参照 (2) pAM 1519 特開昭58−77895参照 (3) pAJ 655 特開昭58−192900参照 (4) pAJ 611 同上 (5) pAJ 1844 同上 (6) pCG １ 特開昭57−134500参照 (7) pCG ２ 特開昭58−35197参照 (8) pCG ４ 特開昭57−183799参照 (9) pCG 11 同上 プラスミドベクターDNAの開裂は、当該DNA
を一箇所で切断する制限酵素を用いて切断する
か、複数部位を切断する制限酵素を用いて部分的
に切断することにより行う。 ベクターDNAは染色体遺伝子を切断した際に、
用いられた制限酵素により切断され、または染色
体DNA切断フラグメント及び切断されたベクタ
ーDNAのそれぞれの両端に相補的な塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを接続せしめて、つい
でプラスミドベクターと染色体DNAフラグメン
トとのライゲーシヨン反応に付される。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの組換えDNAをコリネ型細菌
に属する受容菌へ導入するには、エシエリヒア・
コリＫ−12について報告されている様な
（Mandel.M.and Higa.A.，J.Mol.，Biol.，53，
159（1970））受容細菌胞を塩化カルシウムで処理
してDNAの透過性を増す方法、またはバチル
ス・ズブチリスについて報告されている様に
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.
E.，Gene.１，153（1977））細胞がDNAを取り込
み得る様になる増殖段階（いわゆるコンピテント
セル）に導入する方法により可能である。あるい
は、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母
について知られている様に（Chang，Ｓ，and
Choen，Ｓ，N.，Molec.Gen.，Genet.，168，
111（1979）；Bibb，M.j，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A.，Nature，274，398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R，
Proc.Natl.Acad.Sei.USA，75，1929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエロプラストにして
プラスミドをDNA受容菌に導入することも可能
である。 プロトプラスト法では上記のパチルス・ズブチ
リスにおいて使用されている方法でも充分高い頻
度を得ることができるし、特開昭57−183799に記
載されたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属のプロトプラストにポリエチレングリ
コールまたはポリビニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にDNAをとり込ませる方法も当
然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールの代りに、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、フイコール、ブルロ
ニツクF68（セルバ社）などの添加によつてDNA
のとり込みを促進させる方法でも同等の結果が得
られる。 Ｌ−トリプトフアン生産菌として、PRAI−
InGP欠損株を宿主として形質転換した株を用い
ることができるが、以下に示すような宿主を用い
ればよりＬ−トリプトフアンの生産性が高い菌株
が得られることがある。 即ち、ブレビバクテリウム属のフエニルアラニ
ン、チロシンを要求し、５−メチルトリプトフア
ンに耐性を有する変異株（I.Shiio，H.Sato，M.
Nakagawa.，Agric.Biol.Ctem.36，2315
（1972））、ブレビバクテリウム属のフエニルアラ
ニンを要求し、ｍ−フルオロフエニルアラニン、
５−フルオロトリプトフアンに耐性を有する変異
株（I.Shiio，S.Sugimoto，M.Nakagawa.，
Agrie.Biol.Chem.，39，627（1975））、ブレビバク
テリウム属のチロシンを要求し、５−フルオロト
リプトフアン、アザセリンに耐性を有する変異
株、コリネバクテリウム属のフエニルアラニン、
チロシンを要求し、５−メチルトリプトフアン、
４−メチルトリプトフアン、６−フルオロトリプ
トフアン、トリプトフアンヒドロキサメート、ｐ
−フルオロフエニルアラニン、チロシンヒドロキ
サメート、フエニルアラニンヒドロキサメートに
耐性を有する変異株（H.Hagino，K.
Nakayama.，Agric.Biol.Chem.，39，345
（1975））等がある。最も好ましいものは、コリネ
ホルム・グルタミン酸生産菌に属しｍ−フルオロ
フエニルアラニン及び５−フルオロトリプトフア
ンに耐性を示す微生物である。 このようにして得られたＬ−トリプトフアン生
産能を有するコリネ型細菌を培養してＬ−トリプ
トフアンを生成蓄積せしめる方法は、従来コリネ
型細菌によるＬ−トリプトフアンの製造のために
使用されていた方法と特に大きく違う点はない。
即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオ
ン、更に必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有
機微量栄養素を含有する通常のものである。炭素
源としては、グルコース、シユクロース、ラクト
ース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホ
エイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、ア
ンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩そ
の他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−トリプトフアンの生産
蓄積が停止するまで行なわれる。 実施例 (1) PRAI−InGP遺伝子を含む染色体DNAの調
製 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12036（FERM−P7559）を１のCMG培地
（ペプトン１ｇ/dl、酵母エキス１ｇ/dl、グル
コース0.5ｇ/dl、及びNaCl0.5ｇ/dlを含み、PH
7.2に調整したもの）に植菌し、30℃で約３時
間振盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集め
た。 この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたの
ち、通常のフエノール処理法により、染色体
DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを
得た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（分子量5.4メガダル
トン）を用い、そのDNAを次の様にして調製
した。 まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12037（FERM−P7234）を100mlのCMG培
地に接種し、30℃で対数増殖期後期まで培養し
たのち、リゾチームSDS処理により溶菌させ、
30000×ｇ、30分の超遠心により上清を得た。
フエノール処理ののち、２容のエタノールを加
えてDNAを沈澱回収した。これを少量のTEN
緩衝液（20mMトリス塩酸塩、20mM NaCl，
1mM EDTA（PH8.0）に溶解後、アガロースゲ
ル電気泳動にかけ分離後、切り出してpAJ1844
プラスミドDNA約15μｇを得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇと(2)で得たプラ
スミドDNA5μｇとを制限エンドヌクレアーゼ
PstIでそれぞれ37℃に１時間保持し、切断し
た。65℃に10分間加熱した後、両反応液を混合
し、ATP及びジチオスレイトール存在下、T4
フアージ由来のDNAリガーゼによつて10℃に
24時間保持しDNA鎖を連結せしめた。ついで
反応液を、65℃にて５分間加熱し、反応液に２
倍容のエタノールを加えて連結されたDNAの
沈澱を採取した。 (4) コロニーバンクの作成 アントラニル酸シンターゼが欠損したブレビ
バクテリウム・ラクトフアーメンタムAS60（ブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12036を親株として、Ｎ−メチル−Ｎ−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジンにより変異処理す
ることにより、アントラニル酸を生育に要求す
る変異株として選択した。）を受容菌として用
いた。 形質転換の方法としては、プロトプラストト
ランスフオーメーシヨン法を用いた。まず、菌
株を５mlのCMG液体培地で対数増殖期の初期
まで培養し、ペニシリンＧを0.6ユニツト／ml
添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離
により菌体を集め、菌体を0.5Mシユークロー
ス、20mMマレイン酸、20mM塩化マグネシウ
ム、3.5％ペナツセイブロス（Difco）からなる
SMMP培地（PH6.5）0.5mlで洗浄した。次いで
10mg/mlのリゾチームを含むSMMP培地に懸濁
し30℃で20時間プロトプラスト化を図つた。
6000×ｇ、10分間遠心分離後、プロトプラスト
をSMMPで洗浄し0.5mlのSMMPに再度懸濁し
た。この様にして得られたプロトプラストと(3)
で調製したDNA10μｇを5mMEDTA存在下で
混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が
30％になる様に添加した後、DNAをプロトプ
ラストに取り込ませるため室温に２分間放置し
た。このプロトプラストをSMMP培地１mlで
洗浄後、SMMP培地１mlに再懸濁し、形質発
現のため、30℃で２時間培養した。この培養液
をPH7.0のプロトプラスト再生培地上に塗布し
た。プロトプラスト再生培地は蒸留水１あた
りトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン12
ｇ、KCl0.5ｇ、グルコース10ｇ、MgCl2・
6H2O8.1ｇ、CaCl2・2H2O2.2ｇ、ペプトン４
ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸（Difco
社）１ｇ、K2HPO40.2ｇ、コハク酸ナトリウ
ム135ｇ、寒天８ｇ及びクロラムフエニコール
3μｇ／mlを含む。 30℃で２週間培養後、50000個のクロラムフ
エニコール耐性コロニーが出現してきたのでこ
れを全てかきあつめ、コロニーバンクを作成し
た。 (5) トリプトフアン生合成系遺伝子が増幅された
クローンの選択 コロニーバンクを適当に希釈したもの（約
103〜104／ml）とアンピシリン耐性のプラスミ
ドpUC8（Messing，J.，Gene19，259（1982））
を有する大腸菌の生育にトリプトフアンを要求
する変異株を最少培地（２％グルコース、１％
硫酸アンモニウム、0.3％尿素、0.1％リン酸二
水素カリウム、0.04％硫酸マグネシウム７水
塩、2ppm鉄イオン、2ppmマンガンイオン、
200μｇ／サイアミン塩酸塩、50μｇ／ビオ
チン、10μｇ／mlクロラムフエニコール、100μ
ｇ／mlアンピシリン、３％カザミノ酸（Difco
社製）、100mg／アントラニル酸、PH7.0、寒
天1.8％）上に塗布した。 トリプトフアン生合成系遺伝子が増幅され、
トリプトフアンが蓄積するようになつた形質転
換株の周辺には、トリプトフアン要求性の大腸
菌が増殖する。すると大腸菌が保持しているプ
ラスミドpUC8にコードされるβ−ラクタマー
ゼにより培地中のアンピシリンが分解され、形
質転換株はさらに増殖し、コロニーを作る。一
方、トリプトフアンを蓄積しない形質転換株
は、その周辺に大腸菌を増殖させない。したが
つてアンピシリンが分解されないので、増殖で
きず、コロニーを形成しない。このような考え
をもとに大腸菌とコロニーバンクを適当に希釈
したものとを混合して最少培地に塗布し、30℃
にて40日間培養した。周囲に大腸菌が増殖して
いるコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、
(2)で用いた方法によりプラスミドを分離した。
本プラスミドをpAJ234と名付けた。pAJ234は
明らかにベクタープラスミドpAJ1844よりも大
きく、トリプトフアン生合成系遺伝子が挿入さ
れていると考えられた。 (6) pAJ234が有するトリプトフアン生合成系遺
伝子の同定 (6)−１ アンスラニル酸ホスホリボシルトラン
スフエラーゼ（PRT）遺伝子、及び及びトリ
プトフアン合成酵素（TS）遺伝子の同定 PRT遺伝子、TSAサブユニツト遺伝子（以
下TSA遺伝子と記す）、TSBサブユニツト遺伝
子（以下TSB遺伝子と記す）が欠損した各菌
株ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
T13（NRRLB−1534T）、ブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムNo.21、ブレビバクテ
リウム・ラクトフアーメンタムB5、pAJ234を
(4)で述べた方法を用いて形質転換した。30℃に
て１週間再生培地にて培養後生じたクロラムフ
エニコール耐性コロニーのうちそれぞれ10個を
釣り上げトリプトフアン要求性をテストしたと
ころ、これらはいずれも要求性を消失してお
り、上記組換えプラスミド上にPRT遺伝子、
TSA遺伝子、TSB遺伝子が存在することが明
らかになつた。 (6)−２ PRAI−InGP遺伝子の同定 大腸菌trpC欠損株CGSCNo.5889（trpC60.pyrF
287，hisG１，IacZ53，rpsL８，λ-）に
pAJ234を導入した。DNA受容菌細胞を塩化カ
ルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法
を用いてpAJ234を形質転換し、生じたクロラ
ムフエニルコール耐生コロニーのうちそれぞれ
10個を釣り上げトリプトフアン要求性を調べ
た。いずれもが要求性を消失しており、上記組
換えプラスミド上にPRAI−InGP遺伝子が存
在することが明らかとなつた。 (7) PRAI−InGP遺伝子のサブクローニング pAJ234を組換えに用いた制限酵素PstIで切
断すると2.1kb，2.0kb，1.75kb，1.2kb，
0.8kb，0.5kbの６種の挿入PstI断片が検出され
た。このうち2.0kbのPstI断片を分画し、
pAJ1844のPstIサイトに連結し、ブレビバクテ
リウムラクトフアーメンタムT13，B5，No.21
及びE.coliCGSCNo.5889（trpC）を形質転換し
た。その結果、2.0kbのPstI断片を有する組換
プラスミドはT13の要求性を消失させたが、No.
21，B5，及びE.coliCGSCNo.5889の要求性は消
失させなかつた。次にこの2.0kbのPst断片を
Bglで切断し1.6kbのPst−Bgl断片をPst
，BamHIで切断したpAJ224に連結し、T13
を形質転換したところ、その要求性は消失し
た。従つてPRT遺伝子は1.6kbのPst−Bgl
断片上に存在すると考えられる。 次に2.1kb.のPst断片をpAJ1844のPstサ
イトに連結しブレビバクテリウムラクトフアー
メンタムB5に形質転換したところクロラムフ
エニコールを含む再生培地上に生じたコロニー
はいずれもトリプトフアン要求性を消失してい
た。代表的なコロニーからプラスミドを調製
し、再度B5及びブレビバクテリウムラクトフ
アーメンタムT13，No.21，E.coliCGSCNo.5889
（trpC）を形質転換した。その結果B5の要求性
は消失したが、T13，No.21及びE.coliの要求性
は消失しなかつた。 従つて2.1kb.のPst断片上にTSB遺伝子が
存在すると考えられる。さらに分画した2.0kb
と2.1kbのPst断片とPstで切断した
pAJ1844を(3)の方法により連結し、E.
coliCGSCNo.5889の要求性を消失させる組換え
プラスミドを得た。本プラスミドは2.0kbと
2.1kbのPst断片を有しており、T13，B5に
形質転換したところいずれの要求性をも消失さ
せた。 次にPRAI−InGP遺伝子のサブクローニン
グを行なうため、2.0kb，2.1kbのPst断片を
有する組換えプラスミドから第１図に示した約
2kb.のSst−EcoRI断片を分画しSstI，EcoRI
で切断したpUC19（Messing，J.，et al.，
Gene，33 103−119，1985）に連結し、lacプ
ロモーターからの転写が可能になるように配置
した。或いは第１図の約2.6kbのSst−Hind
断片を分画しSst，Hindで切断した
pUC18（Messing，J.，et Al.，Gene，33，103
−119（1985））に連結しlacプロモーターからの
転写が可能になるように配置し、E.coliCGSC
No.5889を形質転換した。その結果、Sst−
EcoRI断片、或いはSst−Hind断片を有す
る組換えプラスミドは、E.coliの要求性を消失
させた。 以上の結果からPRT遺伝子、PRAI−InGP
遺伝子、TSB遺伝子は2.0kb，2.1kbのPst断
片上に第１図に示す位置に存在していると考え
られる。 尚PRT遺伝子のサブクローニングの際用い
たプラスミドpAJ224は以下の様にして造成し
た。 pAJ224はトリメトプリム耐性を有するベク
タープラスミドpAJ228から造成した。pAJ228
の造成は以下の通りである。 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12036より変異誘導されたトリメトプリム耐
性変異株AJ12146（FERM−P7672）から(1)で
述べた方法により染色体DNAを調製した。一
方、プラスミドベクターpAM330を保有するブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869から(2)で述べた方法により
pAM330を調製した。 次に、染色体DNA20μｇとpAM330 10μｇと
を制限エンドヌクレアーゼMboでそれぞれ
を37℃、30分間処理し、部分切断した。65℃、
10分の熱処理後、両反応液を混合し、ATP及
びジチオスレイトール存在下、T4フアージ由
来のDNAリガーゼによつて10℃、24時間DNA
鎖の連結反応を行つた。65℃、５分の熱処理
後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結
反応終了後のDNAを沈澱採取した。 DNAの沈澱を適当量TENバツフアーに溶解
後、トリメトプリム感受性のAJ12036を受容菌
として、形質転換に用いた。 形質転換の方法としては、(4)で述べた方法を
用いた。トリメトプリム（Sigma社）25μｇ／
mlを含む再生培地にて、30℃で１週間培養後、
約100個のコロニーが出現してきたので、これ
をトリメトプリム50μｇ／mlを含む最小培地に
レプリカし、トリメトプリム耐性１株を得た。 この株の有するプラスミドDNAを検出した
ところ、ベクターのpAM330よりも明らかに大
きなプラスミドが検出された。 このプラスミドをpAJ228と名付け、再度
AJ12036を形質転換した。 生じたトリメトプリム耐性を有するコロニー
のうちそれぞれ10個を釣り上げアガロース・ゲ
ル電気泳動法によりプラスミドDNAを検出し
たところ、これらのいずれにもpAJ228と同じ
大きさのプラスミドが存在していた。上記組換
えプラスミド上にトリメトプリム耐性を表現す
る遺伝子が存在することが明らかとなつた。 pAJ228からpAJ224の造成は第２図に示した
通りである。 pAJ211より制限酵素PstIによる部分切断で
切り出した2.9kbのDNA断片の両端にBamHI，
SalI，PstIの切断部位をもつた第１図に示した
ような合成オリゴヌクレオチドリンカーをT4
フアージ由来のDNAリガーゼを用いて連結さ
せた後、制限酵素BamHIで切断した。得られ
たDNA混合物をアガロース・ゲル電気泳動に
かけ、約2.9kbのDNA断片を分離抽出し、エタ
ノール沈澱によりDNA断片を回収した。こう
して得られたDNA断片は2.9kbのHK遺伝子を
含むDNAの両端にPatI，SalI，BamHIの切断
部位が並んだ構造になつている。 pAJ211はpAJ1844のPatIサイトに2.9kbの
HK（ホモセリンキナーゼ）遺伝子を有する
PatI断片が挿入されたものでAJ12079（FERM
−P7237）として寄託されている。 一方、pAJ228は制限酵素MboIで部分切断し
た後65℃、10分の熱処理をした。この反応液に
前述の方法で得たHK遺伝子を含むDNA断片
を加え、T4DNAリガーゼでDNA鎖の連結反
応を行つた。反応後、65℃、５分の熱処理を
し、２倍容のエタノールの添加により沈澱採取
されるDNAを、(4)と同様の方法によりトリメ
トプリム感受性で、かつ、HK遺伝子が欠損し
たブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12078を受容菌としてプロトプラストランフ
オーメーシヨンを行つた後、トリメトプリム
100μｇ／mlを含むプロトプラスト再生培地で
培養した結果約200個の再生コロニーが出現し
てきた。 これをトリメトプリムを200μｇ／mlを含み
受容菌の要求物質であるスレオニンを含まない
最少培地にレプリカし、トリメトプリム耐性
で、かつスレオニン要求性が消失した菌株４株
を得た。これらの株より(2)に示した方法により
溶菌液を調製し、アガロース・ゲル電気泳動に
よりプラスミドDNAを検出したところ14.9kb，
12.2kb，9.6kb，6.5kbのプラスミドが検出され
た。このうち最も分子量の小さい6.5kbのプラ
スミドをpAJ212と名付けた。pAJ212を保持す
る株を12078−HK株と名付けた。 pAJ212は、PstIで切断することによりHK遺
伝子を除いて、pAJ224として、ブレビバクテ
リウム・ラクトフアーメンタムAJ12196
（FERM−P8015）として寄託されている。 (8) PRAI−InGP遺伝子のブレビバクテリウム
内で複製可能なベクターへの移し変え (8)−１ pAJ82の造成 pAJ43（特開昭58−192900）5μｇに0.25ユニ
ツトの制限酵素HPaを37℃、５分間反応さ
せた。一方pUB110（Gryczan，T.J.etal J.
Bacteriol.，134，318（1978））5μｇに５ユニツ
トのHpaを37℃、120分間反応させた。両者
を混合後、(3)の方法により連結し、AJ12036に
(4)の方法を用いて形質転換した。 クロラムフエニコール3μｇ／ml、カナマイ
シン100μｇ／mlを含む再生培地上に生じたコ
ロニーを分離した。代表株からプラスミドを分
離し、再度AJ12036を形質転換したところ、再
生培地上に生じたコロニーはいずれもがカナマ
イシン耐性でかつクロラムフエニコール耐性を
示した。本プラスミドをpAJ82と名付けた。そ
の制限酵素切断地図を第３図に示した。 (8)−２ PRAI−InGP遺伝子のpAJ82への移し
変えPRAI−InGP遺伝子を有するSstI−EcoR
断片とpUC19から成る組換えプラスミドを
EcoRで切断し、pAJ82のクロムフエコール
耐性遺伝子内に位置するEcoRサイトに連結
した後、ｍ−フルオロフエニルアラニン及び５
−フルオロトリプトフアン耐性株ブレビバクテ
リウムラクトフアーメンタムM247へ(4)で述べ
た方法により形質転換した。この菌株を
AJ12258（FERM、Ｐ−8470）とした。 カナマイシン100μｇ／mlを含む再生培地上
に生じたコロニーの中からクロラムフエニコー
ル感受性となつた株を分離し、プラスミドを抽
出した。このプラスミドをpAJ235と名付けた
（第４図）。pAJ235を制限酵素EcoR，Hind
，PstI，Bgl等で切断し約2.0kbのPRAI−
InGP遺伝子を有するDNA断片が挿入されてい
ることを確認した。 (9) 形質転換株のトリプトフアン生産能 (8)−２で得た形質転換株AJ12258（FERM Ｐ
−8470のトリプトフアン生産能を調べたところ
第１表に示す結果を得た。 培養はトリプトフアン生産培地（グルコース
130ｇ、（NH4）2SO425ｇ、フマル酸12ｇ、酢酸
３ml、KH2PO41ｇ、MnSO4・4H2O10mg、
MgSO4・7H2O1ｇ、ｄ−ビチオン50μｇ、サイ
アミン塩酸塩200μｇ、メチオニン400mg、チロ
シン650mg、大豆蛋白酸加水分解液「味液」50
ml、CaCO350gを水１に含む、PH6.5。）20ml
を500mlの坂口フラスコに入れたものに被検菌
株を植えつけ、30℃にて72時間、振盪下に行な
つた。培養後、遠心上清中のＬ−トリプトフア
ンをロイコノストツク・メセントロイデス
（Leuconostoc mesenteroides）ATCC8042を
定量菌株として用いるバイオアツセイ法によつ
て求めた。
【表】
尚、M247を得るためには寄託されたAJ12258
（FERM Ｐ−8470）より宿主細胞を損うことな
く宿主細胞中の複合プラスミドを除去することが
可能である。即ち、プラスミドは宿主より自然に
失なわれることもあるし、「除去」操作によつて
除くこともできる（Bact.Rev.，36，p361−405
（1972））。他の除去操作の例は以下の通りである。
AJ12258（FERM−P8470）をCMG液体培地に接
種し、37℃で一晩培養（高温処理）後、培養液を
適当に希釈し、カナマイシンを含有し又は含有し
ないCMG寒天培地に塗布し、30℃で１〜３日間
培養する。かくして感受性株として分譲される株
がM247である。
（FERM Ｐ−8470）より宿主細胞を損うことな
く宿主細胞中の複合プラスミドを除去することが
可能である。即ち、プラスミドは宿主より自然に
失なわれることもあるし、「除去」操作によつて
除くこともできる（Bact.Rev.，36，p361−405
（1972））。他の除去操作の例は以下の通りである。
AJ12258（FERM−P8470）をCMG液体培地に接
種し、37℃で一晩培養（高温処理）後、培養液を
適当に希釈し、カナマイシンを含有し又は含有し
ないCMG寒天培地に塗布し、30℃で１〜３日間
培養する。かくして感受性株として分譲される株
がM247である。
第１図は、PRT遺伝子、PRAI−InGP遺伝子、
TSB遺伝子が存在するDNA断片の制限酵素、地
図、及び各遺伝子の位置を示す図である。第２図
は、PAJ224の造成手順。第３図はPAJ82の制限
酵素地図。第４図は、PRAI−InGP遺伝子の
PAJ82への移し替えの手順。
TSB遺伝子が存在するDNA断片の制限酵素、地
図、及び各遺伝子の位置を示す図である。第２図
は、PAJ224の造成手順。第３図はPAJ82の制限
酵素地図。第４図は、PRAI−InGP遺伝子の
PAJ82への移し替えの手順。
Claims (1)
- １ コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属する
DNA供与菌より得られ、Ｎ−（５−ホスホリボシ
ル）アンスラニル酸イソメラーゼ−インドール−
３−グリセロールリン酸合成酵素をコードする
DNA断片が、コリネホルム・グルタミン酸生産
菌の菌体内で自律複製できるベクタープラスミド
に接続されて、コリネホルム・グルタミン酸生産
菌に属しｍ−フルオロフエニルアラニン及び５−
フルオロトリプトフアンに耐性を示すDNA受容
菌に導入されて得られるＬ−トリプトフアン生産
能を有する微生物を培養し、培養液中に蓄積され
たＬ−トリプトフアンを採取することを特徴とす
るＬ−トリプトフアンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60221592A JPS6279775A (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | 発酵法によるレートリプトファンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60221592A JPS6279775A (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | 発酵法によるレートリプトファンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6279775A JPS6279775A (ja) | 1987-04-13 |
| JPH0476678B2 true JPH0476678B2 (ja) | 1992-12-04 |
Family
ID=16769169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60221592A Granted JPS6279775A (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | 発酵法によるレートリプトファンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6279775A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2656300B2 (ja) * | 1988-04-18 | 1997-09-24 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ−トリプトファンの製造法 |
| JP2967996B2 (ja) * | 1989-06-06 | 1999-10-25 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ―トリプトファンの製造法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59156292A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | トリプトフアンの製造法 |
-
1985
- 1985-10-04 JP JP60221592A patent/JPS6279775A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6279775A (ja) | 1987-04-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |