JPH0616713B2 - 複合プラスミド - Google Patents
複合プラスミドInfo
- Publication number
- JPH0616713B2 JPH0616713B2 JP57131838A JP13183882A JPH0616713B2 JP H0616713 B2 JPH0616713 B2 JP H0616713B2 JP 57131838 A JP57131838 A JP 57131838A JP 13183882 A JP13183882 A JP 13183882A JP H0616713 B2 JPH0616713 B2 JP H0616713B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- composite
- composite plasmid
- glutamic acid
- coryneform
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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Description
【発明の詳細な説明】 この発明は、複合プラスミド、特にコリネホルム・グル
タミン酸生産菌の中で複製しうる複合プラスミドに関す
る。
タミン酸生産菌の中で複製しうる複合プラスミドに関す
る。
コリネホルム・グルタミン酸生産菌は、大量のＬ−グル
タミン酸を生産することが知られていて、またその変異
株はリジン等のアミノ酸、イノシン酸のプリンヌクレオ
チド等を生産するものが知られていて、工業的に有用な
微生物である。一方、最近ＤＮＡ組換え技術による工業
微生物の育種、改良がエシエリヒア・コリ等により試み
られているが、コリネホルム・グルタミン酸生産菌につ
いては、これらの微生物を宿主とするに適したベクター
が開発されておらず、ＤＮＡ組換えによるコリネホルム
・グルタミン酸生産菌の育種、改良の妨げとなってい
た。
タミン酸を生産することが知られていて、またその変異
株はリジン等のアミノ酸、イノシン酸のプリンヌクレオ
チド等を生産するものが知られていて、工業的に有用な
微生物である。一方、最近ＤＮＡ組換え技術による工業
微生物の育種、改良がエシエリヒア・コリ等により試み
られているが、コリネホルム・グルタミン酸生産菌につ
いては、これらの微生物を宿主とするに適したベクター
が開発されておらず、ＤＮＡ組換えによるコリネホルム
・グルタミン酸生産菌の育種、改良の妨げとなってい
た。
コリネホルム・グルタミン酸生産菌の内で複製しうるい
くつかのプラスミドがコリネホルム・グルタミン酸生産
菌で見出されていたが、これらの性質のうち、マーカー
として容易に識別できるような遺伝的性質については明
らかにされていない。コリネホルム・グルタミン酸生産
菌から単離されたマルチコピープラスミドがベクターと
して使われている例はあるが、これらは容易に識別でき
る遺伝子マーカーを持たないために、コリネホルム・グ
ルタミン酸生産菌より工業用微生物を育種するために組
換えＤＮＡ技術を応用することは依然として容易ではな
かった。
くつかのプラスミドがコリネホルム・グルタミン酸生産
菌で見出されていたが、これらの性質のうち、マーカー
として容易に識別できるような遺伝的性質については明
らかにされていない。コリネホルム・グルタミン酸生産
菌から単離されたマルチコピープラスミドがベクターと
して使われている例はあるが、これらは容易に識別でき
る遺伝子マーカーを持たないために、コリネホルム・グ
ルタミン酸生産菌より工業用微生物を育種するために組
換えＤＮＡ技術を応用することは依然として容易ではな
かった。
そのため、コリネホルム・グルタミン酸生産菌よりの工
業微生物を育種、改良するための新しいプラスミド、ベ
クターの開発はなおも必要とされていた。
業微生物を育種、改良するための新しいプラスミド、ベ
クターの開発はなおも必要とされていた。
本発明の目的は、このような背景において、コリネホル
ム・グルタミン酸生産菌を用いて、工業用微生物の育種
改良に有用な、新規な複合プラスミドを造成することで
あり、又グルタミン酸生産性コリネホルムバクテリアか
ら分離された天然型プラスミドを改良して、コリネホル
ム・グルタミン酸生産菌よりの工業生産用微生物の育種
改良に適するように仕立てることである。
ム・グルタミン酸生産菌を用いて、工業用微生物の育種
改良に有用な、新規な複合プラスミドを造成することで
あり、又グルタミン酸生産性コリネホルムバクテリアか
ら分離された天然型プラスミドを改良して、コリネホル
ム・グルタミン酸生産菌よりの工業生産用微生物の育種
改良に適するように仕立てることである。
これらの目的は以下に述べる如く、達成された。
コリネホルム・グルタミン酸生産菌内で増殖可能なプラ
スミドｐＡＭ３３０、ｐＡＭ２８６、及びｐＨＭ１５１
９より選ばれるひとつ(A)とエシェリヒア・コリもしく
はバチルス・ズブチルスの細胞内で増殖可能なプラスミ
ド(b)の薬剤耐性遺伝子部分を含む遺伝子領域(B)とより
成るコリネホルム・グルタミン酸生産菌内で増殖可能な
複合プラスミド。
スミドｐＡＭ３３０、ｐＡＭ２８６、及びｐＨＭ１５１
９より選ばれるひとつ(A)とエシェリヒア・コリもしく
はバチルス・ズブチルスの細胞内で増殖可能なプラスミ
ド(b)の薬剤耐性遺伝子部分を含む遺伝子領域(B)とより
成るコリネホルム・グルタミン酸生産菌内で増殖可能な
複合プラスミド。
その遺伝子断片上に更にプラスミド(b)のドライブユニ
ット部位が含まれる場合には、この複合プラスミドはエ
シェリヒア・コリまたはバチルス・ズブチリスの中でも
増殖でき、エシェリヒア・コリ、またはバチルス・ズブ
チリスを用いて本複合プラスミドを選び出すことまたは
増巾することが可能となる。
ット部位が含まれる場合には、この複合プラスミドはエ
シェリヒア・コリまたはバチルス・ズブチリスの中でも
増殖でき、エシェリヒア・コリ、またはバチルス・ズブ
チリスを用いて本複合プラスミドを選び出すことまたは
増巾することが可能となる。
添付図面は以下のとおりである。
第１図：ｐＡＭ３３０の制限酵素切断地図 第２図：ｐＡＭ２８６の制限酵素切断地図 第３図：ｐＨＭ１５１９の制限酵素切断地図 第４図：複合プラスミドpAJ655の制限酵素切断地図 第５図：複合プラスミドpAJ611の制限酵素切断地図 第６図：複合プラスミドpAJ1844の制限酵素切断地図 第７図：複合プラスミドpAJ440の制限酵素切断地図 第８図：複合プラスミドpAJ3148の制限酵素切断地図 「マルチコピープラスミド」とは通常の定義どおり、一
つの細胞に複数コピー存在するプラスミドをいう。
つの細胞に複数コピー存在するプラスミドをいう。
「ドライブユニット」とは、宿主細胞の中で遺伝子が複
製するために必要な最小の遺伝子領域をいう。
製するために必要な最小の遺伝子領域をいう。
「薬剤に対する耐性」とは通常の定義どおり、宿主細胞
の生育を阻害する抗生物質のような薬剤に対する耐性を
いう。
の生育を阻害する抗生物質のような薬剤に対する耐性を
いう。
そのような抗生物質としては、ペニシリン、カナマイシ
ン、クロラムフェニコール エリスロマイシン、アクチ
ノマイシン等がある。
ン、クロラムフェニコール エリスロマイシン、アクチ
ノマイシン等がある。
コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽性桿菌で
あり、非抗酸性でバーヂース・マニュアル・オブ・デタ
ーミネイティブバクテリオロジー第８版５９９頁（１９
７４）に記載されている。
あり、非抗酸性でバーヂース・マニュアル・オブ・デタ
ーミネイティブバクテリオロジー第８版５９９頁（１９
７４）に記載されている。
本発明の宿主菌として利用しうるコリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌の野性株の例としては次のようなものがあ
げられる。
ミン酸生産菌の野性株の例としては次のようなものがあ
げられる。
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトファ-メンタム ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240コリネ バクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC 13870コリネ バクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806コリネ バクテリウム・カルナエ ATCC 15991コリネ バクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,13060コリネ バクテリウム・リリウム ATCC 15990コリネ バクテリウム・メラセコ-ラ ATCC 17965ミクロ バクテリウム・アンモニアフィラム ATCC 15354 コリネホルム・グルタミン酸生産菌にはグルタミン酸生
産性を失なった変異株、あるいは、リジン、アルギニン
等のアミノ酸、イノシン等のブリンヌクレオシド、イノ
シン５′−モノりん酸等のブリンヌクレオチド、又はそ
の他の生産物を生産する変異株も含まれる。
産性を失なった変異株、あるいは、リジン、アルギニン
等のアミノ酸、イノシン等のブリンヌクレオシド、イノ
シン５′−モノりん酸等のブリンヌクレオチド、又はそ
の他の生産物を生産する変異株も含まれる。
本発明の複合プラスミドまたは、異種遺伝子の挿入され
た複合プラスミドの宿主として、上記のようなコリネホ
ルム・グルタミン酸生産菌を用いる場合、制限酵素活性
を低める変異を常法により宿主に与えておけば更に良好
な結果が得られる。
た複合プラスミドの宿主として、上記のようなコリネホ
ルム・グルタミン酸生産菌を用いる場合、制限酵素活性
を低める変異を常法により宿主に与えておけば更に良好
な結果が得られる。
このようなコリネホルム・グルタミン酸生産菌を外来遺
伝子の挿入された複合プラスミドを導入するのに用いれ
ば外来遺伝子に担われた遺伝情報を発現せしめるのによ
り有利である。
伝子の挿入された複合プラスミドを導入するのに用いれ
ば外来遺伝子に担われた遺伝情報を発現せしめるのによ
り有利である。
コリネホルム・グルタミン酸生産菌の細胞内で増殖でき
る能力のあるマルチコピープラスミドの例としては、次
のようなものがある。
る能力のあるマルチコピープラスミドの例としては、次
のようなものがある。
(1) pAM330： (a) 分離源：ブレビバクテリウム ラクトフェルメン
タム ATCC 13869 (b) 分子量：3.０メガダルトン（アガロースゲル電気
泳動上の移動距離と電子顕微鏡観察下でのＤＮＡ鎖長か
ら計算した） (c) 制限酵素による切断箇所：第１表参照 (d) 制限酵素切断地図 ： 第１図参照 (2) pAM286： (a) 分離源：コリネバクテリウム グルタミカム ＡＪ11560（FERM-P5485） (b) 分子量：3.０メガダルトン（アガロースゲル電気
泳動上の移動距離と電子顕微鏡観察下でのＤＮＡ鎖長か
ら計算した） (c) 制限酵素による切断箇所：第２表参照 (d) 制限酵素切断地図： 第２図参照 (3) pAM1519： (a) 分離源：コリネバクテリウム グルタミカムATCC
13058 (b) 分子量：1.８メガダルトン (c) 制限酵素による切断箇所：第３表参照 (d) 制限酵素切断地図： 第３図参照 コリネホルムグルタミン酸生産菌細胞内で増殖可能なマ
ルチコピープラスミドの他の例として、Agric.Biol.Che
mi.,43,867(1979)に報告されており、このプラスミドも
本発明のマルチコピープラスミド(a)に含まれる。この
プラスミドは、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムより分離され、分子量は３７メガダルトンである。
タム ATCC 13869 (b) 分子量：3.０メガダルトン（アガロースゲル電気
泳動上の移動距離と電子顕微鏡観察下でのＤＮＡ鎖長か
ら計算した） (c) 制限酵素による切断箇所：第１表参照 (d) 制限酵素切断地図 ： 第１図参照 (2) pAM286： (a) 分離源：コリネバクテリウム グルタミカム ＡＪ11560（FERM-P5485） (b) 分子量：3.０メガダルトン（アガロースゲル電気
泳動上の移動距離と電子顕微鏡観察下でのＤＮＡ鎖長か
ら計算した） (c) 制限酵素による切断箇所：第２表参照 (d) 制限酵素切断地図： 第２図参照 (3) pAM1519： (a) 分離源：コリネバクテリウム グルタミカムATCC
13058 (b) 分子量：1.８メガダルトン (c) 制限酵素による切断箇所：第３表参照 (d) 制限酵素切断地図： 第３図参照 コリネホルムグルタミン酸生産菌細胞内で増殖可能なマ
ルチコピープラスミドの他の例として、Agric.Biol.Che
mi.,43,867(1979)に報告されており、このプラスミドも
本発明のマルチコピープラスミド(a)に含まれる。この
プラスミドは、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムより分離され、分子量は３７メガダルトンである。
エシェリヒア・コリで増殖可能であり薬剤耐性の遺伝情
報を有するプラスミド(b)は、マルチコピープラスミド
である。例えばPAC105,RSF2124,pCR1,pMB9,pBR313,pBR3
22,pBR324,pBR325,pBR327,pBR328,pKY2289,pKY2700,pKN
80,pKC7,pKB158,pKM2004,pACYC177,及びpACYC184があ
る。
報を有するプラスミド(b)は、マルチコピープラスミド
である。例えばPAC105,RSF2124,pCR1,pMB9,pBR313,pBR3
22,pBR324,pBR325,pBR327,pBR328,pKY2289,pKY2700,pKN
80,pKC7,pKB158,pKM2004,pACYC177,及びpACYC184があ
る。
バチルス・ズブチリスで増殖可能であり、薬剤耐性の遺
伝情報を有するプラスミド(b)は、マルチコピーであ
り、例えばpT127,pC194,pC221,pC223,pUB112,pUB110,pS
A0501,pSA2100,pE194,pTP4及びpTP5がある。
伝情報を有するプラスミド(b)は、マルチコピーであ
り、例えばpT127,pC194,pC221,pC223,pUB112,pUB110,pS
A0501,pSA2100,pE194,pTP4及びpTP5がある。
プラスミド(a)及び(b)より本発明の複合プラスミドを構
築するためには、通常の方法を用いることができる。例
えば、プラスミド(a)及び(b)の両者を一ないし複数の制
限酵素切断点において相補的な一本鎖オリゴヌクレオチ
ドを生じ若しくはフラッシュエンド（flush end）端を
生ずる制限酵素により切断し、然る後に切断されたプラ
スミド(a)及び(b)をリガーゼを用いて結合する。あるい
は、プラスミド(a)及び(b)の両者を、一つまたは複数の
制限酵素または剪断力により切断し、必要ならばエクソ
ヌクレアーゼで処理した後、ターミナルトランスフェラ
ーゼを用いてプラスミドの切断点に相補的な１本鎖オリ
ゴヌクレオチドを付加した後、最後にこれらのプラスミ
ド(a)及び(b)の誘導体をアニーリング（annealing）さ
せることによっても、複合プラスミドを調製することが
できる。
築するためには、通常の方法を用いることができる。例
えば、プラスミド(a)及び(b)の両者を一ないし複数の制
限酵素切断点において相補的な一本鎖オリゴヌクレオチ
ドを生じ若しくはフラッシュエンド（flush end）端を
生ずる制限酵素により切断し、然る後に切断されたプラ
スミド(a)及び(b)をリガーゼを用いて結合する。あるい
は、プラスミド(a)及び(b)の両者を、一つまたは複数の
制限酵素または剪断力により切断し、必要ならばエクソ
ヌクレアーゼで処理した後、ターミナルトランスフェラ
ーゼを用いてプラスミドの切断点に相補的な１本鎖オリ
ゴヌクレオチドを付加した後、最後にこれらのプラスミ
ド(a)及び(b)の誘導体をアニーリング（annealing）さ
せることによっても、複合プラスミドを調製することが
できる。
プラスミド(b)由来の遺伝子断片については、プラスミ
ド(a)と同様に、薬剤耐性を発現する遺伝子領域や、ド
ライブユニットを含む遺伝子領域以外の部分がより少な
くなるように切断することが望ましい。
ド(a)と同様に、薬剤耐性を発現する遺伝子領域や、ド
ライブユニットを含む遺伝子領域以外の部分がより少な
くなるように切断することが望ましい。
プラスミド(b)由来の遺伝子断片は、薬剤耐性遺伝子領
域と、複合プラスミドをシャトルベクターとなるようド
ライブユニット領域とを合せ持つことが最も望ましい。
域と、複合プラスミドをシャトルベクターとなるようド
ライブユニット領域とを合せ持つことが最も望ましい。
接続反応の後、以下の様にして目的とする複合プラスミ
ドを選別することができる：プラスミド(a)由来のドラ
イブユニット領域とプラスミド(b)由来の薬剤耐性遺伝
子を含む遺伝子断片を持つ複合プラスミドは、コリネホ
ルムグルタミン酸生産菌中で増殖でき、かつ、コリネホ
ルムグルタミン酸生産菌を薬剤耐性に形質転換し得るプ
ラスミドとして得られる。さらに、プラスミド(a)由来
のドライブユニット領域と、プラスミド(b)由来のドラ
イブユニット領域、及びプラスミド(b)由来の薬剤耐性
遺伝子とを合せ持つプラスミドは、コリネホルムグルタ
ミン酸生産菌及び、エシェリヒア・コリまたはバチルス
・ズブチリスで増殖でき、かつ(1)コリネホルムグルタ
ミン酸生産菌または(2)エシェリヒア・コリ（使用され
たプラスミドがエシェリヒア・コリで増殖可能な場合）
若しくはバチルス・ズブチリス（使用されたプラスミド
がバチルス・ズブチリスで増殖可能な場合）を薬剤耐性
に形質転換できるプラスミドとして得られる。
ドを選別することができる：プラスミド(a)由来のドラ
イブユニット領域とプラスミド(b)由来の薬剤耐性遺伝
子を含む遺伝子断片を持つ複合プラスミドは、コリネホ
ルムグルタミン酸生産菌中で増殖でき、かつ、コリネホ
ルムグルタミン酸生産菌を薬剤耐性に形質転換し得るプ
ラスミドとして得られる。さらに、プラスミド(a)由来
のドライブユニット領域と、プラスミド(b)由来のドラ
イブユニット領域、及びプラスミド(b)由来の薬剤耐性
遺伝子とを合せ持つプラスミドは、コリネホルムグルタ
ミン酸生産菌及び、エシェリヒア・コリまたはバチルス
・ズブチリスで増殖でき、かつ(1)コリネホルムグルタ
ミン酸生産菌または(2)エシェリヒア・コリ（使用され
たプラスミドがエシェリヒア・コリで増殖可能な場合）
若しくはバチルス・ズブチリス（使用されたプラスミド
がバチルス・ズブチリスで増殖可能な場合）を薬剤耐性
に形質転換できるプラスミドとして得られる。
エシェリヒア・コリ及びバチルス・ズブチリスでこのよ
うな実験に望ましい株は、エシェリヒア・コリＫ−１２
及びバチルス・ズブチリスＲＭ１２５である。
うな実験に望ましい株は、エシェリヒア・コリＫ−１２
及びバチルス・ズブチリスＲＭ１２５である。
プラスミドＤＮＡのコリネホルムグルタミン酸生産菌へ
の導入は、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告さ
れている様に（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,
１５９（１９７９））受容菌細胞を塩化カルシウムで処
理してＤＮＡの透過性を増す方法、またはバチルス・ズ
ブチリスについて報告されている様に（Duncan,C.H.,wi
lson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,１５３（１９７
７））細胞がＤＮＡを取り込み得る様になる増殖段階
（いわゆるコンビテントセル）に導入する方法により可
能である。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類
および酵母について知られている様に（Chang,S.and Ch
oen,S.N.,Molec.Gen.Genet.,１６８．１１１（１９７
９）；Bibb,M.J.,ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,
２７４，３９８（１９７８）；Hinnen,A.,Hicks,J.B.an
d Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,１９２９（１
９７８））、ＤＮＡ受容菌を、プラスミドＤＮＡを容易
に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストにし
てプラスミドをＤＮＡ受容菌に導入することも可能であ
る。
の導入は、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告さ
れている様に（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,
１５９（１９７９））受容菌細胞を塩化カルシウムで処
理してＤＮＡの透過性を増す方法、またはバチルス・ズ
ブチリスについて報告されている様に（Duncan,C.H.,wi
lson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,１５３（１９７
７））細胞がＤＮＡを取り込み得る様になる増殖段階
（いわゆるコンビテントセル）に導入する方法により可
能である。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類
および酵母について知られている様に（Chang,S.and Ch
oen,S.N.,Molec.Gen.Genet.,１６８．１１１（１９７
９）；Bibb,M.J.,ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,
２７４，３９８（１９７８）；Hinnen,A.,Hicks,J.B.an
d Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,１９２９（１
９７８））、ＤＮＡ受容菌を、プラスミドＤＮＡを容易
に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストにし
てプラスミドをＤＮＡ受容菌に導入することも可能であ
る。
本発明で得られる複合プラスミドはコリネホルムグルタ
ミン酸生産菌を薬剤耐性菌に形質転換し得るので、この
複合プラスミドまたは外来遺伝子を組み込んだ複合プラ
スミドを有するコリネホルムグルタミン酸生産菌は、薬
剤耐性を調べることにより容易に同定できる。
ミン酸生産菌を薬剤耐性菌に形質転換し得るので、この
複合プラスミドまたは外来遺伝子を組み込んだ複合プラ
スミドを有するコリネホルムグルタミン酸生産菌は、薬
剤耐性を調べることにより容易に同定できる。
複合プラスミドがプラスミド(b)のドライブユニット領
域を持つ遺伝子断片を有する場合、複合プラスミドはエ
シェリヒア・コリまたはバチルス・ズブチリスで増殖で
きる。また、この複合プラスミドまたはこれに外来遺伝
子を組み込んだ複合プラスミドは、エシェリヒア・コリ
またはバチルス・ズブチリスを用いて増幅したりクロー
ン化することができる。
域を持つ遺伝子断片を有する場合、複合プラスミドはエ
シェリヒア・コリまたはバチルス・ズブチリスで増殖で
きる。また、この複合プラスミドまたはこれに外来遺伝
子を組み込んだ複合プラスミドは、エシェリヒア・コリ
またはバチルス・ズブチリスを用いて増幅したりクロー
ン化することができる。
本発明の複合プラスミドを有する宿主は以下の通り寄託
されている。
されている。
pAJ 655：エシェリヒア・コリ ＡＪ １１８８２ FERM-p 6517＝FERM-BP136 pAJ 611：エシェリヒア・コリ ＡＪ１１８８４ FERM-p 6519＝FERM-BP 138 コリネバクテリウム・グルタミカムSR8201 ATCC39135 pAJ 1844：エシェリヒア・コリ ＡＪ １１８８３ FERM-p 6518＝FERM-BP137 コリネバクテリウム・グルタミカムSR8202 ATCC 39136 pAJ 440：バチルス・ズブチリス KS440 ATCC39139 pAJ 3148：コリネバクテリウム・グルタミカム SR8203 ATCC 39137 本発明の複合プラスミドは、寄託されている微生物細胞
を対数増殖期後期まで生育させた後、リゾチーム及びＳ
ＤＳにより溶菌せしめ、30,000xgで遠心分離して得られ
た上清にポリエチレングリコールを加え、沈澱させたＤ
ＮＡを塩化セシウム・エチジウムブロミド平衡密度勾配
遠心で分画することにより精製することができる。
を対数増殖期後期まで生育させた後、リゾチーム及びＳ
ＤＳにより溶菌せしめ、30,000xgで遠心分離して得られ
た上清にポリエチレングリコールを加え、沈澱させたＤ
ＮＡを塩化セシウム・エチジウムブロミド平衡密度勾配
遠心で分画することにより精製することができる。
宿主微生物を得るために、以下のようにして、寄託され
た微生物より宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の複合
プラスミドを除去することが可能である：プラスミドは
宿主より自然に失なわれることもあるし、「除去」操作
によって除くこともできる（Bact.Rev.,36,p361-405(19
72)）。除去操作の一例は以下の通りである：宿主の生
育を不完全に阻害する濃度（２−５０μｇ／ml）のアク
リジンオレンジを含む培地に、１ｍ当り約１０４細胞
程度になる様に少量の菌株を接種し宿主菌の生育を不完
全に阻害してから２７−３５℃で一夜培養する（J.Bact
eriol.,88,261(1964)）。培養液を寒天培地に塗布し、
２７−４２℃で一夜培養する。培地上に出現したコロニ
ーの多くは、プラスミドが除去されている可能性が高
い。
た微生物より宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の複合
プラスミドを除去することが可能である：プラスミドは
宿主より自然に失なわれることもあるし、「除去」操作
によって除くこともできる（Bact.Rev.,36,p361-405(19
72)）。除去操作の一例は以下の通りである：宿主の生
育を不完全に阻害する濃度（２−５０μｇ／ml）のアク
リジンオレンジを含む培地に、１ｍ当り約１０４細胞
程度になる様に少量の菌株を接種し宿主菌の生育を不完
全に阻害してから２７−３５℃で一夜培養する（J.Bact
eriol.,88,261(1964)）。培養液を寒天培地に塗布し、
２７−４２℃で一夜培養する。培地上に出現したコロニ
ーの多くは、プラスミドが除去されている可能性が高
い。
本発明を一般的に記述してきたが、さらにその趣旨は同
様のことは実施例を参照することにより容易に理解され
るであろう。本特許中の実施例は具体的な認識を得る一
助としてのみに挙げられており、特許請求の範囲を限定
するものではない。
様のことは実施例を参照することにより容易に理解され
るであろう。本特許中の実施例は具体的な認識を得る一
助としてのみに挙げられており、特許請求の範囲を限定
するものではない。
実施例１ この実施例では、プラスミドpBR325とpAM330から成り、
エシェリヒア・コリＫ−１２内で複製しうる複合プラス
ミドpAJ655を示す。
エシェリヒア・コリＫ−１２内で複製しうる複合プラス
ミドpAJ655を示す。
(1) プラスミドpBR325はエシェリヒア・コリ内でアン
ピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン耐
性を発現する分子量3.６メガダルトンのベクタープラス
ミドである〔Boliver,F.Gene,4.１２１（１９７
８）〕。実験に使用したプラスミドpBR325は（ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリー）（ＢＲＬ）から購入した。
ピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン耐
性を発現する分子量3.６メガダルトンのベクタープラス
ミドである〔Boliver,F.Gene,4.１２１（１９７
８）〕。実験に使用したプラスミドpBR325は（ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリー）（ＢＲＬ）から購入した。
(2) プラスミドpAM330はブレビバクテリウム・ラクト
フェルメンタムATCC 13869から新たに我々が分離した分
子量3.０メガダルトンのプラスミドであり、第１図にそ
の制限酵素切断地図を示した。プラスミドpAM330ＤＮＡ
は次の様にして調製した。
フェルメンタムATCC 13869から新たに我々が分離した分
子量3.０メガダルトンのプラスミドであり、第１図にそ
の制限酵素切断地図を示した。プラスミドpAM330ＤＮＡ
は次の様にして調製した。
蒸留水１あたりペプトン１０ｇ、粉末酵母エキス１０
ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース５ｇを含むＣＭＧ
培地（pH 7.２）１中に温度３０℃でブレビバクテリ
ウム・ラクトフェルメンタムATCC 13869を対数増殖期後
期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を、リゾチ
ームとＳＤＳにより溶菌させる簡便法により溶菌せしめ
た後、30,000×ｇで３０分間遠心分離し６４ｍの上澄
液を得た。上澄液中のプラスミドＤＮＡは、上澄液にポ
リエチレングリコール（最終濃度１０％）を添加し沈降
させた後、１０ｍのＴＥＮ緩衝液に溶解した。
ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース５ｇを含むＣＭＧ
培地（pH 7.２）１中に温度３０℃でブレビバクテリ
ウム・ラクトフェルメンタムATCC 13869を対数増殖期後
期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を、リゾチ
ームとＳＤＳにより溶菌させる簡便法により溶菌せしめ
た後、30,000×ｇで３０分間遠心分離し６４ｍの上澄
液を得た。上澄液中のプラスミドＤＮＡは、上澄液にポ
リエチレングリコール（最終濃度１０％）を添加し沈降
させた後、１０ｍのＴＥＮ緩衝液に溶解した。
ＤＮＡをリボヌクレアーゼで処理した後（リボヌクレア
ーゼＩ５０μｇ／mで３７℃、３０分間反応）、フェ
ノール抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え−２０
℃でＤＮＡを沈澱させ、沈澱を１ｍのＴＥＮ緩衝液に
溶解した。このＤＮＡ溶液をアガロースゲル電気泳動に
かけ、ゲルから約７４μｇの純粋なプラスミドＤＮＡを
分離した。
ーゼＩ５０μｇ／mで３７℃、３０分間反応）、フェ
ノール抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え−２０
℃でＤＮＡを沈澱させ、沈澱を１ｍのＴＥＮ緩衝液に
溶解した。このＤＮＡ溶液をアガロースゲル電気泳動に
かけ、ゲルから約７４μｇの純粋なプラスミドＤＮＡを
分離した。
(3) 複合プラスミドの作成、分離、同定 (i)プラスミドpBR325 0.2μｇに１ユニットの制限酵素
BamHI（ＢＲＬから購入）を３７℃で６０分間反応さ
せ、ＤＮＡを充分分解した。
BamHI（ＢＲＬから購入）を３７℃で６０分間反応さ
せ、ＤＮＡを充分分解した。
(ii)プラスミドpAM330（1.２μｇ）に0.２ユニットの制
限酵素ＭｂｏＩを３７℃で１５分間反応させ、ＤＮＡを
部分分解した。
限酵素ＭｂｏＩを３７℃で１５分間反応させ、ＤＮＡを
部分分解した。
(iii) (i)と(ii)で得たＤＮＡを混合し制限酵素を不活
化するため６５℃で１０分間熱処理した後、ＡＴＰとジ
チオスレイトール存在下２２℃で２時間0.０１ユニット
のT4ＤＮＡリガーゼを作用させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を６５℃、１０分間の処理で不活化し、２倍量のエタノ
ールを加えた後、15,000ｇ１５分間の遠心分離によりＤ
ＮＡを回収した。
化するため６５℃で１０分間熱処理した後、ＡＴＰとジ
チオスレイトール存在下２２℃で２時間0.０１ユニット
のT4ＤＮＡリガーゼを作用させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を６５℃、１０分間の処理で不活化し、２倍量のエタノ
ールを加えた後、15,000ｇ１５分間の遠心分離によりＤ
ＮＡを回収した。
このようにして得た複合プラスミドをトランスオーメイ
ション(iv)に使用した。
ション(iv)に使用した。
(iv) エッシェリヒア・コリＣ−６００（thr−,leu−,
thiamine−、r−、m−）（Meselson,M.and Yuan,R.Natur
e,217,１１１０（１９６８））を２０ｍのＣＭＧ培地
に３０℃で対数増殖期中期まで培養し、菌体を集めた。
Kushner等（“Geneted Engineering”，p.17（１９７
８），Elsevier/North Holland Biomedical Press）の
方法に従って(iii)で得られたＤＮＡを用いてＣ−６０
０を形質転換した。
thiamine−、r−、m−）（Meselson,M.and Yuan,R.Natur
e,217,１１１０（１９６８））を２０ｍのＣＭＧ培地
に３０℃で対数増殖期中期まで培養し、菌体を集めた。
Kushner等（“Geneted Engineering”，p.17（１９７
８），Elsevier/North Holland Biomedical Press）の
方法に従って(iii)で得られたＤＮＡを用いてＣ−６０
０を形質転換した。
形質転換株は２０μｇ／ｍのクロラムフェニコールを
含むＣＭＧ倍地で３７℃、２４時間培養し選択した。形
質転換株の中からAJ 11882を選択し、次の実験に用い
た。
含むＣＭＧ倍地で３７℃、２４時間培養し選択した。形
質転換株の中からAJ 11882を選択し、次の実験に用い
た。
複合プラスミドpAJ655は、次のような方法によりAJ1188
2の溶菌液から分離した。AJ11882をＣＭＧ培地で培養
後、簡便法（Tanaka et al.,J.Bacteriol.,121,354(197
5)）により溶菌せしめ、溶菌液をアガロースゲルにか
け、電気泳動にかけた（sharp et al.,Biochemistry 1
2，3055(1973)）。分子量マーカーとの比較により、プ
ラスミドの分子量は6.6Md.と計算された。プラスミドの
制限酵素切断地図を第４図に示した。プラスミドはpBR3
25とpAM330のフラグメントから成ることを、K.J.Danna
の方法（Methods in Enzymology 65,449,Academic Pre
ss(1980)）により確認した。
2の溶菌液から分離した。AJ11882をＣＭＧ培地で培養
後、簡便法（Tanaka et al.,J.Bacteriol.,121,354(197
5)）により溶菌せしめ、溶菌液をアガロースゲルにか
け、電気泳動にかけた（sharp et al.,Biochemistry 1
2，3055(1973)）。分子量マーカーとの比較により、プ
ラスミドの分子量は6.6Md.と計算された。プラスミドの
制限酵素切断地図を第４図に示した。プラスミドはpBR3
25とpAM330のフラグメントから成ることを、K.J.Danna
の方法（Methods in Enzymology 65,449,Academic Pre
ss(1980)）により確認した。
実施例２ この実施例は実施例１で得た複合プラスミドpAJ655がブ
レビバクテリウム・ラクトフェルメンタム内で複製し、
pAJ655上のpBR322に由来する抗生物質耐性マーカーが発
現しうることを示すものである。
レビバクテリウム・ラクトフェルメンタム内で複製し、
pAJ655上のpBR322に由来する抗生物質耐性マーカーが発
現しうることを示すものである。
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムATCC13869
を親株とする三重栄養要求（リジン、メチオニン、スレ
オニン）突然変異株ブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムNo，６４をＤＮＡ受容菌として実験に用いた。
を親株とする三重栄養要求（リジン、メチオニン、スレ
オニン）突然変異株ブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムNo，６４をＤＮＡ受容菌として実験に用いた。
(1) プロトプラストの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムNo，６４
（ATCC39134）を５ｍのＣＭＧ培地で対数増殖期の初
期まで培養し、ペニシリンＧ0.６ユニット／ｍを添加
後、さらに1.５時間振盪培養し、遠心分離により菌体を
集め、菌体を0.５Ｍシュークロース、２０mMマレイン
酸、２０mM塩化マグネシウム、3.５％ペナッセイ ブロ
ス（Difco）からなるＳＭＭＰ培地（pH 6.５）0.５ｍ
で洗浄した。次で１０mg/mのリゾチームを含むＳＭＭ
Ｐ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトプラスト化を図
った。６０００ｇ １０分間遠心分離後、プロトプラス
トをＳＭＭＰで洗浄し0.５ｍのＳＭＭＰに再度懸濁し
た。
（ATCC39134）を５ｍのＣＭＧ培地で対数増殖期の初
期まで培養し、ペニシリンＧ0.６ユニット／ｍを添加
後、さらに1.５時間振盪培養し、遠心分離により菌体を
集め、菌体を0.５Ｍシュークロース、２０mMマレイン
酸、２０mM塩化マグネシウム、3.５％ペナッセイ ブロ
ス（Difco）からなるＳＭＭＰ培地（pH 6.５）0.５ｍ
で洗浄した。次で１０mg/mのリゾチームを含むＳＭＭ
Ｐ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトプラスト化を図
った。６０００ｇ １０分間遠心分離後、プロトプラス
トをＳＭＭＰで洗浄し0.５ｍのＳＭＭＰに再度懸濁し
た。
(2) トランスフォーメーション、形質転換体の選択、
プラスミドの同定 得られたプロトプラストを、実施例１で調製したpAJ655
DNA 2μｇと混合し、ポリエチレングリコールを最終濃
度が３０％になるように添加した後、ＤＮＡをプロトプ
ラストに取り込ませるために室温に２分間放置した。細
胞をＳＭＭＰ培地１ｍで洗浄後、ＤＮＡを取り込んだ
プロトプラストをＳＭＭＰ培地１ｍ中に再懸濁し、薬
剤耐性を発現させるために、３０℃で３時間培養した。
この培養液をpH7.０のプロトプラスト再生培地上に塗布
した。プロトプラスト再生培地は蒸留水１あたりトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２ｇ、KCl 0.５
ｇ、グルコース１０ｇ、MgCl2・6H2O 8.1ｇ、CaCl2・2H
2O 2.２ｇ、ペプトン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザ
ミノ酸（Difco社）１ｇ、K2HPO40.２ｇ、コハク酸ナト
リウム１３５ｇ、寒天１８ｇ及びクロラムフェニコール
５μｇ/ｍを含む。
プラスミドの同定 得られたプロトプラストを、実施例１で調製したpAJ655
DNA 2μｇと混合し、ポリエチレングリコールを最終濃
度が３０％になるように添加した後、ＤＮＡをプロトプ
ラストに取り込ませるために室温に２分間放置した。細
胞をＳＭＭＰ培地１ｍで洗浄後、ＤＮＡを取り込んだ
プロトプラストをＳＭＭＰ培地１ｍ中に再懸濁し、薬
剤耐性を発現させるために、３０℃で３時間培養した。
この培養液をpH7.０のプロトプラスト再生培地上に塗布
した。プロトプラスト再生培地は蒸留水１あたりトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２ｇ、KCl 0.５
ｇ、グルコース１０ｇ、MgCl2・6H2O 8.1ｇ、CaCl2・2H
2O 2.２ｇ、ペプトン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザ
ミノ酸（Difco社）１ｇ、K2HPO40.２ｇ、コハク酸ナト
リウム１３５ｇ、寒天１８ｇ及びクロラムフェニコール
５μｇ/ｍを含む。
３０℃で３〜１０日間培養後に出現したコロニー中の５
株を選びこれらを２０μｇ/ｍのクロラムフェニコー
ルを含むＣＭＧ培地で培養し、薬剤（クロラムフェニコ
ル）耐性株であることを確認した。
株を選びこれらを２０μｇ/ｍのクロラムフェニコー
ルを含むＣＭＧ培地で培養し、薬剤（クロラムフェニコ
ル）耐性株であることを確認した。
さらにプラスミドの存在を確認するため、ここで生育し
たクロラムフェニコール耐性株を溶菌せしめ、溶菌液を
実施例１と同様の方法によりアガロースゲル電気泳動に
かけ、PAJ655と同じ分子量と制限酵素切断地図を持つプ
ラスミドを認めた。
たクロラムフェニコール耐性株を溶菌せしめ、溶菌液を
実施例１と同様の方法によりアガロースゲル電気泳動に
かけ、PAJ655と同じ分子量と制限酵素切断地図を持つプ
ラスミドを認めた。
実施例３ この実施例は、実施例４で作られた複合プラスミドpAJ6
11がコリネバクテリウム・グルタミカム中で複製し、pB
R325由来の抗生物質耐性マーカーを発現することを示す
ものである。
11がコリネバクテリウム・グルタミカム中で複製し、pB
R325由来の抗生物質耐性マーカーを発現することを示す
ものである。
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13060を受容菌
体として使用し、エシェリヒア・コリAJ 11884から抽出
したpAJ611DNAを用いて実施例２で示した通りにプロト
プラストトランスフォーメイションを行なった。
体として使用し、エシェリヒア・コリAJ 11884から抽出
したpAJ611DNAを用いて実施例２で示した通りにプロト
プラストトランスフォーメイションを行なった。
SR-8201と名付けた形質転換株は、ＣＭＧ培地中でクロ
ラムフェニコール耐性を示し、かつその保有するプラス
ミドの分子量と制限酵素切断地図からこのプラスミドが
pAJ611と同一のものといえることが判明した。
ラムフェニコール耐性を示し、かつその保有するプラス
ミドの分子量と制限酵素切断地図からこのプラスミドが
pAJ611と同一のものといえることが判明した。
実施例４ ここでは複合プラスミドPAJ611を示す。pAJ611はpBR325
とpAM286から構成された複合プラスミドであり、エシェ
リヒア・コリの中で増殖することができる。
とpAM286から構成された複合プラスミドであり、エシェ
リヒア・コリの中で増殖することができる。
(1) pBR325は、実施例１と同じものを使用した。
(2) pAM286は、コリネバクテリウム・グルタミクム）A
J11560（FERM-P5485）から新しく分離された分子量3.０
メガダルトンのプラスミドでその制限酵素地図は、第２
図に示してある。実施例１と同様の方法により約20μｇ
のpAM286が単離された。
J11560（FERM-P5485）から新しく分離された分子量3.０
メガダルトンのプラスミドでその制限酵素地図は、第２
図に示してある。実施例１と同様の方法により約20μｇ
のpAM286が単離された。
(3) 複合プラスミドpAJ611の造成、単離および同定
は、pAM330のかわりにpAM286を使用したこと以外は、す
べて実施例１の方法に従った。
は、pAM330のかわりにpAM286を使用したこと以外は、す
べて実施例１の方法に従った。
分子量が6.６メガダルトンの、第５図に示すような制限
酵素地図をもつ複合プラスミドpAJ611は、エシェリヒア
・コリC-600を宿主として、実施例１と同様の手法で選
別された。pAJ611のＤＮＡの単離は、エシェリヒア・コ
リAJ11884株（pAJ611を含む株）より実施例１の方法に
よって行った。
酵素地図をもつ複合プラスミドpAJ611は、エシェリヒア
・コリC-600を宿主として、実施例１と同様の手法で選
別された。pAJ611のＤＮＡの単離は、エシェリヒア・コ
リAJ11884株（pAJ611を含む株）より実施例１の方法に
よって行った。
実施例５ ここでは、複合プラスミドpAJ440を示す。pAJ440はpUB1
10とpAM330から構成される複合プラスミドであり、B.Su
bstilisの中で増殖することができる。
10とpAM330から構成される複合プラスミドであり、B.Su
bstilisの中で増殖することができる。
(1) pUB110は、スタヒロコッカス オーレウス由来の
分子量3.０メガダルトンのプラスミドであり、バチルス
ズブチリスの中で増殖し、カナマイシン耐性を示す。
〔keggins,K,M,Lovett,P,S,and Duval,E.J.,proc,Natl,
Acad,Sci.,75,1423（１９７８）〕、pUB110は、Bethesd
a Research Laboratory（BRL）から購入し、複合プラス
ミドのマーカーとして使用した。
分子量3.０メガダルトンのプラスミドであり、バチルス
ズブチリスの中で増殖し、カナマイシン耐性を示す。
〔keggins,K,M,Lovett,P,S,and Duval,E.J.,proc,Natl,
Acad,Sci.,75,1423（１９７８）〕、pUB110は、Bethesd
a Research Laboratory（BRL）から購入し、複合プラス
ミドのマーカーとして使用した。
(2) pAM330の調製法は実施例１に示してある。
(3) 複合プラスミドの造成、単離そして同定。
(i) pUB110（0.2μｇ）は制限酵素Bam HI(BRL製）１ユ
ニットを使用して３７℃６０分で完全に切断した。
ニットを使用して３７℃６０分で完全に切断した。
(ii) pAM330（1.2μｇ）は制限酵素MboIを0.2ユニット
使用して３７℃１５分で部分的に切断した。
使用して３７℃１５分で部分的に切断した。
(iii) 酵素的に切断された両ＤＮＡを混合し、実施例
１の方法で結合させた。結合させたＤＮＡは0.８％のア
ガロースゲルを使用して、トリスー酢酸バッファー中で
５Ｖ／cm、２時間電気泳動にかけた。pUB110よりも泳動
度の低いＤＮＡ画分をゲルから抽出し、フェノール処理
し、エタノールで沈澱させ単離した。
１の方法で結合させた。結合させたＤＮＡは0.８％のア
ガロースゲルを使用して、トリスー酢酸バッファー中で
５Ｖ／cm、２時間電気泳動にかけた。pUB110よりも泳動
度の低いＤＮＡ画分をゲルから抽出し、フェノール処理
し、エタノールで沈澱させ単離した。
(iv) バチルス・ズブチリスRM125（arg−，leu−，
r−，m-）〔Uozumi T.et.al.,Molec.Gen.Genet,152，65
（1975）〕は、(iii)で得られたＤＮＡ混合物を用ちい
てDabnauらの方法〔Dabnau,D.,et al.,J.Mol.Biol.,56,
209（1971）〕で形質転換を行なった。形質転換株は、
カナマイシン５μｇ／ｍ入りのＣＭＧ寒天プレート上
に３７℃にて２４時間培養して生育してくるものとし
て、選択された。
r−，m-）〔Uozumi T.et.al.,Molec.Gen.Genet,152，65
（1975）〕は、(iii)で得られたＤＮＡ混合物を用ちい
てDabnauらの方法〔Dabnau,D.,et al.,J.Mol.Biol.,56,
209（1971）〕で形質転換を行なった。形質転換株は、
カナマイシン５μｇ／ｍ入りのＣＭＧ寒天プレート上
に３７℃にて２４時間培養して生育してくるものとし
て、選択された。
カナマイシン５μｇ／ｍのＣＭＧ寒天プレート上に生
育したトランスフォーマントのうち２０個を選び、それ
らの菌体中のプラスミドの存在を調べた。明瞭なプラス
ミドのバンドが検出された菌の一つをKS440と命名しATC
C39139として寄託した。KS440中に含まれるプラスミド
は、pAJ440と命名した。pAJ440をゲルから抽出し、いく
つかの制限酵素で切断した。分子量が6.０メガダルトン
であり、また第７図に示めす様な制限エンドヌクレアー
ゼ地図が得られたことから、pAJ440はpUB110とpAM330か
ら構成されてる複合プラスミドである。
育したトランスフォーマントのうち２０個を選び、それ
らの菌体中のプラスミドの存在を調べた。明瞭なプラス
ミドのバンドが検出された菌の一つをKS440と命名しATC
C39139として寄託した。KS440中に含まれるプラスミド
は、pAJ440と命名した。pAJ440をゲルから抽出し、いく
つかの制限酵素で切断した。分子量が6.０メガダルトン
であり、また第７図に示めす様な制限エンドヌクレアー
ゼ地図が得られたことから、pAJ440はpUB110とpAM330か
ら構成されてる複合プラスミドである。
実施例６ ここでは、複合プラスミドpAJ440がブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム中で増殖し、またpAJ440上のpU
B110由来の抗生物質耐性マーカーが発現し得ること示
す。
・ラクトファーメンタム中で増殖し、またpAJ440上のpU
B110由来の抗生物質耐性マーカーが発現し得ること示
す。
宿主として、Brevibacterium lactofermentum No.６４
を使用した。pAJ440によるNo.６４株のプロトプラスト
形質転換法は実施例２に記載されている方法で行なっ
た。ただし、今回は、１μｇのpAJ440を形質転換に使用
し、プロトプラストの再生培地には、形質転換株を選択
する為に、１００μｇ／ｍのカナマイシンを添加た。
３〜１０日で生育してきた形質転換株のうち２株を20μ
ｇ／ｍのカナマイシンが入っているＣＭＧ培地で培養
し、プラスミドを調べるために、前述の実施例と同様の
手法により溶菌せしめ、その溶菌液をアガロースゲル電
気泳動にかけた。プラスミドの分子量とその制限酵素切
断地図は、実施例４のpAJ440と同じであった。
を使用した。pAJ440によるNo.６４株のプロトプラスト
形質転換法は実施例２に記載されている方法で行なっ
た。ただし、今回は、１μｇのpAJ440を形質転換に使用
し、プロトプラストの再生培地には、形質転換株を選択
する為に、１００μｇ／ｍのカナマイシンを添加た。
３〜１０日で生育してきた形質転換株のうち２株を20μ
ｇ／ｍのカナマイシンが入っているＣＭＧ培地で培養
し、プラスミドを調べるために、前述の実施例と同様の
手法により溶菌せしめ、その溶菌液をアガロースゲル電
気泳動にかけた。プラスミドの分子量とその制限酵素切
断地図は、実施例４のpAJ440と同じであった。
実施例７ ここでは、複合プラスミドpAJ1844を示す。pAJ1844は、
pBR325とpHM1519から構成される複合プラスミドであ
り、エシエリヒア・コリの中で増殖することができる。
pBR325とpHM1519から構成される複合プラスミドであ
り、エシエリヒア・コリの中で増殖することができる。
(1) pBR325は実施例１と同じものを使用した。
(2) pHM1519はコリネバクテリウム・グルタミクムATCC
13058から新しく分離された分子量1.８メガダルトンの
プラスミドでその制限酵素切断地図は、第３図に示して
ある。実施例１と同様の方法により約２４μｇのpHM151
9が単離された。
13058から新しく分離された分子量1.８メガダルトンの
プラスミドでその制限酵素切断地図は、第３図に示して
ある。実施例１と同様の方法により約２４μｇのpHM151
9が単離された。
(3) 複合プラスミドpAJ1844の造成、分離および同定。
(i) 0.２μｇのpBR325は実施例１の方法で切断した。
(ii) 1.０μｇのpHM1519は制限酵素Bgl II （Boehring
er Manheim GmbH製）５ユニットを使用して３７℃６０
分で切断した。
er Manheim GmbH製）５ユニットを使用して３７℃６０
分で切断した。
(iii) 形質転換株は、実施例１に示した方法に従いエ
シェリヒア・コリ−600に複合プラスミドを導入するこ
とにより得た。pAJ1844と命名された複合プラスミド
は、形質転換株のうちの一株、エシェリヒア・コリAJ 1
1883から分離された。pAJ1844の分子量は5.４メガダル
トンで、その制限酵素切断地図は第６図に示した。
シェリヒア・コリ−600に複合プラスミドを導入するこ
とにより得た。pAJ1844と命名された複合プラスミド
は、形質転換株のうちの一株、エシェリヒア・コリAJ 1
1883から分離された。pAJ1844の分子量は5.４メガダル
トンで、その制限酵素切断地図は第６図に示した。
実施例８ ここでは、実施例７で作くられた複合プラスミドAJ1844
がコリネバクテリウム・グルタミクム中で増殖し、pAJ1
844上のpBR325由来の抗生物質耐性マーカーが発現する
ことを示す。受容菌として、コリネバクテリウム・グル
タミクムATCC13032を用いた。実施例２のプロトプラス
ト形質転換法に従い、エシェリヒア・コリAJ11883株か
ら得られたpAJ1844をコリネバクテリウム・グルタミク
ムATCC13032に導入することができた。さらにこの形質
転換株の中のプラスミドはエシェリヒア・コリAJ11883
由来のpAJ1844と同じプラスミドであることが確認され
た。SR8202は、pAJ1844を保持しているコリネバクテリ
ウム・グルタミクムの代表的な形質転換株である。
がコリネバクテリウム・グルタミクム中で増殖し、pAJ1
844上のpBR325由来の抗生物質耐性マーカーが発現する
ことを示す。受容菌として、コリネバクテリウム・グル
タミクムATCC13032を用いた。実施例２のプロトプラス
ト形質転換法に従い、エシェリヒア・コリAJ11883株か
ら得られたpAJ1844をコリネバクテリウム・グルタミク
ムATCC13032に導入することができた。さらにこの形質
転換株の中のプラスミドはエシェリヒア・コリAJ11883
由来のpAJ1844と同じプラスミドであることが確認され
た。SR8202は、pAJ1844を保持しているコリネバクテリ
ウム・グルタミクムの代表的な形質転換株である。
実施例９ 本実施例では、プラスミドpUB110及びpHM1519より造成
された複合プラスミドpAJ3148について示す。
された複合プラスミドpAJ3148について示す。
(1) 使用したプラスミドpUB110は実施例５と同一の標
品で実施例５の方法により、制限酵素BamHIで切断し
た。
品で実施例５の方法により、制限酵素BamHIで切断し
た。
(2) 使用したプラスミドpHM1519は実施例７と同一の標
品で実施例７の方法により、制限酵素BgIIIで切断し
た。
品で実施例７の方法により、制限酵素BgIIIで切断し
た。
(3) (1)及び(2)で得られた切断されたＤＮＡを混合連
結した。連結したＤＮＡは電気泳動にかけた。pUB110モ
ノマーよりも大分子量のＤＮＡを採取し、実施例５の方
法に従いバチルス・ズブチリスRM125に導入した。pUB11
0よりも大分子量のプラスミドを、トランスホーマントN
o.1129中で確認した。このプラスミドpAJ3148は、分子
量6.６メガダルトンで、その切断地図を、第８図に示
す。第８図に示すように、本プラスミドは、１分子のpU
B110と、２分子のpHM1519より成る。
結した。連結したＤＮＡは電気泳動にかけた。pUB110モ
ノマーよりも大分子量のＤＮＡを採取し、実施例５の方
法に従いバチルス・ズブチリスRM125に導入した。pUB11
0よりも大分子量のプラスミドを、トランスホーマントN
o.1129中で確認した。このプラスミドpAJ3148は、分子
量6.６メガダルトンで、その切断地図を、第８図に示
す。第８図に示すように、本プラスミドは、１分子のpU
B110と、２分子のpHM1519より成る。
実施例１０ 本実施例では、実施例９で造成された複合プラスミドpA
J3148が、コリネバクテリウム・グルタミクム内で複製
しpUB110由来の薬剤耐性マーカーを発現することを示
す。
J3148が、コリネバクテリウム・グルタミクム内で複製
しpUB110由来の薬剤耐性マーカーを発現することを示
す。
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032をＤＮＡ
受容菌として使用し、実施例２で述べたプロトプラスト
形質転換法を用い、バチルス・ズブチリスNo.1129より
得られたpAJ3148DNAを、ATCC13032に導入することがで
きた（コリネバクテリウム・グルタミカムSR8203 ATCC3
9137）。pAJ3148は複製し、かつカナマイシン耐性を発
現した。分子量及び制限酵素切断地図はpAJ3148と同じ
であった。
受容菌として使用し、実施例２で述べたプロトプラスト
形質転換法を用い、バチルス・ズブチリスNo.1129より
得られたpAJ3148DNAを、ATCC13032に導入することがで
きた（コリネバクテリウム・グルタミカムSR8203 ATCC3
9137）。pAJ3148は複製し、かつカナマイシン耐性を発
現した。分子量及び制限酵素切断地図はpAJ3148と同じ
であった。
実施例１１ 本実施例では、クローニング実験の例を示す。新しい複
合プラスミドpSR8204は、実施例７で述べられたベクタ
ープラスミドpAJ1844と、少なくともｍ−フルオローフ
ェニルアラニン耐性に関する遺伝子を担う染色体ＤＮＡ
断片から造成した。
合プラスミドpSR8204は、実施例７で述べられたベクタ
ープラスミドpAJ1844と、少なくともｍ−フルオローフ
ェニルアラニン耐性に関する遺伝子を担う染色体ＤＮＡ
断片から造成した。
(1) プラスミドpAJ1844は、実施例７で造成した複合プ
ラスミドで、実施例７で述べられるように、エシェリヒ
ア・コリAJ11883中で複製された。pAJ1844をベクターと
して使用し、制限酵素PstIで切断した。
ラスミドで、実施例７で述べられるように、エシェリヒ
ア・コリAJ11883中で複製された。pAJ1844をベクターと
して使用し、制限酵素PstIで切断した。
(2) 挿入されるＤＮＡ断片としてブレビバクテリウム
・ラクトフェルメンタムFERMp-1914を選び、これより、
染色体ＤＮＡを抽出し、PstIで切断した。FERMp-1914
は、ｍ−フルオローフェニルアラニン耐性で、培地中に
フェニルアラニンを生産する。
・ラクトフェルメンタムFERMp-1914を選び、これより、
染色体ＤＮＡを抽出し、PstIで切断した。FERMp-1914
は、ｍ−フルオローフェニルアラニン耐性で、培地中に
フェニルアラニンを生産する。
(3) PstIで切断したベクタープラスミドと同酵素で切
断した染色体ＤＮＡを混合し連結した。
断した染色体ＤＮＡを混合し連結した。
(4) 連結したＤＮＡ標品をコリネバクテリウム・グル
タミクムATCC13060のプロトプラストと接触させ、形質
転換株をまずクロラムフェニコール耐性で選択した。次
にｍ−フルオローフェニルアラニン耐性で選別し、フェ
ニル−アラニンの生産性を調べた。形質転換株の溶菌上
清におけるプラスミドＤＮＡ分析はアガロースゲル電気
泳動により行った。
タミクムATCC13060のプロトプラストと接触させ、形質
転換株をまずクロラムフェニコール耐性で選択した。次
にｍ−フルオローフェニルアラニン耐性で選別し、フェ
ニル−アラニンの生産性を調べた。形質転換株の溶菌上
清におけるプラスミドＤＮＡ分析はアガロースゲル電気
泳動により行った。
(i) ベクターＤＮＡ；複合プラスミドpAJ1844はエシェ
リヒア・コリAJ11883より単離した。AJ11883を２０ｍ
のＣＭＧ培地に培養し、対数生育後期の培養液に、クロ
ラムフェニコールを最終１７０μｇ／ｍになるよう添
加し、更に１８時間培養した。クロラムフェニコール処
理菌体の溶菌上清より１０μｇのプラスミドＤＮＡが得
られた。得られたＤＮＡ0.０５μｇを３７℃６０分間Ps
tIで完全切断した。
リヒア・コリAJ11883より単離した。AJ11883を２０ｍ
のＣＭＧ培地に培養し、対数生育後期の培養液に、クロ
ラムフェニコールを最終１７０μｇ／ｍになるよう添
加し、更に１８時間培養した。クロラムフェニコール処
理菌体の溶菌上清より１０μｇのプラスミドＤＮＡが得
られた。得られたＤＮＡ0.０５μｇを３７℃６０分間Ps
tIで完全切断した。
(ii) 染色体ＤＮＡ；ブレビバクテリウム・ラクトフェ
ルメンタムAJ3437（FERMp-1914）の染色体ＤＮＡをフェ
ノールを用いる常法に従い１のＣＭＧ培養液より３０
mg採取した。本ＤＮＡ１０μｇを３７℃５分ないし６０
分間１０ユニットのPstIで部分分解した。
ルメンタムAJ3437（FERMp-1914）の染色体ＤＮＡをフェ
ノールを用いる常法に従い１のＣＭＧ培養液より３０
mg採取した。本ＤＮＡ１０μｇを３７℃５分ないし６０
分間１０ユニットのPstIで部分分解した。
(iii) 連結；(i)と(ii)のＤＮＡを混合し、２２℃にて
４時間、0.１ユニットのＴ４リガーゼで連結した。他の
条件は実施例１と同様であった。
４時間、0.１ユニットのＴ４リガーゼで連結した。他の
条件は実施例１と同様であった。
(iv) ＤＮＡ受容菌；コリネバクテリウム・グルタミク
ムATCC13060のプロトプラストを連結したＤＮＡ(iii)の
ＤＮＡ受容菌として使用した。プロトプラスト調製に
は、ＣＭＧ培地中の対数増殖初期の細胞を、最終濃度1.
２ユニット／ｍになるようペニシリンＧを添加、1.５
時間培養後、集菌、洗菌し１０mg卵白リゾチームを含む
ＳＭＭＰ培地0.５ｍに再懸濁後、３０℃に２０時間保
ったとにより行った。
ムATCC13060のプロトプラストを連結したＤＮＡ(iii)の
ＤＮＡ受容菌として使用した。プロトプラスト調製に
は、ＣＭＧ培地中の対数増殖初期の細胞を、最終濃度1.
２ユニット／ｍになるようペニシリンＧを添加、1.５
時間培養後、集菌、洗菌し１０mg卵白リゾチームを含む
ＳＭＭＰ培地0.５ｍに再懸濁後、３０℃に２０時間保
ったとにより行った。
(v) 形質転換；連結したＤＮＡ(iii)とプロトプラスト
(iv)を混合し、プロトプラストへのＤＮＡの吸着促進の
ため、ポリエチレングリコール（最終濃度３０％）を添
加した。このようにして得られたＤＮＡ−プロトプラス
ト複合体を洗浄し、選択薬剤としてクロラムフェニコー
ル５μｇ／ｍを含む再生培地プレート（実施例２参
照）に播いた。
(iv)を混合し、プロトプラストへのＤＮＡの吸着促進の
ため、ポリエチレングリコール（最終濃度３０％）を添
加した。このようにして得られたＤＮＡ−プロトプラス
ト複合体を洗浄し、選択薬剤としてクロラムフェニコー
ル５μｇ／ｍを含む再生培地プレート（実施例２参
照）に播いた。
(vi) 形質転換株；数白のクロラムフェニコール耐性の
形質転換株を得、１mg/ｍのｍ−フルオローフェニア
ラニン含有の最小培地（蒸留水１当たり、グルコース
１０ｇ、硫安２ｇ、KE2PO4１ｇ、MgSO4・7H2O 0.４ｇ、
Fe++２ppm、Mn++２ppm、ｄ−ピオチン１００μｇ、チア
ミンHCl１mg寒天１５ｇ（pH7.２））において、ｍ−フ
ルオローフェニルアラニン耐性を調べた。
形質転換株を得、１mg/ｍのｍ−フルオローフェニア
ラニン含有の最小培地（蒸留水１当たり、グルコース
１０ｇ、硫安２ｇ、KE2PO4１ｇ、MgSO4・7H2O 0.４ｇ、
Fe++２ppm、Mn++２ppm、ｄ−ピオチン１００μｇ、チア
ミンHCl１mg寒天１５ｇ（pH7.２））において、ｍ−フ
ルオローフェニルアラニン耐性を調べた。
(vii) プラスミド分析；形質転換株の溶菌上清を、分
子量マーカー（pAJ1844とpAJ655）とともにアガロース
ゲル電気泳動に、かけた。トランスホーマント中のプラ
スミドの分子量は約６メガダルトンであった。
子量マーカー（pAJ1844とpAJ655）とともにアガロース
ゲル電気泳動に、かけた。トランスホーマント中のプラ
スミドの分子量は約６メガダルトンであった。
本トランスホーマントをSR8204、ATCC39138、プラスミ
ドをpSR8204と命名した。
ドをpSR8204と命名した。
(viii) フェニルアラニンの生産性；Ｐ−培地で生産さ
れたフェニルアラニン量は、SR8204の場合１ｇ／で、
宿主ATCC13060は、0.１ｇ／以下であった。同培地中
に生産されたチロシン量はSR8204の場合0.４ｇ／で、
宿主ATCC13060は、0.１ｇ／以下であった。尚ｐ−培
地は１蒸留水当たり、グルコース１００ｇ、硫安４０
ｇ、KH2PO4１ｇ、MgSO4・7H2O 0.4ｇ、Fe++2ppm、Mn++2
ppm、ｄ−ピオチン１００μｇ、チアミンHCl１mg及びCa
CO3５０ｇ（pH7.0）を含む。
れたフェニルアラニン量は、SR8204の場合１ｇ／で、
宿主ATCC13060は、0.１ｇ／以下であった。同培地中
に生産されたチロシン量はSR8204の場合0.４ｇ／で、
宿主ATCC13060は、0.１ｇ／以下であった。尚ｐ−培
地は１蒸留水当たり、グルコース１００ｇ、硫安４０
ｇ、KH2PO4１ｇ、MgSO4・7H2O 0.4ｇ、Fe++2ppm、Mn++2
ppm、ｄ−ピオチン１００μｇ、チアミンHCl１mg及びCa
CO3５０ｇ（pH7.0）を含む。
本発明に記載の６個の菌株（SR-8201、SR-8202、SR-820
3、SR-8204、No.６４及びKS440）は１９８２年６月３日
にATCCに寄託した。
3、SR-8204、No.６４及びKS440）は１９８２年６月３日
にATCCに寄託した。
以上のごとく、本発明を充分説明したので、当技術によ
り、発明の精神や知見を冒すことなく巾広い同等の条件
やパラメーター等の範囲内で同じ操作が実施されうるこ
とが理解されるだろう。
り、発明の精神や知見を冒すことなく巾広い同等の条件
やパラメーター等の範囲内で同じ操作が実施されうるこ
とが理解されるだろう。
第１図は、pAM330の制限酵素切断地図を示す。 第２図は、pAM286の制限酵素切断地図を示す。 第３図は、pHM1519の制限酵素切断地図を示す。 第４図は、複合プラスミドpAJ655の制限酵素切断地図を
示す。 第５図は、複合プラスミドpAJ611の制限酵素切断地図を
示す。 第６図は、複合プラスミドpAJ1844の制限酵素切断地図
を示す。 第７図は、複合プラスミドpAJ440の制限酵素切断地図を
示す。 記号は以下の制限酵素を示す。 A ：AvaI、II：HindII Bc：BclI、III：HindIII Bg：BglII、Ｘ：XbaI E ：EcoRI 第８図は、複合プラスミドpAJ3148の制限酵素切断地図
を示す。 記号は以下の制限酵素を示す。 Bc：Bcl I、II：HindII Bg：Bgl II、III：HindIII E ：EcoRI、Ｘ：Xba I H ：Hae II
示す。 第５図は、複合プラスミドpAJ611の制限酵素切断地図を
示す。 第６図は、複合プラスミドpAJ1844の制限酵素切断地図
を示す。 第７図は、複合プラスミドpAJ440の制限酵素切断地図を
示す。 記号は以下の制限酵素を示す。 A ：AvaI、II：HindII Bc：BclI、III：HindIII Bg：BglII、Ｘ：XbaI E ：EcoRI 第８図は、複合プラスミドpAJ3148の制限酵素切断地図
を示す。 記号は以下の制限酵素を示す。 Bc：Bcl I、II：HindII Bg：Bgl II、III：HindIII E ：EcoRI、Ｘ：Xba I H ：Hae II
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） 審査官 佐伯 裕子 (56)参考文献 特開 昭56−148295（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−148296（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−109588（ＪＰ，Ａ) Ｍｏｌ，Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．，168 （1979） Ｐ．111−115 Ｍｏｌ，Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．，174 （1979） Ｐ．281−286 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，146（１) （1981） Ｐ．360−368
Claims (13)
- 【請求項１】コリネホルム・グルタミン酸生産菌内で増
殖可能なプラスミドであって下記の制限酵素切断地図で
表現されるｐＡＭ３３０、ｐＡＭ２８６、及びｐＨＭ１
５１９より選ばれるひとつ(A)とエシェリヒア・コリも
しくはバチルス・ズブチルスの細胞内で増殖可能なプラ
スミド(b)の薬剤耐性遺伝子部分を含む遺伝子領域(B)と
より成るコリネホルム・グルタミン酸生産菌内で増殖可
能な複合プラスミド。 - 【請求項２】遺伝子領域(B)が薬剤耐性遺伝子以外にさ
らにドライブ・ユニットを有する特許請求の範囲第１項
記載の複合プラスミド。 - 【請求項３】プラスミド(b)が、ｐＵＢ１１０である特
許請求の範囲第１項又は第２項記載の複合プラスミド。 - 【請求項４】プラスミド(b)が、ｐＢＲ３２５である特
許請求の範囲第１項又は第２項記載の複合プラスミド。 - 【請求項５】コリネホルム・グルタミン酸生産菌が、ブ
レビバクテリウム・ラクトフェルメンタムまたはコリネ
バクテリウム・グルタミクムである特許請求の範囲第１
項ないし第４項記載の複合プラスミド。 - 【請求項６】複合プラスミドがｐＡＪ６５５である特許
請求の範囲第２項記載の複合プラスミド。 - 【請求項７】複合プラスミドがｐＡＪ６１１である特許
請求の範囲第２項記載の複合プラスミド。 - 【請求項８】複合プラスミドがｐＡＪ１８４４である特
許請求の範囲第２項記載の複合プラスミド。 - 【請求項９】複合プラスミドがｐＡＪ４４０である特許
請求の範囲第２項記載の複合プラスミド。 - 【請求項１０】複合プラスミドがｐＡＪ３１４８である
特許請求の範囲第２項記載の複合プラスミド。 - 【請求項１１】複合プラスミドが、コリネホルム・グル
タミン酸生産菌由来の遺伝子を更に有している特許請求
の範囲第１項ないし第１０項記載の複合プラスミド。 - 【請求項１２】複合プラスミドが、コリネホルム・グル
タミン酸生産菌の細胞内に内蔵されている特許請求の範
囲第１項ないし第１１項記載の複合プラスミド。 - 【請求項１３】コリネホルム・グルタミン酸生産菌が、
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムまたはコリ
ネバクテリウム・グルタミクムである特許請求の範囲第
１２項記載の複合プラスミド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/386,980 US4514502A (en) | 1982-05-04 | 1982-06-10 | Composite plasmid |
| US386980 | 1982-06-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58216199A JPS58216199A (ja) | 1983-12-15 |
| JPH0616713B2 true JPH0616713B2 (ja) | 1994-03-09 |
Family
ID=23527910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57131838A Expired - Lifetime JPH0616713B2 (ja) | 1982-06-10 | 1982-07-28 | 複合プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0616713B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2165546B (en) * | 1984-08-21 | 1989-05-17 | Asahi Chemical Ind | A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2068969B (en) * | 1980-02-05 | 1983-07-27 | Upjohn Co | Gene expression |
| JPS56148295A (en) * | 1980-04-17 | 1981-11-17 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-glutamic acid by fermentation method |
| JPS56148296A (en) * | 1980-04-17 | 1981-11-17 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-glutamic acid by fermentation method |
| JPS5774845A (en) * | 1980-10-27 | 1982-05-11 | Nippon Columbia Co Ltd | Optical recording disk |
| JPH0691827B2 (ja) * | 1981-12-17 | 1994-11-16 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規ベクタ−プラスミド |
-
1982
- 1982-07-28 JP JP57131838A patent/JPH0616713B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４６（１）（１９８１）Ｐ．３６０−３６８ |
| Ｍｏｌ，Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．，１６８（１９７９）Ｐ．１１１−１１５ |
| Ｍｏｌ，Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．，１７４（１９７９）Ｐ．２８１−２８６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58216199A (ja) | 1983-12-15 |
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