JPH0527640B2 - - Google Patents
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- JPH0527640B2 JPH0527640B2 JP58233570A JP23357083A JPH0527640B2 JP H0527640 B2 JPH0527640 B2 JP H0527640B2 JP 58233570 A JP58233570 A JP 58233570A JP 23357083 A JP23357083 A JP 23357083A JP H0527640 B2 JPH0527640 B2 JP H0527640B2
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Description
本発明は、腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有
する新リンホカインＩとその製造方法および用途
に関する。 腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有するリンホ
カインとしては、リンホトキシンやツモア ネク
ロシス フアクターなどが知られている。 リンホトキシンは、青木隆一ほか共著『リンホ
カイン』新免疫学叢書６、87〜105頁（1979年）
医学書院、Bloom B.R.＆Glade P.R.共編「In
Vitro methods in cell−mediated immunity」
Academic Press（1971年）およびCellular
Immunology Vol.38、388〜402頁（1978年）な
どに記載され、ツモア ネクロシス フアクター
は、Carswe11 E.A.et al.，Pr.Natl.Acad.Sci.，
U.S.A.，Vol.72、No.９ 3666〜3670頁（1975年）
およびE.Pick編Tumor Necrosis Factor in
Lymphokines Vol.．235〜272頁、Academic
Press（1981年）などの記載されている。 また、最近、大西治夫らが特開昭58−146293号
公報でリンホカインの一種である抗腫瘍性糖蛋白
質を明らかにしている。 本発明者らは、リンホカインについて多年研究
してきた。その結果、従来知られているこれらリ
ンホカインとは全く違つた理化学的性質を有する
新リンホカインの存在を認め、その製造方法を
確立し、さらに各種悪性腫瘍細胞に対する細胞障
害活性を認め、その用途を確立して本発明を完成
した。 すなわち、本発明は、理化学的性質が、 分子量 20000±2000 等電点 pI＝5.6±0.2 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶、エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示す 作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L929細胞に対して細胞障害活性を示し、インタ
ーフエロン活性を実質的に示さず 水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで
安定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0
乃至11.0の範囲で安定、デイスパーゼ
（DISPASE）処理により不安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である
新リンホカイン（本明細書を通じて、本物質
を新リンホカインと云う。）と、その製造方
法および用途に関する。 新リンホカインの製造方法は、新リンホカイ
ン産生能を有するヒト由来の細胞、例えば白血
球、リンパ球、培養株化された細胞などに誘導剤
を作用させて生成せしめればよい。 ヒト由来の白血球、リンパ球は、ヒトから採取
した血液を分離して調整すればよい。 培養株化されたヒト由来の細胞は、常法に従つ
て、生体外（in vitro）で増殖させた細胞が使用
できる。 しかしながら、本発明の場合には、培養株化さ
れた細胞の増殖に際し、ヒト以外の温血動物体内
に直接移植するか、または拡散チヤンバー内へ接
種して、その温血動物の体液の供給を受けながら
増殖させる方が望ましい。 即ち、生体外（in vitro）で増殖させる場合と
は違つて、高価な血清などを含む栄養培地が不
要、または大幅に節約できるばかりではなく、細
胞増殖中の維持管理も極めて容易であり、その
上、得られた細胞から誘導生成される新リンホカ
イン活性が高い特徴を有している。 ヒト以外の温血動物を利用する方法は、培養株
化されたヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物
体内に移植し、あるいは、その動物の体液の供給
を受けることのできる拡散チヤンバーを動物体内
に埋設して通常の飼育をすれば、温血動物体から
供給される栄養物を含有する体液を利用してその
細胞が容易に増殖しうるのである。 更に、生体外（in vitro）で増殖させる場合と
比較して、この細胞の増殖が安定であること、そ
の増殖速度が大きいこと、得られる細胞量が多い
こと、更には、細胞当りの新リンホカインＩの収
量が著しく増加することも大きな特徴である。 本発明で使用する培養株化されたヒト由来の細
胞は、ヒト以外の温血動物体内に移植して容易に
移植し得て、しかも新リンホカイン産生能を有
する細胞であればよく、例えば、「蛋白質核酸酵
素Vol.20、No.６」616〜643頁（1975年）に記載さ
れているヒト由来の各種株化細胞を用いることが
できる。とりわけ、「Journal of Clinical
Microbiology Vol.1」116〜117頁（1975年）に
記載されているNamalva細胞、Ｉ，Miyoshi著
「Nature Vol.267」843〜844頁（1977年）に記載
されているBALL−１細胞、TALL−１細胞、
NALL−１細胞、「Journal of Immunology
Vol.113」1334〜1345頁（1974年）記載のＭ−
7002細胞、Ｂ−7101細胞、「組織培養」第６巻、
第13号、527〜546頁（1980年）に記載されている
JBL細胞、EBV−Sa細胞、EBV−wa細胞、
EBV−HO細胞、MOLT−３細胞や、その他
BALM2細胞、CCRF−SB細胞（ATCC CCL
120）CCRF−CEM細胞、DND−41細胞などの
株化されたリンパ芽球様細胞や、また、正常な単
核細胞顆粒性白血球細胞などを各種ウイルス、薬
剤、放射線などで処理し培養株化させた細胞など
が好適である。 また、これらヒト由来の細胞の新リンホカイン
産性能を有する遺伝子を、例えば、ポリエチレ
ングルコールやセンダイウイルスなどを利用する
細胞融合の手段、DNAリガーゼ、制限酵素（ヌ
クレアーゼ）、DNAポリメラーゼなどの酵素を利
用する遺伝子組み換えの手段などによつて処理
し、その増殖速度を高めたり、細胞当りの新リン
ホカイン産生能を高めたりして使用してもよ
く、本明細書に記載する株化細胞のみに限定され
るものではない。これらの細胞は、後に述べる新
リンホカインを誘導生成させるまでの過程で、
単独、または２種以上を混合して自由に利用され
る。必要ならば、これに、例えばヒトから採取し
調製される白血球、リンパ球などを併用すること
もできる。 本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞
が増殖し得るものであればよく、例えばニワト
リ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサ
ギ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、モルモツト、ラツ
ト、ヌードラツト、ハムスター、普通マウス、ヌ
ードマウスなどの哺乳類が使用できる。 これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好
ましくない免疫反応を起すおそれがあるので、そ
の反応をできるだけ抑えるため、使用する動物は
できるだけ幼若な状態、即ち卵、胚、胎児、また
は新生期、幼少期のものの方が好ましい。 また、これら動物に例えば200〜600レム程度の
エツクス線若しくはガンマ線を照射するか、また
は抗血清若しくは免疫抑制剤などを注射するなど
の前処理をほどこして、免疫反応を弱めて移植し
てもよい。 使用する動物がヌードマウスあるいはヌードラ
ツトの場合には、成長したものであつても免疫反
応が弱いので、これらの前処理を必要とすること
もなく、培養株化されたヒト由来の細胞が移植で
き、急速に増殖できるので特に好都合である。 また、培養株化されたヒト由来の細胞を例えば
先づハムスターに移植し移植させた後、この細胞
を更にヌードマウスに移植するなどのように、ヒ
ト以外の温血動物間で移植してヒト由来の細胞の
増殖をより安定化したり、更にそれらから誘導生
成される新リンホカイン量を増加させることも
自由である。 この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同綱
間、同門間移植であつてもよい。ヒト由来の細胞
を移植する動物体内の部位は、移植した細胞が増
殖しうる部位であればよく、例えば尿液腔、静
脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる。 また、動物体内にヒト由来の細胞を移植するこ
となく、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾
過膜、例えば孔径約10-7〜10-5ｍを有するメンプ
ランフイルター、限外濾過膜またはフオローフア
イバーなどを設けた公知の各種形状、大きさの拡
散チヤンバーを動物体内、例えば腹腔内に埋設し
て、動物体からの栄養物を含む体液の供給を受け
つつ、そのチヤンバー内で前述の培養株化された
ヒト由来の細胞を何れも増殖させることができ
る。 また必要に応じて、このチヤンバー内の栄養物
を含む溶液を動物体内の体液と接続し、潅流させ
るようにしたチヤンバーを、例えば動物体表に取
付け、チヤンバー内のヒト由来の細胞の移植状態
をその表面に設けた窓を通じて透視できるように
することも、また、このチヤンバー部分のみを着
脱交換できるようにして動物を屠殺せずに寿命一
杯細胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産量
を更に高めることもできる。 これらの拡散チヤンバーを利用する方法は、ヒ
ト由来の細胞が動物細胞と直接接触しないので、
ヒト由来の細胞のみが容易に採取できるだけでな
く、好ましくない免疫反応を起す心配も少ないの
で、免疫反応を抑制する前処置の必要もなく、各
種温血動物を自由に利用できる特徴を有してい
る。 移植した動物の維持管理は、その動物の通常の
飼育管理を続ければよく、移植後といえども特別
の取扱いは何ら必要としないので好都合である。 ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は通常
１〜10週の期間で目的を達成することができる。
このようにして得られるヒト由来の細胞数は動物
個体当り約107〜1012個、またはそれ以上に達す
ることを見出した。 換言すれば、動物生体内で増殖させたヒト由来
の細胞数は、動物個体当り移植した細胞数の約
102〜107倍、またはそれ以上にも達し、生体外の
栄養培地に接種して増殖させる場合の約101〜106
倍、またはそれ以上にも達して、新リンホカイン
の製造のために極めて好都合である。 このようにして増殖させたヒト由来の細胞から
新リンホカインを誘導生成させる方法は自由で
ある。それが、増殖した動物体内のままで新ホカ
イン誘導剤を作用させることもできる。例え
ば、腹腔内の腹水に浮遊状で移植したヒト由来の
細胞に、また皮下に生じた腫瘍細胞に、新リンホ
カイン誘導剤を直接作用させて新リンホカイン
を誘導生成させ、次いで、その血清、腹水また
は腫瘍から新リンホカインを精製採取すればよ
い。 また、ヒト由来の増殖細胞をヒト以外の動物体
内から取り出し、生体外で新リンホカイン誘導
体を作用させて新リンホカインを誘導生成させ
ることもできる。例えば、腹水中で増殖したヒト
由来の細胞を採取し、または皮下に生じたヒト由
来の細胞を含む腫瘍を摘出、分散し、得られる細
胞約20〜40℃に保つた栄養培地に細胞濃度が約
105〜108／mlになるよう浮遊させ、これに新リン
ホカイン誘導剤を作用させることによつて新リ
ンホカインを誘導生成させ、これを精製採取す
ればよい。 更に、ヒト由来の細胞を拡散チヤンバー内で増
殖させた場合は、増殖させた細胞をチヤンバー内
のままで、またはチヤンバーから取り出して、新
リンホカイン誘導剤を作用させ、新リンホカイ
ンを誘導生成させることもできる。 また、前述のようにヒト以外の温血動物を利用
して得られるヒト由来の細胞を、必要ならば、更
にインビトロで１〜４日間程度培養し細胞の増殖
世代を同調させるなどした後、新リンホカイン
誘導剤を作用させ新リンホカインを誘導生成さ
せることも自由である。 また、例えば、増殖させたヒト由来の細胞に先
づ動物体内のままで新リンホカインを誘導生成
させた後、次いで、同一動物個体の特定の部位ま
たは全体から採取したヒト由来の細胞に動物体外
で新リンホカインを誘導生成させる方法、ま
た、一度新リンホカインの誘導生成に使用した
細胞を、更に２度以上新リンホカインの誘導生
成に使用する方法、または動物体内に埋設、若し
くは接続するチヤンバーを交換して得られる細胞
数を増加させる方法などによつて、使用する動物
個体当りの新リンホカイン生成量で更に高める
ことも自由である。 本発明の新リンホカイン誘導剤としては、α
−インターフエロン誘導剤として知られているウ
イルス、核酸、ヌクレオチドなどやγ−インター
フエロン誘導剤として知られているフイトヘマグ
ルチニン、コンカナバリンＡ、ポークウイードミ
トーゲン、リポポリサツカリド、エンドトキシ
ン、多糖類、細菌などが適宜用いられる。また感
作化された細胞にとつては、抗原も新リンホカイ
ンの誘導剤である。 更に、ヒト由来の細胞から新リンホカインを
誘導生成させるに際し、新リホカイン誘導剤と
して、α−インターフエロン誘導剤とγ−インタ
ーフエロン誘導剤とを併用することにより新リン
ホカインの生産量を高めることも自由である。 また、これら誘導生成によつて新リンホカイン
が産生されるだけでなく、種特異性の高いヒト
インターフエロンも同時に産生されることが判明
した。 このことは、貴重な２種以上のヒト生理活性物
質の同時生産を可能にし、更に、ヒト由来の細胞
の高度利用を可能にし、新リンホカイン及びヒ
トインターフエロンを大量に安価に供給する点か
らきわめて好都合である。 このようにして誘導生成された新リンホカイン
は、公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、
濾過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを行うこと
によつて容易に精製分離し、採取することができ
る。更に高度の精製を必要とする場合には、例え
ば、イオン交換体への吸着−溶出、ゲル濾過およ
び等電点分画、電気泳動、イオン交換クロマトグ
ラフイー、高速度液体クロマトグラフイー、カラ
ムクロマトグラフイー、アフイニテイクロマトグ
ラフイーなど公知の方法を組合せれば、最高純度
の新リンホカインを採取することも可能であ
る。 また、このようにして得られた新リンホカイン
を、抗原としてヒト以外の温血動物を免疫し、
該動物から抗体産生細胞を採取して、この細胞と
骨髄腫細胞とを融合せしめ、得られる融合細胞か
ら抗新リンホカイン抗体産生能を有する融合細
胞を選択し、この選択細胞を増殖させ、生成した
モノクローナル抗体を、例えば、ブロムシアン活
性化セフアロースと反応させて得られる固定化モ
ノクローナル抗体を用いて精製し、高純度の新リ
ンホカインを高収率で採取することも有利に用
いることができる。 このようにいて精製し製造された新リンホカイ
ンは、理化学的性質が、 分子量 20000±2000 等電点 pI＝5.6±0.2 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶、エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示す 作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L929細胞に対して細胞障害活性を示し、インタ
ーフエロン活性を実質的に示さず 水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで、
安定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0
乃至11.0の範囲で安定、デイスパーゼ
（DISPASE）処理により不安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である ことが判明した。 また、新リンホカインは、マウスL929細胞の
みならず、各種ヒト腫瘍細胞に障害を与え死滅さ
せる能力を有しているが、ヒト正常細胞には実質
的に障害を与えないことも判明した。 従つて、新リンホカインは、これを含有する
組成物などとして、新リンホカイン感受性疾
患、例えば、悪性腫瘍の予防剤、治療剤なかで
も、従来、治療がきわめて困難とされていたヒト
の各種悪性腫瘍治療剤として有利に用いることが
できる。 新リンホカインの活性は、標的細胞として
KB細胞、またはL929細胞を用いて測定した。即
ち、KB細胞を用いる場合には、Cancer
Chemotherapy Reports Parts ３、Vol.3、No.
２、September1972の記載に準じて、KB細胞の
増殖抑制活性を測定し、L929細胞を用いる場合に
は、E.Pick編、Tumor Necrosis Factor in
“Lymphokines”Vol.、pp.245〜249、
Academic Press（1981年）の記載に準じて、ア
クチノマイシンＤ存在下でのL929細胞に与える細
胞障害活性を測定した。本明細書では、特にこと
わらない限り、L929細胞を用いる活性測定方法を
採用した。 ヒトに種特異性の高いインターフエロンの活性
は「蛋白質核酸酵素」Vol.20、No.６、616〜643頁
（1975年）に報告されているヒト羊膜由来のEL細
胞を使用して公知のプラーク半減法で測定した。 赤血球凝集価はJ.E.Salk著「Journal of
Immunology」Vol.49、87頁、（1944年）の方法
に準じて測定した。 次に、本発明を実験で説明する。 実験Ａ−１ 部分精製した新リンホカインの調
製 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法
で調製した抗血清を注射して、ハムスターの免疫
反応を弱めた後、その皮下にBALL−１細胞を移
植し、その後通常の方法で３週間飼育した。皮下
に生じた腫瘤を摘出して細切りし、生理食塩水で
分散させほぐした。得られた細胞を血清添加の
RPMI 1640培地（PH7.2）で洗浄し、同培地約２
〜106／mlになるよう懸濁した。本細胞懸濁液に
対して、ml当り約400赤血球凝集価のセンダイウ
イルスを添加し、37℃で24時間保つて新リンホカ
インを誘導生成させた。 これを約４℃、約1000ｇで遠心分離し、沈澱物
を除去し、得られた上清をPH7.2、0.01Mリン酸
塩緩衝液を含有する生理的食塩水で20時間透析
し、更に、精密濾過して得た瀘液を、抗インター
フエロン抗体を固体化している抗体カラムに流
し、その非吸着画分を採取し、更に、これをクロ
マトフオーカツシング法により活性画分を採取
し、濃縮し、凍結乾燥して新リンホカイン活性
を含有する粉末を得た。 本粉末の比活性は、約106単位／mg蛋白質であ
つた。また、新リホカインの収量は、ハムスタ
ー１匹当り約3000万単位であつた。 実験Ａ−２ 抗新リンホカイン抗体の調製 実験Ａ−１の方法で得た新リンホカインを生
理食塩水に蛋白質濃度として約0.05w／ｖ％にな
るように溶解し、これとフロイント完全アジユバ
ント乳化液とを等量混合して、この混合液0.2ml
をマウムの皮下に注射し、７日後再び同様に注射
してマウスを免疫した。その抗体産生能を有する
細胞に抗新リンホカイン抗体を誘導生成せし
め、このマウスからひ臓を摘出し、細切分散して
得られるひ臓細胞とマウス骨髄細胞P3−X63−
Ag8（Flow Laboratories社製）とを、血清無含
有Engleの最少基本培地で調製した50w／ｖ％ポ
リエチレングリコール−1000溶液（PH7.2、温度
37℃）に、それぞれ104／mlになるように浮遊さ
せて５分間保つた後、前記基本培地で20倍に希釈
し、次いで、DavisonなどがSomatic Cell
Genetics、Vol.2、175〜176頁（1976年）に報告
している方法に準じてヒポキサンチン−アミノプ
テリン−チミジン培養液で増殖しうる融合細胞を
採取し、この融合細胞から抗新リンホカイン抗
体産生能を有する融合細胞を選択した。得られた
融合細胞をマウス腹腔内に１匹当り約106個移植
して２週間飼育した後、これを屠殺して腹水、血
液などの体液を集め、遠心分離し、この上清を硫
安塩析して飽和度30〜50％の沈澱画分を集め、次
いで透析し、更に、この液を、実験Ａ−１の方法
で得た新リンホカインをブロムシアン活性化セ
フアロースと室温下で反応させて得られる固定化
新リンホカインゲルを用いてアフイニテイクロ
マトグラフイーを行ない、抗新リンホカイン抗
体画分を得、透析した後濃縮し、凍結乾燥して新
リンホカインのモノクローナル抗体粉末を採取
した。 本品は、新リンホカインの細胞障害活性に対
して免疫学的に特異的な中和活性を示した。 実験Ａ−３ 高純度に精製した新リンホカイン
の調製とその理化学的性質 実験Ａ−１の方法で調製した新リンホカイン
の部分精製品を、実験Ａ−２の方法で調製したモ
ノクローナル抗体を固定化したゲルを用いてアフ
イニテイクロマトグラフイーを行ない新リンホカ
インの活性画分を採取し、透析し、濃縮して凍
結乾燥した。 本品は、高純度に精製された新リンホカイン
であつて、その比活性は、約109単位／mg蛋白質
であつた。また、本品はKB細胞を用いる活性測
定法においてもほぼ同じ比活性を示した。 本品を用いて、理化学的性質を調査した。 分子量 K.Weber and M.Osborn、J.Biol.Chem.，
Vol.244、4406頁（1969年）の記載に準じて、
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
調べた。即ち、0.1％SDS存在下、10％アクリ
ルアミドゲルカラムに試料約10ひｇを負荷し、
カラム当り８ｍＡで４時間泳動後、抽出し、そ
の活性測定から分子量を求めたところ、20000
±2000であつた。 等電点 スウエーデン、LKB社製、等電点電気泳動
用ゲル、商品名AMPHOLINE PAGPLATE
（PH3.5〜9.5）を用いて、25W、２時間泳動し
た結果、等電点pIは5.6±0.2であつた。 電気易動度 B.J.Davis、Ann.N.Y.Acad.Sci.，Vol.121、
404頁（1964年）の記載に準じて、7.5％アクリ
ルアミドゲルカラムに試料約10μｇ負荷し、PH
8.3、カラム当り３ｍＡで２時間泳動後、抽出
してその活性測定から電気易動度を求めたとこ
ろ、Rf0.29±0.02であつた。 紫外線吸収スペクトル 株式会社島津製作所製の分光光度計、商品名
UV−250を用いて紫外部での吸収スペクトル
を調べた結果、280nｍ付近に最大吸収を示し
た。 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶。エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶であつた。 呈色反応 ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示した。 作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性および
L929細胞に対して細胞障害活性る示した。イン
ターフエロン活性は実質的に示さなかつた。 水溶液での活性安定性 (i) 熱安定性 約１×105単位／mlの試料を各温度により
PH7.2で30分間保持した後、残存する活性を
測定した結果、60℃まで安定であつた。 (ii) PH安定性 約１×106単位／mlの試料0.1mlを各PH緩衝
液（PH２〜７……Mcllvaine buffer.PH７〜
８……Phosphate buffer.PH８〜11……
Glycine−NaOH buffer）１mlに加え、４℃
で16時間保持した後、この0.1mlをPH7.2、
0.05Mリン酸塩緩衝液でPH7.2に調整して残
存する活性を測定した結果、PH4.0乃至11.0
の範囲で安定であつた。 (iii) デイスパーゼ（DISPASE）に対する安定性 約１×105単位／mlの試料にデイスパーゼ
（合同酒精株式会社製造のバシラス属細菌由
来のプロテアーゼ）100単位／mlになるよう
に加え、PH7.2、温度37℃で０乃至２時間反
応させ、経時的にサンプリングし、牛血清ア
ルブミンを1w／ｖ％になるように加えて反
応を止めた。この液の新リンホカインの残
存活性を測定した結果、新リンホカインは
デイスパーゼ処理により不安定で、その反応
につれて新リンホカインの活性が失なわれ
た。 凍結貯蔵による安定性 PH7.2の水溶液を−10℃で凍結し１ケ月間貯
蔵した後、融解し、活性を測定した結果、活性
の低下は見られなかつた。 以上の結果から、新リンホカインは、従来知
られているリンホトキシン、ツモアネクロシス
フアクター（TNF）、インターフエロンなどのリ
ンホカインとは、明らかに違つた理化学的性質を
有する。 実験Ｂ−１ 悪性腫瘍細胞に対する増殖抑制作用 実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方法で得た新
リンホカインを用いて、ヒト由来の各種細胞に
対する増殖抑制作用を調べた。 牛胎児血清を補足した公知の栄養培地１mlにヒ
ト由来の各種細胞を106個ずつとり、１日培養し
た後、これに実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方
法で調製した新リンホカインを50単位または
500単位含有する生理食塩水0.1mlを加え、37℃で
２日間培養した。培養終了後、Applied
Microbiology Vol.22、No.４、671〜677頁（1971
年）に記載されている方法に準じて、染色剤ニユ
ートラルレツドで生細胞を染色し、続いて、この
染色剤をアシドエタノールで溶出し、溶出液の
540nｍにおける吸光度から生細胞量を測定した。 なお、対照実験には、新リンホカインを含ま
ない生理食塩水0.1mlを用いた。 細胞の増殖抑制率（％）は、次の式から算出し
た。 細胞増殖抑制率（％）＝（１−新リンホカイ
ンを使用した吸光度／対照の吸光度）×100 その結果を、第１表に示した。
する新リンホカインＩとその製造方法および用途
に関する。 腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有するリンホ
カインとしては、リンホトキシンやツモア ネク
ロシス フアクターなどが知られている。 リンホトキシンは、青木隆一ほか共著『リンホ
カイン』新免疫学叢書６、87〜105頁（1979年）
医学書院、Bloom B.R.＆Glade P.R.共編「In
Vitro methods in cell−mediated immunity」
Academic Press（1971年）およびCellular
Immunology Vol.38、388〜402頁（1978年）な
どに記載され、ツモア ネクロシス フアクター
は、Carswe11 E.A.et al.，Pr.Natl.Acad.Sci.，
U.S.A.，Vol.72、No.９ 3666〜3670頁（1975年）
およびE.Pick編Tumor Necrosis Factor in
Lymphokines Vol.．235〜272頁、Academic
Press（1981年）などの記載されている。 また、最近、大西治夫らが特開昭58−146293号
公報でリンホカインの一種である抗腫瘍性糖蛋白
質を明らかにしている。 本発明者らは、リンホカインについて多年研究
してきた。その結果、従来知られているこれらリ
ンホカインとは全く違つた理化学的性質を有する
新リンホカインの存在を認め、その製造方法を
確立し、さらに各種悪性腫瘍細胞に対する細胞障
害活性を認め、その用途を確立して本発明を完成
した。 すなわち、本発明は、理化学的性質が、 分子量 20000±2000 等電点 pI＝5.6±0.2 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶、エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示す 作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L929細胞に対して細胞障害活性を示し、インタ
ーフエロン活性を実質的に示さず 水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで
安定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0
乃至11.0の範囲で安定、デイスパーゼ
（DISPASE）処理により不安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である
新リンホカイン（本明細書を通じて、本物質
を新リンホカインと云う。）と、その製造方
法および用途に関する。 新リンホカインの製造方法は、新リンホカイ
ン産生能を有するヒト由来の細胞、例えば白血
球、リンパ球、培養株化された細胞などに誘導剤
を作用させて生成せしめればよい。 ヒト由来の白血球、リンパ球は、ヒトから採取
した血液を分離して調整すればよい。 培養株化されたヒト由来の細胞は、常法に従つ
て、生体外（in vitro）で増殖させた細胞が使用
できる。 しかしながら、本発明の場合には、培養株化さ
れた細胞の増殖に際し、ヒト以外の温血動物体内
に直接移植するか、または拡散チヤンバー内へ接
種して、その温血動物の体液の供給を受けながら
増殖させる方が望ましい。 即ち、生体外（in vitro）で増殖させる場合と
は違つて、高価な血清などを含む栄養培地が不
要、または大幅に節約できるばかりではなく、細
胞増殖中の維持管理も極めて容易であり、その
上、得られた細胞から誘導生成される新リンホカ
イン活性が高い特徴を有している。 ヒト以外の温血動物を利用する方法は、培養株
化されたヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物
体内に移植し、あるいは、その動物の体液の供給
を受けることのできる拡散チヤンバーを動物体内
に埋設して通常の飼育をすれば、温血動物体から
供給される栄養物を含有する体液を利用してその
細胞が容易に増殖しうるのである。 更に、生体外（in vitro）で増殖させる場合と
比較して、この細胞の増殖が安定であること、そ
の増殖速度が大きいこと、得られる細胞量が多い
こと、更には、細胞当りの新リンホカインＩの収
量が著しく増加することも大きな特徴である。 本発明で使用する培養株化されたヒト由来の細
胞は、ヒト以外の温血動物体内に移植して容易に
移植し得て、しかも新リンホカイン産生能を有
する細胞であればよく、例えば、「蛋白質核酸酵
素Vol.20、No.６」616〜643頁（1975年）に記載さ
れているヒト由来の各種株化細胞を用いることが
できる。とりわけ、「Journal of Clinical
Microbiology Vol.1」116〜117頁（1975年）に
記載されているNamalva細胞、Ｉ，Miyoshi著
「Nature Vol.267」843〜844頁（1977年）に記載
されているBALL−１細胞、TALL−１細胞、
NALL−１細胞、「Journal of Immunology
Vol.113」1334〜1345頁（1974年）記載のＭ−
7002細胞、Ｂ−7101細胞、「組織培養」第６巻、
第13号、527〜546頁（1980年）に記載されている
JBL細胞、EBV−Sa細胞、EBV−wa細胞、
EBV−HO細胞、MOLT−３細胞や、その他
BALM2細胞、CCRF−SB細胞（ATCC CCL
120）CCRF−CEM細胞、DND−41細胞などの
株化されたリンパ芽球様細胞や、また、正常な単
核細胞顆粒性白血球細胞などを各種ウイルス、薬
剤、放射線などで処理し培養株化させた細胞など
が好適である。 また、これらヒト由来の細胞の新リンホカイン
産性能を有する遺伝子を、例えば、ポリエチレ
ングルコールやセンダイウイルスなどを利用する
細胞融合の手段、DNAリガーゼ、制限酵素（ヌ
クレアーゼ）、DNAポリメラーゼなどの酵素を利
用する遺伝子組み換えの手段などによつて処理
し、その増殖速度を高めたり、細胞当りの新リン
ホカイン産生能を高めたりして使用してもよ
く、本明細書に記載する株化細胞のみに限定され
るものではない。これらの細胞は、後に述べる新
リンホカインを誘導生成させるまでの過程で、
単独、または２種以上を混合して自由に利用され
る。必要ならば、これに、例えばヒトから採取し
調製される白血球、リンパ球などを併用すること
もできる。 本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞
が増殖し得るものであればよく、例えばニワト
リ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサ
ギ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、モルモツト、ラツ
ト、ヌードラツト、ハムスター、普通マウス、ヌ
ードマウスなどの哺乳類が使用できる。 これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好
ましくない免疫反応を起すおそれがあるので、そ
の反応をできるだけ抑えるため、使用する動物は
できるだけ幼若な状態、即ち卵、胚、胎児、また
は新生期、幼少期のものの方が好ましい。 また、これら動物に例えば200〜600レム程度の
エツクス線若しくはガンマ線を照射するか、また
は抗血清若しくは免疫抑制剤などを注射するなど
の前処理をほどこして、免疫反応を弱めて移植し
てもよい。 使用する動物がヌードマウスあるいはヌードラ
ツトの場合には、成長したものであつても免疫反
応が弱いので、これらの前処理を必要とすること
もなく、培養株化されたヒト由来の細胞が移植で
き、急速に増殖できるので特に好都合である。 また、培養株化されたヒト由来の細胞を例えば
先づハムスターに移植し移植させた後、この細胞
を更にヌードマウスに移植するなどのように、ヒ
ト以外の温血動物間で移植してヒト由来の細胞の
増殖をより安定化したり、更にそれらから誘導生
成される新リンホカイン量を増加させることも
自由である。 この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同綱
間、同門間移植であつてもよい。ヒト由来の細胞
を移植する動物体内の部位は、移植した細胞が増
殖しうる部位であればよく、例えば尿液腔、静
脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる。 また、動物体内にヒト由来の細胞を移植するこ
となく、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾
過膜、例えば孔径約10-7〜10-5ｍを有するメンプ
ランフイルター、限外濾過膜またはフオローフア
イバーなどを設けた公知の各種形状、大きさの拡
散チヤンバーを動物体内、例えば腹腔内に埋設し
て、動物体からの栄養物を含む体液の供給を受け
つつ、そのチヤンバー内で前述の培養株化された
ヒト由来の細胞を何れも増殖させることができ
る。 また必要に応じて、このチヤンバー内の栄養物
を含む溶液を動物体内の体液と接続し、潅流させ
るようにしたチヤンバーを、例えば動物体表に取
付け、チヤンバー内のヒト由来の細胞の移植状態
をその表面に設けた窓を通じて透視できるように
することも、また、このチヤンバー部分のみを着
脱交換できるようにして動物を屠殺せずに寿命一
杯細胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産量
を更に高めることもできる。 これらの拡散チヤンバーを利用する方法は、ヒ
ト由来の細胞が動物細胞と直接接触しないので、
ヒト由来の細胞のみが容易に採取できるだけでな
く、好ましくない免疫反応を起す心配も少ないの
で、免疫反応を抑制する前処置の必要もなく、各
種温血動物を自由に利用できる特徴を有してい
る。 移植した動物の維持管理は、その動物の通常の
飼育管理を続ければよく、移植後といえども特別
の取扱いは何ら必要としないので好都合である。 ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は通常
１〜10週の期間で目的を達成することができる。
このようにして得られるヒト由来の細胞数は動物
個体当り約107〜1012個、またはそれ以上に達す
ることを見出した。 換言すれば、動物生体内で増殖させたヒト由来
の細胞数は、動物個体当り移植した細胞数の約
102〜107倍、またはそれ以上にも達し、生体外の
栄養培地に接種して増殖させる場合の約101〜106
倍、またはそれ以上にも達して、新リンホカイン
の製造のために極めて好都合である。 このようにして増殖させたヒト由来の細胞から
新リンホカインを誘導生成させる方法は自由で
ある。それが、増殖した動物体内のままで新ホカ
イン誘導剤を作用させることもできる。例え
ば、腹腔内の腹水に浮遊状で移植したヒト由来の
細胞に、また皮下に生じた腫瘍細胞に、新リンホ
カイン誘導剤を直接作用させて新リンホカイン
を誘導生成させ、次いで、その血清、腹水また
は腫瘍から新リンホカインを精製採取すればよ
い。 また、ヒト由来の増殖細胞をヒト以外の動物体
内から取り出し、生体外で新リンホカイン誘導
体を作用させて新リンホカインを誘導生成させ
ることもできる。例えば、腹水中で増殖したヒト
由来の細胞を採取し、または皮下に生じたヒト由
来の細胞を含む腫瘍を摘出、分散し、得られる細
胞約20〜40℃に保つた栄養培地に細胞濃度が約
105〜108／mlになるよう浮遊させ、これに新リン
ホカイン誘導剤を作用させることによつて新リ
ンホカインを誘導生成させ、これを精製採取す
ればよい。 更に、ヒト由来の細胞を拡散チヤンバー内で増
殖させた場合は、増殖させた細胞をチヤンバー内
のままで、またはチヤンバーから取り出して、新
リンホカイン誘導剤を作用させ、新リンホカイ
ンを誘導生成させることもできる。 また、前述のようにヒト以外の温血動物を利用
して得られるヒト由来の細胞を、必要ならば、更
にインビトロで１〜４日間程度培養し細胞の増殖
世代を同調させるなどした後、新リンホカイン
誘導剤を作用させ新リンホカインを誘導生成さ
せることも自由である。 また、例えば、増殖させたヒト由来の細胞に先
づ動物体内のままで新リンホカインを誘導生成
させた後、次いで、同一動物個体の特定の部位ま
たは全体から採取したヒト由来の細胞に動物体外
で新リンホカインを誘導生成させる方法、ま
た、一度新リンホカインの誘導生成に使用した
細胞を、更に２度以上新リンホカインの誘導生
成に使用する方法、または動物体内に埋設、若し
くは接続するチヤンバーを交換して得られる細胞
数を増加させる方法などによつて、使用する動物
個体当りの新リンホカイン生成量で更に高める
ことも自由である。 本発明の新リンホカイン誘導剤としては、α
−インターフエロン誘導剤として知られているウ
イルス、核酸、ヌクレオチドなどやγ−インター
フエロン誘導剤として知られているフイトヘマグ
ルチニン、コンカナバリンＡ、ポークウイードミ
トーゲン、リポポリサツカリド、エンドトキシ
ン、多糖類、細菌などが適宜用いられる。また感
作化された細胞にとつては、抗原も新リンホカイ
ンの誘導剤である。 更に、ヒト由来の細胞から新リンホカインを
誘導生成させるに際し、新リホカイン誘導剤と
して、α−インターフエロン誘導剤とγ−インタ
ーフエロン誘導剤とを併用することにより新リン
ホカインの生産量を高めることも自由である。 また、これら誘導生成によつて新リンホカイン
が産生されるだけでなく、種特異性の高いヒト
インターフエロンも同時に産生されることが判明
した。 このことは、貴重な２種以上のヒト生理活性物
質の同時生産を可能にし、更に、ヒト由来の細胞
の高度利用を可能にし、新リンホカイン及びヒ
トインターフエロンを大量に安価に供給する点か
らきわめて好都合である。 このようにして誘導生成された新リンホカイン
は、公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、
濾過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを行うこと
によつて容易に精製分離し、採取することができ
る。更に高度の精製を必要とする場合には、例え
ば、イオン交換体への吸着−溶出、ゲル濾過およ
び等電点分画、電気泳動、イオン交換クロマトグ
ラフイー、高速度液体クロマトグラフイー、カラ
ムクロマトグラフイー、アフイニテイクロマトグ
ラフイーなど公知の方法を組合せれば、最高純度
の新リンホカインを採取することも可能であ
る。 また、このようにして得られた新リンホカイン
を、抗原としてヒト以外の温血動物を免疫し、
該動物から抗体産生細胞を採取して、この細胞と
骨髄腫細胞とを融合せしめ、得られる融合細胞か
ら抗新リンホカイン抗体産生能を有する融合細
胞を選択し、この選択細胞を増殖させ、生成した
モノクローナル抗体を、例えば、ブロムシアン活
性化セフアロースと反応させて得られる固定化モ
ノクローナル抗体を用いて精製し、高純度の新リ
ンホカインを高収率で採取することも有利に用
いることができる。 このようにいて精製し製造された新リンホカイ
ンは、理化学的性質が、 分子量 20000±2000 等電点 pI＝5.6±0.2 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶、エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示す 作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L929細胞に対して細胞障害活性を示し、インタ
ーフエロン活性を実質的に示さず 水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで、
安定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0
乃至11.0の範囲で安定、デイスパーゼ
（DISPASE）処理により不安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である ことが判明した。 また、新リンホカインは、マウスL929細胞の
みならず、各種ヒト腫瘍細胞に障害を与え死滅さ
せる能力を有しているが、ヒト正常細胞には実質
的に障害を与えないことも判明した。 従つて、新リンホカインは、これを含有する
組成物などとして、新リンホカイン感受性疾
患、例えば、悪性腫瘍の予防剤、治療剤なかで
も、従来、治療がきわめて困難とされていたヒト
の各種悪性腫瘍治療剤として有利に用いることが
できる。 新リンホカインの活性は、標的細胞として
KB細胞、またはL929細胞を用いて測定した。即
ち、KB細胞を用いる場合には、Cancer
Chemotherapy Reports Parts ３、Vol.3、No.
２、September1972の記載に準じて、KB細胞の
増殖抑制活性を測定し、L929細胞を用いる場合に
は、E.Pick編、Tumor Necrosis Factor in
“Lymphokines”Vol.、pp.245〜249、
Academic Press（1981年）の記載に準じて、ア
クチノマイシンＤ存在下でのL929細胞に与える細
胞障害活性を測定した。本明細書では、特にこと
わらない限り、L929細胞を用いる活性測定方法を
採用した。 ヒトに種特異性の高いインターフエロンの活性
は「蛋白質核酸酵素」Vol.20、No.６、616〜643頁
（1975年）に報告されているヒト羊膜由来のEL細
胞を使用して公知のプラーク半減法で測定した。 赤血球凝集価はJ.E.Salk著「Journal of
Immunology」Vol.49、87頁、（1944年）の方法
に準じて測定した。 次に、本発明を実験で説明する。 実験Ａ−１ 部分精製した新リンホカインの調
製 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法
で調製した抗血清を注射して、ハムスターの免疫
反応を弱めた後、その皮下にBALL−１細胞を移
植し、その後通常の方法で３週間飼育した。皮下
に生じた腫瘤を摘出して細切りし、生理食塩水で
分散させほぐした。得られた細胞を血清添加の
RPMI 1640培地（PH7.2）で洗浄し、同培地約２
〜106／mlになるよう懸濁した。本細胞懸濁液に
対して、ml当り約400赤血球凝集価のセンダイウ
イルスを添加し、37℃で24時間保つて新リンホカ
インを誘導生成させた。 これを約４℃、約1000ｇで遠心分離し、沈澱物
を除去し、得られた上清をPH7.2、0.01Mリン酸
塩緩衝液を含有する生理的食塩水で20時間透析
し、更に、精密濾過して得た瀘液を、抗インター
フエロン抗体を固体化している抗体カラムに流
し、その非吸着画分を採取し、更に、これをクロ
マトフオーカツシング法により活性画分を採取
し、濃縮し、凍結乾燥して新リンホカイン活性
を含有する粉末を得た。 本粉末の比活性は、約106単位／mg蛋白質であ
つた。また、新リホカインの収量は、ハムスタ
ー１匹当り約3000万単位であつた。 実験Ａ−２ 抗新リンホカイン抗体の調製 実験Ａ−１の方法で得た新リンホカインを生
理食塩水に蛋白質濃度として約0.05w／ｖ％にな
るように溶解し、これとフロイント完全アジユバ
ント乳化液とを等量混合して、この混合液0.2ml
をマウムの皮下に注射し、７日後再び同様に注射
してマウスを免疫した。その抗体産生能を有する
細胞に抗新リンホカイン抗体を誘導生成せし
め、このマウスからひ臓を摘出し、細切分散して
得られるひ臓細胞とマウス骨髄細胞P3−X63−
Ag8（Flow Laboratories社製）とを、血清無含
有Engleの最少基本培地で調製した50w／ｖ％ポ
リエチレングリコール−1000溶液（PH7.2、温度
37℃）に、それぞれ104／mlになるように浮遊さ
せて５分間保つた後、前記基本培地で20倍に希釈
し、次いで、DavisonなどがSomatic Cell
Genetics、Vol.2、175〜176頁（1976年）に報告
している方法に準じてヒポキサンチン−アミノプ
テリン−チミジン培養液で増殖しうる融合細胞を
採取し、この融合細胞から抗新リンホカイン抗
体産生能を有する融合細胞を選択した。得られた
融合細胞をマウス腹腔内に１匹当り約106個移植
して２週間飼育した後、これを屠殺して腹水、血
液などの体液を集め、遠心分離し、この上清を硫
安塩析して飽和度30〜50％の沈澱画分を集め、次
いで透析し、更に、この液を、実験Ａ−１の方法
で得た新リンホカインをブロムシアン活性化セ
フアロースと室温下で反応させて得られる固定化
新リンホカインゲルを用いてアフイニテイクロ
マトグラフイーを行ない、抗新リンホカイン抗
体画分を得、透析した後濃縮し、凍結乾燥して新
リンホカインのモノクローナル抗体粉末を採取
した。 本品は、新リンホカインの細胞障害活性に対
して免疫学的に特異的な中和活性を示した。 実験Ａ−３ 高純度に精製した新リンホカイン
の調製とその理化学的性質 実験Ａ−１の方法で調製した新リンホカイン
の部分精製品を、実験Ａ−２の方法で調製したモ
ノクローナル抗体を固定化したゲルを用いてアフ
イニテイクロマトグラフイーを行ない新リンホカ
インの活性画分を採取し、透析し、濃縮して凍
結乾燥した。 本品は、高純度に精製された新リンホカイン
であつて、その比活性は、約109単位／mg蛋白質
であつた。また、本品はKB細胞を用いる活性測
定法においてもほぼ同じ比活性を示した。 本品を用いて、理化学的性質を調査した。 分子量 K.Weber and M.Osborn、J.Biol.Chem.，
Vol.244、4406頁（1969年）の記載に準じて、
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
調べた。即ち、0.1％SDS存在下、10％アクリ
ルアミドゲルカラムに試料約10ひｇを負荷し、
カラム当り８ｍＡで４時間泳動後、抽出し、そ
の活性測定から分子量を求めたところ、20000
±2000であつた。 等電点 スウエーデン、LKB社製、等電点電気泳動
用ゲル、商品名AMPHOLINE PAGPLATE
（PH3.5〜9.5）を用いて、25W、２時間泳動し
た結果、等電点pIは5.6±0.2であつた。 電気易動度 B.J.Davis、Ann.N.Y.Acad.Sci.，Vol.121、
404頁（1964年）の記載に準じて、7.5％アクリ
ルアミドゲルカラムに試料約10μｇ負荷し、PH
8.3、カラム当り３ｍＡで２時間泳動後、抽出
してその活性測定から電気易動度を求めたとこ
ろ、Rf0.29±0.02であつた。 紫外線吸収スペクトル 株式会社島津製作所製の分光光度計、商品名
UV−250を用いて紫外部での吸収スペクトル
を調べた結果、280nｍ付近に最大吸収を示し
た。 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶。エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶であつた。 呈色反応 ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示した。 作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性および
L929細胞に対して細胞障害活性る示した。イン
ターフエロン活性は実質的に示さなかつた。 水溶液での活性安定性 (i) 熱安定性 約１×105単位／mlの試料を各温度により
PH7.2で30分間保持した後、残存する活性を
測定した結果、60℃まで安定であつた。 (ii) PH安定性 約１×106単位／mlの試料0.1mlを各PH緩衝
液（PH２〜７……Mcllvaine buffer.PH７〜
８……Phosphate buffer.PH８〜11……
Glycine−NaOH buffer）１mlに加え、４℃
で16時間保持した後、この0.1mlをPH7.2、
0.05Mリン酸塩緩衝液でPH7.2に調整して残
存する活性を測定した結果、PH4.0乃至11.0
の範囲で安定であつた。 (iii) デイスパーゼ（DISPASE）に対する安定性 約１×105単位／mlの試料にデイスパーゼ
（合同酒精株式会社製造のバシラス属細菌由
来のプロテアーゼ）100単位／mlになるよう
に加え、PH7.2、温度37℃で０乃至２時間反
応させ、経時的にサンプリングし、牛血清ア
ルブミンを1w／ｖ％になるように加えて反
応を止めた。この液の新リンホカインの残
存活性を測定した結果、新リンホカインは
デイスパーゼ処理により不安定で、その反応
につれて新リンホカインの活性が失なわれ
た。 凍結貯蔵による安定性 PH7.2の水溶液を−10℃で凍結し１ケ月間貯
蔵した後、融解し、活性を測定した結果、活性
の低下は見られなかつた。 以上の結果から、新リンホカインは、従来知
られているリンホトキシン、ツモアネクロシス
フアクター（TNF）、インターフエロンなどのリ
ンホカインとは、明らかに違つた理化学的性質を
有する。 実験Ｂ−１ 悪性腫瘍細胞に対する増殖抑制作用 実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方法で得た新
リンホカインを用いて、ヒト由来の各種細胞に
対する増殖抑制作用を調べた。 牛胎児血清を補足した公知の栄養培地１mlにヒ
ト由来の各種細胞を106個ずつとり、１日培養し
た後、これに実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方
法で調製した新リンホカインを50単位または
500単位含有する生理食塩水0.1mlを加え、37℃で
２日間培養した。培養終了後、Applied
Microbiology Vol.22、No.４、671〜677頁（1971
年）に記載されている方法に準じて、染色剤ニユ
ートラルレツドで生細胞を染色し、続いて、この
染色剤をアシドエタノールで溶出し、溶出液の
540nｍにおける吸光度から生細胞量を測定した。 なお、対照実験には、新リンホカインを含ま
ない生理食塩水0.1mlを用いた。 細胞の増殖抑制率（％）は、次の式から算出し
た。 細胞増殖抑制率（％）＝（１−新リンホカイ
ンを使用した吸光度／対照の吸光度）×100 その結果を、第１表に示した。
【表】
第１表の結果から明らかなように、新リンホカ
インは、正常細胞に対してほとんど影響を与え
ず、各種の悪性腫瘍細胞に対してはその増殖を著
しく抑制することが判明した。また、その効果
は、高度に精製したもののみならず、部分精製し
たものであつてもよいことが判明した。 実験Ｂ−２ BALB／Ｃマウスに、マウス肉腫Meth−Ａ細
胞を移植し、その後移植10日目から、実験Ａ−３
の方法で得られた新リンホカインを生理食塩水
に溶解した状態で、毎日１回、100または1000単
位／Kgずつ15日間静脈注射を行つた。その後、マ
ウスを屠殺して腫瘍の重量を測定した。 その結果、第２表に示した。
インは、正常細胞に対してほとんど影響を与え
ず、各種の悪性腫瘍細胞に対してはその増殖を著
しく抑制することが判明した。また、その効果
は、高度に精製したもののみならず、部分精製し
たものであつてもよいことが判明した。 実験Ｂ−２ BALB／Ｃマウスに、マウス肉腫Meth−Ａ細
胞を移植し、その後移植10日目から、実験Ａ−３
の方法で得られた新リンホカインを生理食塩水
に溶解した状態で、毎日１回、100または1000単
位／Kgずつ15日間静脈注射を行つた。その後、マ
ウスを屠殺して腫瘍の重量を測定した。 その結果、第２表に示した。
【表】
＊ 危険率５％以下で、対照の値に比較
し、推計学的に有意差あり。
実験Ｂ−３ BALB／Ｃ由来ヌードマウスにヒト乳癌組織
片を背部皮下に移植し、その腫瘍体積が約200mm3
になつた時期から、実験Ａ−１、または実験Ａ−
３の方法で得られた新リンホカインを生理食塩
水に溶解した状態で、毎日１回、100または1000
単位／Kgずつ20日間静脈注射を行つた。その後、
ヌードマウスを屠殺して腫瘍の重量を測定した。 その結果を、第３表に示した。
し、推計学的に有意差あり。
実験Ｂ−３ BALB／Ｃ由来ヌードマウスにヒト乳癌組織
片を背部皮下に移植し、その腫瘍体積が約200mm3
になつた時期から、実験Ａ−１、または実験Ａ−
３の方法で得られた新リンホカインを生理食塩
水に溶解した状態で、毎日１回、100または1000
単位／Kgずつ20日間静脈注射を行つた。その後、
ヌードマウスを屠殺して腫瘍の重量を測定した。 その結果を、第３表に示した。
【表】
＊ 危険率５％以下で、対照の値に比較
し、推計学的に有意差あり。
実験Ｂ−４ 生後20日のマウスを使用して、実験Ａ−３の方
法で得られた新リンホカインの急性毒性試験を
したところ、新リンホカインの毒性は極めて低
く、腹腔内に注射した時のLD50は、109単位以上
であることが判明した。 以上の実験からも明らかなように、本発明の新
リンホカインは、生体外（in vitro）のみなら
ず、生体内においても悪性腫瘍の増殖抑制に有効
であり、その有効用量から見て安定性は極めて高
い。 本発明の新リンホカインの成人１日当りの用
量は５〜500000000単位であり、好ましくは局所
注射および点眼などの局所適用用量は５〜
10000000単位、軟膏または坐剤などの経皮または
経粘皮適用の場合10〜50000000単位、静注および
筋注など全身注射の場合50〜100000000単位、経
口投与の場合500〜500000000単位であるが、用法
あるいは症状に応じて適宜増減することができ
る。必要に応じて任意、慣用の製薬用担体、基剤
あるいは賦形剤とともに慣用の方法で医療用製剤
に調製することができる。その使用量は、新リン
ホカインの毒性、有効量および安全性を考慮す
ると医療用製剤グラム当り５単位以上の新リンホ
カインを含有せしめるのが望ましい。 新リンホカインを含有する新リンホカイン
感受性疾患予防剤、若しくは治療剤は、その目的
に応じたその形状を自由に選択できる。 経口投与剤としては、カプセル剤、錠剤、散剤
などの腸溶製剤、直腸内投与剤としては直腸坐
剤、注射剤としては、例えば、用時に注射用蒸溜
水に溶解して使用する凍結乾燥注射剤、その他点
鼻もしくは点眼、軟膏剤として用いることもでき
る。 また、新リンカホインを用いて悪性腫瘍を治
療するに際し、例えば、患者の腫瘍の一部を取
り、これを新リンカホインで処理することによ
つて、その腫瘍の免疫原性を高めた後、腫瘍患者
の体内に戻すことにより、この悪性腫瘍の治療を
より効果的に行うこともできる。 以下、実施例Ａで本発明における新リンホカイ
ンの製造例を、実施例Ｂで本発明における新リ
ンホカインの組成物である各種薬剤の製造例を
述べる。 実施例 Ａ−１ ヒト由来のリンパ芽球様細胞BALL−１細胞を
牛胎児血清を20％補足したEagleの最少基本倍地
（PH7.4）に接種し、37℃で常法に従い生体外（in
vitro）で浮遊培養した。得られた細胞を血清無
添加のEagleの最少基本培地（PH7.4）で洗浄し、
同培地に約１×107／mlになるように懸濁した。
この懸濁液にセンダイウイルスをml当り約1000赤
血球凝集価添加し、38℃で１日保つて新リンホカ
インを誘導生成させた。これを４℃、約1000ｇ
で遠心分離し、得られた上清をPH7.2、0.01Mリ
ン酸緩衝液を含有する生理食塩水で15時間透析
し、更に精密濾過して得た瀘液を実験Ａ−１と同
様に抗インターフエロン抗体のカラムに流し、そ
の非吸着画分を、実験Ａ−３で述べた方法でモノ
クローナル抗体のゲルカラムを用いてアフイニテ
イクロマグラフイーにより精製し、濃縮して比活
性約109単位／mg蛋白質を有する新リンホカイン
の濃縮液を得た。 活性収率は、誘導生成時の懸濁液１当り約
200万単位であつた。 実施例 Ａ−２ 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法
で調製した抗血清を注してハムスターの免疫反応
を弱めた後、その皮下に培養株化されたヒト由来
のリンパ芽球様細胞BALL−１細胞を移植し、そ
の後通常の方法で３週間飼育した。皮下に生じた
約15ｇの腫瘤を摘出し細切し、生理食塩水中で分
散させほぐした。得られた細胞を血清無添加の
RPMI 1640培地（PH7.2）で洗浄し、同培地に約
５〜106／mlに懸濁した。この懸濁液に、センダ
イウイルスをml当り約1000赤血球凝集価及びE.
coli由来のエンドトキシンをml当り約10μｇを添
加し、37℃で１日間保つて新リンホカインを誘
導生成させた。これを約４℃、約1000ｇで遠心分
離し、沈澱物を除去し、得られた上清をPH7.2、
0.01Mリン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水で21
時間透析し、更に精密濾過して得た瀘液を、実施
例Ａ−１と同様に抗体カラムを用いて精製し、得
られる溶液を濃縮し、凍結乾燥して比活性約109
単位／mg蛋白質を有する新リンホカインの粉末
を得た。 活性収率は、約4000万単位であつた。 実施例 Ａ−３ 成長したヌードマウスの腹腔内に、培養株化さ
れたヒト由来のリンパ芽球様細胞TALL−１細胞
を移植後、通常の方法で５週間飼育した。この腹
腔内へ、約3000赤血球凝集価のニユーカツスル病
ウイルスを紫外線によつて予めほとんど失活させ
て注入し、24時間後に屠殺して腹水を採取した。
以後、実施例Ａ−２と同様に精製し濃縮乾燥して
新リンホカインの粉末を得た。 活性収率は、ヌードマウス１匹当り約400万単
位であつた。 実施例 Ａ−４ 成長した普通マウスに約400レムのエツクス線
を予め照射してマウスの免疫能を弱めた後、その
マウスの皮下に培養株化されたヒト由来のリンパ
芽球様細胞Mono−１細胞を移植し、その後通常
の方法で３週間飼育した。皮下に生じた約10ｇの
腫瘤を摘出した後、実施例Ａ−２と同様にして細
胞を分散させた。この細胞を実施例Ａ−２と同様
に懸濁した後、この懸濁液に、センダイウイルス
をml当り約500赤血球凝集価及びコンカナバリン
Ａをml当り0.8μｇを添加し、37℃で１日間保つて
新リンホカインを誘導生成させた。以後、実施
例Ａ−２と同様に精製、濃縮、乾燥して新リンホ
カインの粉末を得た。 活性収率は、マウス１匹当り2400万単位であつ
た。 実施例 Ａ−５ 新生児のハムスターに実施例Ａ−２と同様にし
て培養株価されたヒト由来のリンパ芽球様細胞
Namalva細胞を移植し、その後通常の方法で４
週間飼育した。皮下に生じた約20ｇの腫瘤を実施
例Ａ−２と同様にほぐして約３×106／mlの細胞
懸濁液を得た。本権濁液にセンダイウイルスをml
当り約1000赤血球凝集価を添加し36℃で２日間保
つて新リンホカインを誘導生成させ次いで実施
例Ａ−１と同様に精製濃縮して新リンホカイン
の濃縮液を得た。 活性収率は、ハムスター１匹当り約2600万単位
であつた。 実施例 Ａ−６ 孔径0.5ミクロンのメンブランフイルターを設
けた内容量約10mlのプラスチツク製円筒型拡散チ
ヤンバー内に、培養株化されたヒト由来のリンパ
芽球様細胞NALL−１細胞を生理食塩水で浮遊
させ、これを成長したラツトの腹腔内に埋設し
た。このラツトを通常の方法で４週間飼育した
後、この拡散チヤンバーを取り出した。これによ
り得られたヒト由来の細胞の濃度は約５×108／
mlであつて、生体外の栄養培地に炭酸ガスインキ
ユベーター中で移植させる場合の約102倍以上に
も達することがわかつた。この細胞を実施例Ａ−
２と同様に懸濁し、この懸濁液に、ml当り約500
赤血球凝集価のニユーカツスル病ウイルスを紫外
線で予めほとんど失活させて加え、さらにフイト
ヘマグルチニンをml当り約50μｇ加え37℃で１日
間保つて新リンホカインを誘導生成させた。以
後、実施例Ａ−２と同様に精製し、濃縮、乾燥し
て新リンホカインの粉末を得た。 活性収率は、ラツト１匹当り約1000万単位であ
つた。 実施例 Ａ−７ 37℃で５日間保つたニワトリの受精卵に、ヒト
由来の株化細胞CCRF−CEM細胞を移植した後、
37℃で１週間保つた。この卵を割卵した後、増殖
細胞を採取した。この細胞を実施例Ａ−１と同様
に５×106／mlに懸濁した。この懸濁液にml当り
約500赤血球凝集価のセンダイウイルスを添加し、
37℃で１日間保つて新リンカインを誘導生成さ
せ、次いで実施例Ａ−２と同様に精製し、濃縮、
乾燥させ新リンホカインの粉末を得た。 活性収率は、受精卵10個当り約80万単位であつ
た。 実施例 Ｂ−１ 注射剤 実施例Ａ−２の方法で調製した新リンホカイン
1500000単位を200mlの生理食塩水に溶解し、メン
ブランフイルターを用いて無菌的に濾過する。瀘
液を滅菌したガラス容器に２mlづつ充填して凍結
乾燥し、これを密栓して、凍結乾燥粉末製剤とす
る。 本品は、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療
に好適である。 実施例 Ｂ−２ 軟膏剤 実施例Ａ−３の方法で調製した新リンホカイン
を常法に従い少量の流動パラフインに研和した
後、ワセリンを加え20000単位／ｇの軟膏薬とし
た。 本品は、皮膚癌、乳癌、リンパ腫などの治療に
好適である。 実施例 Ｂ−３ 点眼剤 蒸溜水800mlとβ−フエニルエチルアルコール
５mlと実施例Ａ−４の方法で調製した新リンホカ
インを20000000単位とに等張化するよう食塩を
加え蒸溜水で1000mlとし点眼剤とした。 本品は、網膜芽細胞腫などの治療に好適であ
る。 実施例 Ｂ−４ 腸溶性錠剤 常法に従つて澱粉とマルトースとを混合使用し
て打錠するに際し、実施例Ａ−７の方法で調製し
た新リンホカインを製品１錠（100mg）当たり
200000単位になるように含有せしめて錠剤を製造
し、これにメチルセルロースフタレートをコーテ
イグして腸溶性錠剤とした。 本品は、大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療に好
適である。
し、推計学的に有意差あり。
実験Ｂ−４ 生後20日のマウスを使用して、実験Ａ−３の方
法で得られた新リンホカインの急性毒性試験を
したところ、新リンホカインの毒性は極めて低
く、腹腔内に注射した時のLD50は、109単位以上
であることが判明した。 以上の実験からも明らかなように、本発明の新
リンホカインは、生体外（in vitro）のみなら
ず、生体内においても悪性腫瘍の増殖抑制に有効
であり、その有効用量から見て安定性は極めて高
い。 本発明の新リンホカインの成人１日当りの用
量は５〜500000000単位であり、好ましくは局所
注射および点眼などの局所適用用量は５〜
10000000単位、軟膏または坐剤などの経皮または
経粘皮適用の場合10〜50000000単位、静注および
筋注など全身注射の場合50〜100000000単位、経
口投与の場合500〜500000000単位であるが、用法
あるいは症状に応じて適宜増減することができ
る。必要に応じて任意、慣用の製薬用担体、基剤
あるいは賦形剤とともに慣用の方法で医療用製剤
に調製することができる。その使用量は、新リン
ホカインの毒性、有効量および安全性を考慮す
ると医療用製剤グラム当り５単位以上の新リンホ
カインを含有せしめるのが望ましい。 新リンホカインを含有する新リンホカイン
感受性疾患予防剤、若しくは治療剤は、その目的
に応じたその形状を自由に選択できる。 経口投与剤としては、カプセル剤、錠剤、散剤
などの腸溶製剤、直腸内投与剤としては直腸坐
剤、注射剤としては、例えば、用時に注射用蒸溜
水に溶解して使用する凍結乾燥注射剤、その他点
鼻もしくは点眼、軟膏剤として用いることもでき
る。 また、新リンカホインを用いて悪性腫瘍を治
療するに際し、例えば、患者の腫瘍の一部を取
り、これを新リンカホインで処理することによ
つて、その腫瘍の免疫原性を高めた後、腫瘍患者
の体内に戻すことにより、この悪性腫瘍の治療を
より効果的に行うこともできる。 以下、実施例Ａで本発明における新リンホカイ
ンの製造例を、実施例Ｂで本発明における新リ
ンホカインの組成物である各種薬剤の製造例を
述べる。 実施例 Ａ−１ ヒト由来のリンパ芽球様細胞BALL−１細胞を
牛胎児血清を20％補足したEagleの最少基本倍地
（PH7.4）に接種し、37℃で常法に従い生体外（in
vitro）で浮遊培養した。得られた細胞を血清無
添加のEagleの最少基本培地（PH7.4）で洗浄し、
同培地に約１×107／mlになるように懸濁した。
この懸濁液にセンダイウイルスをml当り約1000赤
血球凝集価添加し、38℃で１日保つて新リンホカ
インを誘導生成させた。これを４℃、約1000ｇ
で遠心分離し、得られた上清をPH7.2、0.01Mリ
ン酸緩衝液を含有する生理食塩水で15時間透析
し、更に精密濾過して得た瀘液を実験Ａ−１と同
様に抗インターフエロン抗体のカラムに流し、そ
の非吸着画分を、実験Ａ−３で述べた方法でモノ
クローナル抗体のゲルカラムを用いてアフイニテ
イクロマグラフイーにより精製し、濃縮して比活
性約109単位／mg蛋白質を有する新リンホカイン
の濃縮液を得た。 活性収率は、誘導生成時の懸濁液１当り約
200万単位であつた。 実施例 Ａ−２ 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法
で調製した抗血清を注してハムスターの免疫反応
を弱めた後、その皮下に培養株化されたヒト由来
のリンパ芽球様細胞BALL−１細胞を移植し、そ
の後通常の方法で３週間飼育した。皮下に生じた
約15ｇの腫瘤を摘出し細切し、生理食塩水中で分
散させほぐした。得られた細胞を血清無添加の
RPMI 1640培地（PH7.2）で洗浄し、同培地に約
５〜106／mlに懸濁した。この懸濁液に、センダ
イウイルスをml当り約1000赤血球凝集価及びE.
coli由来のエンドトキシンをml当り約10μｇを添
加し、37℃で１日間保つて新リンホカインを誘
導生成させた。これを約４℃、約1000ｇで遠心分
離し、沈澱物を除去し、得られた上清をPH7.2、
0.01Mリン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水で21
時間透析し、更に精密濾過して得た瀘液を、実施
例Ａ−１と同様に抗体カラムを用いて精製し、得
られる溶液を濃縮し、凍結乾燥して比活性約109
単位／mg蛋白質を有する新リンホカインの粉末
を得た。 活性収率は、約4000万単位であつた。 実施例 Ａ−３ 成長したヌードマウスの腹腔内に、培養株化さ
れたヒト由来のリンパ芽球様細胞TALL−１細胞
を移植後、通常の方法で５週間飼育した。この腹
腔内へ、約3000赤血球凝集価のニユーカツスル病
ウイルスを紫外線によつて予めほとんど失活させ
て注入し、24時間後に屠殺して腹水を採取した。
以後、実施例Ａ−２と同様に精製し濃縮乾燥して
新リンホカインの粉末を得た。 活性収率は、ヌードマウス１匹当り約400万単
位であつた。 実施例 Ａ−４ 成長した普通マウスに約400レムのエツクス線
を予め照射してマウスの免疫能を弱めた後、その
マウスの皮下に培養株化されたヒト由来のリンパ
芽球様細胞Mono−１細胞を移植し、その後通常
の方法で３週間飼育した。皮下に生じた約10ｇの
腫瘤を摘出した後、実施例Ａ−２と同様にして細
胞を分散させた。この細胞を実施例Ａ−２と同様
に懸濁した後、この懸濁液に、センダイウイルス
をml当り約500赤血球凝集価及びコンカナバリン
Ａをml当り0.8μｇを添加し、37℃で１日間保つて
新リンホカインを誘導生成させた。以後、実施
例Ａ−２と同様に精製、濃縮、乾燥して新リンホ
カインの粉末を得た。 活性収率は、マウス１匹当り2400万単位であつ
た。 実施例 Ａ−５ 新生児のハムスターに実施例Ａ−２と同様にし
て培養株価されたヒト由来のリンパ芽球様細胞
Namalva細胞を移植し、その後通常の方法で４
週間飼育した。皮下に生じた約20ｇの腫瘤を実施
例Ａ−２と同様にほぐして約３×106／mlの細胞
懸濁液を得た。本権濁液にセンダイウイルスをml
当り約1000赤血球凝集価を添加し36℃で２日間保
つて新リンホカインを誘導生成させ次いで実施
例Ａ−１と同様に精製濃縮して新リンホカイン
の濃縮液を得た。 活性収率は、ハムスター１匹当り約2600万単位
であつた。 実施例 Ａ−６ 孔径0.5ミクロンのメンブランフイルターを設
けた内容量約10mlのプラスチツク製円筒型拡散チ
ヤンバー内に、培養株化されたヒト由来のリンパ
芽球様細胞NALL−１細胞を生理食塩水で浮遊
させ、これを成長したラツトの腹腔内に埋設し
た。このラツトを通常の方法で４週間飼育した
後、この拡散チヤンバーを取り出した。これによ
り得られたヒト由来の細胞の濃度は約５×108／
mlであつて、生体外の栄養培地に炭酸ガスインキ
ユベーター中で移植させる場合の約102倍以上に
も達することがわかつた。この細胞を実施例Ａ−
２と同様に懸濁し、この懸濁液に、ml当り約500
赤血球凝集価のニユーカツスル病ウイルスを紫外
線で予めほとんど失活させて加え、さらにフイト
ヘマグルチニンをml当り約50μｇ加え37℃で１日
間保つて新リンホカインを誘導生成させた。以
後、実施例Ａ−２と同様に精製し、濃縮、乾燥し
て新リンホカインの粉末を得た。 活性収率は、ラツト１匹当り約1000万単位であ
つた。 実施例 Ａ−７ 37℃で５日間保つたニワトリの受精卵に、ヒト
由来の株化細胞CCRF−CEM細胞を移植した後、
37℃で１週間保つた。この卵を割卵した後、増殖
細胞を採取した。この細胞を実施例Ａ−１と同様
に５×106／mlに懸濁した。この懸濁液にml当り
約500赤血球凝集価のセンダイウイルスを添加し、
37℃で１日間保つて新リンカインを誘導生成さ
せ、次いで実施例Ａ−２と同様に精製し、濃縮、
乾燥させ新リンホカインの粉末を得た。 活性収率は、受精卵10個当り約80万単位であつ
た。 実施例 Ｂ−１ 注射剤 実施例Ａ−２の方法で調製した新リンホカイン
1500000単位を200mlの生理食塩水に溶解し、メン
ブランフイルターを用いて無菌的に濾過する。瀘
液を滅菌したガラス容器に２mlづつ充填して凍結
乾燥し、これを密栓して、凍結乾燥粉末製剤とす
る。 本品は、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療
に好適である。 実施例 Ｂ−２ 軟膏剤 実施例Ａ−３の方法で調製した新リンホカイン
を常法に従い少量の流動パラフインに研和した
後、ワセリンを加え20000単位／ｇの軟膏薬とし
た。 本品は、皮膚癌、乳癌、リンパ腫などの治療に
好適である。 実施例 Ｂ−３ 点眼剤 蒸溜水800mlとβ−フエニルエチルアルコール
５mlと実施例Ａ−４の方法で調製した新リンホカ
インを20000000単位とに等張化するよう食塩を
加え蒸溜水で1000mlとし点眼剤とした。 本品は、網膜芽細胞腫などの治療に好適であ
る。 実施例 Ｂ−４ 腸溶性錠剤 常法に従つて澱粉とマルトースとを混合使用し
て打錠するに際し、実施例Ａ−７の方法で調製し
た新リンホカインを製品１錠（100mg）当たり
200000単位になるように含有せしめて錠剤を製造
し、これにメチルセルロースフタレートをコーテ
イグして腸溶性錠剤とした。 本品は、大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療に好
適である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 理化学的性質が、 分子量 20000±2000 等電点 pI＝5.6±0.2 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶、エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示す 作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L929細胞に対して細胞障害活性を示し、インタ
ーフエロン活性を実質的に示さず 水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで
安定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0
乃至11.0の範囲で安定、デイスパーゼ
（DISPASE）処理により不安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定 である新リンホカイン。 ２ 下記の理化学的性質を有する新リンホカイン
産性能を有するヒト由来の細胞に誘導剤を作用
させて新リンホカインを生成し採取することを
特徴とした新リンホカインの製造方法。 分子量 20000±2000 等電点 pI＝5.6±0.2 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶、エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示す 作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L929細胞に対して細胞障害活性を示し、インタ
ーフエロン活性を実質的に示さず 水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで
安定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0
乃至11.0の範囲で安定、デイスパーゼ
（DISPASE）処理により不安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定 ３ 理化学的性質が、 分子量 20000±2000 等電点 PH＝5.6±0.2 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶、エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示す 作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L929細胞に対して細胞障害活性を示し、インタ
ーフエロン活性を実質的に示さず 水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで
安定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0
乃至11.0の範囲で安定、デイスパーゼ
（DISPASE）処理により不安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定 である新リンホカインを、これに特異性を示す
モノクロナル抗体を用いて精製し、採取すること
を特徴とした特許請求の範囲第２項記載の新リン
ホカインの製造方法。 ４ 理化学的性質が、 分子量 20000±2000 等電点 pI＝5.6±0.2 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可
溶、エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロ
ホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビユーレツト法で蛋
白質陽性反応を示し、フエノール硫酸法または
アントロン硫酸法で糖質陽性反応を示す 作用 KB細胞に対して細胞増殖抑制活性をおよび
L929細胞に対して細胞障害活性を示し、インタ
ーフエロン活性を実質的に示さず 水溶液での活性安定性 PH7.2で30分間保持する条件により60℃まで
安定、４℃で16時間保持する条件によりPH4.0
乃至11.0の範囲で安定、デイスパーゼ
（DISPASE）処理により不安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定 である新リンホカインＩを含有することを特徴と
した抗腫瘍剤。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58233570A JPS60126228A (ja) | 1983-12-13 | 1983-12-13 | 新リンホカイン１とその製造方法および用途 |
| US06/675,291 US4758549A (en) | 1983-12-13 | 1984-11-27 | Lymphokine, monoclonal antibody specific to the lymphokine and their production and uses |
| GB08431152A GB2153364B (en) | 1983-12-13 | 1984-12-10 | Lymphokine, monoclonal antibody specific to the lymphokine, and their production and uses |
| FR8418868A FR2556220B1 (fr) | 1983-12-13 | 1984-12-11 | Nouveau lymphokine et anticorps monoclonal specifique de ce lymphokine, leur production et leurs utilisations |
| IT49292/84A IT1199239B (it) | 1983-12-13 | 1984-12-12 | Linfochina,anticorpo monoclonale specifico per tale linfochina,e procedimento per la loro produzione |
| CH5906/84A CH664969A5 (fr) | 1983-12-13 | 1984-12-12 | Lymphokine humain, sa production et son utilisation pour obtenir un anticorps monoclonal specifique de ce lymphokine. |
| KR1019840007900A KR930000188B1 (ko) | 1983-12-13 | 1984-12-13 | 신규 림포카인(lymphokine), 이 림포카인에 특이적인 모노클로날 항체 및 이들의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58233570A JPS60126228A (ja) | 1983-12-13 | 1983-12-13 | 新リンホカイン１とその製造方法および用途 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59010941A Division JPS60126222A (ja) | 1984-01-26 | 1984-01-26 | 新リンホカイン１の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60126228A JPS60126228A (ja) | 1985-07-05 |
| JPH0527640B2 true JPH0527640B2 (ja) | 1993-04-21 |
Family
ID=16957141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58233570A Granted JPS60126228A (ja) | 1983-12-13 | 1983-12-13 | 新リンホカイン１とその製造方法および用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60126228A (ja) |
-
1983
- 1983-12-13 JP JP58233570A patent/JPS60126228A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60126228A (ja) | 1985-07-05 |
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