JPH07274944A - 新規変異株及び蛋白加水分解物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アスペルギルス・オリーゼを変異処理し、次
いでポリエン系抗生物質耐性株を選択することにより、
蛋白分解酵素高活性変異株を製造する。これらの高活性
変異株の培養物を蛋白に作用させることによる蛋白加水
分解物の製造法、すなわち、高窒素、高グルタミン酸含
有の蛋白加水分解物の製造法を提供する。 【効果】 効率よく高活性変異株を取得できる。高活性
変異株は親株の１.５〜４.５倍のプロテアーゼ活性を有
するもので、高活性変異株の培養物を蛋白質に作用させ
て得られる蛋白加水分解物は、窒素含有率が高く、遊離
アミノ酸量、特にグルタミン酸遊離量が多いものであ
り、呈味力の強い調味料として有利に利用されるもので
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛋白加水分解酵素の高
活性変異株、及びその変異株の培養物を用いた蛋白加水
分解物の製造法に関する。詳細には、蛋白加水分解酵素
の高活性変異株を効率良く得る方法として、アスペルギ
ルス・オリーゼを変異処理後、ポリエン系抗生物質耐性
株を選択する方法を採用し、その結果得られる、ポリエ
ン系抗生物質耐性であり、蛋白加水分解酵素高活性が上
昇したアスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryza
e）である。また、該アスペルギルス・オリーゼの培養
物を脱脂大豆等の蛋白質に作用させることを特徴とする
蛋白加水分解物の製造法、すなわち、窒素含有率の高い
蛋白加水分解物、更には呈味力の強いグルタミン酸等の
アミノ酸量の含有率が高い蛋白加水分解物の製造法を提
供するものである。なお、この蛋白質加水分解物は調味
料としての利用価値が高い。

【０００２】

【従来の技術】アスペルギルス・オリーゼは、黄麹菌と
もいわれ、日本の麹菌の代表菌であり、味噌、醤油、清
酒、みりん、甘酒等の醸造に古くから用いられている最
も有用な麹カビである。このアスペルギルス・オリーゼ
の生産する蛋白加水分解酵素は、日本の伝統的な発酵調
味料である醤油、味噌等の製造に利用されており、これ
らの調味料製造においてプロテアーゼやペプチダーゼ等
の蛋白加水分解酵素の活性上昇させることは、工業的生
産において非常に重要である。従って、以前からＸ線照
射、ＵＶ照射、突然変異剤を用いた変異育種による高活
性変異株の造成は多くの報告がある（井口信義：農化,2
9,73,(1955)、井口信義,山本喜志郎：農化29,394,(195
5)、H.Sekine S.Nasuno and N.Iguchi：Agric. Biol. C
hem.,33,1477,(1969)、S.Nasuno and T.Nakadai：J. Fe
rment. Technol.,49,544,(1971)、T.Nakadai and S.Nas
uno：J. Ferment. Technol.,55,273,(1977)）。

【０００３】近年、バチルス属の菌体外酵素生産菌を変
異処理し、その後、バンコマイシン、リストセチン等の
細胞膜合成阻害剤すなわち抗生物質を付与することで、
プロテアーゼ、セルラーゼ等の菌体外酵素の生産量を２
〜４倍向上させる方法が報告されており（S.Ito Y.Ohta
M.Shimooka M.Takaiwa K.Ozaki S.Adachi and K.Okamo
to：Agric. Biol. Chem.,55(9),2387,(1991)、特公平1-
222771号）、バンコマイシン耐性変異株による細胞外酵
素の高生産はよく使用される手法となっている（H.Kawa
hara et al.,：Biosci. Biochem.,(1993) ）。

【０００４】しかしながら、真核生物における抗生物質
耐性株の報告は、ペニシリウム属に属するミコフェノー
ル酸産生株のポリエン抗生物質耐性株を選択すること
で、優れたミコフェノール酸産生変異株を得られること
（特開昭53-115880号）、サッカロミセス属に属する酵
母のポリエン系抗生物質耐性株が冷凍耐性に優れている
との報告はあるが（特開昭59-203441号）、酵素活性上
昇を目的とした抗生物質耐性株の報告はない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、アスペ
ルギルス・オリーゼの培養物を蛋白に作用させて、窒素
の含有率が高く、かつアミノ酸含有率、特に呈味力のあ
るグルタミン酸の含有率が高い蛋白加水分解物を得るた
めに、蛋白加水分解酵素の高活性変異株を造成する必要
があった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
である蛋白加水分解酵素の高活性変異株（以下高活性変
異株と略称）を効率よく得るべく方法について鋭意研究
を行った結果、アスペルギルス・オリーゼを変異処理
し、次いでポリエン系抗生物質耐性株を選択することで
高活性株を効率良く得ることを見いだした。さらに、そ
の高活性変異株の培養物を蛋白質に作用させたところ、
窒素含有率が高く、アミノ酸含有率、特に呈味力のある
グルタミン酸含有率が高い蛋白加水分解物が得られる事
を見いだし、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明はアスペルギルス・オリ
ーゼを変異処理し、次いでポリエン系抗生物質耐性株を
選択することにより、効率の良い高活性変異株の製造法
を提供するものである。また、本発明は同方法によって
得られる高活性変異株でもある。更には、これらの高活
性変異株の培養物を蛋白に作用させることによる蛋白質
加水分解物の製造法、すなわち、高窒素、高グルタミン
酸含有の蛋白加水分解物の製造法を提供するものであ
る。本発明は特許請求の範囲に記載されるとおり （１）ポリエン系抗生物質耐性であり、蛋白加水分解酵
素高活性が上昇したアスペルギルス・オリーゼ（Asperg
illus oryzae）であり、（２）（１）記載のアスペルギ
ルス・オリーゼの培養物を蛋白に作用させることを特徴
とする蛋白加水分解物の製造法である。

【０００８】本発明において用いるポリエン系抗生物質
とは、真菌その他の真核細胞の細胞膜ステロールと結合
して膜の流動性を変化させる結果、膜に傷害を与える物
質であり、その例としてはアンホテリシンＢ，ナイスタ
チン、ピマリシン等が挙げられる。

【０００９】本発明のアスペルギルス・オリーゼのポリ
エン系抗生物質耐性株（以下耐性株と略称する）は、各
種の蛋白質分解酵素を生産するアスペルギルス・オリー
ゼに、突然変異剤として従来からよく用いられるニトロ
ソグアニジンを作用させ、次いでこれらの菌株をポリエ
ン系抗生物質を高濃度含有する寒天培地上で培養し、そ
こで生育してくる耐性株を取得した。

【００１０】突然変異の誘発に関しては、変異剤として
上記のニトロソグアニジンだけではなく、ヒドロキシル
アミン、エチルメチルスルホン酸等の一般的に用いられ
るその他の化学物質、または紫外線、放射線、Ｘ線等の
照射、あるいは変異処理無しで得られる、いわゆる自然
突然変異によって取得することも可能である。

【００１１】ここで、本明細書において「耐性」とは、
ある微生物が、親株の最少生育阻止濃度以上のポリエン
系抗生物質の存在する環境下で生育できる性質を獲得し
たことをいう。従って、突然変異株の中から耐性株を選
択するには親株の最少生育阻止濃度を測定し、その濃度
以上のポリエン系抗生物質を含有する寒天培地上で突然
変異株を培養し、コロニーを形成した菌株を集めれば良
い。例えば、アンホテリンＢをポリエン系抗生物質とし
て用いる場合、アスペルギルス・オリーゼの最小生育阻
止濃度は約２０μｇ／ｍｌであり、突然変異株の中から
耐性株を選択するには、２０〜２００μｇ／ｍｌのアン
ホテリシンＢを含有する寒天培地上で突然変異株を培養
し、コロニーを形成した菌株を集めれば良い。

【００１２】また、本発明の耐性株から更に蛋白質分解
酵素の高活性変異株を取得する方法に関しては、例え
ば、脱脂大豆粉末、リン酸水素カリウムを含有する寒天
培地に耐性株の胞子懸濁液を１〜１０μlのせて４〜８
日間培養し、脱脂大豆粉末が分解されて透明帯となった
部分（分解ハロー）の半径と菌糸の半径との比から、高
活性変異株を選択する。これにより、耐性株の中で生育
不良菌株、あるいは蛋白加水分解活性の低下菌株を除去
することができ、高活性変異株を効率良く選択できる。
なお、培地中に含まれる蛋白質は目的に応じてカゼイ
ン、小麦粉、ゼラチン等を同様に用いることも可能であ
る。

【００１３】斯くして得られる本発明の高活性変異株の
うちの代表例としては、アスペルギルス・オリーゼＡＪ
１１７２８１を親株とし、これから導かれるアンホテリ
シンＢ（以下ＡＭＢと略称）耐性のアスペルギルス・オ
リーゼＡＪ１１７２８６、ＡＪ１１７２８７、ＡＪ１１
７２８９、ＡＪ１１７２９０が挙げられる。この高活性
変異株の主たる菌体学的性状は、その親株と比較して相
違はない。しかし、ＡＭＢ存在下でも生育し、しかもプ
ロテアーゼ活性が親株の１.５〜４倍ある点で著しく異
なっている。

【００１４】本発明の高活性変異株の培養物は、液体培
養物あるいは固体培養物、すなわち麹からなるものであ
る。通常、管理のし易さから液体培養が選択される。こ
れらの培養物は、各種の分解酵素を含むことから液体培
養物あるいは固体培養物をそのまま使用することが好ま
しいが、培養物から必要とする酵素を分離、精製して使
用することができる。すなわち、液体培養物から遠心分
離または濾過等によって菌体を分離し、その菌体及び培
養液から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱
法、溶媒沈澱法によって蛋白質を沈澱させたり、限外濾
過法により濃縮して酵素液とすることができ、また、通
常の精製法により分離採取した精製品を単独であるいは
組み合わせて使用することもできる。また、固体培養か
らも酵素液を抽出後、同様に分離、精製し、各々抽出
物、分離した酵素液、精製した酵素を単独であるいは組
合せで使用することができる。

【００１５】本発明における高活性変異株の液体培養に
関しては、炭素源、窒素源、無機塩類、補助因子等から
なる通常培地であり、常法に従って通気培養すれば良
い。炭素源として、例えば可溶性デンプン、小麦フスマ
あるいは小麦フスマ抽出液、グルコース、マンノース、
フラクトース、ガラクトース、シュークロース等が、窒
素源としては、例えば大豆粉、脱脂大豆、カゼイン、酵
母エキス、ペプトン、硫酸アンモニウム等が挙げられ
る。また、無機塩類としては、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリ
ウム等が、補助因子としてコーンスティープリカー、コ
メ油等の油類、シュガーエステル等の界面活性剤等が挙
げられる。また、培養条件に関しては、ｐＨ４.０〜８.
０、好ましくはｐＨ５.０〜６.０、温度は２０〜４０
℃、好ましくは２７〜３３℃の間が適当である。培養時
間は２４〜７２時間、好ましくは３６〜６０時間が適当
である。

【００１６】また、固体培養、すなわち製麹は通常の製
麹条件下で良い。麹の原料としては、例えば脱脂大豆、
膨化脱脂大豆、小麦、小麦フスマ、米等が挙げられる。

【００１７】ここで、これらの培養物に市販酵素製剤、
例えば蛋白加水分解酵素、細胞壁分解酵素、グルタミナ
ーゼ等を含む酵素液あるいは精製した酵素製剤を目的に
応じて加えても良い。

【００１８】次に、本発明の高活性変異株の培養物を作
用させる蛋白質としては、例えば大豆、小麦、コーンミ
ール、ミルクカゼイン、フィッシュミール等であり、更
に脱脂あるいは膨化等の加工を施された蛋白質あるい
は、これら原料からの分離蛋白質でも良い。

【００１９】また、高活性変異株の培養物を蛋白質に作
用させる条件について述べると、例えば原料の脱脂大
豆、分離大豆蛋白質などに高活性変異株の培養物を混合
し、５〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃にて６時間〜
１５日間、好ましくは２４時間〜１０日反応させれば良
い。反応中、防腐の目的で食塩、エタノール等を添加し
ても差し支えない。

【００２０】反応終了後、未反応の原料蛋白質、菌体等
の不溶物は遠心分離や濾過等、従来の分離法を用いて除
去すれば良い。生成した各蛋白質分解液のグルタミン酸
遊離率やアミノ酸遊離率は、酵素法によるグルタミン酸
定量、アミノ酸分析による遊離アミノ酸量、全窒素量の
測定から求めれば良い。

【００２１】

【発明の効果】本発明によれば、効率よく高活性変異株
を取得できる。本発明の高活性変異株は親株の１.５〜
４.５倍のプロテアーゼ活性を有するもので、本発明の
高活性変異株の培養物を蛋白質に作用させて得られる蛋
白加水分解物は、窒素含有率が高く、遊離アミノ酸量、
特にグルタミン酸遊離量が多いものであり、呈味力の強
い調味料として有利に利用されるものである。

【００２２】

【実施例】以下、実施例、参考例を挙げ、本発明の耐性
株、高活性変異株の分離法、及び蛋白質加水分解物の製
造法等について詳しく説明する。なお、実施例中におけ
るプロテアーゼ活性の測定法は次の通りである。プロテ
アーゼ活性測定は、通常行われているアンソン−萩原変
法（B.Hagiharaet al.,：J.Biochem., 45,185,1958）に
従い測定した。具体的には、０.７５％カゼイン溶液４
００μｌと０.２４Ｍ リン酸水素二ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ７.５）１００μｌを３７℃、５分間プレインキュベー
トし、そこへ酵素溶液（培養物の上清等）１０〜１００
μｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。反
応停止は０.１Ｍトリクロロ酢酸、０.２２Ｍ酢酸ナトリ
ウム、０.３３Ｍ酢酸の等量混合液を加えた。次に、こ
の反応溶液の上清２００μｌを、０.５５M炭酸ナトリウ
ム溶液５００μｌに加え、そこに２倍に希釈した市販の
フェノール試薬１００μｌを添加、直ちに攪拌後、３０
℃で３０分間インキュベートした。この溶液の６６０ｎ
ｍでの吸光度を測定し、酵素活性を求めた。なお、１un
itは上記条件下において１分間に１μｇチロシン相当の
Folin呈色を示す非蛋白質物質を生成する活性とする。

【００２３】（参考例）アスペルギルス・オリーゼＡＪ
１１７２８１の胞子懸濁液を、各濃度のＡＭＢを含むポ
テトデキストロース寒天培地（以下ＰＤＡ培地と略称）
に塗布し、ＡＭＢの最少生育阻止濃度を求めた。すなわ
ち、ＡＭＢを添加したＰＤＡ培地に上記アスペルギルス
・オリーゼＡＪ１１７２８１の胞子懸濁液を塗布したも
のを３０℃で５日培養し、培地表面の菌糸の生育を目視
で観察した。この結果を表１に示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】この結果から明らかなように、アスペルギ
ルス・オリーゼＡＪ１１７２８１に対する最少生育阻止
濃度は約２０μｇ／ｍｌであった。

【００２６】（実施例１）アスペルギルス・オリーゼＡ
Ｊ１１７２８１を親株としたＡＭＢ耐性株の選択法の実
施例を以下に示す。培養した親株のＰＤＡ斜面培地から
得られる胞子懸濁液に０〜４ｍｇ／ｍｌのニトロソグア
ニジン溶液を各々胞子懸濁液と等量添加し、３０℃、３
０分間インキュベートした。この胞子懸濁液を、ＡＭＢ
の最少生育阻止濃度より高濃度の５０μｇ／ｍｌ含むＰ
ＤＡ培地に塗布し、３０℃、５〜８日間培養、培地表面
に生育したコロニーを採り、ＰＤＡ培地で３０℃、４〜
７日培養した。上記操作によりＡＭＢ耐性株約２００株
を得た。

【００２７】（実施例２）ＡＭＢ耐性株より、蛋白加水
分解酵素の高活性変異株選択の実施例を以下に示す。実
施例１で得られたＡＭＢ耐性株の胞子懸濁液を表２に示
す脱脂大豆粉末を含む培地Ａに２μｌのせ、３０℃、５
〜７日培養し、菌糸の集落の周囲にできる脱脂大豆分解
による透明帯（ハロー）の半径と菌糸集落の半径との比
（以下、分解ハロー比と略称）を２３０株について測
定、親株の分解ハロー比よりも５％以上大きい株を選択
した。この結果を表３に示す。

【００２８】

【表２】

【００２９】

【表３】

【００３０】この表から明らかなように、ＡＭＢ耐性株
の分解ハロー比上昇の割合は、変異処理のみの変異株よ
りも高かった。ここで分解ハロー比が上昇したＡＭＢ耐
性株については、表４に示す液体培地Ｂで３０℃、４８
時間振とう培養し、その上清のプロテアーゼ活性を測定
した。この結果を表５に示す。

【００３１】

【表４】

【００３２】

【表５】

【００３３】この表から明らかなように、ＡＭＢ耐性株
の液体培養上清のプロテアーゼ活性は変異処理のみの変
異株と比較して、親株より上昇した高活性変異株が多く
得られた。また、その活性の最高値は親株の４.５倍に
達し、変異処理のみの変異株の３倍であった。

【００３４】このプロテアーゼ活性が４５０ｕ／ｍｌを
示した高活性変異株No.A2801をアスペルギルス・オリー
ゼ１１７２９０と命名し、工業技術院微生物工業技術研
究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４２５９として寄託し
た。

【００３５】（実施例３）次に、高活性変異株の培養物
を蛋白に作用させ得られる蛋白分解物の製造法の実施例
を以下に述べる。以下の操作は無菌的に行った。実施例
２の分解ハローにより選抜された高活性変異株の液体培
養物２０ｍｌを脱脂大豆フレーク５ｇに精製水７.５ｍ
ｌ加えてオートクレーブ（１２１℃、２０分）処理を行
ったものに加え、エタノール０.６ｍｌを混合し、３０
℃、５日間、次いで５０℃、５日間反応させた。その反
応物を遠心分離した上清について、全窒素、アミノ酸分
析によるアミノ酸遊離量、収量の測定を行い、親株と比
較した。グルタミン酸遊離率、総遊離アミノ酸量、窒素
利用率が明らかに上昇した高活性変異株の結果を表６〜
８に示す。

【００３６】

【表６】

【００３７】

【表７】

【００３８】

【表８】

【００３９】また、これらの脱脂大豆分解液のアミノ酸
分析から求めた各アミノ酸のアミノ酸遊離率（アミノ酸
遊離量（ｇ）／全窒素量（ｇ））を表９に示す。

【００４０】

【表９】

【００４１】表６〜８に示したＡＭＢ耐性の高活性変異
株No.B310、No.B1005、No.B109を各々アスペルギルス・
オリーゼＡＪ１１７２８９、ＡＪ１１７２８７、ＡＪ１
１７２８６と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託した。受託番号は、それぞれ、ＦＥＲＭ Ｐ−１
４２５８、Ｐ−１４２５７、Ｐ−１４２５６である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/62 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:69）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリエン系抗生物質耐性であり、蛋白加
   水分解酵素高活性が上昇したアスペルギルス・オリーゼ
   （Aspergillus oryzae）。
2. 【請求項２】 請求項１記載のアスペルギルス・オリー
   ゼの培養物を蛋白に作用させることを特徴とする蛋白加
   水分解物の製造法。