JPH0449658B2 - - Google Patents
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- JPH0449658B2 JPH0449658B2 JP56140668A JP14066881A JPH0449658B2 JP H0449658 B2 JPH0449658 B2 JP H0449658B2 JP 56140668 A JP56140668 A JP 56140668A JP 14066881 A JP14066881 A JP 14066881A JP H0449658 B2 JPH0449658 B2 JP H0449658B2
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- Japan
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- lymphocytes
- microcapsules
- cell
- rosette
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
-
- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/56972—White blood cells
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は改良された細胞性免疫測定法に用いる
マイクロカプセルおよびそれを用いた細胞性免疫
測定法に関するもので、さらに詳細にはリンパ球
の抗原に対する抗体を感作させたマイクロカプセ
ル、ならびに前記マイクロカプセルとヒツジ赤血
球を用いてリンパ球の細胞性免疫測定法、２種以
上の相互に識別しうる前記のマイクロカプセルを
用いてリンパ球の細胞性免疫測定法、およびリン
パ球のＢ細胞の抗原に対する抗体を感作したマイ
クロカプセルを用いてリンパ球のＢ細胞の細胞性
免疫測定法に関するものである。
マイクロカプセルおよびそれを用いた細胞性免疫
測定法に関するもので、さらに詳細にはリンパ球
の抗原に対する抗体を感作させたマイクロカプセ
ル、ならびに前記マイクロカプセルとヒツジ赤血
球を用いてリンパ球の細胞性免疫測定法、２種以
上の相互に識別しうる前記のマイクロカプセルを
用いてリンパ球の細胞性免疫測定法、およびリン
パ球のＢ細胞の抗原に対する抗体を感作したマイ
クロカプセルを用いてリンパ球のＢ細胞の細胞性
免疫測定法に関するものである。
従来臨床免疫学的にヒトリンパ球のＴ細胞とＢ
細胞の同定または計測には、一般にヒツジ赤血球
によるＥロゼツト法によりＴリンパ球の同定また
は計測が行われ、Fc受容体やC3受容体をEAまた
はEACロゼツト法により、または細胞膜表面の
免疫グロブリンを蛍光抗体法で検出する蛍光抗体
法によりＢリンパ球の同定または計測に用いられ
ている。これらの検査方法は細胞性免疫の最も基
本となる反応であり、近年Ｔ及びＢリンパ球の比
率を求め、患者の免疫機能の推定に欠くことので
きない検査法として、日常検査に次第に広く行わ
れるようになつたが、従来の方法を用いるかぎ
り、別々のプレートを用いて、Ｔ、Ｂ細胞を別個
に同定・計測しなければならず、また蛍光抗体法
では、検体量も比較的多く必要とするために患者
の肉体的負担が大きく、かつ特殊な器具や施設を
要し、技術的にも熟練を要する等の制約を受ける
などの問題点がいくつかあつた。
細胞の同定または計測には、一般にヒツジ赤血球
によるＥロゼツト法によりＴリンパ球の同定また
は計測が行われ、Fc受容体やC3受容体をEAまた
はEACロゼツト法により、または細胞膜表面の
免疫グロブリンを蛍光抗体法で検出する蛍光抗体
法によりＢリンパ球の同定または計測に用いられ
ている。これらの検査方法は細胞性免疫の最も基
本となる反応であり、近年Ｔ及びＢリンパ球の比
率を求め、患者の免疫機能の推定に欠くことので
きない検査法として、日常検査に次第に広く行わ
れるようになつたが、従来の方法を用いるかぎ
り、別々のプレートを用いて、Ｔ、Ｂ細胞を別個
に同定・計測しなければならず、また蛍光抗体法
では、検体量も比較的多く必要とするために患者
の肉体的負担が大きく、かつ特殊な器具や施設を
要し、技術的にも熟練を要する等の制約を受ける
などの問題点がいくつかあつた。
またＥロゼツト法、EAロゼツト法またはEAC
ロゼツト法においては動物の赤血球を用いるの
で、赤血球浮遊液の調製のためにきわめてわずら
わしい操作を必要とする上に長期間赤血球を保存
することができないという問題点があつた。
ロゼツト法においては動物の赤血球を用いるの
で、赤血球浮遊液の調製のためにきわめてわずら
わしい操作を必要とする上に長期間赤血球を保存
することができないという問題点があつた。
本発明者らはリンパ球の抗原に対する抗体を感
作させたマイクロカプセルを１種類、または複数
種、またはヒツジ赤血球とともに、マイクロプレ
ートなどの上に付着させたリンパ球に接触させて
免疫反応させることにより、従来方法に比べて著
しく微量の検体でリンパ球のＴ細胞、Ｂ細胞、そ
の他の細胞を１回の操作で同時に簡単に同定・計
測しうることを見出し、本発明に到達した。
作させたマイクロカプセルを１種類、または複数
種、またはヒツジ赤血球とともに、マイクロプレ
ートなどの上に付着させたリンパ球に接触させて
免疫反応させることにより、従来方法に比べて著
しく微量の検体でリンパ球のＴ細胞、Ｂ細胞、そ
の他の細胞を１回の操作で同時に簡単に同定・計
測しうることを見出し、本発明に到達した。
本発明の目的は各種のリンパ球の測定を１回の
測定操作を実施できる方法を提供することであ
る。
測定操作を実施できる方法を提供することであ
る。
本発明の他の目的は暗室設備や高価な蛍光顕微
鏡を必要とせずに通常の光学顕微鏡を用いて容易
な操作で正確に各種のリンパ球の測定を実施でき
る方法を提供することである。
鏡を必要とせずに通常の光学顕微鏡を用いて容易
な操作で正確に各種のリンパ球の測定を実施でき
る方法を提供することである。
本発明の他の目的は、マイクロカプセルの細胞
内への取りこみにより貪食機能をもつ貪食細胞を
可視的に区別できることにより、リンパ球から貪
食細胞を除去する工程を省略して各種のリンパ球
の測定を実施できる方法を提供することである。
内への取りこみにより貪食機能をもつ貪食細胞を
可視的に区別できることにより、リンパ球から貪
食細胞を除去する工程を省略して各種のリンパ球
の測定を実施できる方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は合成されたマイクロ
カプセルに各種のリンパ球の抗原に対する抗体を
感作させたマイクロカプセルを用いることにより
抗体がきわめて安定で長期間保存できるので、常
に再現性のよい正確な各種リンパ球の測定を実施
できる方法を提供することである。
カプセルに各種のリンパ球の抗原に対する抗体を
感作させたマイクロカプセルを用いることにより
抗体がきわめて安定で長期間保存できるので、常
に再現性のよい正確な各種リンパ球の測定を実施
できる方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は前記の諸目的に有用
なリンパ球の抗原に対する抗体を感作させたマイ
クロカプセルを提供することである。
なリンパ球の抗原に対する抗体を感作させたマイ
クロカプセルを提供することである。
本発明のさらに他の目的はマイクロカプセルの
内部に着色物質を有し、外壁にリンパ球の抗原に
対する抗体を感作させ、光学的に容易に識別でき
るマイクロカプセルを提供することである。
内部に着色物質を有し、外壁にリンパ球の抗原に
対する抗体を感作させ、光学的に容易に識別でき
るマイクロカプセルを提供することである。
本発明は、
(1) ポリマーからなる壁を有するマイクロカプセ
ルの壁表面にリンパ球の抗原に対する抗体を感
作させたマイクロカプセルとヒツジ赤血球とを
同時にリンパ球に適用してロゼツトを形成さ
せ、しかる後識別されるリンパ球の細胞をそれ
ぞれ別個に計測することを特徴とする細胞性免
疫測定法。
ルの壁表面にリンパ球の抗原に対する抗体を感
作させたマイクロカプセルとヒツジ赤血球とを
同時にリンパ球に適用してロゼツトを形成さ
せ、しかる後識別されるリンパ球の細胞をそれ
ぞれ別個に計測することを特徴とする細胞性免
疫測定法。
ならびに
(2) ポリマーからなる壁を有するマイクロカプセ
ルの壁表面にリンパ球の抗原に対する２種以上
の抗体を感作させた２種以上のマイクロカプセ
ルを同時にリンパ球に適用してロゼツトを形成
させ、しかる後光学的に識別されるリンパ球の
細胞をそれぞれ別個に計測することを特徴とす
る細胞性免疫測定法である。
ルの壁表面にリンパ球の抗原に対する２種以上
の抗体を感作させた２種以上のマイクロカプセ
ルを同時にリンパ球に適用してロゼツトを形成
させ、しかる後光学的に識別されるリンパ球の
細胞をそれぞれ別個に計測することを特徴とす
る細胞性免疫測定法である。
本発明に於て用いられる抗体はリンパ球の抗原
に対する抗体を用いることが出来る。例えば抗
IgG、抗IgM、抗IgA、抗Ｔ抗体、その他リンパ
球表面抗体として脳共通抗体、胸腺共通抗原など
に対する抗体を使用することが出来る。
に対する抗体を用いることが出来る。例えば抗
IgG、抗IgM、抗IgA、抗Ｔ抗体、その他リンパ
球表面抗体として脳共通抗体、胸腺共通抗原など
に対する抗体を使用することが出来る。
本発明に用いられるマイクロカプセルの着色剤
の色調としては各種の色調を用いることができる
が、羊赤血球と同時に測定する場合は羊赤血球の
色調と同様な色調でなく識別計測し易い色調にす
べきであることは云う迄もない。又二種以上のマ
イクロカプセルを使用する場合でも相互に識別計
測し易い色調にすべきであることはこれまた云う
迄もないことである。
の色調としては各種の色調を用いることができる
が、羊赤血球と同時に測定する場合は羊赤血球の
色調と同様な色調でなく識別計測し易い色調にす
べきであることは云う迄もない。又二種以上のマ
イクロカプセルを使用する場合でも相互に識別計
測し易い色調にすべきであることはこれまた云う
迄もないことである。
本発明においては測定計測し易い色素をマイク
ロカプセルの芯材に入れることが出来ることであ
る。従来一般に用いられている合成された充実微
粒子に着色したものはその着色材が直接、リンパ
球の抗原に対する抗体に接触するので抗体に悪影
響を及ぼすことが多く実用するのに困難なことが
多かつた。これに対しマイクロカプセルでは壁材
には樹脂のみで着色材は芯材に入れることができ
るので、マイクロカプセルの表面は樹脂で覆われ
ているため樹脂の種類を選択することにより抗体
に対し悪影響を与えないことが可能である。本発
明に用いることができる色素は特開昭55−94636
号明細書に開示されている色素を用いることがで
き、またポリマーからなる壁を有するマイクロカ
プセルは同明細書に開示されている製造方法に従
つて製造することができ、さらに抗体をマイクロ
カプセルの外壁に感作させる方法は同明細書に開
示の方法に準じて実施することができる。
ロカプセルの芯材に入れることが出来ることであ
る。従来一般に用いられている合成された充実微
粒子に着色したものはその着色材が直接、リンパ
球の抗原に対する抗体に接触するので抗体に悪影
響を及ぼすことが多く実用するのに困難なことが
多かつた。これに対しマイクロカプセルでは壁材
には樹脂のみで着色材は芯材に入れることができ
るので、マイクロカプセルの表面は樹脂で覆われ
ているため樹脂の種類を選択することにより抗体
に対し悪影響を与えないことが可能である。本発
明に用いることができる色素は特開昭55−94636
号明細書に開示されている色素を用いることがで
き、またポリマーからなる壁を有するマイクロカ
プセルは同明細書に開示されている製造方法に従
つて製造することができ、さらに抗体をマイクロ
カプセルの外壁に感作させる方法は同明細書に開
示の方法に準じて実施することができる。
本発明に用いるマイクロカプセルの大きさはリ
ンパ球の大きさと余り違わないことが識別計測上
有利である、即ち1μｍから10μｍの範囲が好適で
ある。
ンパ球の大きさと余り違わないことが識別計測上
有利である、即ち1μｍから10μｍの範囲が好適で
ある。
実施例および比較例
ヒツジ赤血球浮遊液
緩衝生理食塩液（PBS）で３回洗浄し、２
×108／mlになるようにウシ胎児血清（ECS）
に浮遊させた。
×108／mlになるようにウシ胎児血清（ECS）
に浮遊させた。
抗ヒト免疫グロブリンFITC標識ウサギ血清
は、ベーリング社の抗血清を１万rpmで30分遠
心後、平均孔径0.22μｍのミクロフイルターで
過し、PBSで10倍に希釈して使用した。
は、ベーリング社の抗血清を１万rpmで30分遠
心後、平均孔径0.22μｍのミクロフイルターで
過し、PBSで10倍に希釈して使用した。
固定染色液はPBSに、グルタールアルデヒ
ドを0.25％、ブリリアントクルシルブルー（C.
I.＃51010）を0.005％に溶解し使用した。
ドを0.25％、ブリリアントクルシルブルー（C.
I.＃51010）を0.005％に溶解し使用した。
プレートのpoly−Ｌ−lysine（PLL）処理は
マイクロプレート（フアルコン社製3034）の各
穴に40μｇ／mlのpoly−Ｌ−lysine（PLL、
Sigma社製）1μを入れ、室温に60分放置後、
蒸溜水で洗浄し、乾燥させて使用した。
マイクロプレート（フアルコン社製3034）の各
穴に40μｇ／mlのpoly−Ｌ−lysine（PLL、
Sigma社製）1μを入れ、室温に60分放置後、
蒸溜水で洗浄し、乾燥させて使用した。
リンパ球の分離は健康者の肘静脈より採血し
たヘパリン加末梢血液からBoyumの方法に準
じて、Ficoli−Isopaqueを用いた比重遠心法で
分離し、３回洗浄後１×106に調整した。
たヘパリン加末梢血液からBoyumの方法に準
じて、Ficoli−Isopaqueを用いた比重遠心法で
分離し、３回洗浄後１×106に調整した。
微量マイクロカプセル法は
上記のPLL処理プレートにリンパ球1.0μを
付着させた後、FCSで未反応のPLLを処理し
後記するで得られたマイクロカプセル浮遊液
25μを加えて反応させた後転倒静置し、ふり
すて（flicking）カトランペツト管で非結合粒
子を除去した。その後に記載した固定染色液
で染色し、プレートのまま顕微鏡下でリンパ球
200個を数えロゼツト形成率を求めた。計測は
すべて三重測定で行い、平均値で表現した。
付着させた後、FCSで未反応のPLLを処理し
後記するで得られたマイクロカプセル浮遊液
25μを加えて反応させた後転倒静置し、ふり
すて（flicking）カトランペツト管で非結合粒
子を除去した。その後に記載した固定染色液
で染色し、プレートのまま顕微鏡下でリンパ球
200個を数えロゼツト形成率を求めた。計測は
すべて三重測定で行い、平均値で表現した。
膜蛍光抗体法：
リンパ球２×106／ml0.5mlにFITC標識抗ヒ
ト免疫グロブリンウサギ血清0.5mlを加え、室
温で30分反応後、５％FCSを含むPBSで３回
洗浄し、蛍光顕微鏡でリンパ球200個を数え、
蛍光を発する細胞の百分率を求めた。
ト免疫グロブリンウサギ血清0.5mlを加え、室
温で30分反応後、５％FCSを含むPBSで３回
洗浄し、蛍光顕微鏡でリンパ球200個を数え、
蛍光を発する細胞の百分率を求めた。
Ｅロゼツト法：
リンパ球をPLL処理プレートに付着後に
記載したヒツジ赤血球浮遊液10mlを加え、室温
で90分、さらに４℃で一晩反応させ、ヒツジ赤
血球を除去し、固定染色してロゼツト形成率を
求め、Ｔリンパ球とした。
記載したヒツジ赤血球浮遊液10mlを加え、室温
で90分、さらに４℃で一晩反応させ、ヒツジ赤
血球を除去し、固定染色してロゼツト形成率を
求め、Ｔリンパ球とした。
同時ロゼツト法：
PLL処理プレートに付着したリンパ球に
に記載のＥロゼツト法と、に記載のマイクロ
カプセル法を組み合せて同時測定を行つた。こ
の測定は通常の光学顕微鏡を用いて行なつた。
に記載のＥロゼツト法と、に記載のマイクロ
カプセル法を組み合せて同時測定を行つた。こ
の測定は通常の光学顕微鏡を用いて行なつた。
マイクロカプセル（MC）：
ユリア樹脂を表面に持ち、平均粒径5.0μｍ、
C.I.ソルベントブルー11（C.I.＃61525）を内部
に包含させて明青色に着色されたマイクロカプ
セルを用いた。このものは比重1.15、陰荷電を
有しており、水中に10％の割で含有させた浮遊
液としたものを原液とした。
C.I.ソルベントブルー11（C.I.＃61525）を内部
に包含させて明青色に着色されたマイクロカプ
セルを用いた。このものは比重1.15、陰荷電を
有しており、水中に10％の割で含有させた浮遊
液としたものを原液とした。
MCへの抗ヒト免疫グロブリン抗体の結合：
MC原液を生理食塩液で２回洗滌し、沈渣を
20倍稀釈のPH8.6の0.1Mトリス（Tris）２−
Hcl緩衝液に浮遊させ、3.125％のグルタールア
ルデヒドを等量加え、37℃で30分反応させた
後、同じ溶媒で２回洗滌し、沈渣を２容の溶媒
に浮遊させた。これに抗体（抗ヒト免疫グロブ
リンウサギIgG）５mgを加え、37℃で１時間反
応させ、３回同じ溶媒で洗い、0.2％の割合に
グリシンを含ませたトリスーHcl緩衝液に浮遊
させた。
20倍稀釈のPH8.6の0.1Mトリス（Tris）２−
Hcl緩衝液に浮遊させ、3.125％のグルタールア
ルデヒドを等量加え、37℃で30分反応させた
後、同じ溶媒で２回洗滌し、沈渣を２容の溶媒
に浮遊させた。これに抗体（抗ヒト免疫グロブ
リンウサギIgG）５mgを加え、37℃で１時間反
応させ、３回同じ溶媒で洗い、0.2％の割合に
グリシンを含ませたトリスーHcl緩衝液に浮遊
させた。
に記載の方法で簡単に同時測定ができ、再
現性よく精度よく安定してＴ細胞81％、Ｂ細胞
19％が得られた。その他貪食細胞は容易に区別
でき、判定には支障がなかつた。Ｂ細胞のみの
測定も従来法であるに記載の方法による測定
に比して再現性よく精度のよい結果がきわめて
容易な操作により得られた。
現性よく精度よく安定してＴ細胞81％、Ｂ細胞
19％が得られた。その他貪食細胞は容易に区別
でき、判定には支障がなかつた。Ｂ細胞のみの
測定も従来法であるに記載の方法による測定
に比して再現性よく精度のよい結果がきわめて
容易な操作により得られた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ポリマーからなる壁を有するマイクロカプセ
ルの壁表面にリンパ球の抗原に対する抗体を感作
させたマイクロカプセルとヒツジ赤血球とを同時
にリンパ球に適用してロゼツトを形成させ、しか
る後識別されるリンパ球の細胞をそれぞれ別個に
計測することを特徴とする細胞性免疫測定法。 ２ ポリマーからなる壁を有するマイクロカプセ
ルの壁表面にリンパ球の抗原に対する２種以上の
抗体を感作させた２種以上のマイクロカプセルを
同時にリンパ球に適用してロゼツトを形成させ、
しかる後光学的に識別されるリンパ球の細胞をそ
れぞれ別個に計測することを特徴とする細胞性免
疫測定法。 ３ 前記２種以上のマイクロカプセルが、その内
部に互いに光学的に識別可能な色調の着色物質を
有していることを特徴とする特許請求の範囲第２
項記載の細胞性免疫測定法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56140668A JPS5842971A (ja) | 1981-09-07 | 1981-09-07 | 抗体を感作させたマイクロカプセルを用いる細胞性免疫測定法 |
| DE19823232955 DE3232955A1 (de) | 1981-09-07 | 1982-09-04 | Mit antikoerper sensibilisierte mikrokapseln und ein verfahren zur messung von lymphozyten unter verwendung derselben auf der grundlage zellvermittelter immunitaet |
| GB08225328A GB2105463B (en) | 1981-09-07 | 1982-09-06 | Microcapsules sensitized with anti-lymphocyte antibody and a method for measurement of lymphocytes |
| US06/415,300 US4483928A (en) | 1981-09-07 | 1982-09-07 | Microcapsules sensitized with antibody and a method for measurement of lymphocyte using the same based on cell-mediated immunity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56140668A JPS5842971A (ja) | 1981-09-07 | 1981-09-07 | 抗体を感作させたマイクロカプセルを用いる細胞性免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5842971A JPS5842971A (ja) | 1983-03-12 |
| JPH0449658B2 true JPH0449658B2 (ja) | 1992-08-12 |
Family
ID=15273979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56140668A Granted JPS5842971A (ja) | 1981-09-07 | 1981-09-07 | 抗体を感作させたマイクロカプセルを用いる細胞性免疫測定法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4483928A (ja) |
| JP (1) | JPS5842971A (ja) |
| DE (1) | DE3232955A1 (ja) |
| GB (1) | GB2105463B (ja) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5622871A (en) * | 1987-04-27 | 1997-04-22 | Unilever Patent Holdings B.V. | Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents |
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| US4806466A (en) * | 1981-10-29 | 1989-02-21 | The Regents Of The University Of California | Cell agglutination reagent comprising conjugates of antibody covalently bound to liposomes |
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