JPH0450000B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、被検液中の脂肪族アルコールまたは
脂肪族アルデヒドのいずれか１成分を定量する方
法において、サイクリング反応を利用する新規な
酵素的高感度測定法に関する。

従来より酵素的サイクリングとしては、NAD
（ニコチンアデニンジヌクレオチド）サイクリン
グ、NADP（ニコチンアデニンジヌクレオチドホ
スフエート）サイクリング、CoAサイクリング
が知られており、例えばエタノールを基質とし、
NADを用いてアルコールデヒドロゲナーゼを作
用せしめ、還元型NADを生成し、またこの還元
型NADはオギザル酢酸を基質としてリンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼを作用せしめてNADとなすNAD
一還元型NADのサイクリング反応を形成せしめ
るものである〔日本生化学会編、「生化学実験講
座」５巻、酵素研究法（上）第121〜135頁、株式
会社東京化学同人、1975年８月発行、森昭胤編
集、「神経伝達物質測定法マニユアル」第165〜
172頁、医歯薬出版株式会社、1979年11月発行〕。
また上記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの代りに還
元型NADオキシダーゼを用いて酸素および還元
型NADを消費して水分子およびNADを生成する
サイクリングも知られている〔理化学研究所編、
「ライフサイエンスの現状と将来」第30〜32頁、
株式会社創造ライフサイエンス研究会、1981年３
月発行〕。さらに基質としてヒドロキシステロイ
ドを用いてヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼを作用せしめ、NADを還元型NADとなし、こ
の還元型NADはテトラゾリウム塩とジアホラー
ゼなどの転位酵素の作用にてホルマザンを形成し
つつNADとなすサイクリング〔特開昭56−
144096号〕や、グルタチオンとデヒドロアスコル
ビン酸にグルタチオンデヒドロアスコルビン酸オ
キシドレダクターゼを作用せしめてデヒドロアス
コルビ酸をアスコルビン酸となし、このアスコル
ビン酸はアスコルビン酸オキシダーゼを用いて酸
素を消費して水分子およびデヒドロアスコルビン
酸を生成してなるデヒドロアスコルビン酸−アス
コルビン酸のサイクリング反応を形成せしめてな
る〔特開昭56−151498号〕も知られている。その
他特開昭56−78599号記載の酸素を消費して過酸
化水素を生成する還元型NADオキシダーゼを用
いるNADサイクリングも知られている。このよ
うに種々のサイクリング反応系が報告され、また
過酸化水素を生成する還元型NADオキシダーゼ
を用いるNADサイクリング反応も報告されてい
るが、特にこの過酸化水素を生成する還元型
NADオキシダーゼは、今だに良好に精製されて
おらず、酵素自体の精製が困難であり、かつ高価
なものであつた。

従来のアルコールオキシダーゼは、脂肪族アル
コールを脂肪族カルボン酸まで酸化する酵素であ
つて、アルデヒドの形で止めることは知られてい
なかつた。

ところが、アルコールオキシダーゼ酵素反応系
とアルコールデヒドロゲナーゼ酵素反応系を組合
せると、アルコールオキシダーゼ酵素反応系によ
る酸化作用のあるH₂O₂の生成とアルコールデヒ
ドロゲナーゼ酵素反応系のために用いる還元作用
のある還元型NAD（Ｐ）が共存する状態であるに
もかかわらず、全く意外にも、この酸化作用の
H₂O₂と還元作用の還元型NAD（Ｐ）との反応を
生ずることなく良好にサイクリング反応する新規
なサイクリング反応を見い出した。しかも、この
サイクリング反応において、反応に関与する脂肪
族アルコールまたは脂肪族アルデヒドのいずれか
１成分を含有する被検液を用いて、被検液の１成
分以外の必要とする成分であるアルコールオキシ
ダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、還元型
NAD（Ｐ）およびO₂を用いて反応せしめること
により、そのサイクリング反応は１分間当り10サ
イクル以上の定量的な反応を行い、良好に進行
し、反応によつて生ずる検出できる変化の量を定
量することにより、被検液中の成分を簡便かつ高
感度にて正確に測定できることを完成した。

本発明は上記の知見に基いて完成されたもので
あつて、被検液中の式 被検液中の脂肪族アルコールまたは脂肪族アル
デヒドのいずれか１成分を定量する方法におい
て、式 で示されるサイクリング反応を形成させるため
に、被検液中の成分とサイリング反応〔〕を形
成するアルコールオキシダーゼ、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ、還元型NAD（Ｐ）およびO₂を反
応せしめ、サイリング反応〔〕によつて生じた
検出できる変化の量を定量することを特徴とする
酵素的高感度測定法である。

まず本発明の被検液としては、脂肪族アルコー
ルまたは脂肪族アルデヒドのいずれか１成分を含
有するか、またはその１成分を遊離、生成する系
が挙げられる。特に被検液中の１成分を遊離、生
成する系としては、種々の酵素反応系による酵素
活性の測定や基質の定量の目的において供され
る。これらの酵素反応系において例示すれば、以
下の種々の反応系が挙げられるが、本発明におい
ては何んら限定されるものではない。

まず脂肪族アルコール、脂肪族アルデヒドを遊
離、生成する系を例示する。

脂肪族アルコールの例としては、エタノール、
プロパノール、ブタノールなどの低級脂肪族アル
コールがあげられ、脂肪族アルデヒドの例として
はアセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブ
チルアルデヒドの低級脂肪族アルデヒドがあげら
れるが、具体的には次のものが例示される。

(1) アルコール醗酵におけるエタノールやブタノ
ール、酒類を飲用した後の呼気や血液中のエタ
ノール量や飲食中のエタノール量。

(2) 脂肪族アルコールや脂肪族アルデヒドを基質
とする酵素反応系。

(3) RCH₂OH、RCHOを生成する酵素反応系の
酵素活性、元の基質などの定量。

これらの酵素反応系において、定量すべき成分
または活性測定すべき成分のいずれか１成分を含
有する被検液を対象とし、これにその酵素反応系
を実施する必要な試薬を加えて反応せしめる。こ
の反応液を脂肪族アルコール、脂肪族アルデヒ
ド、NAD（Ｐ）、還元型NAD（Ｐ）のいずれか１
成分を含有する被検液として用いればよく、この
際、別にその酵素反応系を行わせしめ被検液とし
て供してもよく、またはその酵素反応系を、サイ
クリング反応〔〕の系を同一媒体中で一段反応
にて行わせしめてもよい。さらにその酵素反応系
を反応せしめるに当つては、例えば被検液0.001
〜５mlを用いて、これと必要な試薬を含有する弱
酸性〜弱アルカリ性の緩衝液とを37℃にて通常１
分間以上反応せしめればよい。また用いる試薬の
量としては被検液中の測定の対象成分の量よりも
過剰に用いればよく、特に限定されるものではな
い。

前記のサイクリング反応〔〕において述べれ
ば、１モル比の脂肪族アルコールを基質として１
モル比のO₂、通常溶存酸素を消費してアルコー
ルオキシダーゼ（AOX）の作用により１モル比
の脂肪族アルデヒドおよび１モル比のH₂O₂を生
成してなるAOX系反応を生じるもので、また生
成した１モル比の脂肪族アルデヒドは１モル比の
還元型NAD（Ｐ）の存在下アルコールデヒドロゲ
ナーゼ（ADH）の作用により１モル比のNAD
（Ｐ）および１モル比の脂肪族アルコールを生成
してなるADHおよび１モル比のＲ脂肪族アルコ
ールを生成してなるADH系反応を生じるもので、
さらにこの脂肪族アルコールはAOX系反応を生
じるサイクル反応を行うものである。従つてこの
サイクル反応〔〕を行うに当つては、脂肪族ア
ルコール、脂肪族アルデヒドAOX、ADH、還元
型NAD（Ｐ）とO₂の６成分の要件にてなし得る
ものであるが、脂肪族アルコールと脂肪族アルデ
ヒドとはサイクリング反応〔〕によつていずれ
か１成分をその被検液由来として用いれば他の成
分を生成するためこの脂肪族アルコール、脂肪族
アルデヒドのいずれか１成分を被検液中の１成分
として使用すればよいものである。

さらにこのサイクリング反応〔〕における
H₂O₂と還元型NAD（Ｐ）を反応せしめてNAD
（Ｐ）を生成する、より高感度な測定法となして
もよい。即ちサイクリング反応〔〕において、
１分子のH₂O₂と１分子の還元型NAD（Ｐ）を消
費して２分子の水（H₂O）と１分子のNADを生
成する反応を触媒する酵素であるNAD（Ｐ）ペル
オキシダーゼ（EC.1.11.1.1）〔J.Biol.Chem.、
225、557（1957）〕を組合せ用いてなるもので、下
記反応〔〕にて表わされる。

このサイクリング反応〔〕においては、サイ
クリング反応〔〕にて生成したH₂O₂が、さら
に還元型NAD（Ｐ）とともに消費されてNAD
（Ｐ）を生成するために、サイクリング反応〔〕
の１サイクルにて２分子の還元型NAD（Ｐ）の消
費となるもので、サイクリング反応〔〕に比べ
て２倍の還元型NAD（Ｐ）の変化量となり、より
高感度に測定できるものとなる。

さらにまたこのNAD（Ｐ）を、NAD（Ｐ）を基
質とする第２のデヒドロゲナーゼおよびそのデヒ
ドロゲナーゼ用基質化合物により還元型NAD
（Ｐ）に変換せしめるNAD（Ｐ）、第２のデヒドロ
ゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ用基質化合物の成分
を組合せて用いてNAD（Ｐ）のサイクリング反応
を行わせ、このサイクリング反応と上記の６成分
によるサイクリング反応〔〕との組合せでもよ
く、下記反応（）にて表わされる。

従つてまずサイクリング反応〔〕に基いて被
検液中の１成分と、サイクリング反応〔〕を形
成する成分〔〓〓にて示す〕とについて述べる。

(a) 被検液中の１成分が脂肪族アルコールまたは
脂肪族アルデヒドである場合： このように脂肪族アルコールまたは脂肪族アル
デヒドを含有、または遊離、生成する酵素反応系
などの被検液中の１成分が脂肪族アルコールまた
は脂肪族アルデヒドである場合には、サイクリン
グ反応〔Ia〕を形成する成分としAOX、ADH、
O₂および還元型NAD（Ｐ）が用いられる。この
サイクリング反応〔ａ〕において、例えば
AOXは被検液中の脂肪族アルコールを基質とし
て、１分子の脂肪族アルコールとO₂とを消費し
て１分子のH₂O₂と被検液中の脂肪族アルコール
の炭素数と同一炭素数の脂肪族アルデヒドを生成
し、さらにこの脂肪族アルデヒドを基質として
ADHは１分子の同一炭素数の脂肪族アルデヒド
と一還元型NAD（Ｐ）を消費して１分子の同一炭
素数の脂肪族アルコールおよびNAD（Ｐ）の１分
子づつを生成してなるもので脂肪族アルコール−
脂肪族アルデヒドのサイクル反応を形成する。し
かしまたO₂は反応系における溶存酸素を利用す
ればよく、よつてAOX、ADHおよび還元型
NAD（Ｐ）を測定のための試薬として過剰量用い
ればよい。また、被検液中の成分が脂肪族アルデ
ヒドの場合には、前記〔ａ〕に示される各必要
成分を用いることにより、同様にそのサイクリン
グ反応を形成するものである。この被検液中の脂
肪族アルコールまたは脂肪族アルデヒドの含有量
は特に限定されるものではなく、また高濃度の場
合には希釈して用いればよい。また用いられる
AOXやADHの使用量としては特に限定されるも
のでなく、被検液中の脂肪族アルコールまたは脂
肪族アルデヒドの量に基いて適宜決定すればよ
く、脂肪族アルコールまたは脂肪族アルデヒドの
量と相対的に加減して用いればよく、通常１テス
ト当り0.01単位以上用いればよく、好ましくは
AOXは0.1〜100単位程度、ADHは通常0.1単位以
上、好ましくは５〜300単位程度であり、またこ
れ以上の量の各酵素を用いてもよい。さらに還元
型NAD（Ｐ）の使用量としては被検液中の脂肪族
アルコールまたは脂肪族アルデヒドの量と反応時
間によるサイクリング数の積以上の量を用いれば
よく、通常脂肪族アルコールまたは脂肪族アルデ
ヒドの量に比べて大過剰の量が用いられ、例えば
50倍量以上、好ましくは100〜10000倍量用いるこ
とがよく、またこの量以上用いることを何んら限
定するものではない。さらに前記サイクリング反
応〔ａ〕、即ち反応式〔ａ〕の脂肪族アルコ
ール−脂肪族アルデヒドサイクリング反応の後反
応によつて生ずる検出できる変化の量としては、
反応によつて消費されるO₂の量、消費される還
元型NAD（Ｐ）の量や生成されるH₂O₂の量が挙
げられる。また、この脂肪族アルコール−脂肪族
アルデヒドサイクリング反応における生成成分で
あるH₂O₂と消費される成分である還元型NAD
（Ｐ）を反応せしめて、より高感度にて測定して
もよい。即ち、このサイクリング反応に、１分子
H₂O₂と１分子の還元型NAD（Ｐ）を消費して２
分子の水と１分子のNADを生成する反応を触媒
する酵素であるNAD（Ｐ）ペルオキシダーゼを組
合せ用いてなる前記反応〔〕にて表わされる反
応に基づくもので、その脂肪族アルコール−脂肪
族アルデヒドサイクリング反応〔ａ〕にて生成
したH₂O₂の量に対応して還元型NAD（Ｐ）と反
応してNAD（Ｐ）を生成してなるものである。こ
の反応においてNAD（Ｐ）ベルオキシダーゼは通
常１テスト当り0.1単位以上用いればよく、好ま
しくは１〜20単位程度用いれば良い。また反応に
よつて生ずる検出できる変化の量としては、反応
によつて消費される還元型NAD（Ｐ）の量にて測
定することが好ましい。

また、以下の反応系を用いて脂肪族アルコール
または脂肪族アルデヒドを定量してもよい。

このような場合、サイクリング反応〔ａ〕を
形成する成分としてはAOX、ADH、O₂、還元型
NAD（Ｐ）、第２のデヒドロゲナーゼ、この第２
のデヒドロゲナーゼ用基質化合物が用いられる。
このサイクリング反応〔ａ〕において、第２の
デヒドロゲナーゼは脂肪族アルコール−脂肪族ア
ルデヒドのサイクリング反応によつて還元型
NAD（Ｐ）から生ずるNAD（Ｐ）に作用してなる
もので、１分子のNAD（Ｐ）とデヒドロゲナーゼ
用基質化合物を消費して、１分子の基質化合物と
還元型NAD（Ｐ）を生成し、この還元NAD（Ｐ）
はNAD（Ｐ）の生成を伴う脂肪族アルコール−脂
肪族アルデヒドのサイクル反応になるものであ
る。この生成した還元型NAD（Ｐ）はその１分子
当り等モル比の脂肪族アルデヒドとともにADH
の作用をうけて１分子のNAD（Ｐ）と脂肪族アル
コールを生成し、さらにAOXの作用により、１
分子のRCH₂OHとO₂を消費して１分子のH₂O₂と
脂肪族アルデヒドを生成してなるものである。し
かしO₂は溶存酸素の利用にて足り、よつて、
AOX、ADH、還元型NAD（Ｐ）、第２のデヒド
ロゲナーゼ、この第２のデヒドロゲナーゼ基質用
化合物を測定のための試薬として過剰量用いれば
よい。さらにこのサイクリング反応〔ａ〕の後
反応によつて生じる検出できる変化の量として
は、消費されるO₂の量または生成されるH₂O₂の
量や基質化合物の酸化物の量が挙げられる。この
サイクリング反応〔ａ〕に基けば、高価な還元
型NAD（Ｐ）の使用量が節約できる良好な利点を
有するものである。

またこのサイクリング反応〔ａ〕に用いられ
る第２のデヒドロゲナーゼとしては、このデヒド
ロゲナーゼ用基質化合物とNAD（Ｐ）とを基質と
してその基質化合物の酸化物および還元型NAD
（Ｐ）を生成する反応を触媒する酵素であればよ
く、以下の反応を触媒するデヒドロゲナーゼとこ
のデヒドロゲナーゼ用基質化合物が例示され、被
検液中のNAD（Ｐ）とともに還元型NAD（Ｐ）を
形成するNAD（Ｐ）のサイクリング反応に利用さ
れる。

(1) デヒドロゲナーゼがＤ−アラビニトールデヒ
ドロゲナーゼ（Ａ Dase：EC.1.1.1.11）であ
り、デヒドロゲナーゼ用基質化合物がＤ−アラ
ビトールである組合せ反応： Ｄ−アラビトール＋NAD ――――→ ADaseＤ−キシロース＋還元型NAD (2) デヒドロゲナーゼがラクテートデヒドロゲナ
ーゼ（EC.1.1.1.27）、デヒドロゲナーゼ用基質
化合物がＬ−乳酸である組合せ反応： Ｌ−乳酸＋NAD ――――――――――――――――→ ラクテートデヒドロゲナーゼピルビン酸＋還元型NAD (3) デヒドロゲナーゼがマレイトデヒドロゲナー
ゼ（デカルボキシレイテイング）
（EC.1.1.1.28）、デヒドロゲナーゼ用基質化合物
がＬ−リンゴ酸である組合せ反応： Ｌ−リンゴ酸＋NAD ―――――――――――――――――→ マレイトデヒドロゲナーゼ マレイトデヒドロゲナーゼ （デカルボキシレイテイング）ピルビン酸＋CO₂＋還元
型NAD (4) デヒドロゲナーゼがグリコースデヒドロゲナ
ーゼ（EC.1.1.1.47）、デヒドロゲナーゼ用基質
化合物がグルコースである組合せ反応： β−Ｄ−グルコース＋NAD ――――――――――――――――→ ――――――――――――――――→ グルコースデヒドロゲナーゼＤ−グルコノーδ−ラクト
ン＋還元型NAD 次いでこのような脂肪族アルコールまたは脂肪
族アルデヒドのいずれかの１成分を含有する被検
液またはその１成分を遊離、生成する酵素反応系
の被検液を対象として目的とする成分を定量する
のであるが、定量に当つては目的とする成分と前
記のサイクリング反応の反応に基いて行えばよ
く、また被検液中の成分の一定量に対して各サイ
クリング反応は10サイクル以上の反応を生ずるこ
とから、少なくとも目的成分に比べてそのサイク
ル数以上のモル比に相応した量の試薬を用いれば
よく、さらに極めて少量の被検液もしくは希釈し
た被検液を用いればよい。またこの反応における
媒体としては、用いる各酵素の活性の安定なPH域
のものであればよく、通常弱酸性ないし弱アルカ
リ性、例えばPH6.5〜8.5のリン酸緩衝液、トリス
ーHCl緩衝液、イミダゾールーHCl緩衝液、ジメ
チルグルタール酸−NaOH緩衝液、ピペスー
NaOH緩衝液などのグツドの緩衝液などが用い
られる。さらに反応に当つては、通常37℃付近に
て１分以上反応せしめればよい。このサイクリン
グ反応〔〕は、用いる酵素の量やKm値によつ
て異なるが、通常１分間当り10サイクル以上の反
応を行うもので、好ましくは１分間当り20サイク
ル以上の反応を行うような酵素量、その他の試薬
を用いればよい。

このようにして反応せしめた後、次いで反応に
よつて生ずる検出できる変化の量を定量するので
あるが、この検出できる変化としては、サイクリ
ング反応〔〕の脂肪族アルコールまたは脂肪族
アルデヒドの１モル比の生成または消費の１回サ
イクル反応において、１モル比の成分を消費する
か、または生成する成分が挙げられ、これらの成
分としては、消費されるO₂、消費される還元型
NAD（Ｐ）、生成されるH₂O₂の各成分が挙げられ
る。まず消費されるO₂の量の定量に当つては、
通常酸素電極を用いる電気化学的変化の量として
定量すればよい。また還元型NAD（Ｐ）の消費量
の定量に当つては、あらかじめ用いた量の還元型
NAD（Ｐ）から反応後に残存する還元型NAD
（Ｐ）の量の差を求めることによつてなされる。
この反応後に残存する還元型NAD（Ｐ）の量また
はあらかじめ用いた還元型NAD（Ｐ）の量の定量
は、公知の種々の還元型NAD（Ｐ）の定量法が用
いられる。この還元型NAD（Ｐ）の定量法として
は、例えば共存するNAD（Ｐ）にはなく、還元型
NAD（Ｐ）の特異的吸収長域の波長に基づいて吸
光度測定すればよい。NAD（Ｐ）は260nｍ近辺
の特異的極大吸収波長を有し、還元型NAD（Ｐ）
は260nｍおよび340nｍ近辺に特異的極大吸収波
長を有することから、還元型NAD（Ｐ）の定量の
ための特異的吸収波長である吸収波長域としては
320nｍ〜360nｍ近辺であり、好ましくは340nｍ
近辺である。この波長により残存する還元型
NAD（Ｐ）を吸光度値として定量される。さらに
別の還元型NAD（Ｐ）の定量法としては、還元型
NAD（Ｐ）の水素原子の受容能を有する水素原子
伝達系色原体の発色による方法が挙げられる。こ
の水素原子伝達系色原体としては、例えば３−
（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ−ニトロフエニ
ル）−５−フエニル−2H−テトラゾリウム・クロ
ライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリ
ル）−２，５−ジフエニル−2H−テトラゾリウ
ム・ブロマイド、３，3′−（４，4′−ビフエニレ
リン）−ビス（２，５−ジフエニル−2H−テトラ
ゾリウム・クロライド）、３，3′−（３，3′−ジメ
トキシ−４，4′−ビフエニリレン）−ビス〔２−
（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニル−2H−テ
トラゾリウム・クロライド〕（別名：ニトロテト
ラゾリウム：NTB）、３，3′−（３，3′−ジメト
キシ−４，4′−ビフエニリレン）−ビス〔２，５
−ビス（ｐ−ニトロフエニル）−2H−テトラゾリ
ウム・クロライド〕、３，3′−（３，3′−ジメトキ
シ−４，4′−ビフエニリレン）−ビス（２，５−
ジフエニル−2H−テトラゾリウム・クロライド）
などのテトラゾリウム塩や２，６−ジクロロフエ
ノールインドフエノールなどが用いられ、好まし
くは水溶性テトラゾリウム塩とジアホラーゼまた
はフエナジンメトサルフエートを組合せ用いて電
子伝達を良好にせしめたものを用いればよい。こ
の水素伝達系色原体は還元型NAD（Ｐ）の水素原
子を受けて呈色するホルマザン色素を形成するも
ので、このホルマザン色素をその吸収波長域、例
えば500nｍ〜550nｍにおける極大吸収波長域に
基づいて吸光度測定すればよい。さらに別の測定
法としては、例えば還元型NAD（Ｐ）にレザズリ
ンなどの螢光用試薬の共存下ジアホラーゼを作用
せしめて反応によつて螢光する成分の量を定量し
てもよく、公知のこの種の還元型NAD（Ｐ）の定
量手段が利用できる。特に還元型NAD（Ｐ）を定
量するに当つては、サイクリング反応〔〕にお
いてはH₂O₂の生成を伴うためにカタラーゼを用
いてH₂O₂を分解、消去せしめることが好ましい。
さらに感度を向上させるためには、サイクリング
反応〔〕の系にさらにNAD（Ｐ）ベルオキシダ
ーゼ（EC.1.11.1.1、EC.1.11.1.2.）を作用させ、
生じたH₂O₂を還元型NAD（Ｐ）の減少に変え、
２倍の感度で測定してもよい。また生成する成分
であるH₂O₂の定量に当つては、過酸化水素電極
を用いる電気化学的変化の量として定量すること
ができる。

このように本発明は、脂肪族アルコール−脂肪
族アルデヒドサイクリング反応による新規な定量
法であり、かつ１分間当り10サイクル以上の高サ
イクル反応を行うもので、極めて高感度にて被検
液中の成分を測定できる優れたものである。

次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明はこれらによつて何んら限定されるも
のではない。

実施例 １ アセトアルデヒドまたはエタノールの定量50ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH7.5） アルコールデヒドロゲナーゼ（酵母製） 40U／ml アルコールオキシダーゼ（Candida boidinii製シ
グマ社） 40U／ml 1.8ｍＭ 還元型NAD 0.2M Kcl 上記組成を有する反応液0.5mlを小試験管にと
り、37℃に加温後、各々０、20、40、60、80、
100μMのエタノールまたはアセトアルデヒド10μ
を添加し、37℃で正確に５分間反応を行い、
0.5％SDS（ドデシル・硫酸ナトリウム）溶液（PH
7.5）2.5ml添加して反応を停止し、340nｍにおけ
る吸光度を測定した。その結果は第１図に示す通
りで約30回転／分のサイクリング率であつた。

○−○エタノール、●−●アセトアルデヒド。

実施例 ２ 実施例１と同一の組成を有する反応液に
1.2U／mlのNAD−パーオキシダーゼ
（EC.1.11.1.1、StrePtococcus faecalis、シグマ
社製）または400U／mlのカタラーゼを添加した
反応液を用い実施例１と同様の反応を行つた。そ
の結果は、第２図の通りであつて、NAD−パー
オキシダーゼを添加した場合は２倍の感度で測定
された。また、カタラーゼを添加した場合は、高
値の部分で直線性が良い結果が得られた。なお検
体はアセトアルデヒドを用いた。

実施例 ３ 実施例１と同一の組成を有する反応液1.0mlを
ガルバニー型酸素電極を装着した反応槽にとり、
温度37℃に保つたのち、各々０、50、100、150、
200、300、400、500μMのアセトアルデヒド溶液
20μ添加し、このときの酸素消費速度を測定し
た。その結果は第３図に示す通りであつて、良い
直線性が得られた。

実施例 ４ 実施例と同一の組成を有する反応液1.0mlを用
い、これにYSI社製過酸化水素電極を配設し、37
℃に加温後、０、５、10、15、20、30、40、
50μMのエタノールを10μ添加して反応せしめ、
そのときのエタノール量をH₂O₂生成量の関係に
て測定した結果第４図○−○にて示すもので、良
好な直線関係が得られた。

また上記のエタノールの代りにプロパノールを
用いて同様に行なつた結果第４図●−●にて示す
通りで、良好な直線関係が得られた。

実施例 ５ 0.5Mリン酸緩衝液（PH7.5） 100ml アルコールデヒドロゲナーゼ（酵母製） 40000U アルコールオキシダーゼ（ピキア属由来；フリツ
プス・ペトロリアム社製） 40000U 還元型NAD 200μmo／es Kcl 0.2mo／ｅ シユクロース 10ｇ FAD 5μmo／es 上記の組成を有する溶液100mlを凍結乾燥して
1000ml用試薬とした。本試薬は脂肪族アルコール
や脂肪族アルデヒドの定量用、またはこれらを遊
離する反応系の成分の定量もしくはそれらに関与
する酵素活性測定用試薬として供されるものであ
る。

実施例 ６ エタノールおよびアセトアルデヒドの定量50ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH6.5） アルコールデヒドロゲナーゼ（酵母製） 40U／ml アルコールオキシダーゼ（Candida boidinii製シ
グマ社） 40U／ml 1.8ｍＭ 還元型NAD 0.2M Kcl 上記組成を有する反応液0.5mlを小試験管にと
り、37℃に加温後、各々０、20、40、60、80、
100μMのエタノールまたはアセトアルデヒド10μ
を添加し、37℃で正確に５分間反応を行い、
0.5％SDS（ドデシル・硫酸ナトリウム）（PH7.5）
2.5mlを添加して反応を停止し、340nｍにおける
吸光度を測定した。その結果は第５図に示す通り
で、エタノール（○−○）、アセトアルデヒド
（●−●）ともに良好な直線性が得られ、またサ
イクリング率は19回転／分であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はアセトアルデヒドおよびエタノールの
定量曲線、第２図はアセトアルデヒドの定量曲
線、第３図は酵素電極法によるアセトアルデヒド
の定量曲線、第４図はエタノールおよびプレパノ
ールの検量線、第５図はエタノールおよびアセト
アルデヒドの定量曲線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 被検液中の脂肪族アルコールまたは脂肪族ア
   ルデヒドのいずれかの１成分を定量する方法にお
   いて、式 （ただし、脂肪族アルコールと脂肪族アルデヒド
   の炭素数は同一である。） で示されるサイクリング反応を形成させるため
   に、被検液中の成分とサイクリング反応〔〕を
   形成するアルコールオキシダーゼ、アルコールデ
   ヒドロゲナーゼ、還元型NAD（Ｐ）およびO₂を
   反応せしめ、サイクリング反応〔〕によつて生
   じた検出できる変化の量を定量することを特徴と
   する酵素的高感度測定法。 ２ サイクリング反応〔〕において、１分子の
   H₂O₂と１分子の還元型NAD（Ｐ）を消費して２
   分子の水分子と１分子のNAD（Ｐ）を生成する反
   応を触媒するNAD（Ｐ）ペルオキシダーゼを作用
   せしめ、次いで反応によつて生じる検出できる変
   化の量を定量してなる特許請求の範囲第１項記載
   の測定法。 ３ サイクリング反応〔〕における生成NAD
   （Ｐ）において、NAD（Ｐ）を基質とする第２の
   デヒドロゲナーゼおよびそのデヒドロゲナーゼ用
   基質化合物を用いて生成NAD（Ｐ）に作用せし
   め、NAD（Ｐ）を還元型NAD（Ｐ）にサイクリン
   グせしめてなる第２サイクリング反応を形成せし
   めることを含む特許請求の範囲第１項記載の測定
   法。 ４ 検出できる変化の量が、O₂消費量である特
   許請求の範囲第１項記載の測定法。 ５ 検出できる変化の量が、H₂O₂生成量である
   特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ６ 検出できる変化の量が、還元型NAD（Ｐ）消
   費量である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ７ 脂肪族アルコールが低級脂肪族アルコールで
   ある特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ８ 低級脂肪族アルコールが、エタノール、プロ
   パノールまたはブタノールである特許請求の範囲
   第７項記載の測定法。 ９ 脂肪族アルデヒドが、低級脂肪族アルデヒド
   である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 １０ 低級脂肪族アルデヒドが、アセトアルデヒ
   ド、プロピオンアルデヒドまたはプチルアルデヒ
   ドである特許請求の範囲第９項記載の測定法。