JPS6083599A - 新規な酵素的高感度測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明け、被検液中の脂肪族アルコールまたは脂肪族ア
ルデヒドのいずれかｌ成分を定麓する方法において、サ
イクリング反応を利用するｗ１虫な酵素的高感度測定法
に関する。

従来より酵素的サイクリングとしては、ＮＡＤにコチン
アデニンジヌクレオチド）サイクリング、ＮＡＤＰ　に
コチンアデニンジヌクレオチドホスフエート）サイクリ
ング、ＣＯＡサイクリングが知られており、例えばエタ
ノールを基質とし、ＮＡＤｅ用いてアルコールデヒドロ
ゲナーゼヲ作用せしめ、還元型ＮＡＤを生成し、またこ
の還元型ＮＡＤはオギザル酢酸を基質としてリンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼを作用せしめてＮＡＤとなすＮＡＤ−還
元型ＮＡＤのサイクリング反応を形成せＵ２めるもので
ある〔日本生化学余線、「生化学実験講座」５巻、酵素
研究法（上）第１２１〜１３５頁、株式会社東京化学同
人、１９７５年８月発行、森昭胤編集、「神経伝達物質
測定法マニュアル」第１６５〜１７２頁、医歯薬出版株
式会社、１９７９年１１月発行〕。また上記のリンゴ酸
デヒドロゲナーゼの代りに還元型ＮｋＤオキシダーゼを
用いて酸６素および還元型ＮＡＩ）を消費（、て水分子
およびＮＡＤを生成するサイクリングも知られ−（Ｖる
〔理化学研究新編、［ライフサイエンスの現状と将来」
第３０〜３２頁、株式会社創造ライフサイエンス研究会
、１９８１年３月発行〕。ざらに基質としてヒドロキシ
ステロイドを用いてヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼを作用せしめ、ＮｈＤｋＲ元型ＮＡＤとなし、この
還元型ＮＡＤはテトラゾリウム塩とジアホラーゼなどの
転位酵素の作用にてホルマザンを形成しっつＮＡＤとな
すサイクリング〔特、開開５６−１４４０９６号〕や、
ゲルタナオンとデヒドロアスコルビンばにグルタチオン
テヒドロアスコルビン酸オキシドレダクターゼを作用せ
しめてデヒドロアスコルピｅ　ｋ　７　、ｚ。

コルビン酸となし、このアスコルビン酸はアスコルビン
酸オキシダーゼ金用すて酸素を消費して水分子、および
デーヒドロアスコルビン酸を生成してなるデヒドロアス
コルビン酸−アスコルビン酸のサイクリング反応を形成
せしめてなる〔特開昭５６−１５１４９８号〕も知られ
て−る。その他特開開５６−７８５９９号記載のｅ索を
消費して過ば化水素ケ生成する還元型ＮＡＤオキシダー
ゼを用いるＮＡＤす°イクリングも知られている。この
ように種々のサイクリング反応系が報告され、また過酸
化水素を生成する還元型Ｎ　Ａ　Ｄオキシダーゼを用い
るＮＡＤサイクリング反応も報告されているが、特にこ
の過酸化水素を生成する還元型ｒＪ　ＡＤオキシダーゼ
は、今だに良好にＮＨされて計らず、酵素自体の精製が
困難であり、かつ高ｉ［Ｉｌｉなものであった。

従来のアルコールオキシダーゼは、脂肪族アルコールを
脂肪族カルボン酸まで酸化する酵素であって、アルデヒ
ドの形で止めることは知られていなかった。

ところが、アルコールオキシダーゼ酵素反応系とアルコ
ールデヒドロゲナーゼ酵素反応系を１１１１１　ｆせる
と、アルコールオキシダーゼ酵素反応系による酸化作用
のある１（２０□の生成とアルコールデヒドロゲナーゼ
酵素反応系やために用いる還元作用のある還元型ＮＡＤ
　（Ｐ）が共存する状態であるにもかかわらず、全く意
外にも、この酸化１・「用のＨ２０□と還元作用の還元
型ＮＡＤ　（Ｐ）との反応を生ずることなく良好にサイ
クリング反応する〃ｒ規なサイクリング反応を見い出し
た。しかも、このサイクリング反応において、反応に関
与する脂肪族アルコールまたは脂肪族アルデヒドのいず
れかｌ成分を含有する被検液を用すて、被検液の１成分
以外の必要とする成分であるアルコールオキシダーゼ、
アルコールデヒドロゲナーゼ、還元型ＮＡＤ゛（Ｐ）お
よび０２を用いて反応せしめることにより、そのサイク
リング反応は１分間当りｌＯプサイル以上の定量的な反
応を行い、良好に進行し７、反応によって生ずる検出で
きる変化の量を定量することにより、被検液中の成分を
簡便かつ高感度にて正確に測定できることを完成し７ヒ
。

本発明は上記の知見に基因で完成されたものであって、
被検液中の式 被検ン゛改甲の脂肪族アルコールま＃：、ｖ′！、脂肪
族アルデヒドのめずれか１成分を定量する方法にひいて
、式 で示さルるサイクリング反応全形成させるために、被検
液中の成分とサイクリング反応ＣＩ）を形成するアルコ
ールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、還元
型ＮＡｉ）（Ｐ）およびＯ４を反応せしめ、サイクリン
グ反応ＣＩ）によって生じた検出できる変化の量を定量
することを特徴とする酵素的高感度測定法である。

まず本発明の被検液としては、脂肪族アルコールまたは
脂肪族アルデヒドのいずれかｌ成分を含有するか、また
はそのｌ成分を遊離、生成する系か挙げられる。特に被
検液中の１成分を遊離、生成する系としては、神々の酵
素反応系による酵素活性の測定や基質の定量の目的にお
いて供さノシる。

これらの酵素反応系において例示すれば、以下の種々の
反応系が挙けられるが、本発明においては何んら限定さ
り、るものではなり０ まず脂肪族アルコール、脂肪族アルテヒド金遊離、生成
する系を例示する。

脂肪族アルコールの例としてｔま、エタノール、グロパ
ノール、ブタノールなどの低級ＭＷ脂肪族アルコールあ
げられ、脂肪族アルデヒドの例としてはアセトアルデヒ
ド、プロピオンアルテヒド、ブチルアルデヒドなどの低
級脂肪族アルデヒドがあげられるが、具体的には次のも
のが例示される。

（１）　アルコール醗酵におけるエタノールやブタノー
ル、酒類を飲用しまた後の呼気や血液中のエタノール量
や飲食中のエタノール量。

（２）脂肪族アルコールや脂肪族アルデヒドを基質とす
る酵素反応系。

（３）　ＲＣＨ２０Ｈ，ＲＣＨＯｆ：生成する酵素反応
系の＃素活性、元の基質などの定量。

これらの酵素反応系において、定量すべき成分または活
性測定すべき成分のいずれかｌｂＸ、分を含有する被検
液を対象とし７、これにその酵素反応系を実施する必要
な試薬を刃口えて反応せしめる。この反応液を脂肪族ア
ルコール、脂肪族アルデヒド、ＮＡＤ　（Ｐ）　、ａノ
ｃｍＮ八〇　（へ）のｂｆれか１成分を含有する被検液
として用いればよく、この隙、別にその酵素反応系を行
わせしめ被検液として供してもよく、またはその酵素反
応系を、サイクリング反応ＣＩ］の系を同−媒体中で一
段反応にて行わせしめてもよい。さらにその酵素反応系
を反応せしめるに当っては、例えば被検液０．０　（１
１〜５ゴを用Ａて、これと必要な試薬を含有する弱酸性
〜弱アルカリ性の緩衝液とを３７℃にて通常１分間以上
反応せしめればよい。また用し）る試薬の量とし２ては
被検液中の測定の対象成分の址よりも過剰に用いればよ
く、特に限定されるものｃｔ／ｉない。

前記のサイクリング反応〔■〕において述べれば、１モ
ル比の脂肪族アルコールｙ＜）５質として１モル比の０
□、通常溶存酸素全消費してアルコールオキシダーゼ（
ＡＯＸ）の作用により１モル比の脂肪族アルデヒドおよ
び１モル比のＨ２Ｃ。を生飲、シフてなるＡＯＸ系反応
を生じるもので、また生成しまた１モル比の脂肪族アル
デヒドは１モル比の還元’Ｊ　Ｎ　Ａ　Ｄ　（Ｐ　）の
存在下アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＩ（）の作用
により１モル比のＮ　Ａ　Ｊ）　（Ｐ）および１モル比
の脂肪族アルコールを生成ｔ２てなるＡＤＨおよび１モ
ル比のｉｔ脂肪族アルコールを生成してなるＡＩ）Ｈ系
反応を生じるもので、さらにこの脂肪族アルコール＋−
１：　Ａ　ＯＸ系反応を生じるサイクル反応を行うもの
である。従ってこのサイクル反応ＣＩＩを行うに坐って
は、脂肪族アルコール、脂肪族アルデヒドＡＯＸＸ　Ａ
ＤＨ，還元型ＮＡｐ　（Ｐ）と０２の６成分の要件にて
なし得るものであるが、脂肪族アルコールと脂肪族アル
デヒドとはサイクリング反応ＣＩ’］によっていす力、
か１成分をその被検液出米として用いれは曲の成分を生
成するためこの脂肪族アルコール、を脂肪族アルデヒド
のいす′ｊ″Ｌカ・ｌ成分全被検液中の１成分と［７て
使用すハばよいものである。

さら６てこのサイクリング反↓ｉＴ、ＣＩ　〕に：＋’
）ＶＪ“るｆＪ２０□と還元型ＮＡＤ（Ｐ）を反応せ（
１，めてｉ’ｊ　Ａ　Ｄ（Ｐ）を生成する、より高感度
な測定法となしてもよ−。即ちサイクリング反応［１］
におりて、１分子のＨ２Ｏ２と１分子の還元型Ｎ　Ａ　
Ｌ）　（ｅ　）を消１費して２分子の水（Ｈ２Ｏ）と１
分子のＮＡ　Ｄ　ｋ生成する反応を触媒する酵素である
ＮＡＤ　（Ｐ）ペルオキシダーゼ（Ｅ　Ｃ，１，１１，
１，１）　ＣＪ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２２５，５５７　（１９５７）　］を組
合せ用いてなるもので、下記反応［］１１にて表わされ
る。

このサイクリング反応Ｃ［［］においては、サイクリン
グ反応〔■〕にて生成したＨ２Ｏ２が、さらに還元型Ｎ
ＡＤ　（Ｐ）とともに消費されてＮ　Ａ　Ｄ（Ｐ）を生
成するために、サイクリング反応〔■〕の１サイクルに
て２分子の還元型ＮＡＤ（Ｐ）の消費となるもので、サ
イクリング反応〔■〕に比べて２倍の還元型ＮＡＤ（Ｐ
）の変化量となり、より高感度に測定できるものとなる
。

さらにまたこのＮＡＤ　（Ｐ）を、ＮＡＤ（Ｐ）を基質
とする第２のデヒドロ材ナーゼおよびそのデヒドロゲナ
ーゼ用基質化合物Ｇ′こより還元型１寸ＡＤ　（Ｐ）に
変換せしめるＮＡＬ）（Ｐ）　、ｉＡ２のデヒドロゲナ
ーゼ、デヒドロゲナーゼ用基質化合物の成分を組合せて
用いてＮＡＤ（Ｐ）のサイクリング反応を行わせ、この
サイクリング反応と上記の６成分によるサイクリング反
応ＣＩ　’）との組合せでもよく、下記反応（■）にて
表わされる。

従ってまずサイクリング反応［Ｉ］１／こ基いて被検液
中の１成分と、サイクリング反応ＣＩ〕”ｋ形成する成
分〔二にて示す〕とについて述べる。

［ａｌ　被検液中の１成分が脂肪族アルコールまたはこ
のように脂肪族アルコールまたは脂肪族アルデヒドを含
有、または遊離、生成する酵素反応系などの被検液中の
１成分が脂肪族アルコールまたは脂肪族アルデヒドであ
る場合には、サイクリング反応ＣＩａｌを形成する成分
としてＡＯＸＸＡｉ）Ｈ，Ｏ□および還元型ＮＡＤ（Ｐ
）が用いられる。

このサイクリング反応［Ｉａｌ）において、例えばＡＯ
Ｘは被検液中の脂肪族アルコールを基質として、１分子
の力行肪族アルコールと０２とを消費して１分子のＨ２
０□と被検液中の脂肪族アルコールの炭素数と同−炭素
堅の脂肪族アルデヒドを生成し、さらにこの脂肪族アル
デヒドを基質とし、てＡＤＩ（は１分子の同一炭素数の
脂肪族アルデヒドと一還元型ＮＡＤ　（Ｐ）を消費して
１分子の同−炭素級の脂肪族アルコールおよびＮＡＤ（
、Ｐ）の１分イづつを生成してなるもので脂肪族アルコ
ール−脂肪族アルデヒドのサイクル反応全形成する。し
、かしまた０２は反応系における溶存酸素を利用すれば
よく、よってＡＯＸ、ＡＤＨおよび還元型ＮＡＩ）ＣＰ
）を測定のための試薬として過剰吐用いればよい。

また、被検液中の成分が脂肪族アルデヒドの場合には、
前記〔■ａ〕に示される各必（要成分で用いることによ
り、同様にそのサイクリング灰地、を形成するものであ
る。この被検液中の脂肪族アルコールまたは脂肪族アル
コールの含Ｍ量は特に限定式力、るものではなく、また
高音！１屍の場合Ｖｃｉｌ″を希釈して用いればよい。

また用いられるＡＯＸやＡ　Ｄ　Ｈの使用量としては特
に限定されるものでなく、被検液中の脂肪族アルコール
または脂肪族アルデヒド゛の融に茫いて適宜決定すれば
よく、脂肪族アルコールまたは脂肪族アルデヒドの量と
相対的に加減Ｕ７て用いｈ５ばよく、通常ｌテスト当り
０．Ｏ１１単以上用因ればよく、好ましくはＡＯＸは０
．１〜１００単位程度、ＡＤｆ（は通常Ｏ１１単位以上
、好ましくけ５〜３００単位程度であり、またこれ以上
の量の各酵素を用すてもより０さらＫ　ｉｔ元型ＮＡＤ
　（Ｐ）の使用量としては被検液中の脂肪族アルコール
または脂肪族アルデヒドの量と反応時間に′よるサイク
リング故の値以上の量を用いればよく、通常脂肪族アル
コールまたは脂肪族アルデヒドの社に比べて大過剰の搦
・が用いられ、レリえば５０倍量以上、好ましくは１０
０〜１００００倍量用いることがよく、またこの量以上
用いることを１＋１」んら限定するものではない。さら
に前記サイクリング反応〔■ａ〕、即ち反応式［１ａ：
］の］脂肪族アルコールー脂肪族アルデヒドザイクリン
グ反の後反応によって生ずる検出できる変化の着として
は、反応によって消費さ・れる０２の量、消費される還
元型ＮＡＤ　（Ｐ）の量や生成されるＨ２０□の量が挙
げられる。また、この脂肪族アルコール−脂肪族アルデ
ヒドサイクリング反応における生成成分であるＨ２Ｏ２
と消費される成分である還元型ＮＡ１）（Ｐ）を反応せ
しめて、より高感度にて測定してもよい。

即ち、このサイクリング反応に、１分子Ｈ２０゜と１分
子の還元型Ｎ’ＡＤ　（Ｐ）’ｋＭ費して２分子の水と
１分子のＮＡＤを生成する反応全触媒する酵素であるＮ
ＡＤ　（Ｐ）ペルオキシダーゼを組合せ用いてなる前記
反応〔■〕にて表わさｉｚる反応に基づくもので、その
脂肪族アルコール−脂肪族アルデヒドサイクリング反応
［Ｉａ）にて生成し、た１（２０２の量に対応して還元
型ＮＡＤ（Ｐ）と反応し、てＮＡＤ　（Ｐ）ｋ生成し２
てなるものである。この反応においてＮＡＤ　（Ｐ）ペ
ルオキシダーゼは〕爪常ｌテスト当り０．１単位以上用
い１シ（〆ｆよく、好ましくは１〜２０単位程度用込れ
ばよい。また反応によって生ずる検出できる変化の蛍と
しては、反応によって消費される還元型ＮＡＤ　（ｐ）
の量にて測定することが好ましい。

ｔた、以下の反応系を用いて脂肪族アルコールまたは脂
肪族アルデヒドを定量り、でもよめ。

このような場合、サイクリング反応ＣＩＩＩａ）を形成
する成分としてばＡＯＸ、ＡＤＨ，Ｏ３、還元型ＮＡＤ
　（Ｐ）　、第２のデヒドロゲナーゼ、この第２のデヒ
ドロゲナーゼ用基質化合物が用すら瓦る。このサイクリ
ング反応［−１１Ｉａ）において、第２のデヒドロゲナ
ーゼは脂肪族アルコール−カビ肪族アルデヒドのサイク
リング反応によって還元型ＮＡＤ　（Ｐ）から生ずるＮ
ＡＤ　（Ｐ）に作用してなるもので、１分子のＮＡＩ）
（Ｐ）とデヒド−ロゲナーゼ用基質化合物全消費り１．
て、１分子の基質化合物と還元型ＮＡＤ（Ｐ）を生成シ
フ、この還元ＮＡＤ　（Ｐ）ｉｄＮＡｌ）（Ｐ）（Ｄ生
成を伴う脂肪Ｈ７ルコールー脂肪族アルデヒドのサイク
ル反応になるものである。この生成り、た還元型ＮＡＤ
（Ｐ）はその１分子当り等モル比の脂肪族アルデヒ１゛
とともにＡ　、Ｄ　Ｈの作用をうけて１分子のＮＡＤ　
（Ｐ）と脂肪族アルコールを生成シ１、さらＶこＡＯＸ
の作用により、１分子のＲＣｆ（２０ｆ（と０２を消費
（、て１分子のＨ２０□と脂肪族アルデヒドを生成し、
てなるものである。しかし０□は溶存酸素の利用にて足
り、よって、ＡＯＸ、、ＡＤＨＸ還元型ＮＡＤ（Ｐ）、
第２のデヒドロゲナーゼ、この第２のデヒドロゲナーゼ
基質用化合物を測定のための試薬として過剰一時用いれ
ばよい。さらにこのサイクリング反応〔ＩＩＩａ：］の
後反応に工って生ずる検出できる変化の瞼としては、消
費さり、る０２の益または生成さり、るＨ２Ｏ。の量や
基質化合物の酸化物の量が挙げられる。

このサイクリング反応［ＩＩＩａ）に基けば、高１：Ｉ
ｉｉな還元型ＮＡＤ（Ｐ）の使用量が節約できる良好な
利点を有するものである。

またこのサイクリング反応Ｃ１１１ａ）ｉｃ用いられる
第２のデヒドロゲナーゼとしては、このテヒドロゲナー
ゼ用基質化合物とＮＡＤ　（Ｐ）とを基質としてその基
質化合物の酸化物および還元型ＮＡＤ（Ｐ）を生成する
反応を触媒する酵素であればよく、以下の反応を触媒す
るデヒドロゲナーゼとこのデヒドロゲナーゼ用基質化合
物が例示され、被検液中のＮＡＤ、（Ｐ）とともに還元
型ＮＡＤ　（Ｐ）を形成するＮＡＤ　（Ｐ）のサイクリ
ング反応に利用される。

（１）　デヒドロゲナーゼがＤ−アラビニトールデヒド
ロゲナーゼ（Ａ　Ｄａｓｅ　：　Ｅ　Ｃ，１，１，１，
１１）であり、デヒドロゲナーゼ用基質化合物がＤ〜ア
ラビトールである組合せ反応： （２）　デヒドロゲナーゼがラクテートデヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ，１，１，１，２７）、デヒドロゲナーゼ用基
質化合物がＬ−乳酸である組合せ反応： ゼ（デカルボキシレイティング）　（ｇｃ、１．１．１
゜２８）、デヒドロゲナーゼ用基質化合ｔカがＬ−リン
ゴ酸である組合せ反応： ＣＯ２＋還元型ＮＡＤ （４）　デヒドロゲナーゼがグルコニスデヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ、１，１，１，４７）　、デヒドロゲナーゼ用
基質化合物がグルコースである組合せ反応ニゲルコノ−
δ−ラクトン＋還元型ＮＡＤ次いでこのような脂肪族ア
ルコールまたは脂肪族アルデヒドのいずれかの１成分を
含有する被検液またはそのｌ成分を遊離、生成する酵素
反応系の被検液を対象として目的とする成分全定量する
のであるが、定数に当っては目的とする成分と前記り）
サイクリング反応の反応に基いて、行えばよく、また被
検液中の成分の一定値に対して谷サイクリング反応は１
０サイクル以上の反応を生ずることから、少なくとも目
的成分に比へてそのサイクル数以上のモル比に相応し、
た量の試薬を用すればよく、さらに極めて少量の被検液
もし７くけ希釈した被検液を用因ればよい。またこの反
応における媒体としては、用いる各酵素の活性の安定な
Ｐ　Ｈ域のものであればよく、通常弱酸性なｌ／′１［
２弱アルカリ性、例えばｐ　Ｈ６，５〜８．５　のリン
酸緩衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液、イミダゾール−ＨＣ
ｌ緩衝！、ジメチルゲルタールＰａ　、ＮａＯＨ緩衝液
、ビベスーＮａＯＨ緩衝液などのグツドの緩衝液などが
用すられる。さらに反応に当っては、通常３７℃付近に
て１分以上反応せしめればより０このサイクリング反応
［Ｉ）は、用いろ酵素の量−？Ｋｍ値によって異なるが
、通常１分間当りＩＯプサイル以上の反応を行うもので
、好ましくは１分間当り２ｏプサイル以上の反応を行う
ような酵素量、その１１ハの試薬を用論ればより０ このようにして反応せしめた後、次いで反応によって生
ずる検出できるツテ化の虚を定量するのであるが、この
検出できる変化としては、サイクリソ、グ反応〔■〕の
脂肪族アルコールまたは脂肪族アルデヒドの１モル比の
生成または消費の１回サイクル反応において、１モル比
の成分を消費する′か、または生成する成分が挙げられ
、これらの成分としては、消費される０□、消費さ九る
還元型ＮＡＪ）（Ｐ）、生成されるｆ（２０□の各成分
が挙げられる。まず消費される０２の量の定）；ｉｉ　
Ｋ当っては、通常酸素電極を用いる電気化学的変化の縫
として定計すればよ−、また。（火元？見ＮＡＤ　ｌ）
のｉ？４費膚の定量に当って（ま、あらかじめ用いたＨ
の還元型ＮＡＤ（Ｐ）から反応後−区残４＃　−ｆ　ル
ｊＭ元１ｉ！１．　Ｎ　Ａ　Ｄ（Ｉ〕）の量う）差をめ
ろこと１１こよってなざ、する。

この反応後に残存する還元型ＮＡＤ（Ｐ）の、甘まｆ：
、（ｌ−ｊ：あらかじめ用すだ還元型ｆＪＡＤ（ｉＪ）
の−４の定量は、公知の種々の還元型２寸ＡＤＩ）の定
数法が用いられる。この還元型ＮＡ１．）（Ｐ）の定１
．１法としては、例えば共存するＮＡＤ（Ｐ）／こけな
く、還元型ＮＡＩ）（Ｐ）のＣｊ５４的吸収液吸収波長
域に基づいて吸光度測定すればよい、ＮＡＤ（Ｐ）は２
６０　ｎｍ近辺に特異的極大吸収波長をゼし、還元型Ｎ
ＡＤ　（Ｐ）は２６．Ｏｎｍおよび３４０ｎｍ近辺に特
異的極大吸収波長を有することから、還元型ＮＡＤ　（
Ｐ）の定量のための特異的吸収波長である吸収波長域と
しては３２０　ｎｍ〜３６０ｎｍ近辺であり、好まし、
（（ｄ３４０ｒｉｍ近辺である。

この波長により残存する還元型ＮＡＤ　（Ｐ）’ｆｒ吸
光度値として定量される。さらに別の還元型ＮＡＤ　（
Ｐ）の定量法とし７ては、還元型ＮＡＤ　（Ｐ）の水素
原子の受容能を有する水素原子伝達系色原体の発色によ
る方法が挙げられる。この水素原子伝達系色原体として
は、例えば３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニ
トロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム
・クロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリ
ル）　−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム・
ブロマイド、３．３’　−（４，４’−ビフエニリレン
）−ビス゛（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウ
ム・クロライド）、３．３’−（３，３’−ジメトキシ
−４，４′−ビフエニリレン）−ビス（：２−（ｐ−ニ
トロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム
・クロライド〕　（別名：ニトロテトラゾリウム二ＮＴ
Ｂ”ｌ　、３．３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４
′−ビフエニリレン）−ビス［２，５−ビス（ｐ−ニト
ロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム・クロライド〕、
３．３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４′−ビフエ
ニリレン）−ビス（２，５−ジフェニル−２）Ｉ−テト
ラゾリウム・クロライド）などのテトラゾリウム塩や２
．６−シクロロフエノールインドフエノールナトが用い
らｆｂ、好ましくけ水溶性テトラゾリウム塩とジアホラ
ーゼまたはフェナジンメトサルフェートを組合せ用すで
電子伝達を良好にせしめたものを用いればよｈｏこの水
素伝達系色原体は還元型ＮＡＤ　（Ｐ）の水素原子を受
けて呈色するホルマザン色素を形成するもので、このホ
ルマザン色素をその吸収波長域、例えば５００　ｎｍ〜
５５０Ｈｍにおける極大吸収波長域に基ついて吸光度測
定すればよい。さらに別の測定法としては、例えば還元
型ＮＡＤ　（Ｐ）にレザズリンなどの螢光用試莱の共存
下ジアホラーゼを作用せしめて反Ｑｌｒ　Ｖこよって螢
光する成分の量を定量［７てもよく、公知のこの種の還
元型ＮＡＤ　（Ｐ）の定量”Ｉ＝ｊＧが利用できる。特
に還元型ＮＡＤ　（Ｐ）を定量するに当っては、サイク
リング反応〔Ｉ〕においてＵＨ２０゜の生成を伴うため
にカタラーゼを用いてＨ２Ｏ２を分解、消去せしめるこ
とが好ましい。さらに感度を向上させるためには、サイ
クリング反応［１１）の系にさらにＮｋＤ　（Ｐ）ペル
オキシダーゼ（ＥＣ、１，１１゜１．１、ＥＣ，１゜ｌ
　１．１．２．）を作用きせ、生じたＨ２Ｏ２を還元型
ＮＡＤ　（Ｐ）の減少に変え、２倍の感度で測定（、て
もよ−。また生成する成分であるＨ２０□の定量に当っ
ては、過酸化水素電極を用する電気化学的変化の量とし
て定量することができる。

このように本発明ば、脂肪族アルコールー脂肪族アルデ
ヒドサイクル反応による新規な定量法であり、かつ１分
間当り１０サイクル以上の高サイクル反応を行うもので
、極めて高感度にて被検液中の成分を測定できる優れた
ものである。

次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれらによって４’ｉｌんら限定さ九るものではな
い。

実施例１ アセトアルデヒドまたはエタノールの足置５０　ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐ［（７，５）アルコールデヒドロゲナー
ゼ（酵母製）　４０　Ｕ　／ｍｅアルコールオキシダー
ゼ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ　％　シグマ社
）　４０Ｕ／ｍ１ １．８　ｍＭ　還元型ＮＡＤ ０．２Ｍ　Ｋｃｌ 上記組成を有する反応液０．５　ｍｌを小試験管にとり
、３７℃に加温後、各々０．２０．４０．６０．８０．
１００μＭのエタノールまたはアセトアルデヒド１０μ
ｌを添加し、３７℃で正ゲＪに５分間反応ヲ行い、０．
５％ＳＤＳ　（ドデシル・硫酸ナトリウム）溶液（ｐＨ
７，５）　２．５　ｍｌ添加して反応全停止に、３４０
Ｈｍにおける吸光度″ｆ：測定（た。その結果は第１図
に示す通シで約３０回転／分のサイクリング率であった
。

、○−○エタノール、・−のアセトアルデヒド。

実施例２ 実施例１と同一の組成を有する反応液に１．２（Ｊ／ｍ
ｌのＮ４ＡＤ−パーオキシダーゼ（ＥＣ，１，１１゜１
．１　、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉ
ｓ、シグマ社製）または４００　Ｕ／ｍｌ！のカタラー
ゼを添加した反応液分用い実施例１と同様の反応を行っ
た。その結果は、第２図の通りであって、ＮＡＤ−パー
オキシダーゼ全添加り、た場合は２倍の感度で測定され
た。

また、カタラーゼを添加した場合は、ＡＩＬαの部分で
直線性が曵い結果が得られた。なお検体はアセトアルデ
ヒドを用すた。

実施例３ 実施例１と同一の組成を有する反応液ｌ、　Ｑ　ｍｌを
ガルバニ−型酸素電極を装着（−た反応槽にとり、温度
３７℃に保ったのち、各々０．５０Ｘ　１００．１５０
．２００．３００，４００，５００μＭのアセトアルデ
ヒド溶液２０μｌ添加（−１このときの酸素消費速度を
測定した。その結果は第３図に示す通りであって、良い
直線性が得られた。

実施例４ 実施例１と同一の組成を有する反応液１．０　ｄを用ｂ
１これにＹＳＩ社製社製化水素電イ屯を配設し、３７℃
に加温後、０，５．１０Ｘ　１５．２０　、３０゜４０
．５０μＭのエタノールをｌＯμ／　ｋｍ加して反応せ
しめ、そのときのエタノールｍ　ｆ：　Ｈ２０ａ成量の
関係にて測定した結果第４１図０−　ＯＶＣて示すもの
で、良好な１α線関係が得られた。

また上記のエタノールの代りにプロパツールを用いて同
様に行なった結果第４図９−■にて示す通りで、良好な
直線関係が傅らｈ／ζ。

実施例５ ０、５　Ｍリン酸緩衝液（Ｄｉ（７，５）　１００ｍｌ
アルコールデヒドロゲナーゼ（酵母１Ｑ　）　４０００
　（ｌ　ｕアルコールオキシダーゼ（ピキア属由来；　
フィリツプス・ベトロリアム社＃　Ｊ　４　ｏ　ｏ　Ｏ
ＯＵ還元型Ｎ　Ａ　Ｄ　”２００ｔｔｍｏ／ｅｓｆ（ｃ
　１３　０　、２＋ｎｏ／ｅ シユクロース　１０．９ Ｆ　Ａ　Ｄ　５　ｐｍｏ／ｅｓ 上ｎｔの組成を有する溶液１０ＯＩＬｌを凍結乾燥（７
てｌＯ１００Ｏ用試槃とした。本試タトはＪＪ「肪族ア
ルコールや脂肪族アルデヒドの電縫用、またＱよこ几ら
を遊離する反応系の成分の定ｍ　４　Ｌ−＜はそれらに
関与する酵素活性測定用試薬として供されるものである
。

【図面の簡単な説明】

第１図はアセトアルデヒドおよびエタノールの定量曲線
、第２図はアセトアルデヒドの定量曲線、ｙ４３図は酵
素電極法によるアセトアルデヒドヒドの定量曲線、第４
図はエタノールおよびプレ・（ノールの検量線を示す。 ０　２０４０６０８０　＋００　０２０４０６０　８０
　＋００検イ本中のｉｊ（９μＭ）　木ン体中のυＩ刀
支（ＰＭ）Ｏ０，＋　０．２０．３０．４０．５　０　
１０２０３０４０　５０粒中ωアセトアノしデ゛ヒトの
　ギ駐やＬ中ω５息人しく、μＭ）」鯰、ｉｊ（ｍＭ） 手続宇市正１ジＦ 昭和５９年２月２７日 特、１１庁長官　殿 ■、串件の表示 昭和５８年　特許願　第１８９３２７号２、発明の名称 新規な酵素釣菌感度測定法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福６３２の１名称　束〆イ
珀ＩＣ造株式会社 ４、代理人　〒１７０ 東京８１１豊島区北犬塚２−１６−９ １５ｐ、　Ｅ’＋　２９　ｊ ６、補正の対象 （１）願書の「特許出願人」のｔｌＶＩ（２）明細書ノ
ｌ［詳請求ｃｌ）　Ｉｉｉ囲１ｃ７）ＩＩＹＩ７、補正
の内容 （１）特許出願人の代表者名を別紙訂正１！Ｆ！ｉ　；
’＋の進り補正する。 （２、特許請求の範囲を別♀ＪＥの通り補正ずイ１゜植
正液■称丸拵氷（２）柑皿 ヒトのいずれｊイ成分を定量する方法において、式（た
だし、脂肪族アルコールと脂肪族アルデヒドの炭素数は
同一である。） で示されるサイクリング反応を形成させるために、被検
液中の成分とサイクリング反応ＣＩ）を形成するアルコ
ールオキシダーセ、アルコールデヒトロケナーゼ、還元
型ＮＡＤ、（Ｐ）および０２を反応せしめ、サイクリン
グ反応（１）によって生じた検出できる変化の量を定量
することを特徴とする酵素的高感度測定法。 （２）サイクリング反応［１）において、１分子の１１
２　ｏｚと１分子の還元型ＮＡＤ　（Ｐ）を消費して２
分子の水分子と１分子のＮ’ＡＤ（Ｐ）を生成する反応
を触媒するＮＡＤ　（Ｐ）ベルオキシダーセを作用せし
め、次いで反応によって生じる検出てきる変化の量を定
量してなる特許請求の範囲第１項記載の測定法。 恩　サイクリング反応（１）における生成ＮΔＤ（１）
）において、ＮＡＤ　（Ｐ）を基質とする第２のテヒト
（１）　ロケナーゼおよびそのデヒドロゲナーゼ用基ｒ
〔化合物を用いて生成ＮＡＤ’（Ｐ）に作用せしめ、Ｎ
ＡＤＰ） （Ｐ）を還元型ＮＡＤ　（Ｐ）にサイクリング〜υ−し
めてなる第２サイクリング反応を形成せしめることを含
む特許請求の範囲第１項記載の測定法。 阿　検出できる変化の量が、０２消費量である特許請求
の範囲第１項記載の測定法。 皿　検出てきる変化の量が、ｌ−１２０２生成量である
４ｈ許請求の範囲第１項記載の測定法。 皿　検出できる変化の量が、還元型Ｎ八ｌ）　＜　ｐ　
＞　７＋ｌｉ費量である特許請求の範囲第１項記載の測
定法。 辺　脂肪族アルコールか低級脂肪族アルコール−Ｃある
特許請求の範囲第１項記載のｉｊ！Ｉ定法。 皿　低級脂肪族アルコールが、エタノール、プ１：］パ
ノールまたはブタノールである特許請求の範囲第一７−
項記載の測定法。 皿　脂肪族アルデヒドが、低級脂肪族アルデヒドである
特許請求の範囲第１項記載の測定法。 −呼）低級脂肪族アルデヒドが、アセトアルデヒド、プ
ロピオンアルデヒドまたはブチルアルデヒドである特許
請求の範囲第１項記載の測定法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ）被検液中の脂肪族アルコールまたは脂肪族アルデヒ
   ドのめずれかの１成分を定量する方法におりで、式 （ただし、脂肪族アルコールと脂肪族アルデヒドの炭素
   数は同一である。） で示されるサイクリング反応を形成させるために、被検
   液中の成分とサイクリング反応〔■〕を形成するアルコ
   ールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、還元
   型ＮＡＤ　（Ｐ）　おｊび０２を反応せしめ、サイクリ
   ング反応ＣＩ’ｌｌにによって生じた検出できる変化の
   量を定量することを特徴とする酵素的高感度測定法。 ２）サイクリング反応〔■〕において、１分子のＨ２０
   □と１分子の還元型ＮＡＤ　（Ｐ）を消費して２分子の
   水分子と１分子のＮＡＤ　（Ｐ）を生成する反応を触媒
   するＮＡＤ（Ｐ）ペルオキシダーゼを作用せしめ、次い
   で反応によって生ずる検出できる変化の量を定量してな
   る特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ３）検出できる変化の量が、還元型ＮＡＤ　（Ｐ）消費
   量である特許請求の範囲第１　ＪＥ記載の測定法。 ４）サイクリング反応ＣＩ）における生成ＮＡＤ（Ｐ）
   において、ＮＡＤ　（ｐ）を基質とする第２のデヒドロ
   ゲナーゼおよびそのデヒドロゲナーゼ用基質化合物を用
   いて生成ＮＡＬ）（Ｐ）に作用せしめ、ＮＡＤ　（Ｐ）
   を還元型ＮＡＩ）（Ｐ）にサイクリングせＢめてなる第
   ２サイクリング反応を形成せしめることを言ひ特許請求
   の範囲第１項記載の測定法。 ５）検出できる変化の量が、０２消費重である特許請求
   の範囲第１項記載の測定法。 ６）検出できる変化の量が、Ｈ２０□生成量である特許
   請求の範囲第１項記載の測定法。 ７）検出できる変化の量が、還元型ＮＡＤ　（Ｐ）消費
   縫である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ８）脂肪族アルコールが低級脂肪族アルコールである特
   許請求の範囲第１項記載の測定法。 ９）低級脂肪族アルコールが、エタノール、グロパノー
   ルまたはブタノールである特許請求の範囲第８項記載の
   測定法。 １０）脂肪族アルデヒドが、低級脂肪族アルデヒドであ
   る特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ｌｌ）低級脂肪族アルデヒドが、アセトアルデヒド、プ
   ロピオンアルデヒドまたはブチルアルデヒドである特許
   請求の範囲第１Ｏ項記載の測定法。