JPH04500069A - ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチン ウシウィルス性下痢ウィルス（ｂｏｖｉｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ｄｉａｒｒｈ。

ａ　ｖｉｒｕｓ、以後、”　ＢＶＤＶ”と略す）は、英国、それ以外の酉ヨーロ ッパ、化アメリカ、オーストラリア、および、アフリカにおいて、ウシに極めて 一般的なものである。このウィルスに感染すると、最初に感染した年令により大 きく影響されて、種々の病状や症候群が発生するが、このウィルスは、これに感 染したことがない若いコウシに対して、過渡感染を引き起こすものである。これ は、白血球減少症、および、免疫抑制の相関期間と関連するものであり、このウ ィルスに感染すると、他の微生物に感染しやすくなるものである。ＢＶＤＶは、 若い家畜ウシにとっては、多分、ＲＳウィルス（Ｒ３Ｖ：ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ ｙｓｙｎｃｉｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ）に次ぐ、呼吸疾患の突発性に関連した、最 も重要なウィルスであるが、ＢＶＤＶは免疫抑制作用を有するため、他の、コウ シ感染、たとえば腸炎の場合にも、ＢＶＤＶがその原因である可能性がある。こ のウィルスはまた、米国およびカナダにおいて、′過密状態におかれているコウ シ（ｆｅｅｄｌｏｔ　ｃａｌｖｅｓ）”の、病気の主因であるとも考えられてν する。

コウシは回復するにつれて、再感染に対する免疫性を示すが、この免疫性は、完 全もしくは永久的なものではない。

妊娠しているウシが感染すると、問題は、より重大である。すなわち、流産して しまったり、または、出産される胎児が奇形である可能性がある。この奇形は、 免疫適格が発達する時期に、ウィルスに感染することによるものであり、不完全 な免疫反応の結果といえる。免疫適格が発達する前に胎児が感染すると、妊娠期 間に、胎児にウィルス血症が残存するものであり、また、このウィルスの細胞変 性がないまま、永続的にウィルス血症を有するコウシが出産されるものである。

このウシは、特別に、生涯、ＢＶＤＶに対して免疫耐性を有するが、このような コウシは、後に、粘膜の疾患、すなわち、ＢＶＤＶの細胞変性を有する変形株の 重感染により、死に至るものである。

英国における、通常のコウシの約０．４％が、ウィルス血症であると見積られ、 その主な感染源は、農場である。

伝統的には、ウィルス性ワクチンは、以下の２つのグループにわけられるもので ある。すなわち、細胞変性が少なくなるような方法で、処理もしくは増殖させた （毒性を弱められた）生ウィルスを含有する生ワクチンと、不活性ウィルス粒子 を含有するワクチンとである。ＢＶＤＶＪ：ＩＳｌてはいえば、ウィルス自体、 細胞変性であっても、細胞変性でなくても良い。したがって、厘則として、ＢＶ ＤＶワクチンは、４つの主なグループに分けることができるが、入手可能なワク チンの大半は、細胞変性ウィルスに基づくものである。さらに、生ワクチンは許 容されるものではないと考えられており、これは、細胞変性の生ワクチン菌株が 、永続的なウィルス血症動物を、粘膜疾患により致死させてしまう可能性があり 、また、細胞変性のない生ウイルスワクチンは、妊娠したウシの胎児に感染し、 上記のような疾患により致死させてしまう可能性がある。

気道を経由した感染は、農場でのウィルス伝染における最も重要なルートであり 、このルートによる蔓延を防ぐことが、ＢＶＤＶによる疾患を制御するのに、最 も有益な効果を示すものと期待される。

不活性なりＶＤＶを用いてワクチン注射を行なうと、呼吸性感染が防止され、あ る実験においては、５頭の、ワクチン注射したコウシのすべてが、呼吸性感染に 対して抵抗力を示したが、他の５頭の、ワクチン注射をしなかったコウジは、す べて感染した。

不活性な（殺、ｋ　ｉ　Ｉ　Ｉ　ｅｄ）ＢＶＤＶ抗原は、抗体の高タイター価の 産生を誘発し、その量は、ワクチン注射前には、５０単位より少ながったのが、 ワクチン注射後には、２，０００−１０，０００単位以上となった。

本発明は、不活性なく殺、ｋｉｌｌｅｄ）細胞変性のないウィルスからなるワク チンを提供するものであり、そのウィルスは、ＭＤＢＫ細胞系（ＭａｄｉｎＤａ ｒｂｙ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｋｉｄｎｅｙ：　Ｍａｄｉｎ　＆　Ｄａｒｂｙ（１９５ ｆｆ）；　ＥＣＡＣＣ社より入手可能（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒ ｅ％ＵＫ））のような、ウシの細胞から誘導される細胞系において増殖するもの でありごＱｕｉｌ　Ａ”がアジュバントとして加えられたものである。

ＭＤＢＫ細胞は、世界中の、多くの実験室より入手可能なものである。本発明の 実用において使用される、他のウシ細胞系としては、ＥＢＬ細胞、ＮＭ５Ｍ胞、 ＬＷＣ８７４細胞、および、ＣＴｅ細胞が挙げられる。

ＭＤＢＫ細胞系は、このましくは、１４７−１８７の継代培養（ｐａｓｓａｇｅ 　１ｅｖｅｌ）において、より好ましくは１４７から１５７において、最も好ま しくは１４７において、使用されるものである。種ウィルスは、好ましくは、Ｂ ＶＤＶ　（細胞変性していない菌株）を約１０’ＴＣＤ、。を、コウシの精巣細 胞の融合培養に添加することにより調整されるものである。コウシの精巣細胞は 、種培養で増殖しやすいものであり、それは、ウィルス収率が、これらの細胞に おいてより高く、抗原の収率が、ＭＤＢＫ細胞においてより大きいからである。

これらの細胞は、イーグルの最少必須借地（ＥａｇＩ　ｅ’　ｓ　ＭＥＭ）を用 いて回転瓶において増殖され、ウシの胎児の血清　７．５％、炭酸水素ナトリウ ム　０゜１１％、および、ラクトアルブミンの加水分解産物　０．２５％が添加 されてもよいものである。ウィルスの添加後、培養は、５０ｍ１の借地；ウシの 胎児の血清　２％、炭酸水素ナトリウム　０．１７％、ラクトアルブミンの加水 分解産物０．２５％、および、塩化マグネシウム（ＭｇＣ１！・６Ｈ，Ｏ）　０ ．６％を含有する、イーグルの基礎借地（Ｅａｇｌｅ’　ｓ　ＢＭＥ）に、維持 されるものである。培養は、約３６℃において、５日間から９日間、好ましくは ７日間インキュベートされ、凍結／解凍の１サイクルにふされるものである。懸 濁液は、約５００ｇを４分間から６分間、好ましくは５分間、遠心分離されて、 沈殿物が取り除かれ、少量の上澄み液が、約−７０℃に冷却保存される。この保 存された種ウィルスのタイターは、コウシの精巣細胞の培養により、定量するこ とができる。

ウィルス抗原は、約１ｍｌの種ウィルス（ＢＶＤＶを約１０’ＴＣＤ、。含有す る）を、ＭＤＢＫ細胞の培養に添加することにより、調整されるものである。

これらの細胞は、イーグルの最少必須借地、ウシの胎児の血清　１０％、および 、炭酸水素ナトリウム　０．１１％を用いて回転瓶において増殖され、培養が約 ７辱％融合するとき、すなわち約４日後に、使用可能なものである。ウィルスの 添加後、培養は、１２５ｍ１の基礎借地（ＢＭＥ　（二上止！−１１，ＩＬＬ） ）において、維持することができる。７日後、培養が、約１０８の細胞および約 １０ｓ５ＴＣＤｓ、のウィルスタイターを有したら、β−プロピオラクトンを、 ４９９に対して］（５００のうち１）の濃度で添加し、約３６℃で、３時間、回 転瓶で、ウィルスを不活性にするものである。この抗原が完全に不活性であるが 否かは、コウシの精巣細胞の培養において、サンプルの継代により、チェックさ れる。この抗原は、−２０℃において、保存されるものである。

細胞培養が、種ウィルスおよびウィルス抗原に使用される以前に、これらに対す る、外因性のＢＶＤＶの存在がチェックされるものである。ウシの胎児の血清に おいては、ウィルスおよびＢＶＤＶ抗体がないことが、検査されるものである。

ワクチンの１回の投与量は、５０ｕ１の株（水中、２０ｍｇ／ｍｌ）に対して、 １ｍｇの”Ｑｕｉｌ　Ａ”　（スーパーフォス、デンマーク　（Ｓｕｐｅｒｆｏ ｓ　Ａ／ＳＳＤｅｎｍａｒｋ））を、４ｍｌのβ−プロビオラクトンー不活性ウ ィルスに添加することにより、調整されるものである。このワクチンは、生後約 ３箇刀で、自分自身、および、感染により母体から誘導された、ＢＶＤＶ抗体を 、いずれも有さないコウシの後ろ肩に、皮下注射されるものである。

ワクチン注射されたコウシは、エリザ（ＥＬＩＳＡ　（Ｈｏｗａｒｄ、Ｃｌ　ａ ｒｋｅ　＆　Ｂｒｏｗｎｌｉｅ、１９８５））（すなわち、最初のワクチン注射 から６週間を検知するものである）により定められた、抗体反応（表１）を示し た。これらのワクチン注射されたコウシ、および、ワクチン注射されていないも のく比較例）は、ＢＶＤＶが、気道に対して向性を有すること、および、鼻咽喉 へ一定の速度で分散することがら選択されたＢＶＤＶの菌株（１１２４９ｎｃ） を用いて、感染試験された。コウシは、第８透口で、鼻腔に感染させた。ウィル スの分散は、感染試験から約ｌＯ日間、鼻咽喉へ・の感染をａ棒を用いて（同時 に血液検査も行なった）！！ＩＩべられ、サンプルは、コウシの精巣細胞の培養 に伺された。ＢＶＤＶは、表２および表３に示すように、ワクチン注射されてい ないもの（比較例）から検出されたが、ワクチン注射されたコウシからは、検出 されなかった。個々における感染試験時の抗体レベルと感染しやすさとの関係が 、表３に示されている。ワクチン注射されていないもの（比較例ンのいずれも、 感染試験時においては、検出されるほどの抗体を有してぃなかったが、すべての ものが感染し、抗体ができたものである（漿液が変化した）　（表１参照）。

ＢＶＤＶ抗原は、他の微生物（好ましくは不活性な微生物）にも含有されており 、多価のワクチンを形成するものである。これらの微生物には、ＲＳウィルス、 バラインフルエンザ　３　ウィルス、および、マイコプラズマ　ボビス（琶ｃｏ 　ｌａｓｍａ　ｂｏｖｉｓ）が含有されるものである。

すべてのウィルスを使用する替わりに、ウィルスから抗原を分け、これを、Ｑｕ ｉｌ　Ａ”、および、任意には、適当なキャリアなどとともに、使用することが 有益である。これは、公知の方法で施行可能なものである。

（以下、余白） 紅 菌株”　Ｋｙ１２０３ｎｃ”をワクチン注射したコウシにおける、エリザ（ＥＬ ＩＳＡ）’による抗体反応 グループ　コウシ　０週２３週２６週２８週２１０週２１２週２の数 ワクチンを　５　１．４　ＮＤ　ＮＤ　１．４　２．０９　２．５０与えていな い　＋０．６０　＋０．１２もの ワクチンを　５　１．４　１．４　３，０７　３．５２　４．３８　４．０９標 準投与した　＋０．３０　＋０．１３　＋０．２５　＋０．２９もの １　抗体の単位数（１０′′）±　ＳＤ２０週目、３週目、６週目にワクチン注 射。

８週目に菌株”１１２４９ｎｃ”を用いて鼻腔内に、感染試験。

紅 ＢＶＤＶ感染に対する、菌株”Ｋｙ１２０３ｎｃ”のワクチン注射による効果グ ループ　コウジ　下記の日に感染した１コウシの数の数　０　４　６　８　１０ ワクチンを　５　０１５１０ 与えていない もの ワクチンを　ｓ　ｏｏｏｏ。

標準投与した もの １　綿棒による鼻咽喉への検査に上り単離表１ 感染試験時における抗体と個々の感染しやすさとの関係アニマル　ワクチン１　 抗体２　ウィルス単離３　ルコビニア％４コード番号　綿棒による　血液検査 鼻咽喉への検査 Ｘ５０２　Ｓ　３．７１　−　−　５ Ａ２１　Ｓ　３．５７　−　−　０ Ｘ６９４　Ｓ　３．５１　−　−　０ Ｘ６５７　３　３．４２　−　−　０ Ｘ６８４　３　３．３８　−　−　５ Ａｇｏ　１．４．　＋　−４６ Ａ４０７　−　１．４　＋　＋　４８ Ｘ１９２　−　１．４　＋　＋　５３ Ｘ６５８　−　１．４　＋　＋　５２ Ｘ６５９　−　１．４　＋　＋　５４ １　ワクチンを標準投与したもの　（Ｓ）ワクチンを与えていないもの　（−） ２　感染試験日に、エリザ（ＥＬＩＳＡ）による抗体単位（１０″′）３　ｍ棒 による鼻咽喉への検査により単離６日目の血液より単離 ４　ルコピニア（Ｌｅｕｃｏｐｅｎｉａ）接種前値、３値の平均に対する、血球 計算におけるパーセント減ＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ　Ｂｏｖｉｎｅ　 Ｋｉｄｎｅｙ）細胞系は、ＡＴＣＣＣＣＬ　２２として、アメリカン　タイプ　 カルチャー　コレクション、米国、マリ−ランド、ロックビル（ｔｈｅ　Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ％Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）より、約２５年間、入手可能である。１９ ８２年以来、この細胞系は、ＢＶＤ−フリーである。同細胞系は、また、ヨーロ ピアン　コレクション　オプ　アニマル　セル　カルチャーズ、英国、ウイルト シャイアー、サリスバリー、ボートン　ダウン（ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒ ｔｏｎＤｏｗｎｌＳａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ、以後、これ をＥＣＡＣＣと略す）から、受託番号ＥＣＡＣＣ８５１０２４０１号として、入 手可能であるが、このＭＤＢＫ細胞系は、他の種から誘導されたものである。そ のサンプルは、ブタベスト条約に基づき、１９８９年８月２日に、受託番号８９ ０８０２０１号として、ＥＣＡＣＣに寄託されているものである。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）細胞変性のない、ウシウイルス性下痢ウイルス（ｂｏｖｉｎｅｖｉｒ ｕｓｄｉａｒｒｈｏａｖｉｒｕｓ；ＢＶＤＶ）を、ウシの細胞から誘導された細 胞系で増殖する過程と、（ｂ）過程（ａ）で得られたウイルスを不活性にする過 程と、（ｃ）過程（ｂ）で得られたウイルス性誘導物質と、ＱｕｉｌＡとを混合 する過程とからなる、ワクチン調整方法。
2. ２．前記細胞系が、ＭＤＢＫ、ＥＢＬ、ＮＭ５、ＬＷＣ８７４、もしくは、ＣＴ ｅ細胞からなる、特許請求の範囲第１項に記載のワクチン調整方法。
3. ３．前記細胞系が、ＭＤＢＫ細胞からなる、特許請求の範囲第２項に記載のワク チン調整方法。
4. ４．初期過程において、前記細胞系が、コウシの精巣細胞において増殖されたＢ ＶＤＶにより接種されるものである、特許請求の範囲第１項ないし第３項に記載 のワクチン調整方法。
5. ５．前記ウイルス性誘導物質が、すべてのウイルスからなる、特許請求の範囲第 １項ないし第４項に記載のワクチン調整方法。
6. ６．不活性な、細胞変性の無いウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）と、そ のアジュバントとしてのＱｕｉｌＡとからなる、ＢＶＤＶ感染に効果的なワクチ ン。