JPH04500511A - 蛍光性ベンゾチアゾール誘導体の製法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光性ベンゾチアゾール誘導体の製法及び用途１、発明の分野 本発明は、蛍光性物質の分野に関し、又、生物学的検定の分野に関する。

２、背景 環境での物質の状態又は存在を作用物質の加水分解の速度を決定することにより 測定することはよく知られている。特に、このような測定に蛍光性物質を使用す ることは、このような使用が作用物質、例えば酵素の非常に低レベルの加水分解 を測定するのに典型的には実用的でないが、知られている。一般に、化学残基の 除去により、化合物の蛍光は増大する。しかしながら先の化合物は、水性環境中 、低レベルの酵素を測定するには適当でなかった。

明細書中に記載する全ての文献を引用して明細書記載の一部とする。

Ａ、酵素測定 一般に、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の測定は、それが体内組織の細胞膜に 遍在するので、種々の疾病の診断に用いられて来た。

ファーンレイ、エヌ、エッチ１．マミリアン・アルカリン・ホスファターゼ、イ ン：ポイヤー、ビー、ディー、（ニド、）、ジ・エンザイムス、■巻、アカデミ ツク・プレス、二ニー・ヨーク１９７１．４１７−４４７頁。種々のエステラー ゼも、又、疾病の臨床的診断用に測定される。ベルグメイヤー、エッチ、ニー１ ．メリーズ・オン・エンザイマチック・アナリミス、サード・ニド、■巻、１− １４３、ヴエルラーグ・ケミ−，１９８４゜生物学的技術の最近の進歩により、 これらの酵素は、生物学的プローブと組合せて、相補的生物学的分子の決定用の マーカーとして用いられる。即ち、酵素の活性で、プローブに相補的な生物学的 物質の量を間接的に測定する。種々のエステラーゼが使用されうる一方、アルカ リホスファターゼ測定により、相補的生物学的分子の決定及び測定用の便利な検 定が提供される。ベルグメイヤー、上記、同巻１０−１１゜既に、ＡＰのレベル は、ＵＶ可視的スペクトル光度測定法、ラジオイムノアソセ−（ＲＴＡ）及び蛍 光性基質を用いてモニターされて来た。

Ｕｖ化合物は、ＡＰの検定用に試みられて来た。例えばチモールフタレンモノリ ン酸エステル、コールマン、シー、エム１．クリ二カ・キミカ・アクタ、１３： ４０１（１９６６）、フェノールフタレンモノリン酸エステル、ウィルカーソン 、ジェイ、エッチ、及びヴオドン、エイ、ヴイ３、クリニカル・ケミストリイ、 １２ニア０１（１９６６）及びバラ−ニトロ−フェニルリン酸エステル、ノイマ ン、エッチ５及びヴアン・ヴルデンダール、エム２、クリ二カ・キミカ・アクタ 、エフ：１８３（Ｉ　９６７）。これらの化合物は、ｌＯアトモル／Ｉｆｆ（１ ０Ｘ　１０伺８モル／ｆｆｆｆ）のＡＰを決定するのに必要な有効蛍光性化合物 よりも約１０００倍も感受性がない。

ＡＰを検定するのに用いられて来た、文献に記載されている種々の蛍光性基質が ある。これらの基質は、全て、種々の理由から全く満足し得ないものであった。

７−ヒドロキシクマリンリン酸エステル、グレイザー、アール及びハイ不ス、エ ム、アナル、レタース゛、１（５）：３３３−４５（１９６８）並びに７ヤーマ ン、ウィリアム・アール及びロビン、エリ、アナリティカル・ケミストリイ、４ ０／４：８０３−５１（１９６８）は、酵素を飽和するのに１０ｍＭもの高基質 レベルを必要とする。

そのストークスシフトは７８ｎａ＋（３７６ｎｍの励起と４５４ｎｍの放射）及 び４２２ｎｍのラマン蛍光である。ラマンは蛍光最大に近いので、４５４ｎｍに 現れているシグナルをマスクできる。即ち、これらのファクターは、非常に低レ ベルのＡＰを速やかに測定するための基質の能力に悪影響を有する。

２−ベンゾ牛すゾリルー７−ヒドロ手シクマリンリン酸エステル、ウォルフバイ ズ、オツド・ニス　及びフラー、エルンスト、ミクロケミ力・アクタ、３８９− ９５（１９８５）は、４４ｎｍの低ストークスシフ）（４７１ｎｍの放射を伴う ４２７ｎｍの励起）を有する。この基質と関連する二次的マイナスは、トリスｐ Ｈ９，５で一１５℃ですら水性溶液安定性が低いことである。

２−フェニル−７−ヒトロキシクマリンリン酸エステル、オツド・ニスおよびコ ラ−、エルンスト、ミクロケミ力・アクタ、３８９−９５（１９８５）は、８８ ｎｍの高ストークスンフト（４７１ｎｉの放射を伴う３８３ｎｍの励起）を有す るが、先の化合物について述べたと同様、水性溶液安定性が悪い。

フルオレソセンリン酸エステルは、２５ｎ１１１のより高いストークスシフ）（ ４７１ｒ＋１１＋の放射を伴う３８３ｎｍの励起）を有する。この小さなストー クスシフトは、低レベルでのＡＰの決定には全く適当でない。テイファニイ、テ イ二　オウ、：ウストキイ、エム、ビー、；バーチイス、シー、エイ、及びサッ カー、エル、エッチ１、クリニカル・ケミストリイ、旦／８コ　８７１−８２（ １９７３）参照。

３−ヒドロキシー２−ナフタニリド−６−ブロモ、３−ヒドロキシ−２−ナフチ ル−Ｏ−アニンジンリン酸エステル、ギルポウルト、シー、７＋、、　ニニアー φフルオロメトリック・メソッズ・フォア・ジ・アナリシス・イン・バイオロジ カリイ・インボータント・カンバウンズ、４＞フルオレッセンス・テクニクス・ イン・セル・バイオロジイ・サール　エイ、エイ、及びサーネッッ、エム、スプ リンゲルウ゛エルラーク、エヌ、イブ／ロン、１　ハイデルベルグ、ベルリン出 版、２３５−４２（１９８３）；ヴアウグン、エイ９．ギルボウルト、ジー、及 びハックエイ、ディ０．アナリティカル・ケミストリイ、４３／’６：７２１− ４（１９７１）及びギルボウルト　ジージー１．ジェイ、レス、エヌ・ピー・エ イ、７６Ａ　６：６０７−１２（１９７２）は、１１０ｒ＋ｍのストロークスシ フト（４０５ｎｍの励起及び５１５ｎｍの放射）を有する。しかしながら、１９ ７１年の文献は、基質の最大の感受性を減する残存しているリン酸化基質に基づ ＜５］５ｎｍの残留蛍光（ｒｅｓｉｄｕａ］　ｆＩｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）があ ると述べている。さらに、本基質は、ＡＰの存在を顕微鏡的に視覚化するための 無傷の（ｉｎｔａｃｔ）細胞での固体表面アッセーにしか用い得ない。本基質の 構造上の理由から、加水分解生成物は、生物学的材料のアノセーの塩基性水性条 件下では不溶性であろうと思われる。このことから本基質の有用性が限られる。

２−ヒドロキシ−３−ナフトイック・アニリドリン酸エステル、ツオウ、ケイ、 シー、及びマツカワ、サダオ、ジャーナル・イン・メジシナル・ケミストリイ、 １１／１５：］、］０９７−９１９６Ｂ）は、２２０ｎｍのストロークスシフト （３００ｎｍの励起及び５２０ｎｍの放射）を有する。しかしながら本基質は組 織化学的アッセー系にしか使用できない。加水分解生成物、２−ヒドロキシ−３ −ナフトエ酸アニリドは、安定性が低く、その使用が運動論的又は点アッセ（ｋ ｉｎｅｔｉｃ　ｏｒ　ｐｏｉｎｔ　ａｓｓａｙ）での使用を困難にする。又、そ のバックグラウンド蛍光は比較的高く、５２０ｎｍでその最大感受性は高バック グラウンド読取りＣｒｅａｄｉｎｇ）ｊこ基づき低く示すと報告されている。

３−０−メチルフルオレノセンリン酸エステル（３−０−ＭＦＰ）、ヒル、ホイ ル・デー１、サマー、ジッージ・ケイ、及びウォーターズ、ミカケル・ディー１ 、アナリティカル・バイオヶミストリイ、２４：９〜１７（１９６Ｂ）：ウォル フバイズ、オツド・ニス、及びコラ−、エルンスト、ミクロケミ力・アクタ、３ ８９−９５（１９８５）、ハシモト、シンヤ、コバヤシ、ケンセイ；フジワラ、 キタオ、ハラブチ、ヒロシ及びフヮ、ケイイチロ、分析化学、３２：Ｅ１７７− Ｅ　１８４（１８３）並びにフルガールド、アープ、キールドセン、ケルド、シ ーセン、ジム・ステンファソト；ラーセン、クリスチアン・グロンノイ及びシー セン、フレデリック・グロンノイ、スカンジナヴイアン・ジャーナル・オン・ク リニカル・アンド・ラボラトリイ・インヴエスチゲーション、±且　２：１３９ −４４（１９８５）は１５ｎｍのストークスシフトを有する。ハシモト等は、又 、ＡＰのア、セーに適した水性条件下でのリン酸エステルの加水分解の問題を記 載している。

リボフラビン−５−リン酸、グレイイー、アール及びノ１インズ、エム　、アナ リチカル・レターズ、１（５）３３３−４５（１９６Ｂ）及びタケウチ、ティ及 びノガミ、ニス１、アクタ・バソロジ力・ジャパン、４．２７７（１９５４）は 、組織Ａ’Ｐアッセーのみに用いられている。そのアッセーの最大感受性は報告 されていない。

フラボンシリン酸エステルは、５１０ｎｍの放射波長を有する。グレイイー、ア ール、及びハイ不ス、エム、アナリチカル・レターズ、１（５）：３３−４５（ １９６８）並びにランド、ディー、ビー、及びジャ牛ム、イー、アナリチカル・ バイオケミストリイ、１６：４８１（１９６６）。励起波長は報告されなかった 。著者らは、それは３−Ｏ−ＭＦＰよりも安定な基質であり、又、ベータナフト ールリン酸エステルよりもより感受性の蛍光指標であると報告した。本基質は、 蛍光の開始が観察できるまでに２個のリン酸基の離脱を要する。

このことは、出発基質の一つのフラクシヨンのみが蛍光性でないモノリン酸エス テルに変換される運動論的アノセーにとって耐え難い問題を起こすであろう。さ らにモノリン酸エステルは蛍光放射が観察されるまでに３−ヒドロキシ−フラボ ンに変換されなければならない。

４−１９ｈウンベリフエリルリン酸エステル（４−Ｍ−ＭＵＰ）、ウォルフバイ ズ、オツド・ニス、及びコラ−、エルンスト、ミクロケミカル・アクタ、３Ｂ９ −９５（１９８５）：コーニッシュ、コラリー・ジエイ、、ニール、フランシス ・シー、及びボーズン、゛／クロモンアメリカン・ジャーナル・オン・クリニカ ル・バンロジイ、アール及びロビン、エリ、アナリチカル・ケミストリイ、４０ ４：８０３−５（１９７８）は、３６７ｎｍでの励起を伴う８２ｎｍのストーク スシフトを有する。放射は４４９ｒ＋ｍである。最初の順位ラマンは４１２ｎｍ で、これは４−メチル−ウンベリフェロン（４−ＭＵ）のそれの１／１２０であ る。放射は高いバックグラウンド蛍光に寄与する。コーニッシュらは、４−ＭＵ 　Ｐが４６５ｎｍに放射を有し、それは４−メチル−ウンベリフェロン（４−Ｍ Ｕ）の１／１２０であると報告している。又、これらの著者により、４−ＭＵ　 Ｐが塩基性トリス緩衝液中で分解することが記載された。彼等は重炭酸塩／炭酸 塩緩衝液中で４−ＭＩＪ　Ｐを製造することによって本加水分解の問題、を減少 させることができた。ハシモト、シンヤ、コバヤシ、ケンセイ、フジワラ、キタ オ、ハラブチ、ヒロキ及びフヮ、ケイイチロ、分析化学、３２：Ｅ　１７７−Ｅ 　１８４（１９８３）には、彼等の文献調査によれば４−ＭＵ　Ｐは「天然水中 に溶解した酵素（ＡＰ）に対するより一層の研究に最も期待できる基質のように 思われること。本基質を用い４８時間のインキ二ベーションで、ＡＰ活性の測定 の最低限度はＩ　Ｘ　１０”％ル１弓分−１であったこと。一方、Ｐ、−ＮＰＰ を用いる慣用のスペクトル光度測定法のそれは０．４Ｘ１０′□＠モル１゛１分 −１であったこと。」が報告された。

トルカ、マーリン及びマツクエロイ、ダブリュ、デ仁、メス。

アナル、ケム、旦　４：８０３−５（１９６８）は、水性ｐＨ９，０溶液中のＬ −（＋）−ルシフェリン（ＬＨ）が３８５ｎｍの励起レベルと約５４０ｎｍに放 射を伴う高蛍光性化合物であることを報告している。

水溶液中、量子収率は０．６２である。ＬＨは塩基性水性溶液中、不安定な化合 物である。

２−カルバモイル−６−メドキシベンゾチアゾール、ＬＨの合成での中間体は、 メリーズ・オン・エンザイモロジイ、５７巻、１９頁に報告されている。本物質 に対する報告では蛍光はなく、そしてこのことは我々の実験で証明された。

Ｂ、環境状態測定 環境因子はリン酸エステル基の加水分解を生ずることが知られているので、加水 分解速度のモニタリングは間接的に種々の環境状態を監視しうる。例えば、温度 又はｐＨ又は金属での極端な状態は加水分解力として作用する。従って化学的残 基の付着により阻害され、又、加水分解力により化学的残基が開離して回復した 蛍光を示す蛍光性化合物を持つことは価値がある。

酸素の存在に対し比色試験を用いることは、この分野で、例えば嫌気性環境に対 する比色試験で知られている。蛍光性化合物は、又、酸素レベルの測定にも用い うる。一般に、蛍光性化合物が「長い生存時間−：特性を有する場合には、化合 物は酸素の存在により抑制される可能性がある。これは、蛍光性化合物中の電子 が低エネルギーレベルまで低下し、それらが光エネルギーを放射すると起きる。

電子が低下する期間が充分な場合、低下する電子により放出されるエネルギーの あるものは、酸素分子により利用される。低下する電子に対する最小「生存時間 」は約１０−＋ａ秒であるが、より長い生存時間がより感受性の酸素測定に提供 される。従って、酸素を測定するために「長い生存時間」を伴う蛍光性化合物を 持つことは価値がある。

Ｃ１生物学的分子の直接決定、検定又はモニタリング生物学的リガンド用の標識 はこの分野でよく知られており、それらは放射活性物質、比色指標、及び蛍光性 化合物を含む。典型的には、これらの物質は、放射活性スクレオチドの使用にお けるように生物学的リガンドに取込まれるか、或いはグルタルアルデヒド又は抗 体に蛍光性標識を付すのに用いられる種々の化学的「拡張腕ｊ（ｅｘｔｅｎｓｉ ｏｎ　ａｒｍ＋ｓ）の使用におけるように、リガンドに化学的に付される。

従って、本発明は以下の利点を提供する。

１６水性環境中で安定性を保持する蛍光性化合物；２、バックグラウンド干渉以 上に容易に検定可能である蛍光性化合物。

３、化学的残基の付着によって、蛍光が激しく減するが、該化学的残基の除去に よって、強く蛍光性を示す蛍光性化合物；４、アノセー指示又は他のマーカーと して用いるのに充分なストークスンフトを示す蛍光性化合物； ５、少なくとも約１０アトモル（１０”モル）ａ度のアルカリホスファターゼの 検出用の手段を提供する蛍光性化合物：６　「長い生存期間づを有し、酸化剤を 検出する手段を提供する蛍光性化合物ニ ア、種々の溶媒中で蛍光特性を保持する蛍光性化合物；８、水中で安定で、加水 分解で蛍光性化合物を形成することができる非蛍光性リン酸エステル化合物； ９、幾つかのメンバーは可視光で励起することができる一クラスの蛍光性化合物 。

本発明の要約 本発明は、蛍光性基質としてのベンゾチアゾール（ＢＴ）の誘導体の用途に関す る。ＢＴの高蛍光性誘導体は、ＢＴ誘導体に化学的残基を付着することにより非 蛍光性誘導体に変換できる。化学的残基が非蛍光性誘導体から切断するか、さも なければ解離すると、蛍光が回復する。

これまで、簡単なベンゾチアゾール誘導体で蛍光を示すものはなかった。ごくわ ずかの蛍光性ベンゾチアゾール化合物が文献に報告されているが、実際の蛍光特 性は報告されていないし、知られてもいない。２−カルバモイル−６−メドキシ ベンゾチアゾールは、これまでルシフェリンの非蛍光性誘導体であると報告され ており（上記参照）、これは我々の手で確認された。２−シアノ−６−ヒドロキ シベンゾチアゾール（ＣＢＴ）、トルカ、エム、エイ、及ヒマツクエロイ、ダブ リ丸ディ８、メソズ・オン・エンザイモロジイ、５７：１５−２４（アカデミツ ク・プレス）及び２−カルバモイル−６−ヒドロキシベンゾチアゾール、フォウ レ・アール等、オルグ、マグン、レシン、１１：６１７−２７（１９７８）は、 共に文献に報告されているが、このような化合物の蛍光についても、又、付着さ れた化学的残基によってこのような化合物の蛍光が抑制されることも報告されて いない。ベンゾチアゾール誘導体が蛍光性でありうること、どのような条件下で 、このような蛍光が発現し、どのような条件下で蛍光が抑制されるか、何も示し ていなかった。即ち、ＣＢＴ及びＡＢＴ並びに他のＢＴ誘導体の蛍光性性質は、 本発明以前のこれらの化合物の報告を見ても予期し得ないものである。

本発明は、又、化学的残基を付さないＢＴの蛍光性誘導体の用途にも関する。こ れろの化合物は、例えば生物学的分子を襟識化することにより、直接、生物学的 分子を検定するのに用いることができる。

ＢＴの誘導体は、又、酸素レベルを測定するのに用いることもできる。酸素は、 ＢＴの蛍光性誘導体中、低いエネルギー状態まで低下している励起電子により放 射されたエネルギーを使用するので、ＢＴ分子の蛍光性誘導体の蛍光は減少する 。即ち、蛍光の減少は、アッセー系に存在する酸素の量を示す。

本発明の他の局面は、ＢＴの蛍光性誘導体の、有機溶媒中、蛍光を保持する能力 である。即ち、水中でも有機溶媒中でも、環境における状態及び物質の検出及び 測定に使用することが可能である。

本明細書に記載される一クラスの蛍光性化合物は、図式により示されるこれらの 化合物よりなる。

図中、 ａ）　４．５．６又は７位の炭素の少なくとも一つは、ベンゼン環に付着する陰 性基を含む化学的残基と結合する；　そしてｂ）　２位の炭素は、ベンゾチアゾ ール環系の共鳴を伸張する少なくとも２つの原子よりなる化学的残基と結合する ：　そしてＣ）　！素原子は３位に位置し、そしてｄ）硫黄原子は１位に位置す る。

ベンゼン環と共鳴している陰性基、例えばイオン化可能な水素は、蛍光の抑制に 適した化学的残基の付加に必要である。２位炭素と結合する二原子（ｄｕａｌ　 −ａｔｏｍ）化学的残基は、蛍光用の共鳴系の必要な伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ）である。２位の炭素に結合する化学的残基の長さと結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉ ｏｎ）を増加すると、化合物から放射される光の波長及び励起波長も又、増加す ることが、ここで発見された。即ち、２位炭素に結合する化学的残基の原子の数 を増加することにより、蛍光は色合がより深く表れるであろう。

明細書中、次の用語が以下に定義するように用いられる。

ＡＢＴ：　２−カルバモイル−６−ヒドロキシベンゾチアゾールＢＢＴ：　２’ −（２−ベンゾチアゾリル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾール ＣＢＴ：２−シアノ−６−ヒドロキノベンゾチアゾールストークスシフト：励起 及び放射最大の波長の間の差である冷光発生分子の特性値である物理的定数。

レイリー散乱：光子エネルギーによる励起に基づく電子振動の結果として放射さ れる光による干渉。

ラマン：レイリー散乱ピークよりも高いか又は低い波長の蛍光スペクトルに現れ る。これらのラマン帯は、励起放射とは異なる一定の振動を伴うレイリー散乱ピ ークのサテライトである。これらの帯は、この励起電子に付加されるか又はこれ から減じられる振動エネルギーのためで１ある。

蛍光能カニ励起するために用いられた光の一部として放射した光の量。

励起波長：任意の単位で測定される、蛍光放射を発生するのに用いられる光の波 長。

放射波長　励む後、蛍光性分子により放射される光の波光。

Ｋｍ：酵素反応の速度が半最大（ｈａｌｆ　ｍａｘｉｍａｌ）である基質濃度。

代謝回転数：酵素が律速因子である場合、単一酵素分子による単位時間当り変換 される基質分子の数。

分子吸収カニ紫外又は可視スペクトルでの吸収帯の強変。

基質：酵素がその上で触媒作用に影響を及ぼす分子。

酵素：特異的化学反応の速度を大きく強める能力を有する触媒。

共鳴：幾つかの構造の各寄与が結合程度と一致するある方法に重点が置かれる場 合で、各々が有し、それが現れたとき、特異的形状を伴う実際の分子。

図面の簡単な説明 図ＡはＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢＢＴの構造を示す。

図ＢはＣＢＴＰ、ＡＢＴＰ及びＢＢＴＰの構造を示す。

図Ｃｌ１ＢＢＴＰをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）測定に用いた一方方向を示 す図式である。

図りは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）が攻撃される抗体に相補性の材料を測 定するのにＢＢＴＰを用いた一方方向を示す。抗体／ＡＰコンプレックスは相補 性（ｃｏｍｐｌ　ｉｍｅｎｔａｒｙ）分子と結合する。ＡＰはリン酸化ＢＢＴか らリン酸エステル残基を離脱するように作用　。

し、これにより蛍光が回復する。蛍光の測定は、即ち、相補性分子の存在及び量 を示す。

図Ｆは、ＡＰに対するＢＢＴＰの感受性を示すグラフである。ＢＢＴＰは、３． ０＋ｎＬの容量で、０．３アトモルのＡＰを測定することを示す。適当な機器で 、細胞容量は１０又は１００μＣに減少でき、その結果、それぞれ０．００１又 は０．０１アトモルの投影（ｐｒ。

ｊ６ｃｔｅｄ）感度となる。６０分アノセ一時間で決定した６００コピーのＡＰ で０．００１アトモルの感度を示すものはなかった。

図Ｆは、３５°ＣでのＢＢＴＰの加水分解速度と基礎蛍光値での対応増加を示す グラフである。又、ＡＰの１０ａＭ、１００ａ〜１及び１１０００ａ溶液とＢＢ ＴＰの反応の速度も示す。

図Ｇは、水性溶液中４°Ｃと３５℃でのＢＢＴＰの基礎蛍光値対時間のグラフで ある。

図Ｈは、水性溶液中、４℃と３５°ＣでのＡＢＴＰの基礎蛍光値対時間のグラフ である。

図１は４℃でのＢＢＴＰＯ酵素反応の速度対時間のグラフである。

図Ｊは４°ＣでのＡＢＰＴとＡＰの酵素反応の速度対時間のグラフである。

図にはＡＢＴの蛍光対濃度を示すグラフである。

図りはＢＢＴの蛍光対濃度を示すグラフである。

発明の詳細な説明 以下の記載により、本発明の態様が、非常に低レベルの酵素又は蛍光性基質を用 いる加水分解試薬を検出し、測定するため造られ、使用されうる手段の詳細を提 供する。本記載は、本発明の典型例であるが、発明を特異的に限定するものとし て解釈されるべきでない。

本分野の当業者の理解しつる範囲内にありうる変形は本発明の範囲内にあると考 慮されるべきである。

化合物２−ノアノー６−ヒドロ牛ジベンゾチアゾール（ＣＢＴ）、２−カルバモ イル−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（ＡＢＴ）、２″−（２−ベンゾチアゾ リル）−６“−ヒドロキシベンゾチアゾール（ＢＢＴ）は、特異的な４４５ｎｍ −５８０ｎｍ（ＡＢＴ及びＣＢＴ）及び４６０ｎｍ　６６０ｎｍ（ＢＢＴ）塩基 性水性溶液中、それぞれ５１０ｎｍ。

５１８ｎｍ及び５６１ｎｍて生ずる放射で最大に蛍光性である。励起は、それぞ れ３８１　ｎｍ、３８１ｎｍ及び４１９ｎｍで発生する最大を伴う３２０　４３ ０ｒ＋＋ｎ（ＣＢＴ）、３２５−４４０ｎｍ（ＡＢＴ）、及び３３０−４８０ｎ ｍ（ＢＢＴ）の範囲で生じる。これらの化合物の構造についての図Ａ及び上記デ ータの要約についての表１参照。

化学的残基はヒドロキシベン゛／チアゾールの蛍光性誘導体に付加されて、それ は分子の蛍光能力をきびしく抑制する。化学的残基の結合によって酵素に対する 適当な基質が提供されると、残基はヒドロキシベンゾチアゾール分子の非蛍光性 誘導体から離脱し、蛍光が回復する。この方法で、例えばＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢ ＢＴは酵素活性の決定用の蛍光性指標として用いることができる。例えばリン酸 エステル残基は、ＢＢＴに付加して非蛍光性誘導体２°（２−ベンゾチアゾール ）−６−ヒトロキシベンゾチアゾールリン酸エステル（ＢＢＴＰ）、アルカリホ スファターゼ用の適当な基質を生成する。従ってアルカリホスファターゼ（ＡＰ ）によりリン酸エステル残基が離脱すると、酵素活性の測定がなされる。ＡＰと ＢＢＴＰの酵素反応は図Ｃに示される。生成されたリン酸エステル誘導体の分子 構造はＦＢに示される。

他の化学的残基はＢＢＴに結合しうる。例としては、コリンエステラーゼ、コレ ステロールエステラーゼ、リパーゼの適当な基質を提供する化学的残基及び酵素 によりヒドロキシベンゾチアゾールの非蛍光性誘導体から離脱可能な、いかなる 残基をも含む。他の加水分解力により離脱可能な残基も、又、これらの加水分解 力を検定する目的に結合しうる。

加えて、ＣＢＴＳ、ＡＢＴ及びＢＢＴは生物学的分子の検定用に直接又は間接に 用いうる。酵素は、生物学的リガンド、例えばモノクローナル又はポリクローナ ル抗体あるいはその断片、核酸プローブあるいは相補性分子を検出可能な他の生 物学的組成物に結合しうる。

この方法で、酵素／リガンドは最初、相補性生物学的分子に結合し、そして適当 な条件下、ＣＢＴ、ＡＢＴ又はＢＢＴよりなる基質と適当な化学的残基との付加 を伴い、酵素は化学的残基を離脱して、ＣＢＴ、ＡＢＴ又はＢＢＴは強い蛍光を 生ずる。この蛍光の検出又は測定は、プローブに相補性の生物学的材料の検出及 び測定を可能にする。このような検定は生物学的試料、例えば尿、血液又は組織 試料を用いて行なうことができることに注目されたい。リン酸化ＣＢ１組成物及 びアルカリホスファターゼ使用の例は図りに示される。

生物学的分子の直接測定は、本分野の当業者に既知の方法によってＡＢＴ、ＢＢ Ｔ又はＣＢＴを生物学的リガンドに結合させ、蛍光性シグナルを検出することに よって行なうことができる。

本発明の他の局面は、フリーラジカル、例えば特に血液中の酸素濃度を測定する ためのＣＢＴＳＡＢＴ又はＢＢＴの使用である。フリーラジカル、例えば酸素は 蛍光中放射するエネルギーを充当することができるので、誘導体の蛍光の減少は 酸素量と相関しうる。即ち、蛍光の測定は酸素濃度を検出するのに用いることが できる。

ＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢＢＴは異なる溶媒中、蛍光特性を保持しているので、その 化合物は異なる溶媒中でかかる測定を行なうのに用いうろことに注意すべきであ る。表３参照。

好ましい態様の記載 １、用いられる装置 ＵＶ／ＶＪＳ機器はベックマン・モデル・ナンバー２５であった。、ＮＭＲ機器 はヴアリアン・モデル・ＥＭ３６０Ａ　６０ｍＨｚ電子単位又はゼネラル・エレ クトリック・ＧＮ−５００５００Ｍｇヘルツ単位であった。ＮＭＲシフトは内部 基準としてテトラメチルシランを用いて記録される。一つのフルオロメーターは 、励起用の単一モノクロメータ−と放射用の二重モノクロメータ−を備えたスブ セ、ソクス■フルオロログ・モデル１１２であった。それを前表面（ｆｒｏｎｔ ｆａｃｅ）蛍光を用いて稼動した。二つ目のフルオロメーターはチューナーから 購入したフィルターを備えたチューナー・モデル■であった。融点は補正せずに トーマス・フーヴアー毛細管融点機器で決定した。ＨＰＬＣ装置は、溶媒プログ ラマ−（モデル６６０）及びＵ〜７／Ｖ　Ｉ　Ｓ固定波長検出装置（モデル４４ ０）を備えたウォーターズ複式ポンプ（モデルＭ−６０００）ユニットであった 。用いたカラムは３．９Ｘ２５ｍａウォーターズ逆相Ｃ−１８１０ミクロン・イ レギュラー／リカゲルであった。ＨＰＬＣ分析に用いた溶液Ａは、３０００ｘ（ ！のＨＰＬＣグレート水及ｐ７５０ｉ１２（７）ＨＰＬＣグＬ、−ドＪ９／−ル と５．５２ｇのリン酸−ナトリウム−水和物を用いて調製した。

特に述べない限り、ＨＰＬＣ分析に用いた流量は１分当り１．０ｘ（１であった 。用いた反応器バイアルは、パイレックスガラスで造られた１ｘＱから１０ｊＩ Ｑサイズで、試薬側がテフロン表面のシリコン隔壁と内部テフロン磁気撹拌棒を 有した。ｐＨはフィッシャー・アクメット・デジタルモデル５２０を用いて決定 した。基質溶液と接触する全ての装置は、使用前にＩＮ塩酸に３時間浸漬し、次 いで新たに蒸留した税イオン水で完全にすすいだ。これで、通常、存在する外界 ＡＩ）か死滅するのは確実である。シグマから使用したそれぞれ個々の口！トの つ、血清アルブミンは、存在するＡＰのレベルを評価した。

２、使用した試薬 使用した試薬又は溶媒は、特にことわらない限りＡＣ３試薬グレードであった。

使用したＤＥＡは、使用前にガラス内で真空蒸留した。用いたテトラヒドロフラ ン（Ｔ　ＨＦ　）は、水酸化カルシウム上で乾燥し、使用直前に蒸留し、た。使 用水は新しく脱イオン化しく２メガオーム）で蒸留した５ＡＭＰＤはＪＢＬサイ エンティフック・カタログ・ナン／”−１２５０Ａにより供給した。トリエチル アミン、ベンゾチアゾール及び２−アミノ−チオフェノールは、アルドリッチか ら得た。トリメチルブロモシランはベトラーチ・システムズかう得た。２−クロ ロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２〜アミノ−６−ヒドロキシベンゾチア ゾール及び２−ノアノー６−メトキシベンゾチアゾールは、英国、バーミンガム 、デパートメント・オン・クリニカル・ケミストリイ・オン・ザ・ユニバーンテ ィ・オン・ハーミンガム、ネイル・ハシエツト教授がら好意的に提供して頂いた 。これらの化合物は、ポウイー・エル、ジェイ、（２９７８）メンズ・イン・エ ンザイモロジイ（デル力、エム。エイ６、出版）５７巻１５−２８頁、アカデミ ツク・プレス、ニニーヨークにより記載された手順を用いて調製した。

３、蛍光特性 ａ、ＣＢＴＳＡＢＴ及びＢＢＴの蛍光特性ＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢＢＴベンゾチア ゾール（ＢＴ）、２−クロロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（Ｃｊ−ＢＴ） 、２−アミノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（アミノ−ＢＴ）及び２−シア ／−６−メドキシベンゾチアゾール（□Ｎ−メトキシーＢＴ）の蛍光特性は、０ ．１Ｍ２−アミン−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）を加え た水性ｐＨ１０，２溶液中で測定した。はぼ等しい蛍光効率を、適当な溶媒（メ タノール又はエタノール）中に適当な化合物を溶解し、１０ｘρの溶媒当り１０ １ｇ＆することにより決定した。次いで１００ｘ（！のこの溶液を９．９１の、 Ｏ，１Ｍ２−下ミノー２−メチルー１，３−ブロバンジオーノ喧ＡＭＰＤ）を含 むｐＨ１０，０の緩衝液に加えた。蛍光源（２５４ｘｍ）を保持した針（ｈａｎ ｄ）を石英セル内の溶液を励起するのに用い、可視観察を記録した。この溶液が 蛍光性の場合は、１／１０に希釈して測定を繰り返した。ＢＴ、　Ｃ４）−ＢＴ 、アミノ−ＢＴ及びＣＮ−メトキン−ＢＴは全てＣＢＴ％ＡＢＴ及びＢＢＴより も蛍光性能力が少なくとも３オーダーの大きさで低いことが判った。即ち、ベン ゾチアゾール残基がイオン化しつる基をベンゼン環内に含み、且つ共役を拡大す る２位に基を含むとき、蛍光能力は劇的に増大できることが明らかである。

ＣＢＴＳＡＢＴ及びＢＢＴの蛍光特性を測定し、４−メチル−ウンベリフェロン （４−ＭｔＪ）のそれらと比較した。この情報は表１に示される。つｔルフバイ ズ、オツト・ニス、及びコラ−、エルンスト、ミクロケミ力・アクタ、３８９− ９５参照。第一に、ＣＲＴ。

ＡＢＴ及びＢＢＴの分子吸収力は１５，５００（水性０．］ＯＭＡＮＰＤ　ｐＨ １０，２）、１３，３００（水性０．３９２Ｍ炭酸ナトリウムｐＨ１１，０）及 び３３，０００（水性０．１Ｍ　ＤＭＡ　ｐＨ１０，０）であった。これらの分 子吸収力はそれぞれ３７８ｎｍ、　３６８ｎｍ及び４１５ｘｍで測定した。第二 に最大励起は、ＣＢＴとＡＢＴが共に３８１ｘｍであり、ＢＢＴはその最大励起 が４１９ｘｍにあることが判った。放射最大は、ＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢＢＴに対 し、それぞれ５１０ｎｅ、　５１８ｎｍ及び５６１　ｎｍに見られた。ストーク スシフトはそれ１ぞれ１２９ｘｍ、１３７ｎｌ及び１４２ｎ＋ｍであった。これ らのデータは、０．１０Ｍ　ＡＭＰＤ％　ｐＨ１０，０中、スブセックスＤ前面 蛍光を用いて収集した。水に対するラマンはＣＢＴに対し４３３ｘｍに見られた 。水に対するラマンは検定に干渉しないであろう。これらのデ−夕は、これらの 化合物が望ましいストークスシフトを有し、水ラマンが蛍光放射からよく分離し たことを明らかに示す。

決定されるべき次の因子は蛍光効率であった。典型的には、約１％の蛍光効率が 実用的と考えられ、４−ＭＵは形質（ｃｈａｒａｅｔｅｒｉｓｔ　１ｃ）２０− ４０％効率を有する。比較はＣＢＴと４−ＭＵの間で行った。各化合物はその最 大励起で励起した。前面蛍光を用いて、４−ＭＵは６．８６カウント／フエムト モルを与え、ＣＢＴは同一条件下、２，８５カウント／ｆｍを与えた。即ちＣＢ Ｔは４−ＭＵの蛍光効率と非常に近かった。ＡＢＴ及びＢＢＴの蛍光効率に関す る図Ｋ及びＬ参照。蛍光データはチューナー・モデル■を用いて収集した。

カーブはＩＸ及び３×共に１０を越えて１００＋１モルまでの範囲で直線である 。

ｂ、ＣＢＴＰの蛍光特性 ＣＢＴｔ−リン酸化シてＣＢＴＰ２−シアノ−６−ヒドロ牛ジベンゾチアゾール リン酸エステル（ＣＢＴＰ）を作った。構造は図Ｂに示される。予期しないこと に、ＣＢＴＰは非常に低レベルの蛍光を発し、リン酸エステル残基がＣＢＴの蛍 光を非常に抑制することが拘った。

ＣＢＴＰに関するデータは以下のように決定した。ｌｚ９のＣＢＴＰを２．０ｍ ｌ！の緩衝液：０．１０Ｍ　ＡＭＰＤ、０．１０ｍＮａＣ１，ｌ。

ＯｍＭ　ＭｇＣｆｆｔ５０．１．０＋ｎＭ　ＺｕＣＩ２＋、ｐＨ２に溶解した。

この保存溶液１（Ｈクロリットルを緩衝液中に５００ミクロリツトルに希釈した 。目盛り位置は高電圧側７００ボルトであった。最大励起は、３ｎｍで５０４　 ｎｍで５３．　ＯＯ０ｃｐｓの蛍光最大を伴った。少量のＡＰを加えてＣＢＴＰ を加水分解しＣＢＴを形成させた。高電圧を５゜Ｏボルトに減じることにより、 最大励起は３７８ｎｍで、５０１　ｎｍで８０８．０ＯＯｅｐｓの最大蛍光を伴 った。高電圧力供給量の７００ボルトから５００ボルトへの減少により、はぼマ グニチュードのオーダーで感度が減じる。即ち、ＣＢＴＰは、３００がら４００ ｒｉｍに励起した場合、測定しうる蛍光かない。見られる小さな蛍光は多分、Ｃ ＢＴＰ中に共雑物として存在する低レベルのＣＢＴに基づくものであった。表２ 参照。

さらに、ＣＢＴＰは予想された加水分解生成物、ＣＲＴに対する放射波長である ５０５ｎ＋ｎで測定しうる放射を示さない。これはＡＰ検定においてＣＢＴＰの 放射に基づく干渉が低いことを確実にする。

ＣＢＴＰに関して決定されるべき次の重大な因子は、近似Ｋｍ及びＡＰを伴う代 謝回転数（ｔｕｒｎｏｖｅｒ　ｎｕｍｂｅｒ）であった。これはＡＰがいかに速 やかに又、有効にＣＢＴからリン酸エステル残基を切断するかを決定する。ＣＢ ＴＰ−シ（ＡＭＰＤ）塩は、パラ−ニトロフェニルリン酸エステル、ジ−トリス 塩（ｐＮ　Ｐ　Ｐ　、ジ−トリス）及び４−メチルウンベリフェリルリン酸エス テル、ジー（ＡＭＰＤ）塩と直接比較した。ＵＶ／ＶＩＳ検定は、０．ＩＭ　Ａ ＭＰＤ中、ｐＨ１０゜２．３０℃でＣＢＴ（１５，５００Ｅ＋ｎａｘ）に対して ３７５ｎｍを、又、Ｐ）（Ｐ　Ｐ−ジ−トリス（１８，ＯＯＯＥｍａｘ）に対し て４０５ｎａ＋を、又、４−ＭＵに対して３６３ｎｉを用いて行った。用いた酵 素は、ＡＭＰＤ緩衝液中１　／２０．　ＯＯＯに希釈した仔つシ腸ＡＰ（カルザ イム）、３０．０００μ／峠であった。基準側（ｒｅｆｅｒｉｎｃｅ　５ｉｄｅ ）は記載したように５０ＣＢククリツトルを含んだ。例えば、試料側は４６５ミ クロリツトルの緩衝液、２５ミクロリツトルの基質溶液（保存溶液はＡＭＰＤ緩 衝液中２０ｎりＭ基質である）及び１０ミクロリツトルの１／２０．０００に希 釈したＡＰ酵素を含有した。ＣＢＴＰは、同一条件下、ＰＮＰＰの７８％で４− ＭＵ　Ｐの９５％である代謝回転数を有することが判った。即ち、ＣＢＴＰはＡ Ｐで高代謝回転数を有する。これらの条件下、ＡＰによるＣＢＴＰ反転の最大速 度は、２ｒｂＭにあった。又、ＡＢＴＰ及びＢＢＴＰは、同様の条件下約２１１ １ＭのＫｍを有することも判った。この分野における当業者にとって、これらの 化合物は、約０．０５＋ｎＭと約２０ｍＭの間の典型的に実用的な広範囲のＡＰ 濃度で用いうる。

酵素が基質と反応して蛍光性化合物を形成する蛍光測定の究極的感度を限定する 一つの錠因子は、結果としてバックグランド蛍光からの干渉を生ずる。このバッ クグラウンドは、４つの因子：水のラマン蛍光、レイリー散乱、出発基質からの 尾をひく蛍光放射及び基質中に存在する自由加水分解した基質からの蛍光放射に 基づく。混在している加水分解した基質からの蛍光バックグラウンドが問題かど うか決定するため、ＨＰＬＣスキャンを４ＭＵＰ及びＣＢＴＰの両方に操作して 、おのおのに存在する加水分解した基質のレベルを正しく決定した。ＣＢＴＰＩ ；！０．０８％ＣＢＴを有し、４−ＭｔＪＰは０．０７％４−ＭＵ（重量比）を 含有した。自由な加水分解した基質のレベルは比較できるものであり、蛍光感度 は、上で見たように４−ＭＵ及びＣＢＴに対する２、４の因子内であったから、 測定されたどの蛍光バックグラウンドも上述の最初の三つの因子の組合せに基づ くであろう。前面蛍光を用いると、４−ＭｔＪ　Ｐの１ｍＭ溶液は２９７．６４ ０Ｃｐｓ（励起３６６ｍｍ、放射４４４　ｎ１１）の出発ノで・ツクグラウンド 読取りを与えた。１ｍＭ　ＣＮＴＰＣ励起３９／ｎｍ、放射、５０５　ｎｉ）を 用いると、バックグラウンド読取りは４２．５１８カウント／分であった。これ らの読取りは、０．１０Ｍ　ＡＭＰ。

０、１　Ｍ　ＮａＣＱ、　ｐＨ１０，２中でなされた。即ち、４−ＭＵ　ＰはＣ ＢＴＰよりも有意に高いバックグラウンドを有するとみることができる。

次に、ＣＢＴの蛍光は、異なる溶媒中、塩基シクロヘキシルアミン（ＣＡ）の存 在又は不存在で評価した。これらのテークは表３に示される。

実験は１０ｘＱのジメチルスルホキシド中に５ｘ９ＣＢＴを溶解することにより 実施した。この溶液（１０ミクロリツトル）を９．９９ｘ（！の適当な溶媒（溶 液ｌ）に加えた。この溶液を石英ＵＶセルに転して２５　Ｊ　ｎｍ針を保つ光源 で励起した。蛍光は視覚観察後記録した。１０ミクロリツトルのシクロへキシル アミン（ＣＡ）を溶液＃】に加工て、蛍光を上記（溶液２）のように記録した。

最後に、ｌｏｏミクロリｙ）ルのＣ，Ａを溶液２に加えて蛍光を記録した。即ち 異なる溶媒を用いることができ、ＣＢＴが水性塩基性緩衝溶液中にある場合に見 られる特異的緑色型光が観察される。

蛍光のｐＨ研究を０．１０Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８，８９及び０゜１０Ｍ　 ＨＣｇを有する水性溶液中で実施した。本研究は、上記した方法と類似の手法で 行なった。溶液はｐＨが３より下になるまで特異的な緑色蛍光を示した。ｐＨ３ と１の間、極端な酸性状態で、ＣＢＴ溶液はその蛍光を失った。即ち、ＣＢＴが 広いｐＨ範囲でその蛍光を維持することが明らかである。

ＣＢＴＰは水性塩基性状態でＡＢＴＰに変換することが判った。

この変換は、ＣＢＴＰがＡＰと反応すると非直線状運動性となる。

即ち、反応を４℃で速やかに行なわない限り、ＣＢＴＰはＡＢＴ　Ｐに変換する 。

ｃ、ＢＢＴＰの蛍光特性 ＢＢＴＰのＡＰ検出感度を次に決定した。図Ｅを参照。酵素希釈緩衝液は０．１ ０Ｍジェタノールアミン、１．ＯｅＭ塩化マグネシウム、０．１＋Ｍ塩化亜鉛、 ０．００５％アジ化ナイリウムを含み、ｐＨ９，０であった。用いた酵素はカル ザイム、＃２７−５−２４．３ｏ、　ｏ　ｏ　ｏ単位／１９で１０．１５ｍＭア ルカリホスファターゼを含有した。系列希釈して３００　ｆＭ（１０”ＭＸ溶液 Ｅ）及び３０ｆ謙（溶液Ｆ）希釈を得た。

基質緩衝溶液は２．４Ｍ　ＤＥＡ、ｐＨ９，０，０，２３＋Ｍ塩化マグネシウム 、０．００５％アジ化ナトリウム及び１，０ｍＭ基質を含有した。１から１０ミ クロリツトルの溶液Ｅ又はＦの各々を３．　ＯｘＱの、予めチューナー・モデル ｍ内に設置し３５℃の温度とした基質溶液に加えた。勾配（ｓｌｏｐｅ）をスト リップ・チャート・レコーダーを用いて測定した。４−ＭＵＰ、ＣＢＴＡ及びＡ ＢＴＰに用いたフィルターは、励起側で７６０で、放射側で２Ａ及び４７Ｂであ った。ＢＢＴＰに対しては、励起フィルターは４７Ｂで放射フィルターは１６で あった。これらの勾配はＡＰの７ｘ度に対してプロットした。図Ｅは、ＢＢＴＰ を用いて、３０分間ＡＰの１１００ａ溶液を、又、６時間１０ａＭ溶液を測定で きることを示す。この系は３．０ｘ（１試薬容量として用いたが、試薬容量が１ ００ミクロリ、トルに減少すると、６．　ＯＯＯコピー又は０．０１アトモルの ＡＰを３０分間あるいは６００フビー又はｏ、ｏｏｉアトモルを１時間、測定で きる。

ｄ、ＢＢＴＰ及びＡＢＴＰの安定性 ＢＢＴＰＯ１２，４ｍＭ　ＤＥＡ、ｐＨ９，０，０，２３ｍＭ塩化マグネシウム 及びＯ，ＯＯ５％アジ化ナトリウムの水性溶液中での溶液安定性を３５℃で決定 した。結果は図Ｆに示され、又、ＢＢＴＰの１０ρＭ、１１００ａ及び１００１ ０００ａに対する感度も示す。バ。

フグランド蛍光についてのデータは、ＢＢＴＰが金属を含む塩基性水性状態でも 非常に安定な基質であることを示す。それは又、６時間後のバックグラウンド読 み取りの上のＡ　Ｐの１０ρＭ溶液の測定を含む、非常に低レベルのＡＰの測定 に対するバックグラウンドの貢献を示す。

これに加えて、１．０ｍＭＢＢＴＰの水性溶液が上記の緩衝液中で調製でき、４ ℃で維持できることが判った。４℃でのＡＢＴＰ安定性も又、測定した。図Ｇ及 びＨに示される結果は、４℃でのＢＢＴＰとＡＢＴＰの安定性を示す。

次に、ＢＢＴＰとＡＢＴＰの水性溶液を調製し、４℃で保存した。

次いでＢＢＴＰ及びＡＢＴＰのこれらの溶液とＡＰの反応速度を測定した。図Ｉ 及びｊを各参照。これは、これらの溶液が安定で、ＡＰを阻害する化合物が全く 形成されないことを示す。データはＢＢＴＰ、ＡＢＴＰともに溶液中で分解せず ＡＰに対する阻止因子を形成しないことを明らかに示す。

図Ｅにおいて用いた手段は、二つの理由から４−ＭＵ　Ｐに適用できなかった。

第一に、１ｎＭ溶液から得ら右たバックグラウンド”読み取りはチニーナー・モ デル■で目盛からはずれていた。濃度を０４０３０＋ａＭに減じた場合、バック グラウンド読取りはＢＢＴＰ又はＡＢＴＰの１ｍＭ溶液に匹敵した。＊緩衝液中 の４−ＭＩＪＰに関するＫＩｌｌは約３０ｉクロモルであるから、４−ＭｔＪ　 Ｐの代謝反転か減少し、てＡ　Ｐに関する基質の感度を低下させる。新しく調製 した４−ＭＵＰの３０ミクロモル溶液では、ＢＢＴＰの１．０ＩＩＩＭ溶液が得 られるシグナルの約１／２から１／３を与えることか判った。第二に、マグネシ ウムを含む４−ＭＵＰの塩基性水性溶液は４−ＭｔＪ　Ｐを加水分解し、４−メ チルウンベリフェロンを形成することが判った。

この結果、有意にバックグラウンドが増加する。このことは、この溶液を４℃で 保存した場合でも、通常８時間の使用で、４−ＭＵＰを緩衝液で再構成しなけれ ばならないことで試験が限定される。

４、ＢＴ誘導体の合成 ａ、２−シアノ−６−ヒトロキンペンゾチ７ゾール（ＣＢＴ）の合成合成に用い た手法は、デル力、エム、エイ　及びマノクロイ、グブリコ、ディ１、メソズ・ オン・エンザイモロンイ、５７．１５−２４頁、アカデミツク・プレスに記載さ れる。生成物は与えられた融点及びＵＶデータと一致した。）］ＰＬＣは本材料 が９８％純粋（面積パーセントによる）であることを示した。溶液プログラムと して溶液Ａに水を、溶液Ｂにメタノールを用いた。流速は、１００％Ａで出発し ４０％Ｂの最終条件までで、つを−ターズ溶媒プログラマ−で曲線７を用いその 結果わずかに凸状の溶媒プログラムとなる、１０分のブａグラム時間で２０νρ ／分であった。生成物ピークは　。

２５４ｎｍでモニターし、て、１７３分の保持時間を有することが判った。ジメ チルスルホキシド（ｄｂ’）中５００ＭｇヘルツＮＭＲスペクトルは構造が変化 した。表４参照。

ｂ、２−シアノ−６−ヒトロキンベンゾチアゾールジメチルリン酸エステルの合 成 ５００ｚ９（２，８４ｗモル）の２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール を１０ｘｆｆの反応器バイアルに入れ、テフロンキャップでシールし、磁気撹拌 棒を入れた。５．ＯｘＱアリコツトのＴＨＦを加えて撹拌し２ＣＢＴを速やかに 溶解し、澄明な明赤色溶液を得た。これに、次いで０．５５０ｘρ（４０２ｆｆ ９．３．９７ｊ！モル）のトリエチルアミンを加えた。得られる澄明溶液を水浴 中に置くことにより４°Ｃに冷却した。次に、１．５１ρのＴ）（Ｆに溶かした ５１２夏１１（３，５４ｘモル）のジメチルクロルリン酸エステルをこの溶液に ６０秒の期間にわたって添加した。約２０分後、１０１ｇ反応器バイアルを水浴 から取り出して室温で２時間撹拌した。

この時点で反応物は粘稠なスラリーであった。トリエチルアンモニウムクロリド 塩を吸引濾過により除去した。濾液を丸底フラスコに移して真空下、ロトエバボ レータ−（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で濃縮した。

残渣をＥ＋ＯｘＱの酢酸エチルに溶解し、次いで２０ｘｆｆの水と１０ｘＱのＮ ＡＣρ飽和水を加えた。相を分離して酢酸エチル層を得た。水性層を４０ｚＱの 酢酸エチルで洗ってこれを先の酢酸エチル層と合した。

混合した酢酸エチル溶液を１．５ｘＱのＮａ（Ｊ！飽和水と５１ρの水で２回洗 浄した。酢酸エチル層をＭｇ５Ｏａで乾燥し、濾過し、完全な真空でロトエバボ レーターで濃縮した。約５村の酢酸エチルを、粘稠油が溶解した濃縮物に加えた 。これを−２０℃に冷却して白色結晶を速やかに形成させた。白色結晶を濾過に より分離した。生成物、２−シアノー６−ヒドロキシベンゾチアゾールジメチル リン酸エステル（６−ＣＲＴ−ＤＭＰ）の融点は５４．０−５５．１℃であった 。ＨＰＬＣは９６．４％（面積による）の純度を示した。カラムは３．９ｍｍＸ ２５＋ｍで３０分のプログラム時間で、１００％水から１００％メタノールの直 線状プログラムの１．０ｘ（１／分の流速によった。生成物は２５４　ｎｍでモ ニターした。生成物についての保持時間は２３゜４分であった。ＮＭＲスペクト ルを決定した。ＮＭＲに用いた溶媒は、内部標準としてＴＭＳを含む重水素クロ ロホルムであった。１０Ｈｚの結合定数を伴いデルタ３．９に集中し、６．００ 時間積分された二重線があった。３．８時間積分された７、９に集中した多重線 があった。

ｃ、２−カルボミル−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（ＡＢＴ）の合成 ＣＢＴ、１４．０９又は０．０７９モルを６０ｘ４に）脱イオン水ニ懸濁した。

この溶液のｐＨを約１２Ｊ！ρの６．０Ｍ水酸化ナトリウムを用いて１１５に調 整した。得られる澄明暗こはく色溶液を窒素下、−夜撹拌した。ＨＰＬＣ，直線 状プログラムで水からメタノールへの３０分プログラムを翌朝行なった。９５％ （面積による）の出発材料が単一化合物に変換したことが判った。ＣＢＴ及びＡ ＢＴの保持時間は、それぞれ１５，１及び１３．２分であった。

生成物を、等量の水を加え、６Ｎ塩酸でｐＨを１．９に下げることにより分離し た。褐色固体を水ですすいだ。湿潤固体を４００ｘ（のメタノールにｅｏ’ｃで 溶解し、熱濾過し、−晩−１５℃まで冷却した。結晶を真空濾過により集成し、 メタノール、ジエチルエーテルですすぎ、真空乾燥した。ＨＰＬＣは単一ピーク を１３２分に示した。収量は７．５８９又は４９％であった。

ＤＥＳＯ−ｄ６で行った５００ＭｇヘルツＮＭＲは表５に示される。

７．９１０及び８．２９７のピークはアミド水素を特定し、１０．１０６のピー クはフェノール水素を特定した。これらの全てのピーク（７，９１０，８，２９ ７及び１０．１０６）はブチリラムオキシド（ｄｅｔｅｒｉｕｍ　ｏｘｉｄｅ） の添加で消失した。これはアミドによるものである。

ＮＭＲは示された生成物に予想されるものと一致した。

水性溶液中ｐＨ１１で長く処理した、又はより高いｐＨで処理したＡＢＴは、２ −カルボキシルー６−ヒドロキシベンゾチアゾールを形成し、これを分離し、確 認した。ＮＭＲスペクトルは得られたものと一致した。この化合物は、又、予想 通りに大きなストークスシフトの高い蛍光であり、水性塩基性状態でＡＰと反応 した。この化合物はＡＰで低代謝回転数を示し、詳しくは検討しなかった。

ｄ、２−カルボミル−６−ヒドロキシベンゾチアゾールジメチルリン酸エステル の合成 ３ｆ（０，０１５モル）の２−カルボミル−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（ ＡＢＴ）を３０ｘＱｔ７）Ｔ　ＨＦ　ｌ；：溶解した。次イテ１．７２９（。

、０１７モル）トリエチルアミンを撹拌している反応液に加え、次いで直ちに７ ｍ（のＴＨＦに溶解した２、　６ｙ（０，０１８モル）のジメチルクロロリン酸 エステルを５分かけて添加した。この溶液を７２時間室温で撹拌した。

スラリーを吸引濾過して真空下に濃縮して乾燥した。固体を１００ｘ（Ｊのクロ ロホルムに溶解し、炭酸ナトリウム水溶液で３回、飽和塩化ナトリウム水溶液で ２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮して乾燥した。収量は１ ９又は２２％であった。ＨＰＬＣを水からメタノールの１０分直線状プログラム を用いて実施した。生成物は９６％純粋（面積による）で１４１分の保持時間で あることが判った。重水素クロロホルム中のＮＭＲは、生成物に対し以下のよう な予想されたピークを示した：　１０ｈｚ（８，４Ｈ）の結合定数を伴う３．９ のδ、７，６でのδ、１０及び２ｈｚ（９Ｈ）の結合定数、８．０（ｉ、ＯＨ） での幅の広いピーク及び８．２５での二重線１０ｈｚ（１，ＯＨ）の結合定数。

ｅ、２−カルボミル−６−ヒトロキシベンゾチアゾールリン酸ジー（２−アミノ −２−メチル−１，３−プロパンジオール）塩の合成１ｇ（０，００３３モル） の２−カルボミル−６−ヒドロ手ジベンゾチアゾールジメチルリン酸エステルを ２０ｚＱのＴＨＦに溶解した。

この溶液に、トリメチルブロモシラン（０，０２６２モル）を加えた。

この溶液を反応器バイアル中、室温て１２時間シールして保持した。

ＨＰＬＣにより、１２時間後、４％出発材料と２１％モノメチルリン酸エステル が存在した。別の０．００６６モルのトリメチルブロモシランを加え、ＨＰＬＣ は付加５時間後、反応が完了していないことを示した。即ち、さらに０．０１３ ２モルのトリメチルブロモシランとさらに４時間を要して反応は完了した。

バイアル内容物を、５．９９のＡＭＰＤを含む３０ｘ（ｌのメタノール中に空け た。溶液は直ちに濁り、これを１８時間冷凍機に移した。

生成物を吸引濾過により集成し、冷メタノールで洗浄し、真空乾燥した。黄色結 晶の収量は０．９８９又は６２％であった。水からメタノールへの１０分直線状 プログラムを用いる）（ＰＬＣスキャンは、６．１分に単一ピークを示し、それ は９９．１％（面積パーセントによる）であった。ブチリラムオキシド中の５０ ０ＭｇヘルツＮ　ＭＲスペクトルの構造指示（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｓｓｉｎ ｇｒ＋５ｅｎｔ）を変えた。表６参照。

ｆ、２”−（２−ベンゾチアゾリル）−６”−ヒドロキシベンゾチアゾールリン 酸ビス＝（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）塩の合成 ＣＢＴＰ−ビｘ−ＡＭＰＤ塩、２．０９又は０．００４３モルを３０ｘＱビーカ ー内のＪｏｇρの脱イオン水に溶解した。２−アミノーチｔ　７　エ／　−ル、 ０．５４ｔｔ又は０．００４３モルを１０ｘ（１（ｒ）メ９　／　−ルに溶解し 、一度に全部を水溶液に加えた。ビーカーをバラフィルム（ｐａｒａｆ　ｉ　１ ｍ）で覆い室温で２時間撹拌し、次いで冷却機内で一晩保存した。

固体を翌朝集取して、メタノール及びジエチルエーテルでｔｔいだ。これらの粗 製結晶を乾燥して、ＨＰＬＣにより９６．４％の純度を有する１、１９を得た。

粗生成物を水／メタノール（５０１５０容量）の混合物で２０時間スラリーとし 、次いで真空濾過、水及びメタ／−ルによるすすぎ並びに真空乾燥により精製し た。生成物は０．８１９の重さで、１５．３分の保持時間を有する。ＨＰＬＣ分 析（面積パーセント）により９８．６％であった。プログラムは５分直線状プロ グラム、０から１００％溶媒Ｂ、溶液Ａによる開始でメタノールによる終了であ った。ブチリラムオキシド中の５００ＭｇヘルツＮＭＲスペクトルは構造を変え た。表７参照。

生成物１００９を、１．０ｍＭ塩化マグネシウムを含む、０．１ＭＡＭＰ○含有 、ｐＨ１０，０の１０ｘｊの水溶液に溶解した。この時点で、２５４　ｎｍ光源 を指した針を、石英ＵＶセルに移した溶液を小部分励起するのに用いた。溶液は 非常にかすかな青色蛍光を示した。

次いで１００ミクロリツトルのＡＰ、０．３０ミクロモルを加えた。

少量を石英Ｌ７Ｖセルに加えて、前のように励起し、非常に明るいオレンジ色蛍 光が見られた。次の朝までに、ＨＰＬＣによって全ＣＢＴＰ−ビス−ＡＭＰＤが 消費され、新しいピークがＨＰＬＣスキャンに形成したことが示された。このピ ークは、５００ＭｇヘルツＮＭＲスペクトルにより２”−（２−ベンゾチアゾリ ル）−６−ヒドロキシベンゾチアゾール）（ＢＢＴ）と同定された。表８参照。

本発明は、その精神又は本質的特徴を逸脱しない限り、記載した化合物の類縁体 及び誘導体を含む、他の特異的形態を態様としうる。

本態様は、全て例示として考慮されるべきであって、限定するものではない。本 発明の範囲は添付した請求の範囲により示された。

表１ ＣＲＴ、ＡＢＴ、及びＢＢＴの蛍光特性吸光　励起　放射　ストークス 係数（ｎｍ）　最大（ｎｍ）　最大（ｎｍ）　シフト（ｎｍ）ＣＢＴ　３７８　 ３８１　５１０　１２９（ａ２ｏ−４３ｏ）　（４４５−５８０）ＡＢＴ　４６ ８　４８１　５１８　１３７Ｂ　Ｂ　Ｔ　４１５　４１９　５６１　１４２４− Ｍ　Ｕ　Ｎ／Ａ　はぼ３８０　４４９　８２表２ ＣＢＴに対するＣＢＴＰの蛍光特性の比較電圧　励起最大　放射 ＣＢ　Ｔ　Ｐ　７００　３７７　５０４　５：（、０００（８，０８０，０００ ） ＣＢ　Ｔ　５００　３７８　５０１　８０ｇ、　０００表３ 塩基を有し又は有しない異なる溶媒中のＣＢＴの蛍光ｌＯμｆｆ　ＣＡ添加　１ ００μＱＣ＾添加水性０．１０Ｍ　澄明な緑色　−− ＡＭＰＤ　ｐＨ１０，２ メタノール　明るい緑色　澄明な緑色　澄明な緑色ジメチルホルム　わずかに緑 色　淡緑色　澄明な緑色アミド エタノール　無色　明るい緑色　澄明な緑色プロパツール　淡緑色　澄明な緑色 　澄明な緑色アセトン　無色　無色　明るい緑色 テトラヒドロ　無色　無色　淡緑色 フラン トルエン　無色　無色　わずかに緑色 エチルエーテル無色　無色　わずかにブルー表４ ＣＢＴの５００ＭｇヘルツＮＭＲスペクトル化学シフト　積分　結合定数（Ｈｚ ） １０、５１８　（Ｓ）　０．６５ ７、５８９　（Ｄ）　０．８８　２．５７．１８３　（ＤＤ）　１，０９　９． ２．５８．０６４　（Ｄ）　１．００　９ ＡＢＴ１７）５００ＭｇへＡッＮＭＲスベク）ル化学シフト　積分　結合定数（ Ｈｚ） １０、１０６　０．６８ ８．２９７　（Ｓ）　０．８６ ７．９１０　（Ｄ）　Ｃ５＞＊　１．９１　９．０７、４４８　（Ｄ）　１．０ ０　２．５７．０７５　（ＤＤ）　１．１４　９．２．５木ＨｔＯの添加により 、水素の一つが消え、７．９１０で二重線ＡＢＴＰの５００ＭｇヘルツＮＭＲス ペクトル化学シフト　積分　結合定数（Ｈｚ） ８、０４０　（Ｄ）　０．９８　９．０７、８５６　（Ｓ）　１．０：（ ７、４６８（Ｄ）　１．００　９．０ ３、３３５　（Ｑ）　８．３０　１１．０１．０１７　（Ｓ）　６．００ 表ユ ＣＢＴＰの５００λ１ｇヘルツＮＭＲスペクトル化学シフト　積分　結合定数（ Ｈｚ） ７゜９６０　（Ｄ）　Ｑ、　６０　２．０７．４３０　（ＤＤ）　１，００　２ ．５．９．０８、０５７　（Ｄ）　０．９５　９．０８、１８６　（Ｄ）　１． 　［１０８，０８、２２８（Ｄ）　１．　［１０８，０７，６１０（Ｄ、Ｄ、Ｄ ：）：　１．１０　１．５．８．５．７．０７．６７０　（Ｄ、Ｄ、Ｄ）＊　１ ．１５　１．５．８．０．７．０３、３３５　（Ｑ）　８．４６　１１．０１、 ０１７　（Ｓ）　６．００ 本二つの三重線として現れる 表８ ＢＢＴの５００ＭｇヘルツＮＭＲスペクトル化学／フト　積分　結合定数（Ｈｚ ） ７．５０９　（Ｄ）　０．８２　２．５７．０９５　（ＤＤ）　１゜００　２． ５．８．５？、　９９９　（Ｄ）　０．９４　８．５８．１５８　（Ｄ）　１゜ ００　７．５８、２２４　（Ｄ）　１．　［１０７，５７，５７（Ｄ、Ｄ、Ｄ） ｔ　１．０６　６．６．５．１．５７．６１　（Ｄ、Ｄ、Ｄ）＊　１．０６　６ ．６．５．１．５＊二つの三重線として現れる Ｆ／Ｇ　／。

ＣＢＴ　ＡＢＴ ＢＴ 分当りの蛍光態位 蛍光単位 蛍光 ０以ｇゴ８以とゴ８ｙ釦ゴ８以＝ゴ呂 蛍光 分当り形成されたＢＢＴのｎモル 分当り形成されたＡＢＴｏ）ｎモル 蛍光 ロ　δ　き　８　８　８　目 一 〜 国際調査報告 ！”ＣＴ“、’ｔＪＳＳ９ノ’Ｏ？ＳＳｉ：　−ｃｚ　ｒｂ　ａｒｒ＋ｏｙドロ ーｈｙａｒｏｘｙｂｅｎ：ｏｔｈｉｉ；ｏｉ、ｅニーｃｙａｎｃ−ｂ−ｈｙａｒ ｏｘｙｂｅｎ：ｏｔｈｘａ：ｏｌｅ

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. １．▲数式、化学式、表等があります▼［式中、 （ａ）４、５、６又は７のいずれかの位置の少なくとも一つの炭素がベンゼン環 に付着するアニオン基を含む化学残基と結合する；（ｂ）２位の炭素は、少なく とも２原子からなる化学残基Ｘと結合する； （ｃ）窒素原子は３位に位置する； （ｄ）硫黄原子は１位に位置する； （ｅ）化学残基は蛍光を抑制し、下位部分（ｓｕｂｐａｒｔ）（ａ）の該アニオ ン基に付着する； そして、下位部分（ｅ）の該化学残基の除去によって、得られる化合物は蛍光性 であるがルシフェラーゼとの反応でルシフェラーゼと同様の効果の５０％のレベ ルで生物発光を生じない。〕により示される化合物。
2. ２．下位部分（ａ）の該アニオン基が水酸基である、請求項１の化合物。
3. ３．Ｘ位の該化学残基がシアノ残基、カルバモイル残基及び２−べンゾチアゾリ ル残基から構成される群から選択される、請求項１の化合物。
4. ４．下位部分（ａ）の該アニオン基に結合する下位部分（ｅ）の該化学残基がリ ン酸エステル残基、エステル残基及び脂質残基から構成される群から選択される 、請求項１の化合物。
5. ５．下位部分（ｅ）の該化学残基が加水分解により除去することが可能である、 請求項１の化合物。
6. ６．ＡＢＴＰ
7. ７．ＢＢＴＰ
8. ８．ＣＢＴＰ
9. ９．試料中の酵素を検出するための請求項１の化合物の使用方法であって、 （ａ）該酵素は、請求項１の該化合物の請求項１の下位部分（ｅ）の該化学残基 を除去することが可能である；（ｂ）該試料は、該酵素が請求項１の該化合物か ら該化学残基を除去するのに適当な条件下、請求項１の該化合物と接触する；そ して （ｃ）該酵素は、該化学残基の除去により請求項１の該化合物により発生する蛍 光を検出することにより検出される。
10. １０．該酵素がホスファターゼであり、請求項１の下位部分（ｅ）の該化学残基 がリン酸エステル残基を含む、請求項９の方法。
11. １１．請求項１の該化合物がＡＢＴＰ、ＢＢＴＰ及びＣＢＴＰから構成される群 から選択される、請求項１０の方法。
12. １２．該酸素がエステラーゼであり、下位部分（ｅ）の該化学残基がエステル残 基を含む、請求項９の方法。
13. １３．該酵素がリパーゼで、請求項１の下位部分（ｅ）の該化学残基が脂質残基 を含む、請求項９の方法。
14. １４．環境条件をモニターするための請求項１の化合物の使用方法であって、 （ａ）該環境条件が、請求項１の該化合物の請求項１の下位部分（ｅ）の該化学 残基を除去することが可能である；（ｂ）該化合物は該環境条件にさらされる； そして（ｃ）該環境条件を、請求項１の該化合物により、該化学残基が除去され て表れる蛍光を監視することによりモニターする。
15. １５．該環境条件が、温度、又はｐＨ又は金属の存在での極値（ｅｘｔｒｅｍｅ ）である、請求項１４の方法。
16. １６．請求項１の該化合物が、ＡＢＴＰ、ＢＢＴＰ及びＣＢＴＰからなる群から 選択される請求項１４の方法。
17. １７．試験試料中の生物学的分子を検出するために請求項１の化合物を用いる方 法であって、 （ａ）請求項１の該化合物の請求項１の下位部分の該化学残基を除去しうる組成 物が、該生物学的分子に付着しうる生物学的リガンドに付着し； （ｂ）下位部分（ａ）の組成物／リガンドを該生物学的分子への該組成物／リガ ンドの結合に適した条件下、該試験試料に接触させ；（ｃ）請求項１の該化合物 は、請求項１の該化合物から請求項１の下位部分（ｅ）の該化学残基の除去に適 した条件下、該試験試料又はその一部と接触させ；そして （ｄ）該生物学的分子を、該化学残基が除去されて請求項１の該化合物より発生 する検出蛍光によって検出する。
18. １８．請求項１の該化合物の該化学残基を除去しうる該組成物が酵素である請求 項１７の方法。
19. １９．該酵素がホスファターゼ、エステラーゼ及びリパーゼからなる群から選択 される請求項１７の方法。
20. ２０．該酵素がホスファターゼで請求項１の下位部分（ｅ）の該化学残基がリン 酸エステル残基を含む、請求項２０の方法。
21. ２１．請求項１の該化合物がＡＢＴＰ、ＢＢＴＰ及びＣＢＴＰからなる群から選 択される請求項２０の方法。
22. ２２．該酵素がエステラーゼであり、請求項１の下位部分（ｅ）の該化学残基の エステル残基を含む、請求項１７の方法。
23. ２３．該酵素がリパーゼで、請求項１の下位部分の該化学残基が脂質残基を含む 請求項１７の方法。
24. ２４．該生物学的リガンドが抗体、抗体断片及び核酸からなる群から選択される 、請求項１７の方法。
25. ２５．該生物学的リガンドが抗体であり、請求項１の該化合物の請求項１の下位 部分の該化学部分を除去しうる該組成物がホスファターゼであり、且つ請求項１ の該化合物がＡＢＴＰ、ＢＢＴＰ及びＣＢＴＰからなる群から選択される、請求 項２４の方法。
26. ２６．該試験試料が生物学的試料を含む請求項１７の方法。
27. ２７．該生物学的試料が尿、血液及び組織からなる群から選択される請求項２６ の方法。
28. ２８．該生物学的リガンドが抗体であり、請求項１の該化合物の下位部分（ｅ） の該化学残基を除去しうる該組成物がホスファターゼであり、且つ請求項１の該 化合物がＡＢＴＰ、ＢＢＴＰ及びＣＢＴＰからなる群から選択される請求項２７ の方法。
29. ２９．試験試料中、少なくとも約１０アトモル濃度の酵素を検出するために請求 項１の化合物を用いる方法であって、（ａ）請求項１の該化合物の請求項１の下 位部分（ｅ）の該化学残基が酵素により切断可能であり； （ｂ）請求項１の該化合物を該化学残基の除去に適した条件下、該試験試料と接 触させ；そして （ｃ）該１０アトモル濃度の該酵素を、該化学残基の除去によって請求項１の該 化合物より発生する検出蛍光により検出する。
30. ３０．該酵素がアルカリホスファターゼであり、請求項１の該化合物がＡＢＴＰ 、ＢＢＴＰ及びＣＢＴＰからなる群から選択される、請求項２９の方法。
31. ３１．ベンゾチアゾールの該蛍光性誘導体をフリーラジカルを含有すると推測さ れる試料と接触させること、ベンゾチアゾールの蛍光性誘導体の蛍光の減少を検 出又は測定することを含み、蛍光の減少はフリーラジカルの存在を表示するもの である、試験試料中、フリーラジカルを分析するためのべンゾチアゾールの蛍光 誘導体の使用方法。
32. ３２．該フリーラジカルが酸素である請求項３１の方法。
33. ３３．該該験試料が血液を含む、請求項３２の方法。
34. ３４．ベンゾチアゾールの該蛍光誘導体が、ＡＢＴ、ＢＢＴ及びＣＢＴからなる 群から選択される請求項３３の方法。
35. ３５．生物学的分子にベンゾチアゾールの蛍光誘導体を接触させることよりなる 生物学的分子の標識方法。
36. ３６．該生物学的分子が生物学的リガンドである請求項３４の方法。
37. ３７．該生物学的リガンドが抗体、抗体断片及び核酸よりなる群から選択される 請求項３５の方法。
38. ３８．ベンゾチアゾールの該蛍光誘導体がＡＢＴ、ＢＢＴ及びＣＢＴからなる群 から選択される、請求項３５の方法。
39. ３９． ▲数式、化学式、表等があります▼ より示される化合物の製造法であって、［式中、（ａ）４、５、６又は７位の少 なくとも１つの炭素はベンゼン環に付着するアニオン基を含む化学残基と結合し ；（ｂ）２位の炭素は少なくとも２原子からなる化学残基と結合し；（ｃ）窒素 原子は３位に位置し； （ｄ）硫黄原子は１位に位置し；そして（ｅ）化学残基は、蛍光を発する下位部 分（ｃ）の該アニオン基に付着し；下位部分（ａ）の該化学残基が除去されて、 残った化合物は蛍光性であるが、ルシフェラーゼとの反応でルシフェリンと同様 の効果の５０％のレベルで生物発光を示さない。］（ｆ）ベンゾチアゾールのベ ンゼン環の４、５、６又は７位の少なくとも一つの炭素にアニオン基を結合させ 、（ｇ）ベンゾチアゾール分子の２位の炭素に少なくとも２原子から構成される 化学残基を結合させ、 （ｈ）ベンゾチアゾール分子の３位に窒素原子を置き、（ｉ）ベンゾチアゾール 分子の１位の硫黄原子を置き、そして（ｊ）化学残基は、蛍光を抑制し、これを 下位部分（ａ）の該アニオン基に付着させることによる。
40. ４０．下位部分（ａ）及び（ｆ）の該アニオン基が水酸基である請求項３８の方 法。
41. ４１．Ｘ位の該化学残基がシアノ残基、カルバモイル残基及び２−ベンゾチアゾ ール残基からなる群から選択される、請求項３８の方法。
42. ４２．下位部分（ａ）の該アニオン基に付着する下位部分（ｅ）及び（ｊ）の該 化学残基がリン酸エステル残基、エステル残基及び脂質残基から選択される、請 求項３８の方法。
43. ４３．下位部分（ｅ）及び（ｊ）の該化学残基が加水分解により除去しうる、請 求項３８の方法。
44. ４４．請求項３８の方法により生成される生成物。
45. ４５．請求項３９の方法により生成される生成物。
46. ４６．請求項４０の方法により生成される生成物。
47. ４７．請求項４１の方法により生成される生成物。
48. ４８．請求項４２の方法により生成される生成物。