JP2000204088A - 蛍光性ベンゾチアゾ―ル誘導体の製法及び用途 - Google Patents

蛍光性ベンゾチアゾ―ル誘導体の製法及び用途

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料中の酵素を検出するために使用出来る非
蛍光性化合物の提供。 【解決手段】 上記課題は、次の非蛍光性化合物の提供
により解決された： 【化１】 この化合物は、アニオン基（Ａ）と蛍光阻止基（Ｗ）の
間の結合が酵素によって開裂すると、蛍光性を示す化合
物を与える。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光性物質の分野
に関し、又、生物学的検定の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】環境での物質の状態又は存在を作用物質
の加水分解の速度を決定することにより測定することは
よく知られている。特に、このような測定に蛍光性物質
を使用することは、このような使用が作用物質、例えば
酵素の非常に低レベルの加水分解を測定するのに典型的
には実用的でないが、知られている。一般に、化学残基
の除去により、化合物の蛍光は増大する。しかしながら
先の化合物は、水性環境中、低レベルの酵素を測定する
には適当でなかった。
【０００３】明細書中に記載する全ての文献を引用して
明細書記載の一部とする。 Ａ．酵素測定 一般に、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)の測定は、それ
が体内組織の細胞膜に遍在するので、種々の疾病の診断
に用いられて来た。ファーンレイ, エヌ．エッチ., マ
ミリアン・アルカリン・ホスファターゼ, イン：ボイヤ
ー, ピー．ディー．(エド.), ジ・エンザイムス, IV
巻、アカデミック・プレス, ニュー・ヨーク１９７１,
４１７−４４７頁。種々のエステラーゼも、又、疾病の
臨床的診断用に測定される。ベルグメイヤー, エッチ．
ユー．, メソーズ・オブ・エンザイマチック・アナリミ
ス, サード・エド, IV巻、１−１４３、ヴェルラーグ・
ケミー, １９８４。生物学的技術の最近の進歩により、
これらの酵素は、生物学的プローブと組合せて、相補的
生物学的分子の決定用のマーカーとして用いられる。即
ち、酵素の活性で、プローブに相補的な生物学的物質の
量を間接的に測定する。種々のエステラーゼが使用され
うる一方、アルカリホスファターゼ測定により、相補的
生物学的分子の決定及び測定用の便利な検定が提供され
る。ベルグメイヤー, 上記、同巻１０−１１。
【０００４】既に、ＡＰのレベルは、ＵＶ可視的スペク
トル光度測定法、ラジオイムノアッセー(ＲＩＡ)及び蛍
光性基質を用いてモニターされて来た。ＵＶ化合物は、
ＡＰの検定用に試みられて来た。例えばチモールフタレ
ンモノリン酸エステル、コールマン、シー．エム., ク
リニカ・キミカ・アクタ、１３:４０１(１９６６)、フ
ェノールフタレンモノリン酸エステル、ウィルカーソ
ン、ジェイ．エッチ．及びヴォドン、エイ．ヴィ．、ク
リニカル・ケミストリイ、１２:７０１(１９６６)及び
パラ−ニトロ−フェニルリン酸エステル、ノイマン、エ
ッチ．及びヴァン・ヴルデンダール、エム．、クリニカ
・キミカ・アクタ．１７:１８３(１９６７)。これらの
化合物は、１０アトモル／ml(１０×１０-18モル／ml)
のＡＰを決定するのに必要な有効蛍光性化合物よりも約
１０００倍も感受性がない。
【０００５】ＡＰを検定するのに用いられて来た、文献
に記載されている種々の蛍光性基質がある。これらの基
質は、全て、種々の理由から全く満足し得ないものであ
った。７−ヒドロキシクマリンリン酸エステル、グレイ
ザー, アール及びハイネス．エム．アナル．レターズ、
１(５):３３３−４５(１９６８)並びにシャーマン、ウ
ィリアム・アール及びロビン、エリ、アナリティカル・
ケミストリイ、４０／４:８０３−５１(１９６８)は、
酵素を飽和するのに１０mＭもの高基質レベルを必要と
する。そのストークスシフトは７８nm(３７６nmの励起
と４５４nmの放射)及び４２２nmのラマン蛍光である。
ラマンは蛍光最大に近いので、４５４nmに現れているシ
グナルをマスクできる。即ち、これらのファクターは、
非常に低レベルのＡＰを速やかに測定するための基質の
能力に悪影響を有する。
【０００６】２−ベンゾキサゾリル−７−ヒドロキシク
マリンリン酸エステル、ウォルフバイズ、オット・エ
ス．及びコラー、エルンスト、ミクロケミカ・アクタ、
３８９−９５(１９８５)は、４４nmの低ストークスシフ
ト(４７１nmの放射を伴う４２７nmの励起)を有する。こ
の基質と関連する二次的マイナスは、トリスpＨ９.５で
−１５℃ですら水性溶液安定性が低いことである。
【０００７】２−フェニル−７−ヒドロキシクマリンリ
ン酸エステル、オット・エスおよびコラー、エルンス
ト、ミクロケミカ・アクタ、３８９−９５(１９８５)
は、８８nmの高ストークスシフト(４７１nmの放射を伴
う３８３nmの励起)を有するが、先の化合物について述
べたと同様、水性溶液安定性が悪い。
【０００８】フルオレッセンリン酸エステルは、２５nm
のより高いストークスシフト(４７１nmの放射を伴う３
８３nmの励起)を有する。この小さなストークスシフト
は、低レベルでのＡＰの決定には全く適当でない。ティ
ファニィ、ティー．オウ.；ウストキィ、エム．ビー.；
バーティス、シー．エイ．及びサッカー、エル．エッ
チ.、クリニカル・ケミストリイ、１９／８：８７１−
８２(１９７３)参照。
【０００９】３−ヒドロキシ−２−ナフタニリド−６−
ブロモ、３−ヒドロキシ−２−ナフチル−０−アニシジ
ンリン酸エステル、ギルボウルト、ジ−．ジー．，ニュ
アー・フルオロメトリック・メソッズ・フォア・ジ・ア
ナリシス・オブ・バイオロジカリィ・インポータント・
カンパウンズ、イン：フルオレッセンス・テクニクス・
イン・セル・バイオロジィ・サール．エイ．エイ．及び
サーネッツ．エム，スプリンゲルヴェルラーク、エヌ．
イプシロン.，ハイデルベルグ、ベルリン出版、２３５
−４２(１９８３)；ヴァウグン、エイ.；ギルボウル
ト、ジー及びハックニィ、ディ.，アナリティカル・ケ
ミストリィ、４３／６：７２１−４(１９７１)及びギル
ボウルト．ジー．ジー.，ジェイ．レス．エヌ・ビー・
エイ、７６Ａ６:６０７−１２(１９７２)は、１１０nm
のストロークスシフト(４０５nmの励起及び５１５nmの
放射)を有する。しかしながら、１９７１年の文献は、
基質の最大の感受性を減する残存しているリン酸化基質
に基づく５１５nmの残留蛍光(residual fluorescence)
があると述べている。さらに、本基質は、ＡＰの存在を
顕微鏡的に視覚化するための無傷の(intact)細胞での固
体表面アッセーにしか用い得ない。本基質の構造上の理
由から、加水分解生成物は、生物学的材料のアッセーの
塩基性水性条件下では不溶性であろうと思われる。この
ことから本基質の有用性が限られる。
【００１０】２−ヒドロキシ−３−ナフトイック・アニ
リドリン酸エステル、ツオウ、ケイ．シー．及びマツカ
ワ、サダオ、ジャーナル・オブ・メジシナル・ケミスト
リイ、１１／１５：１０９７−９(１９６８)は、２２０
nmのストロークスシフト(３００nmの励起及び５２０nm
の放射)を有する。しかしながら本基質は組織化学的ア
ッセー系にしか使用できない。加水分解生成物、２−ヒ
ドロキシ−３−ナフトエ酸アニリドは、安定性が低く、
その使用が運動論的又は点アッセー(kineticor point
assay)での使用を困難にする。又、そのバックグラウ
ンド蛍光は比較的高く、５２０nmでその最大感受性は高
バックグラウンド読取り(reading)に基づき低く示すと
報告されている。
【００１１】３−０−メチルフルオレッセンリン酸エス
テル(３−０−ＭＦＰ)、ヒル、ホイル・デー,、サマ
ー、ジョージ・ケイ, 及びウォーターズ、ミカケル・デ
ィー．、アナリティカル・バイオケミストリイ、２４:
９−１７(１９６８)：ウォルフバイズ、オット・エス．
及びコラー、エルンスト、ミクロケミカ・アクタ、３８
９−９５(１９８５)、ハシモト、シンヤ、コバヤシ、ケ
ンセイ；フジワラ、キタオ、ハラブチ、ヒロシ及びフ
ワ．ケイイチロ、分析化学、３２：Ｅ１７７−Ｅ１８４
(１８３)並びにノルガールド、アーグ、キールドセン、
ケルド、ラーセン、ジム・ステンファット；ラーセン、
クリスチァン・グロンノイ及びラーセン、フレデリック
・グロンノイ、スカンジナヴィアン・ジャーナル・オブ
・クリニカル・アンド・ラボラトリイ・インヴェスチゲ
ーション、４５ ２:１３９−４４(１９８５)は１５nm
のストークスシフトを有する。ハシモト等は、又、ＡＰ
のアッセーに適した水性条件下でのリン酸エステルの加
水分解の問題を記載している。
【００１２】リボフラビン−５−リン酸、グレイザー、
アール及びハインズ、エム.，アナリチカル・レター
ズ、i(５)３３３−４５(１９６８)及びタケウチ、ティ
及びノガミ、エス．、アクタ・パソロジカ・ジャパン、
４、２７７(１９５４)は、組織ＡＰアッセーのみに用い
られている。そのアッセーの最大感受性は報告されてい
ない。
【００１３】フラボンジリン酸エステルは、５１０nmの
放射波長を有する。グレイザー、アール．及びハイネ
ス、エム．アナリチカル・レターズ、１(５):３３−４
５(１９６８)並びにランド、ディー．ビー．及びジヤキ
ム、イー．アナリチカル・バイオケミストリイ、１６：
４８１(１９６６)。励起波長は報告されなかった。著者
らは、それは３−０−ＭＦＰよりも安定な基質であり、
又、ベータナフトールリン酸エステルよりもより感受性
の蛍光指標であると報告した。本基質は、蛍光の開始が
観察できるまでに２個のリン酸基の離脱を要する。この
ことは、出発基質の一つのフラクションのみが蛍光性で
ないモノリン酸エステルに変換される運動論的アッセー
にとって耐え難い問題を起こすであろう。さらにモノリ
ン酸エステルは蛍光放射が観察されるまでに３−ヒドロ
キシ−フラボンに変換されなければならない。
【００１４】４−メチルウンベリフエリルリン酸エステ
ル(４−Ｍ−ＭＵＰ)、ウォルフバイズ、オット・エス.
及びコラー、エルンスト、ミクロケミカル・アクタ、３
８９−９５(１９８５)：コーニッシュ、コラリー・ジェ
イ.，ニール、フランシス・シー．及びポーズン、ソロ
モン、アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・パ
ソロジィ、５３ １：６８−７６(１９７０)並びにシャ
ーマン、ウィリアム・アール及びロビン、エリ、アナリ
チカル・ケミストリィ、４０ ４：８０３−５(１９７
８)は、３６７nmでの励起を伴う８２nmのストークスシ
フトを有する。放射は４４９nmである。最初の順位ラマ
ンは４１２nmで、これは４−メチル−ウンベリフェロン
(４−ＭＵ)のそれの１／１２０である。放射は高いバッ
クグラウンド蛍光に寄与する。コーニッシュらは、４−
ＭＵＰが４６５nmに放射を有し、それは４−メチル−ウ
ンベリフェロン(４−ＭＵ)の１／１２０であると報告し
ている。又、これらの著者により、４−ＭＵＰが塩基性
トリス緩衝液中で分解することが記載された。彼等は重
炭酸塩／炭酸塩緩衝液中で４−ＭＵＰを製造することに
よって本加水分解の問題を減少させることができた。ハ
シモト、シンヤ、コバヤシ、ケンセイ、フジワラ、キタ
オ、ハラブチ、ヒロキ及びフワ、ケイイチロ、分析化
学、３２：Ｅ１７７−Ｅ１８４(１９８３)には、彼等の
文献調査によれば４−ＭＵＰは「天然水中に溶解した酵
素(ＡＰ)に対するより一層の研究に最も期待できる基質
のように思われること。本基質を用い４８時間のインキ
ュベーションで、ＡＰ活性の測定の最低限度は１×１０
-12モル１-1分-1であったこと。一方、Ｐ−ＮＰＰを用
いる慣用のスペクトル光度測定法のそれは０.４×１０
-9モル１-1分-1であったこと。」が報告された。
【００１５】ドルカ、マーリン及びマックエロイ、ダブ
リュ．ディ．，メス，アナル．ケム．４０ ４：８０３
−５(１９６８)は、水性pＨ９.０溶液中のＬ−(＋)−ル
シフェリン(ＬＨ)が３８５nmの励起レベルと約５４０nm
に放射を伴う高蛍光性化合物であることを報告してい
る。水溶液中、量子収率は０.６２である。ＬＨは塩基
性水性溶液中、不安定な化合物である。
【００１６】２−カルバモイル−６−メトキシベンゾチ
アゾール、ＬＨの合成での中間体は、メソーズ・オブ・
エンザイモロジィ、５７巻、１９頁に報告されている。
本物質に対する報告では蛍光はなく、そしてこのことは
我々の実験で証明された。
【００１７】Ｂ．環境状態測定 環境因子はリン酸エステル基の加水分解を生ずることが
知られているので、加水分解速度のモニタリングは間接
的に種々の環境状態を監視しうる。例えば、温度又はp
Ｈ又は金属での極端な状態は加水分解力として作用す
る。従って化学的残基の付着により阻害され、又、加水
分解力により化学的残基が開離して回復した蛍光を示す
蛍光性化合物を持つことは価値がある。
【００１８】酸素の存在に対し比色試験を用いること
は、この分野で、例えば嫌気性環境に対する比色試験で
知られている。蛍光性化合物は、又、酸素レベルの測定
にも用いうる。一般に、蛍光性化合物が「長い生存時
間」特性を有する場合には、化合物は酸素の存在により
抑制される可能性がある。これは、蛍光性化合物中の電
子が低エネルギーレベルまで低下し、それらが光エネル
ギーを放射すると起きる。電子が低下する期間が充分な
場合、低下する電子により放出されるエネルギーのある
ものは、酸素分子により利用される。低下する電子に対
する最小「生存時間」は約１０-15秒であるが、より長
い生存時間がより感受性の酸素測定に提供される。従っ
て、酸素を測定するために「長い生存時間」を伴う蛍光
性化合物を持つことは価値がある。
【００１９】Ｃ．生物学的分子の直接決定、検定又はモ
ニタリング 生物学的リガンド用の標識はこの分野でよく知られてお
り、それらは放射活性物質、比色指標、及び蛍光性化合
物を含む。典型的には、これらの物質は、放射活性スク
レオチドの使用におけるように生物学的リガンドに取込
まれるか、或いはグルタルアルデヒド又は抗体に蛍光性
標識を付すのに用いられる種々の化学的「拡張腕」(ext
ension arms)の使用におけるように、リガンドに化学
的に付される。
【００２０】従って、本発明は以下の利点を提供する。 １．水性環境中で安定性を保持する蛍光性化合物； ２．バックグラウンド干渉以上に容易に検定可能である
蛍光性化合物； ３．化学的残基の付着によって、蛍光が激しく減ずる
が、該化学的残基の除去によって、強く蛍光性を示す蛍
光性化合物； ４．アッセー指示又は他のマーカーとして用いるのに充
分なストークスシフトを示す蛍光性化合物； ５．少なくとも約１０アトモル(１０-18モル)濃度のア
ルカリホスファターゼの検出用の手段を提供する蛍光性
化合物； ６．「長い生存期間」を有し、酸化剤を検出する手段を提
供する蛍光性化合物； ７．種々の溶媒中で蛍光特性を保持する蛍光性化合物； ８．水中で安定で、加水分解で蛍光性化合物を形成する
ことができる非蛍光性リン酸エステル化合物； ９．幾つかのメンバーは可視光で励起することができる
一クラスの蛍光性化合物。
【００２１】本発明の要約 本発明は、蛍光性基質としてのベンゾチアゾール(ＢＴ)
の誘導体の用途に関する。ＢＴの高蛍光性誘導体は、Ｂ
Ｔ誘導体に化学的残基を付着することにより非蛍光性誘
導体に変換できる。化学的残基が非蛍光性誘導体から切
断するか、さもなければ解離すると、蛍光が回復する。
【００２２】これまで、簡単なベンゾチアゾール誘導体
で蛍光を示すものはなかった。ごくわずかの蛍光性ベン
ゾチアゾール化合物が文献に報告されているが、実際の
蛍光特性は報告されていないし、知られてもいない。２
−カルバモイル−６−メトキシベンゾチアゾールは、こ
れまでルシフェリンの非蛍光性誘導体であると報告され
ており(上記参照)、これは我々の手で確認された。２−
シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール(ＣＢＴ)、ド
ルカ、エム．エイ．及びマックエロイ、ダブリュ．デ
ィ．、メソズ・オブ・エンザイモロジィ、５７：１５−
２４(アカデミック・プレス)及び２−カルバモイル−６
−ヒドロキシベンゾチアゾール、フオウレ・アール等、
オルグ．マグン．レゾン．１１:６１７−２７(１９７
８)は、共に文献に報告されているが、このような化合
物の蛍光についても、又、付着された化学的残基によっ
てこのような化合物の蛍光が抑制されることも報告され
ていない。ベンゾチアゾール誘導体が蛍光性でありうる
こと、どのような条件下で、このような蛍光が発現し、
どのような条件下で蛍光が抑制されるか、何も示してい
なかった。即ち、ＣＢＴ及びＡＢＴ並びに他のＢＴ誘導
体の蛍光性性質は、本発明以前のこれらの化合物の報告
を見ても予期し得ないものである。
【００２３】本発明は、又、化学的残基を付さないＢＴ
の蛍光性誘導体の用途にも関する。これらの化合物は、
例えば生物学的分子を標識化することにより、直接、生
物学的分子を検定するのに用いることができる。
【００２４】ＢＴの誘導体は、又、酸素レベルを測定す
るのに用いることもできる。酸素は、ＢＴの蛍光性誘導
体中、低いエネルギー状態まで低下している励起電子に
より放射されたエネルギーを使用するので、ＢＴ分子の
蛍光性誘導体の蛍光は減少する。即ち、蛍光の減少は、
アッセー系に存在する酸素の量を示す。
【００２５】本発明の他の局面は、ＢＴの蛍光性誘導体
の、有機溶媒中、蛍光を保持する能力である。即ち、水
中でも有機溶媒中でも、環境における状態及び物質の検
出及び測定に使用することが可能である。
【００２６】本明細書に記載される一クラスの蛍光性化
合物は、図式
【化２】 により示されるこれらの化合物よりなる。
【００２７】図中、 a) ４、５、６又は７位の炭素の少なくとも一つは、ベ
ンゼン環に付着する陰性基を含む化学的残基と結合す
る; そして b) ２位の炭素は、ベンゾチアゾール環系の共鳴を伸張
する少なくとも２つの原子よりなる化学的残基と結合す
る; そして c) 窒素原子は３位に位置し、そして d) 硫黄原子は１位に位置する。
【００２８】ベンゼン環と共鳴している陰性基、例えば
イオン化可能な水素は、蛍光の抑制に適した化学的残基
の付加に必要である。２位炭素と結合する二原子(dual
−atom)化学的残基は、蛍光用の共鳴系の必要な伸長(ex
tension)である。２位の炭素に結合する化学的残基の長
さと結合(cinjugation)を増加すると、化合物から放射
される光の波長及び励起波長も又、増加することが、こ
こで発見された。即ち、２位炭素に結合する化学的残基
の原子の数を増加することにより、蛍光は色合がより深
く表れるであろう。
【００２９】明細書中、次の用語が以下に定義するよう
に用いられる。 ＡＢＴ：２−カルバモイル−６−ヒドロキシベンゾチア
ゾール ＢＢＴ：２'−(２−ベンゾチアゾリル)−６'−ヒドロキ
シベンゾチアゾール ＣＢＴ：２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール ストークスシフト: 励起及び放射最大の波長の間の差で
ある冷光発生分子の特性値である物理的定数。 レイリー散乱：光子エネルギーによる励起に基づく電子
振動の結果として放射される光による干渉。 ラマン：レイリー散乱ピークよりも高いか又は低い波長
の蛍光スペクトルに現れる。これらのラマン帯は、励起
放射とは異なる一定の振動を伴うレイリー散乱ピークの
サテライトである。これらの帯は、この励起電子に付加
されるか又はこれから減じられる振動エネルギーのため
である。 蛍光能力：励起するために用いられた光の一部として放
射した光の量。
【００３０】励起波長：任意の単位で測定される、蛍光
放射を発生するのに用いられる光の波長。 放射波長：起後、蛍光性分子により放射される光の波
光。 Ｋm：酵素反応の速度が半最大(half maximal)である基
質濃度。 代謝回転数：酵素が律速因子である場合、単一酵素分子
による単位時間当り変換される基質分子の数。 分子吸収力：紫外又は可視スペクトルでの吸収帯の強
度。 基質：酵素がその上で触媒作用に影響を及ぼす分子。 酵素：特異的化学反応の速度を大きく強める能力を有す
る触媒。 共鳴：幾つかの構造の各寄与が結合程度と一致するある
方法に重点が置かれる場合で、各々が有し、それが現れ
たとき、特異的形状を伴う実際の分子。
【００３１】以下の記載は、蛍光性基質を使用して非常
に低レベルの酵素又は加水分解試薬を検出、測定するた
めに、本発明の具体例が調製され、使用される方法の詳
細を提供する。この記載は、本発明の典型例であるが、
発明を特異的に限定するものとして解釈されるべきでな
い。本分野の当業者の理解しうる範囲内にありうる変形
は本発明の範囲内にあると考慮されるべきである。
【００３２】化合物２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾ
チアゾール(ＣＢＴ)、２−カルバモイル−６−ヒドロキ
シベンゾチアゾール(ＡＢＴ)、２'−(２−ベンゾチアゾ
リル)−６'−ヒドロキシベンゾチアゾール(ＢＢＴ)は、
特異的な４４５nm−５８０nm(ＡＢＴ及びＣＢＴ)及び４
６０nm−６６０nm(ＢＢＴ)塩基性水性溶液中、それぞれ
５１０nm、５１８nm及び５６１nmで生ずる放射で最大に
蛍光性である。励起は、それぞれ３８１nm、３８１nm及
び４１９nmで発生する最大を伴う３２０−４３０nm(Ｃ
ＢＴ)、３２５−４４０nm(ＡＢＴ)、及び３３０−４８
０nm(ＢＢＴ)の範囲で生じる。これらの化合物の構造に
ついての図１及び上記データの要約についての表１参
照。
【００３３】化学的残基はヒドロキシベンゾチアゾール
の蛍光性誘導体に付加されて、それは分子の蛍光能力を
きびしく抑制する。化学的残基の結合によって酵素に対
する適当な基質が提供されると、残基はヒドロキシベン
ゾチアゾール分子の非蛍光性誘導体から離脱し、蛍光が
回復する。この方法で、例えばＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢＢ
Ｔは酵素活性の決定用の蛍光性指標として用いることが
できる。例えばリン酸エステル残基は、ＢＢＴに付加し
て非蛍光性誘導体２'(２−ベンゾチアゾール)−６−ヒ
ドロキシベンゾチアゾールリン酸エステル(ＢＢＴＰ)、
アルカリホスファターゼ用の適当な基質を生成する。従
ってアルカリホスファターゼ(ＡＰ)によりリン酸エステ
ル残基が離脱すると、酵素活性の測定がなされる。ＡＰ
とＢＢＴＰの酵素反応は図３に示される。生成されたリ
ン酸エステル誘導体の分子構造はＦＢに示される。
【００３４】他の化学的残基はＢＢＴに結合しうる。例
としては、コリンエステラーゼ、コレステロールエステ
ラーゼ、リパーゼの適当な基質を提供する化学的残基及
び酵素によりヒドロキシベンゾチアゾールの非蛍光性誘
導体から離脱可能な、いかなる残基をも含む。他の加水
分解力により離脱可能な残基も、又、これらの加水分解
力を検定する目的に結合しうる。
【００３５】加えて、ＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢＢＴは生物
学的分子の検定用に直接又は間接に用いうる。酵素は、
生物学的リガンド、例えばモノクローナル又はポリクロ
ーナル抗体あるいはその断片、核酸プローブあるいは相
補性分子を検出可能な他の生物学的組成物に結合しう
る。この方法で、酵素／リガンドは最初、相補性生物学
的分子に結合し、そして適当な条件下、ＣＢＴ、ＡＢＴ
又はＢＢＴよりなる基質と適当な化学的残基との付加を
伴い、酵素は化学的残基を離脱して、ＣＢＴ、ＡＢＴ又
はＢＢＴは強い蛍光を生ずる。この蛍光の検出又は測定
は、プローブに相補性の生物学的材料の検出及び測定を
可能にする。このような検定は生物学的試料、例えば
尿、血液又は組織試料を用いて行なうことができること
に注目されたい。リン酸化ＣＢＴ組成物及びアルカリホ
スファターゼ使用の例は図４に示される。生物学的分子
の直接測定は、本分野の当業者に既知の方法によってＡ
ＢＴ、ＢＢＴ又はＣＢＴを生物学的リガンドに結合さ
せ、蛍光性シグナルを検出することによって行なうこと
ができる。
【００３６】本発明の他の局面は、フリーラジカル、例
えば特に血液中の酸素濃度を測定するためのＣＢＴ、Ａ
ＢＴ又はＢＢＴの使用である。フリーラジカル、例えば
酸素は蛍光中放射するエネルギーを充当することができ
るので、誘導体の蛍光の減少は酸素量と相関しうる。即
ち、蛍光の測定は酸素濃度を検出するのに用いることが
できる。
【００３７】ＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢＢＴは異なる溶媒
中、蛍光特性を保持しているので、その化合物は異なる
溶媒中でかかる測定を行なうのに用いうることに注意す
べきである。表３参照。
【００３８】
【好ましい態様の記載】１．用いられる装置 ＵＶ／ＶＩＳ機器はベックマン・モテル・ナンバー２５
であった。ＮＭＲ機器はヴアリアン・モデル・ＥＭ３６
０Ａ ６０mＨz電子単位又はゼネラル・エレクトリック
・ＧＮ−５００ ５００Ｍgヘルツ単位であった。ＮＭ
Ｒシフトは内部基準としてテトラメチルシランを用いて
記録される。一つのフルオロメーターは、励起用の単一
モノクロメーターと放射用の二重モノクロメーターを備
えたスプセックスIIフルオロログ・モデル１１２であっ
た。それを前表面(front face)蛍光を用いて稼動し
た。二つ目のフルオロメーターはチューナーから購入し
たフィルターを備えたチューナー・モデルIIIであっ
た。融点は補正せずにトーマス・フーヴァー毛細管融点
機器で決定した。ＨＰＬＣ装置は、溶媒プログラマー
(モデル６６０)及びＵＶ／ＶＩＳ固定波長検出装置(モ
デル４４０)を備えたウォーターズ複式ポンプ(モデルＭ
−６０００)ユニットであった。用いたカラムは３.９×
２５mmウォーターズ逆相Ｃ−１８ １０ミクロン・イレ
ギュラーシリカゲルであった。ＨＰＬＣ分析に用いた溶
液Ａは、３０００mlのＨＰＬＣグレード水及び７５０ml
のＨＰＬＣグレードメタノールと５.５２gのリン酸−ナ
トリウム−水和物を用いて調製した。特に述べない限
り、ＨＰＬＣ分析に用いた流量は１分当り１.０mlであ
った。用いた反応器バイアルは、パイレックスガラスで
造られた１mlから１０mlサイズで、試薬側がテフロン表
面のシリコン隔壁と内部テフロン磁気撹拌棒を有した。
pＨはフィッシャー・アクメット・デジタルモデル５２
０を用いて決定した。基質溶液と接触する全ての装置
は、使用前に１Ｎ塩酸に３時間浸漬し、次いで新たに蒸
留した脱イオン水で完全にすすいだ。これで、通常、存
在する外界ＡＰが死滅するのは確実である。シグマから
使用したそれぞれ個々のロットのウシ血清アルブミン
は、存在するＡＰのレベルを評価した。
【００３９】２．使用した試薬 使用した試薬又は溶媒は、特にことわらない限りＡＣＳ
試薬グレードであった。使用したＤＥＡは、使用前にガ
ラス内で真空蒸留した。用いたテトラヒドロフラン(Ｔ
ＨＦ)は、水酸化カルシウム上で乾燥し、使用直前に蒸
留した。使用水は新しく脱イオン化し(２メガオーム)て
蒸留した。ＡＭＰＤはＪＢＬサイエンティフック・カタ
ロク・ナンバー１２５０Ａにより供給した。トリエチル
アミン、ベンゾチアゾール及び２−アミノ−チオフェノ
ールは、アルドリッチから得た。トリメチルブロモシラ
ンはペトラーチ・システムズから得た。２−クロロ−６
−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−アミノ−６−ヒド
ロキシベンゾチアゾール及び２−シアノ−６−メトキシ
ベンゾチアゾールは、英国、バーミンガム、デパートメ
ント・オブ・クリニカル・ケミストリィ・オブ・ザ・ユ
ニバーシティ・オブ・バーミンガム、ネイル・バジエッ
ト教授から好意的に提供して頂いた。これらの化合物
は、ボウイー・エル．ジェイ．(１９７８)メソズ・イン
・エンザイモロジィ(デルカ、エム．エイ.、出版)５７
巻１５−２８頁、アカデミック・プレス、ニューヨーク
により記載された手順を用いて調製した。
【００４０】３．蛍光特性 a．ＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢＢＴの蛍光特性 ＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢＢＴベンゾチアゾール(ＢＴ)、２
−クロロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール(Ｃl−Ｂ
Ｔ)、２−アミノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール(ア
ミノ−ＢＴ)及び２−シアノ−６−メトキシベンゾチア
ゾール(ＣＮ−メトキシ−ＢＴ)の蛍光特性は、０.１Ｍ
２−アミノ−２−メチル−１,３−プロパンジオール(Ａ
ＭＰＤ)を加えた水性pＨ１０.２溶液中で測定した。ほ
ぼ等しい蛍光効率を、適当な溶媒(メタノール又はエタ
ノール)中に適当な化合物を溶解し、１０mlの溶媒当り
１０mgとすることにより決定した。次いで１００mlのこ
の溶液を９.９mlの、０.１Ｍ２−アミノ−２−メチル−
１,３−プロパンジオール(ＡＭＰＤ)を含むpＨ１０.０
の緩衝液に加えた。蛍光源(２５４nm)を保持した針(han
d)を石英セル内の溶液を励起するのに用い、可視観察を
記録した。この溶液が蛍光性の場合は、１／１０に希釈
して測定を繰り返した。ＢＴ、Ｃl−ＢＴ、アミノ−Ｂ
Ｔ及びＣＮ−メトキシ−ＢＴは全てＣＢＴ、ＡＢＴ及び
ＢＢＴよりも蛍光性能力が少なくとも３オーダーの大き
さで低いことが判った。即ち、ベンゾチアゾール残基が
イオン化しうる基をベンゼン環内に含み、且つ共役を拡
大する２位に基を含むとき、蛍光能力は劇的に増大でき
ることが明らかである。
【００４１】ＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢＢＴの蛍光特性を測
定し、４−メチル−ウンベリフェロン(４−ＭＵ)のそれ
らと比較した。この情報は表１に示される。ウォルフバ
イズ、オット・エス．及びコラー、エルンスト、ミクロ
ケミカ・アクタ、３８９−９５参照。第一に、ＣＢＴ、
ＡＢＴ及びＢＢＴの分子吸収力は１５,５００(水性０.
１０Ｍ ＡＮＰＤ pＨ１０.２)、１３,３００(水性０.
３９２Ｍ炭酸ナトリウムpＨ１１.０)及び３３,０００
(水性０.１Ｍ ＤＭＡ pＨ１０.０)であった。これら
の分子吸収力はそれぞれ３７８nm、３６８nm及び４１５
nmで測定した。第二に最大励起は、ＣＢＴとＡＢＴが共
に３８１nmであり、ＢＢＴはその最大励起が４１９nmに
あることが判った。放射最大は、ＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢ
ＢＴに対し、それぞれ５１０nm、５１８nm及び５６１nm
に見られた。ストークスシフトはそれ,ぞれ１２９nm、
１３７nm及び１４２nmであった。これらのデータは、
０.１０ＭＡＭＰＤ、pＨ１０.０中、スプセックスII前
面蛍光を用いて収集した。水に対するラマンはＣＢＴに
対し４３３nmに見られた。水に対するラマンは検定に干
渉しないであろう。これらのデータは、これらの化合物
が望ましいストークスシフトを有し、水ラマンが蛍光放
射からよく分離したことを明らかに示す。
【００４２】決定されるべき次の因子は蛍光効率であっ
た。典型的には、約１％の蛍光効率が実用的と考えら
れ、４−ＭＵは形質(characteristic)２０−４０％効率
を有する。比較はＣＢＴと４−ＭＵの間で行った。各化
合物はその最大励起で励起した。前面蛍光を用いて、４
−ＭＵは６.８６カウント／フエムトモルを与え、ＣＢ
Ｔは同一条件下、２.８５カウント／fmを与えた。即ち
ＣＢＴは４−ＭＵの蛍光効率と非常に近かった。ＡＢＴ
及びＢＢＴの蛍光効率に関する図１１及び１２参照。蛍
光データはチューナー・モデルIIIを用いて収集した。
カーブは１×及び３×共に１０を越えて１００＋１モル
までの範囲で直線である。
【００４３】b．ＣＢＴＰの蛍光特性 ＣＢＴをリン酸化してＣＢＴＰ２−シアノ−６−ヒドロ
キシベンゾチアゾールリン酸エステル(ＣＢＴＰ)を作っ
た。構造は図２に示される。予期しないことに、ＣＢＴ
Ｐは非常に低レベルの蛍光を発し、リン酸エステル残基
がＣＢＴの蛍光を非常に抑制することが判った。
【００４４】ＣＢＴＰに関するデータは以下のように決
定した。１mgのＣＢＴＰを２.０mlの緩衝液:０.１０Ｍ
ＡＭＰＤ、０.１０mＮaＣl、１.０mＭ ＭgＣl2、０.
１０mＭ ＺuＣl2、pＨ２に溶解した。この保存溶液１
０ミクロリットルを緩衝液中に５００ミクロリットルに
希釈した。目盛り位置は高電圧側７００ボルトであっ
た。最大励起は、３nmで５０４nmで５３,０００cpsの蛍
光最大を伴った。少量のＡＰを加えてＣＢＴＰを加水分
解しＣＢＴを形成させた。高電圧を５００ボルトに減じ
ることにより、最大励起は３７８nmで、５０１nmで８０
８,０００cpsの最大蛍光を伴った。高電圧力供給量の７
００ボルトから５００ボルトへの減少により、ほぼマグ
ニチュードのオーダーで感度が減じる。即ち、ＣＢＴＰ
は、３００から４００nmに励起した場合、測定しうる蛍
光がない。見られる小さな蛍光は多分、ＣＢＴＰ中に共
雑物として存在する低レベルのＣＢＴに基づくものであ
った。表２参照。
【００４５】さらに、ＣＢＴＰは予想された加水分解生
成物、ＣＢＴに対する放射波長である５０５nmで測定し
うる放射を示さない。これはＡＰ検定においてＣＢＴＰ
の放射に基づく干渉が低いことを確実にする。
【００４６】ＣＢＴＰに関して決定されるべき次の重大
な因子は、近似Ｋm及びＡＰを伴う代謝回転数(turnover
number)であった。これはＡＰがいかに速やかに又、有
効にＣＢＴからリン酸エステル残基を切断するかを決定
する。ＣＢＴＰ−シ(ＡＭＰＤ)塩は、パラ−ニトロフェ
ニルリン酸エステル、ジ−トリス塩(pＮＰＰ、ジ−トリ
ス)及び４−メチルウンベリフェリルリン酸エステル、
ジ−(ＡＭＰＤ)塩と直接比較した。ＵＶ／ＶＩＳ検定
は、０.１Ｍ ＡＭＰＤ中、pＨ１０.２、３０℃でＣＢ
Ｔ(１５,５００Ｅmax)に対して３７５nmを、又、pＨＰ
Ｐ−ジ−トリス(１８,０００Ｅmax)に対して４０５nm
を、又、４−ＭＵに対して３６３nmを用いて行った。用
いた酵素は、ＡＭＰＤ緩衝液中１／２０,０００に希釈
した仔ウシ腸ＡＰ(カルザイム)、３０,０００μ／mlで
あった。基準側(referince side)は記載したように５
００ミクロリットルを含んだ。例えば、試料側は４６５
ミクロリットルの緩衝液、２５ミクロリットルの基質溶
液(保存溶液はＡＭＰＤ緩衝液中２０mＭ基質である)及
び１０ミクロリットルの１／２０,０００に希釈したＡ
Ｐ酵素を含有した。ＣＢＴＰは、同一条件下、pＮＰＰ
の７８％で４−ＭＵＰの９５％である代謝回転数を有す
ることが判った。即ち、ＣＢＴＰはＡＰで高代謝回転数
を有する。これらの条件下、ＡＰによるＣＢＴＰ反転の
最大速度は、２mＭにあった。又、ＡＢＴＰ及びＢＢＴ
Ｐは、同様の条件下約２mＭのＫmを有することも判っ
た。この分野における当業者にとって、これらの化合物
は、約０.０５mＭと約２０mＭの間の典型的に実用的な
広範囲のＡＰ濃度で用いうる。
【００４７】酵素が基質と反応して蛍光性化合物を形成
する蛍光測定の究極的感度を限定する一つの錠因子は、
結果としてバックグランド蛍光からの干渉を生ずる。こ
のバックグラウンドは、４つの因子:水のラマン蛍光、
レイリー散乱、出発基質からの尾をひく蛍光放射及び基
質中に存在する自由加水分解した基質からの蛍光放射に
基づく。混在している加水分解した基質からの蛍光バッ
クグラウンドが問題かどうか決定するため、ＨＰＬＣス
キャンを４−ＭＵＰ及びＣＢＴＰの両方に操作して、お
のおのに存在する加水分解した基質のレベルを正しく決
定した。ＣＢＴＰは０.０８％ＣＢＴを有し、４−ＭＵ
Ｐは０.０７％４−ＭＵ(重量比)を含有した。自由な加
水分解した基質のレベルは比較できるものであり、蛍光
感度は、上で見たように４−ＭＵ及びＣＢＴに対する
２.４の因子内であったから、測定されたどの蛍光バッ
クグラウンドも上述の最初の三つの因子の組合せに基づ
くであろう。前面蛍光を用いると、４−ＭＵＰの１mＭ
溶液は２９７.６４０Ｃps(励起３６６mm、放射４４４n
m)の出発バックグラウンド読取りを与えた。１mＭ Ｃ
ＮＴＰＣ励起３９／nm、放射、５０５nm)を用いると、
バックグラウンド読取りは４２.５１８カウント／分で
あった。これらの読取りは、０.１０Ｍ ＡＭＰ、０.１
Ｍ ＮaＣl、pＨ１０.２中でなされた。即ち、４−ＭＵ
ＰはＣＢＴＰよりも有意に高いバックグラウンドを有す
るとみることができる。
【００４８】次に、ＣＢＴの蛍光は、異なる溶媒中、塩
基シクロヘキシルアミン(ＣＡ)の存在又は不存在で評価
した。これらのデータは表３に示される。
【００４９】実験は１０mlのジメチルスルホキシド中に
５mgＣＢＴを溶解することにより実施した。この溶液
(１０ミクロリットル)を９.９９mlの適当な溶媒(溶液
１)に加えた。この溶液を石英ＵＶセルに転して２５４n
m針を保つ光源で励起した。蛍光は視覚観察後記録し
た。１０ミクロリットルのシクロヘキシルアミン(ＣＡ)
を溶液＃１に加えて、蛍光を上記(溶液２)のように記録
した。最後に、１００ミクロリットルのＣＡを溶液２に
加えて蛍光を記録した。即ち異なる溶媒を用いることが
でき、ＣＢＴが水性塩基性緩衝溶液中にある場合に見ら
れる特異的緑色蛍光が観察される。
【００５０】蛍光のpＨ研究を０.１０Ｍリン酸ナトリウ
ム、pＨ８.８９及び０.１０Ｍ ＨＣlを有する水性溶液
中で実施した。本研究は、上記した方法と類似の手法で
行なった。溶液はpＨが３より下になるまで特異的な緑
色蛍光を示した。pＨ３と１の間、極端な酸性状態で、
ＣＢＴ溶液はその蛍光を失った。即ち、ＣＢＴが広いp
Ｈ範囲でその蛍光を維持することが明らかである。
【００５１】ＣＢＴＰは水性塩基性状態でＡＢＴＰに変
換することが判った。この変換は、ＣＢＴＰがＡＰと反
応すると非直線状運動性となる。即ち、反応を４℃で速
やかに行なわない限り、ＣＢＴＰはＡＢＴＰに変換す
る。
【００５２】c．ＢＢＴＰの蛍光特性 ＢＢＴＰのＡＰ検出感度を次に決定した。図５を参照。
酵素希釈緩衝液は０.１０Ｍジエタノールアミン、１.０
mＭ塩化マグネシウム、０.１mＭ塩化亜鉛、０.００５％
アジ化ナイリウムを含み、pＨ９.０であった。用いた酵
素はカルザイム、＃２７−５−２４、３０,０００単位
／mgで１０.１５mＭアルカリホスファターゼを含有し
た。系列希釈して３００fＭ(１０-15Ｍ)(溶液Ｅ)及び３
０fm(溶液Ｆ)希釈を得た。
【００５３】基質緩衝溶液は２.４Ｍ ＤＥＡ、pＨ９.
０、０.２３mＭ塩化マグネシウム、０.００５％アジ化
ナトリウム及び１.０mＭ基質を含有した。１から１０ミ
クロリットルの溶液Ｅ又はＦの各々を３.０mlの、予め
チューナー・モデルIII内に設置し３５℃の温度とした
基質溶液に加えた。勾配(slope)をストリップ・チャー
ト・レコーダーを用いて測定した。４−ＭＵＰ、ＣＢＴ
Ａ及びＡＢＴＰに用いたフィルターは、励起側で７６０
で、放射側で２Ａ及び４７Ｂであった。ＢＢＴＰに対し
ては、励起フィルターは４７Ｂで放射フィルターは１６
であった。これらの勾配はＡＰの濃度に対してプロット
した。図５は、ＢＢＴＰを用いて、３０分間ＡＰの１０
０aＭ溶液を、又、６時間１０aＭ溶液を測定できること
を示す。この系は３.０ml試薬容量として用いたが、試
薬容量が１００ミクロリットルに減少すると、６,００
０コピー又は０.０１アトモルのＡＰを３０分間あるい
は６００コピー又は０.００１アトモルを１時間、測定
できる。
【００５４】d．ＢＢＴＰ及びＡＢＴＰの安定性 ＢＢＴＰの、２.４mＭ ＤＥＡ．pＨ９.０、０.２３mＭ
塩化マグネシウム及び０.００５％アジ化ナトリウムの
水性溶液中での溶液安定性を３５℃で決定した。結果は
図６に示され、又、ＢＢＴＰの１０aＭ、１００aＭ及び
１０００aＭＡＰに対する感度も示す。バックグランド
蛍光についてのデータは、ＢＢＴＰが金属を含む塩基性
水性状態でも非常に安定な基質であることを示す。それ
は又、６時間後のバックグラウンド読み取りの上のＡＰ
の１０aＭ溶液の測定を含む、非常に低レベルのＡＰの
測定に対するバックグラウンドの貢献を示す。
【００５５】これに加えて、１.０mＭ ＢＢＴＰの水性
溶液が上記の緩衝液中で調製でき、４℃で維持できるこ
とが判った。４℃でのＡＢＴＰ安定性も又、測定した。
図７及び８に示される結果は、４℃でのＢＢＴＰとＡＢ
ＴＰの安定性を示す。次に、ＢＢＴＰとＡＢＴＰの水性
溶液を調製し、４℃で保存した。次いでＢＢＴＰ及びＡ
ＢＴＰのこれらの溶液とＡＰの反応速度を測定した。図
９及び１０を各参照。これは、これらの溶液が安定で、
ＡＰを阻害する化合物が全く形成されないことを示す。
データはＢＢＴＰ、ＡＢＴＰともに溶液中で分解せずＡ
Ｐに対する阻止因子を形成しないことを明らかに示す。
【００５６】図５において用いた手段は、二つの理由か
ら４−ＭＵＰに適用できなかった。第一に、１mＭ溶液
から得られたバックグラウンド読み取りはチューナー・
モデルIIIで目盛からはずれていた。濃度を０.０３０m
Ｍに減じた場合、バックグラウンド読取りはＢＢＴＰ又
はＡＢＴＰの１mＭ溶液に匹敵した。本緩衝液中の４−
ＭＵＰに関するＫmは約３０ミクロモルであるから、４
−ＭＵＰの代謝反転が減少してＡＰに関する基質の感度
を低下させる。新しく調製した４−ＭＵＰの３０ミクロ
モル溶液では、ＢＢＴＰの１.０mＭ溶液が得られるシグ
ナルの約１／２から１／３を与えることが判った。第二
に、マグネシウムを含む４−ＭＵＰの塩基性水性溶液は
４−ＭＵＰを加水分解し、４−メチルウンベリフェロン
を形成することが判った。この結果、有意にバックグラ
ウンドが増加する。このことは、この溶液を４℃で保存
した場合でも、通常８時間の使用で、４−ＭＵＰを緩衝
液で再構成しなければならないことで試験が限定され
る。
【００５７】４．ＢＴ誘導体の合成 a．２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール(ＣＢ
Ｔ)の合成 合成に用いた手法は、デルカ、エム．エイ．及びマック
ロイ、ダブリュ.ディ.、メソズ・オブ・エンザイモロジ
ィ、５７、１５−２４頁、アカデミック・プレスに記載
される。生成物は与えられた融点及びＵＶデータと一致
した。ＨＰＬＣは本材料が９８％純粋(面積パーセント
による)であることを示した。溶液プログラムとして溶
液Ａに水を、溶液Ｂにメタノールを用いた。流速は、１
００％Ａで出発し４０％Ｂの最終条件までで、ウォータ
ーズ溶媒プログラマーで曲線７を用いその結果わずかに
凸状の溶媒プログラムとなる、１０分のプログラム時間
で２.０ml／分であった。生成物ピークは２５４nmでモ
ニターして、１７.３分の保持時間を有することが判っ
た。ジメチルスルホキシド(db)中５００ＭgヘルツＮＭ
Ｒスペクトルは構造が変化した。表４参照。
【００５８】b．２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチ
アゾールジメチルリン酸エステルの合成 ５００mg(２.８４mモル)の２−シアノ−６−ヒドロキシ
ベンゾチアゾールを１０mlの反応器バイアルに入れ、テ
フロンキャップでシールし、磁気撹拌棒を入れた。５.
０mlアリコットのＴＨＦを加えて撹拌し２ＣＢＴを速や
かに溶解し、澄明な明赤色溶液を得た。これに、次いで
０.５５０ml(４０２mg、３.９７mモル)のトリエチルア
ミンを加えた。得られる澄明溶液を氷浴中に置くことに
より４℃に冷却した。次に、１.５mlのＴＨＦに溶かし
た５１２mg(３.５４mモル)のジメチルクロルリン酸エス
テルをこの溶液に６０秒の期間にわたって添加した。約
２０分後、１０ml反応器バイアルを氷浴から取り出して
室温で２時間撹拌した。
【００５９】この時点で反応物は粘稠なスラリーであっ
た。トリエチルアンモニウムクロリド塩を吸引濾過によ
り除去した。濾液を丸底フラスコに移して真空下、ロト
エバポレーター(rotoevaporator)で濃縮した。残渣を５
０mlの酢酸エチルに溶解し、次いで２０mlの水と１０ml
のＮＡＣl飽和水を加えた。相を分離して酢酸エチル層
を得た。水性層を４０mlの酢酸エチルで洗ってこれを先
の酢酸エチル層と合した。混合した酢酸エチル溶液を１
５mlのＮaＣl飽和水と５mlの水で２回洗浄した。酢酸エ
チル層をＭgＳＯ4で乾燥し、濾過し、完全な真空でロト
エバポレーターで濃縮した。約５mlの酢酸エチルを、粘
稠油が溶解した濃縮物に加えた。これを−２０℃に冷却
して白色結晶を速やかに形成させた。白色結晶を濾過に
より分離した。生成物、２−シアノ−６−ヒドロキシベ
ンゾチアゾールジメチルリン酸エステル(６−ＣＢＴ−
ＤＭＰ)の融点は５４.０−５５.１℃であった。ＨＰＬ
Ｃは９６.４％(面積による)の純度を示した。カラムは
３.９mm×２５mmで３０分のプログラム時間で、１００
％水から１００％メタノールの直線状プログラムの１.
０ml／分の流速によった。生成物は２５４nmでモニター
した。生成物についての保持時間は２３.４分であっ
た。ＮＭＲスペクトルを決定した。ＮＭＲに用いた溶媒
は、内部標準としてＴＭＳを含む重水素クロロホルムで
あった。１０Ｈzの結合定数を伴いデルタ３.９に集中
し、６.００時間積分された二重線があった。３.８時間
積分された７.９に集中した多重線があった。
【００６０】c．２−カルボミル−６−ヒドロキシベン
ゾチアゾール(ＡＢＴ)の合成 ＣＢＴ、１４.０g又は０.０７９モルを６０mlの脱イオ
ン水に懸濁した。この溶液のpＨを約１２mlの６.０Ｍ水
酸化ナトリウムを用いて１１.５に調整した。得られる
澄明暗こはく色溶液を窒素下、一夜撹拌した。ＨＰＬ
Ｃ、直線状プログラムで水からメタノールへの３０分プ
ログラムを翌朝行なった。９５％(面積による)の出発材
料が単一化合物に変換したことが判った。ＣＢＴ及びＡ
ＢＴの保持時間は、それぞれ１５.１及び１３.２分であ
った。
【００６１】生成物を、等量の水を加え、６Ｎ塩酸でp
Ｈを１.９に下げることにより分離した。褐色固体を水
ですすいだ。湿潤固体を４００mlのメタノールに６０℃
で溶解し、熱濾過し、一晩−１５℃まで冷却した。結晶
を真空濾過により集収し、メタノール、ジエチルエーテ
ルですすぎ、真空乾燥した。ＨＰＬＣは単一ピークを１
３.２分に示した。収量は７.５８g又は４９％であっ
た。
【００６２】ＤＥＳＯ−d６で行った５００ＭgヘルツＮ
ＭＲは表５に示される。７.９１０及び８.２９７のピー
クはアミド水素を特定し、１０.１０６のピークはフェ
ノール水素を特定した。これらの全てのピーク(７.９１
０, ８.２９７及び１０.１０６)はデテリウムオキシド
(deterium oxide)の添加で消失した。これはアミドに
よるものである。ＮＭＲは示された生成物に予想される
ものと一致した。
【００６３】水性溶液中pＨ１１で長く処理した、又は
より高いpＨで処理したＡＢＴは、２−カルボキシル−
６−ヒドロキシベンゾチアゾールを形成し、これを分離
し、確認した。ＮＭＲスペクトルは得られたものと一致
した。この化合物は、又、予想通りに大きなストークス
シフトの高い蛍光であり、水性塩基性状態でＡＰと反応
した。この化合物はＡＰで低代謝回転数を示し、詳しく
は検討しなかった。
【００６４】d．２−カルボミル−６−ヒドロキシベン
ゾチアゾールジメチルリン酸エステルの合成 ３g(０.０１５モル)の２−カルボミル−６−ヒドロキシ
ベンゾチアゾール(ＡＢＴ)を３０mlのＴＨＦに溶解し
た。次いで１.７２g(０.０１７モル)トリエチルアミン
を撹拌している反応液に加え、次いで直ちに７mlのＴＨ
Ｆに溶解した２.６g(０.０１８モル)のジメチルクロロ
リン酸エステルを５分かけて添加した。この溶液を７２
時間室温で撹拌した。
【００６５】スラリーを吸引濾過して真空下に濃縮して
乾燥した。固体を１００mlのクロロホルムに溶解し、炭
酸ナトリウム水溶液で３回、飽和塩化ナトリウム水溶液
で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃
縮して乾燥した。収量は１g又は２２％であった。ＨＰ
ＬＣを水からメタノールの１０分直線状プログラムを用
いて実施した。生成物は９６％純粋(面積による)で１
４.１分の保持時間であることが判った。重水素クロロ
ホルム中のＮＭＲは、生成物に対し以下のような予想さ
れたピークを示した: １０hz(６.４Ｈ)の結合定数を伴
う３.９のδ、７.６でのδ、１０及び２hz(９Ｈ)の結合
定数、８.０(１.０Ｈ)での幅の広いピーク及び８.２５
での二重線1０hz(１.０Ｈ)の結合定数。
【００６６】e．２−カルボミル−６−ヒドロキシベン
ゾチアゾールリン酸ジ−(２−アミノ−２−メチル−１,
３−プロパンジオール)塩の合成 １g(０.００３３モル)の２−カルボミル−６−ヒドロキ
シベンゾチアゾールジメチルリン酸エステルを２０mlの
ＴＨＦに溶解した。この溶液に、トリメチルブロモシラ
ン(０.０２６２モル)を加えた。この溶液を反応器バイ
アル中、室温で１２時間シールして保持した。ＨＰＬＣ
により、１２時間後、４％出発材料と２１％モノメチル
リン酸エステルが存在した。別の０.００６６モルのト
リメチルブロモシランを加え、ＨＰＬＣは付加５時間
後、反応が完了していないことを示した。即ち、さらに
０.０１３２モルのトリメチルブロモシランとさらに４
時間を要して反応は完了した。
【００６７】バイアル内容物を、５.９gのＡＭＰＤを含
む３０mlのメタノール中に空けた。溶液は直ちに濁り、
これを１８時間冷凍機に移した。生成物を吸引濾過によ
り集収し、冷メタノールで洗浄し、真空乾燥した。黄色
結晶の収量は０.９８９又は６２％であった。水からメ
タノールへの１０分直線状プログラムを用いるＨＰＬＣ
スキャンは、６.１分に単一ピークを示し、それは９９.
１％(面積パーセントによる)であった。デテリウムオキ
シド中の５００ＭgヘルツＮＭＲスペクトルの構造指示
(structure assingnment)を変えた。表６参照。
【００６８】f．２'−(２−ベンゾチアゾリル)−６'−
ヒドロキシベンゾチアゾールリン酸ビス−(２−アミノ
−２−メチル−１,３−プロパンジオール)塩の合成 ＣＢＴＰ−ビス−ＡＭＰＤ塩、２.０g又は０.００４３
モルを３０mlビーカー内の１０mlの脱イオン水に溶解し
た。２−アミノ−チオフェノール、０.５４g又は０.０
０４３モルを１０mlのメタノールに溶解し、一度に全部
を水溶液に加えた。ビーカーをパラフィルム(parafilm)
で覆い室温で２時間撹拌し、次いで冷却機内で一晩保存
した。
【００６９】固体を翌朝集収して、メタノール及びジエ
チルエーテルですすいだ。これらの粗製結晶を乾燥し
て、ＨＰＬＣにより９６.４％の純度を有する１.１gを
得た。粗生成物を水／メタノール(５０／５０容量)の混
合物で２０時間スラリーとし、次いで真空濾過、水及び
メタノールによるすすぎ並びに真空乾燥により精製し
た。生成物は０.８１gの重さで、１５.３分の保持時間
を有する。ＨＰＬＣ分析(面積パーセント)により９８.
６％であった。プログラムは５分直線状プログラム、０
から１００％溶媒Ｂ、溶液Ａによる開始でメタノールに
よる終了であった。デテリウムオキシド中の５００Ｍg
ヘルツＮＭＲスペクトルは構造を変えた。表７参照。
【００７０】生成物１００gを、１.０mＭ塩化マグネシ
ウムを含む、０.１Ｍ ＡＭＰＯ含有、pＨ１０.０の１０
mlの水溶液に溶解した。この時点で、２５４nm光源を指
した針を、石英ＵＶセルに移した溶液を小部分励起する
のに用いた。溶液は非常にかすかな青色蛍光を示した。
次いで１００ミクロリットルのＡＰ、０.３０ミクロモ
ルを加えた。少量を石英ＵＶセルに加えて、前のように
励起し、非常に明るいオレンジ色蛍光が見られた。次の
朝までに、ＨＰＬＣによって全ＣＢＴＰ−ビス−ＡＭＰ
Ｄが消費され、新しいピークがＨＰＬＣスキャンに形成
したことが示された。このピークは、５００Ｍgヘルツ
ＮＭＲスペクトルにより２'−(２−ベンゾチアゾリル)
−６−ヒドロキシベンゾチアゾール)(ＢＢＴ)と同定さ
れた。表８参照。
【００７１】本発明は、その精神又は本質的特徴を逸脱
しない限り、記載した化合物の類縁体及び誘導体を含
む、他の特異的形態を態様としうる。本態様は、全て例
示として考慮されるべきであって、限定するものではな
い。本発明の範囲は添付した請求の範囲により示され
た。
【００７２】
【表１】
【００７３】
【表２】
【００７４】
【表３】
【００７５】
【表４】
【００７６】
【表５】
【００７７】
【表６】
【００７８】
【表７】
【００７９】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はＣＢＴ、ＡＢＴ及びＢＢＴの構造を示
す。
【図２】 図２は、ＣＢＴＰ、ＡＢＴＰ及びＢＢＴＰの
構造を示す。
【図３】 図３は、ＢＢＴＰを用いてアルカリホスファ
ターゼ(ＡＰ)を測定する場合の一方法を示す図式であ
る。
【図４】 図４は、ＢＢＴＰを用いてアルカリホスファ
ターゼ(ＡＰ)が結合する抗体に相補性の物質を測定する
場合の一方法を示す。抗体／ＡＰコンプレックスは、相
補性(complimentary)分子に結合する。ＡＰはリン酸化
ＢＢＴからリン酸エステル残基を開裂させるように作用
し、これにより蛍光を回復する。従って、蛍光の測定
は、相補性分子の存在及び量を示す。
【図５】 図５は、ＡＰに対するＢＢＴＰの感受性を示
すグラフである。ＢＢＴＰは、３.０mlの容量で、０.３
アトモルのＡＰを測定することを示す。適当な機器を使
用し、細胞容量を１０又は１００μlに減少させ、その
結果、それぞれ０.００１又は０.０１アトモルの投影(p
rojected)感度とする。０．００１アトモルの感度は、
６０分アッセー時間で決定した６００コピーのＡＰを表
す。
【図６】 図６は、３５℃におけるＢＢＴＰの加水分解
速度と対応するバックグラウンド蛍光値の増加を示すグ
ラフである。又、ＡＰの１０aＭ、１００aＭ及び１００
０aＭ溶液とＢＢＴＰとの反応速度を示す。
【図７】 図７は、４℃と３５℃の水溶液中、ＢＢＴＰ
のバックグラウンド蛍光値対時間のグラフである。
【図８】 図８は、４℃と３５℃の水溶液中、ＡＢＴＰ
のバックグラウンド蛍光値対時間のグラフである。
【図９】 図９は、４℃におけるＢＢＴＰとＡＰとの酵
素反応速度対時間のグラフである。
【図１０】 図１０は、４℃におけるＡＢＰＴとＡＰと
の酵素反応速度対時間のグラフである。
【図１１】 図１１は、ＡＢＴの蛍光対濃度を示すグラ
フである。
【図１２】 図１２は、ＢＢＴの蛍光対濃度を示すグラ
フである。
フロントページの続き (72)発明者 ロバート・アール・クレム アメリカ合衆国カリフォルニア93401、サ ン・ルイス・オビスポ、リンダ・レイン67 番 (72)発明者 ウィリアム・ブライアン・マーヴィン アメリカ合衆国カリフォルニア93402、ロ ス・オソス、マウンテン・ビュー1729番

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 【化１】 ［式中、(a)Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3およびＹ4の少なくとも一つ
    は−Ａ−Ｗであり、残りは水素であって、Ａはイオン化
    しうるアニオン基であり、Ｗは蛍光阻止基であり、Ａと
    Ｗは酵素または加水分解により開裂され得る結合を介し
    て連結しており、(b)Ｘは少なくとも２個の原子を有す
    る化学基であって、ベンゾチアゾール環の共鳴を伸長す
    るものである（ただし、Ｘは置換されていることもある
    チアゾリルではない)。］で表され、実質的に非蛍光性
    であって、ＡとＷの間の結合が酵素または加水分解によ
    り開裂されることによって、Ｗが除去された強い蛍光性
    の成績体を与える、化合物。
  2. 【請求項２】 ＡとＷの間の結合が酵素により開裂され
    るものである、請求項１の化合物。
  3. 【請求項３】 酵素がアルカリホスファターゼ、コリン
    エステラーゼ、コレステロールエステラーゼまたはリパ
    ーゼである、請求項２の化合物。
  4. 【請求項４】 酵素がアルカリホスファターゼである、
    請求項３の化合物。
  5. 【請求項５】 −Ａ−ＷがＡとＷの間で開裂されて−Ｏ
    Ｈを与える基である、請求項１〜４のいずれかの化合
    物。
  6. 【請求項６】 −Ａ−Ｗが−Ｏ−Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)2であ
    る、請求項１〜４のいずれかの化合物。
  7. 【請求項７】 Ｙ3が−Ｏ−Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)2であり、
    Ｙ1、Ｙ2およびＹ4がいずれも水素である、請求項１〜
    ４のいずれかの化合物。
  8. 【請求項８】 Ｘがシアノ、カルバモイルまたは２−ベ
    ンゾチアゾリルである、請求項１〜７のいずれかの化合
    物。
  9. 【請求項９】 Ｘが２−ベンゾチアゾリルである、請求
    項８の化合物。
  10. 【請求項１０】 ２−カルバモイル−６−ヒドロキシベ
    ンゾチアゾールリン酸エステル(ＡＢＴＰ)、２'−(２−
    ベンゾチアゾール)−６'−ヒドロキシベンゾチアゾール
    リン酸エステル(ＢＢＴＰ)または２−シアノ−６−ヒド
    ロキシベンゾチアゾールリン酸エステル(ＣＢＴＰ)であ
    る、請求項１の化合物。
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