JPH04500671A - サポート結合オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サポート結合オリゴヌクレオチド 固体サポート結合オリゴヌクレオチドには幾つかの可能な用途がある。これらは 複合ＤＮＡ中の突然変異の存在−例えばヒトにおける疾患遺伝子座の検出に用い ることができる。これらを用いて、複合混合物から特定核酸を選択することがで き、例えば、全細胞群から特定ｍＲＮＡを選択することができる。これらは１９ ８９年５月２日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ８９１００４６０号に述べられて いる発明に有用である。

幾つかの論文が核酸を固体マトリックスに付着させる方法を述べている（１〜６ ）。これらの方法は二つの問題を有している：これらは複雑で、しばしば非効率 的工程を必要とじ：ヌクレオチドは塩基ならびに末端を介して結合する。塩基を 介しての結合はハイブリッド形成反応に結合ポリヌクレオチドを後に用いること を妨げる。

固体サポート付きオリゴヌクレオチドの合成方法は充分に確立されている（７〜 １４）。オリゴヌクレオチドとサポートとの間の結合は塩基中のブロッキング基 を除去するために用いられる最終試薬に対して不安定であるので、プロセスのこ の工程も固体サポートからオリゴヌクレオチド除去する。オリゴヌクレオチドは 安定な結合を用いた場合にサポートに結合して留まると考えられる。スブロート （Ｓｐｒｏａｔ）とブラウン（Ｂ　ｒ　ｏｗｎ）　（１９８５）は、ウレタン結 合が通常のスクシネート結合よりも安定であるが、ウレタン結合が複雑な合成を 必要とし、最終の脱保護工種に対して完全には安定ではないことを示した。

フレア（Ｃｒ　ｅ　ａ）とホーン（Ｈｏｒｎ）（１９８０）は５′　−ヒドロキ シル基を介してセルロースに結合したりボヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレ オチド合成を開始している。生成した鎖の第１残基と第２残基との間の結合は最 終脱保護工程に対して不安定である。

アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ）とベルブ（Ｂｅｒｇ）（１９８５）はオリゴヌクレ オチド合成のプライマーが共有結合したポリマーサポートを述べている、この場 合にプライマーは選択的酸化によって開裂し、オリゴヌクレオチドの他の結合は 酸化されない。

合成が容易であり、標準的な解重合工程に対して完全に安定である、新しい結合 を提供することが、本発明の目的である。

１態様では、本発明はオリゴヌクレオチド合成に適した誘導サポート（ｄｅｒｉ ｖａｔｉｚｅｄ　５ｕｐｐｏｒｔ）の製造方法であって、オリゴヌクレオチド鎖 から保護基を除去するために用いる条件に安定である共有ホスフォジエステル結 合によってヒドロキシル基含有サポートにヌクレオシド試薬を結合させることか ら成る方法を提供する。

他の態様では、本発明は次の工程： （ａ）サポートにヌクレオシドを結合させる工程：（ｂ）サポート付きヌクレオ シド上で保護基含有オリゴヌクレオチド鎖を合成する工程： （Ｃ）オリゴヌクレオチド鎖から保護基を除去する工程から成るサポートに結合 したオリゴヌクレオチドの製造方法であって、サポートがヒドロキシル基を有し 、それによって工程（ａ）ではヌクレオシドがサポートに工程（Ｃ）で用いる条 件に安定な共有ホスフォジエステル結合によって結合することを特徴とする方法 を提供する。

さらに他の態様では、本発明は構造−〇−ＰＹ−〇−（式中、Ｙは保護されたま たは保護されない酸素原子である）で表される共有ホスフォジエステル結合によ ってサポートに結合したヌクレオシドがら成る、オリゴヌクレオチド合成に適し た誘導サポートを提供する。

さらに他の態様では、本発明はオリゴヌクレオチドが末端ホスフェート基を介し て、構造−〇−ＰＯ！−０−　（Ｃ，Ｈ２，）−［ｎは≧３である］で表される 共有ホスフォジエステル結合によってサポートに結合されるサポート結合オリゴ ヌクレオチドを提供する。

本発明にとってサポートの性質は決定的ではない。サポートは塊状または粒状で あり得、例えば誘導／リカゲルまたはケイソウ土−ポリメチルーアクリルアミド 、または制御孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ　ｇｌａｓｓ）、ま たは板ガラス表面であり得る。本質的なことは、サポートが脂肪族ヒドロキシル 基を有することと、これらのヒドロキシル基がヌクレオシド試薬との反応に利用 され得る形状であることである。これらのヒドロキシル基は、例えば制御孔質ガ ラスまたは他のサポートを長鎖アルキルアルコールによって誘導することによっ て形成されるように、ヒドロキシアルキル基の一部を形成することができる。

この代わりに、サポートを長鎖アルキルアミンによって誘導し、アミン基を使用 現場でヒドロキシル基に転化することができる。または、ヒドロキシル基が、固 体サポートを成すかまたは固体サポート上に誘導されるポリマー構遺体の一部で あることも可能である。

ヌクレオシド試薬の性質は本発明にとって決定的ではない。オリゴヌクレオチド 合成に通常用いられる試薬をこの場合にも用いることができる。試薬がホスフォ ールアミシトであることが好ましい（７と８）。試薬と形成される生成物とを次 の反応図式に示す。

この図式では、工はヌクレオシド３°−ホスフィツト試薬を表し、■は誘導サポ ートを表し、■は両者の間の反応によって最初に形成された共有結合を表し、■ は最終生成物を表す。

Ｂは関係するヌクレオシドに適当な塩基を表す。

Ｘは例えばジメトキシトリチル基のようなブロッキング基であり、その性質は本 発明にとって決定的ではない、またはく特に■では）オリゴヌクレオチド鎖を表 す。

Ｙは保護酸素原子であり、一般には例えばメトキシまたはβ−シアノエトキシ４ のようなアルコキシ基である。

Ｚはジー（ＣＩ−Ｃ４アルキル）アミンまたはＣＩまたはテトラゾリルである。

Ｒは脂肪族であり、アルキル基である。

Ｓは固体サポートを表す。

この代わりに、ヌクレオシド３°−試薬はホスフォネートまたは水素ホスフォネ ート（ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）である（１２）、試薬と形 成された生成物を次の反応図式に示す。

この図式では、■はヌクレオシドホスフォネートまたは水素ホスフォネートを表 し、■は誘導体化サポートを表し、■は両者の間に最初に形成された共有結合を 表し、■は最終生成物を表す。

Ｂ、Ｘ、ＲおよびＳは上記で定義した通りである。

Ｑは本発明の付着工程および合成工程に関係しない水素又は有機基である。

この代わりに、ヌクレオシド３゛　−試薬は、Ａがアルキルであり、Ｂ、Ｘおよ びＺが上記で定義した通りである構造式■を有するホスフォーンアミシト（ｐｈ ｏｓｐｈｏｎａｍｉｄｉｔｅ）である。好ましい例では、Ａはメチルであり、Ｚ はジイソプロピルアミンである。

自動的なオリゴヌクレオチド合成装置は画業的に入手可能である。先行技術では 、捷案オリゴヌクレオチド錫の第１ヌクレオチドによって予調導体化された固体 サポートを合成装置に入れることが必要である。本発明は脂肪族ヒドロキシル基 （例えばヒドロキシアルキル基）を有する固体サポートを合成装置に入れること ができる。次に、ヌクレオシド３°　−試薬を合成装置内でｌｊ１ｇオリゴヌク レオチド鎖の第１ヌクレオチドとしてサポートに付着させる。

上記反応図式では、■〜■の転化または■〜■の転化は酸化工程を含む。これは 標準条件下で例えばヨウ素または硫黄を用いて、オリゴヌクレオチド合成の前ま たはより通常にはオリゴヌクレオチド合成の後に実施することができる。

ヌクレオシド３゛　−試薬は固体状態オリゴヌクレオチド合成のためにヌクレオ シド５°−試薬よりも開発されている。それにも拘わらず、ヌクレオシド５“− 試薬は脂肪族ヒドロキシル（例えばヒドロキシアルキル）基を有する共有５゛一 ホスフオジエステル結合を形成し、固体状態オリゴヌクレオチド合成の基礎とし て、正確にそれらの３″一対応物と同様に、役立つと考えられる。本発明はヌク レオシド３°　−試薬の代替物としてヌクレオシド５′−試薬の使用を考える。

この方法の次の工程はサポート付きヌクレオシド上でのオリゴヌクレオチド鎖の 合成を含む。これの実施方法は周知であり、実際に自動ミクロプロセッサー制御 装置を利用して、この仕事を実施することができる。これらの方法は好ましくな い副反応を避けるために保護基の供給を必ず含み、オリゴヌクレオチド合成の最 終工程は保護基の除去を含む。オリゴヌクレオチドの可溶化を予め生ずるのはこ の工程である。この工程は典型的に、例えばチオフェノキシトを用いたホスフォ ジエステル基からのメチル基の除去、例えば高温でのアンモニアを用いたヌクレ オチド塩基のＮ原子からの保護基の除去、例えばジクロロ酢酸によるオリゴヌク レオチド鎖に加えた最後のヌクレオチドの５°−位置からの保護基の除去を含む 。最初のヌクレオシドとサポートとの間の上記共有結合は上記その他の通常の脱 保護工程に対して安定である。

次の例は本発明を説明する。

例１ バロチ＝（Ｂａ１１ｏｔｉｎｉ）ガラスピーズ［２０ｇ、９０〜１３０μｍ直径 、ジエンコンス（Ｊ　ｅｎｃｏｎｓ）］をキシレン（４０ｍｌ）、グリシドキシ プロビルトリメトキシンランおよび痕跡量のジイソプロピルエチルアミンの混合 物中に９０℃において一晩撹拌しながら懸濁させ、次にメタノール、エーテルに よって完全に洗浄し、風乾した。これらの誘導ビーズ（６ｇ）を窟素雰囲気下、 ８０℃において触媒量の濃硫酸を含むヘキサエチレングリコール中で撹拌しなが ら、−晩加熱して、アルキルヒＶロキンル誘導体化ビーズを得た。メタノールと エーテルで洗浄した後に、ビーズを真空下で乾燥し、アルゴン下、−２０℃で貯 蔵した。

少量のヒドロキシアルキル誘導ビーズを、バクテリオファージ　ラムダの左結合 性端邪の配列を合成するようにプログラムした自動オリゴヌクレオチド合成装置 ［アプライド　バイオシステム（Δｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）］の反 応器に入れた。第１ヌクレオチドは、Ｙがβ−シアノエトキシであり、Ｚがジイ ソプロピルアミンである３゛−ホスフォールアミン（１）であった。これは誘導 ビーズに共有結合した。

除去されたトリチル基量をスペクトロフォトメタ−（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏ ｍｅ　ｔ　ｅ　ｒ）中で測定することによって、合成の各工程をモニターするこ とができる。この試験によって、段階的収率は９６〜９９％であった。このよう に、収量と純度の両方は高く、我々の計算によると、ビーズ１４０ｍｇはオリゴ ヌクレオチド４ｎｍｏｌより多くを保持する。

生成物は熱アンモニアによる標準処理によって脱保護し、蒸留水によって完全に 洗浄した。次にこれを３２Ｐによって５゛端部を標識した相補的オリゴヌクレオ チドｃｏｓＬとのハイブリッド形成に用いた。

バクテリオファージλ（ｃｏｓＬ）の左端部による誘導ビーズ１ｍｇに、放射能 標識した（２０μｌの１００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ中の１３，００ ０　ｃ　ｐｍ”Ｐ）相補的オリゴヌクレオチドを加えた。混合物を３０℃におい て２時間インキュベートし、放射性溶液を取り出し、ビーズを水冷却バッフ１− によって完全に洗浄した。ビーズに付着して残留したオリゴヌクレオチド（約３ ゜０００ｃｐｍ、２３％）蒸留水による溶出によって定量的に除去することがで きる。

非相補的オリゴヌクレオチドによる同じ条件下での対照「ハイブリッド形成」は ビーズに対して０，０２％の非特異的結合を示した。

これらの実験は合成が直接的であること、およびビーズがハイブリッド形成に上 首尾に用いられることを示す。

ガラスピーズはカラムに充填して、多くの望ましい性質を有するアフィニテイマ トリックスを形成するために理想的である。

下記第１表は例１に述べた一般的方法によって誘導されたビーズの物理的パラメ ーターを要約する。

ビーズサイズ（ミクロン）　９０〜１３０　３〜６ビ一ズ表面積（ｍｍ２）　０ ．０４５　０．０００１１ビ一ズ体積（ｍｍ”）　９ｘｌＯ”　１．１ｘｌＯ− ７密度（ｇ／ｃｍ’）　２．５　２．　５ビーズの質量（ｍｇ）　０．００２３ 　２．８ｘｌＯ”ビーズ数／ｍｇ　４３５　３．５ｘｌＯ’表面積／ｍｇ　１９ ．　５　３８５ オリゴヌクレオチド負荷／ｍｇ （ｐｍｏ　１）　〜８０　〜８０ オリゴヌクレオチド負荷／ビーズ （ｆｍｏｌ）　１８４　０．０２ 半径の計算値（ミクロン）　６０　３ 髭 ２枚のガラスシートをそれらの間に狭い間隙を保持して一緒にクランプした。

例１と同じ試薬を狭い間隙に注入して、同じ条件下で誘導を実施した。

固体サポートとして誘導ガラスプレートを用いて標準条件下でオリゴヌクレオチ ド合成を手動で実施した。第１ヌクレオチドはトリエチルアンモニウム塩として 用いた３′−水素ホスフェートであつた。オリゴヌクレオチド合成の第１工程と その後の工程の両方の収率と純度は高かった。

次の例は標１！ＤＮＡフラグメントとオリゴヌクレオチドとの誘導ビーズへの／ Ｘイブリッド形成の幾つかの方法を示す。

氾 スティックに付着したガラスピーズへの／％イブリッド形成プラスチックスティ ック２ｃｍ長さを溶融ポリプロピレン中に浸漬してから、誘導体化ガラスピーズ のパイルに接触させて、冷却した。約１００〜２００ビーズがスティックに接着 した。多くの実験が示すように、このビーズ保持方法はハイブリッド形成を非常 に促進する。配列３°　ＡＧＧＴＣＧＣＣＧＣＣＣ５’　によって誘導体化した ガラスピーズ約１００個が付着したスティックを０．１ＭＮａＣ１と、５°端部 において３０．ＯＯＯｃｐｍの活性までに標識した相補的オリゴヌクレオチド８ Ｑｆｍｏｌとを含む溶液３０μｍ中に浸漬した。

３０℃における３０分後に、スティックを管から取り出し、すすぎ洗いし、ステ ィックを５０℃のＯ，ＩＭ　ＮａＣ１中に浸漬することによって結合物質を溶離 した。次に、ハイブリッド化したオリゴヌクレオチド量を測定した。供給オリゴ ヌクレオチドの典型的に４％がこのやり方でピックアップされることができた； ０．１％は非特異的に結合し、除去されなかった。従って、単一ビーズの結合容 量は約０．０３ｆｍｏｌオリゴヌクレオチドである。

温度を低下させ、ハイブリッド形成の長さを高めることによって、初期オリゴヌ クレオチドのより大きな割合をピックアップすることができた。このようにして 、同様な実験では、３０℃での５５分後に５．３％がハイブリッド化され、０． ０５％は非特異的に結合し、３０℃での１６時間後に１３％がハイブリッド化さ れ、０．２％は非特異的に結合した。

対照として、非相補的オリゴヌクレオチド５’　ＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＴ３゜ は１４時間後に０２％の結合を示したにすぎなかった。

要約すると、プラスチックスティックに付着した誘導ガラスピーズによる実験は 非常に容易であり、ビーズに対するハイブリッド形成の高度な特異性を示すこと が実証された。

０．５ｍｌ遠心管内で典型的に１ｍｇのビーズによってハイブリッド化を実施す ることによって、ビーズにハイプリント化する放射性物質量をさらに高め、非特 異的結合を減することができた。ハイブリッド形成後に、管を回転させ、上澄み を除去し、ビーズを洗浄した。Ｔ、、より高温での洗浄はハイブリッドの完全な 溶融を生ずるので、結合物質をセレンコツ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）計測によっテ測 定することができた。このようにし、で、我々はハイブリッド形成速度と溶離速 度の塩濃度と温度への依存性を次の用に測定することができた。

５管の各々に、はぼ同数のビーズと５０μｌの０．　ＩＭ　ＮａＣ１中の相補的 オリゴヌクレオチド（３０，ＯＯＯｅｐｍ）を加えた。ハイブリッド形成を３０ ℃において一晩実施し２、ハイブリッド量を最大にした。溶液を除去し５、ビー ズを氷冷０．ＩＭ　ＮａＣ１で２回洗浄した。容管に対して異なる温度において 徐々に時間を長くして溶離を実施した。各期間後に。、上澄みを除去し、ビーズ を水冷ＮａＣ１溶液（ｉｏｏμｉ、０．　１Ｍ）で２回洗浄し、予熱したＮａＣ ＋（１００μｍ、Ｏ，ｉＭ）で溶離した。

第２表は結合オリゴヌクレオチドの溶離％を経時的に詳述する。溶離速度は温度 に明確に依存する。例えば、６５℃では３０℃における３倍量が５分間内に溶離 した。Ｔ、より充分に低い３０℃においても、無視できない速度であることは意 外ではない。

他の実験では、供給オリゴヌクレオチドのｍ度を５０倍に変化させた。１５ｍ１ 遠心管内でのＯ，ＩＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ中の３０℃、２時間のハイ ブリッド化の後に、上澄みを除去し、０℃、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ＋により３回洗浄 し、ビーズに結合した放射能量をセレンコツ計測によって測定した１、ａ度とハ イブリッド量（すなわち、ハイブリッド形成速度、第３表）との間にはＩＩＲ的 関係があり、このことはハイブリッド形成が疑似１次反応（ｐｓｅｕｃ！ｏ　ｆ ｉｒｓ↑　ｏｒｄｅｒ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）であることを示す。

オリゴヌクレオチドの最高濃度は２０μｌ中の１６０ｆｍｏ］　（１３，０００ Ｃｍｐに相当）であった。０．０３にのみは非特異的に結合し、溶離しなかった さらに、０，０２％のみの非相補的オリゴヌクレオチドが同様な実験においてビ ーズに結合しく６５．０００ｃｐｍ中の１２ｃｐｍ）１．：のことは、ニー　ノ Ｄ　ｈｌ　Ａフラグメント単離方法が非常に特異的であり、明確であることを示 唆している。

第２表 ３０℃　２３　３８　５４　７１　８５　０３６℃　３４　６１　７８　９０　 ９６　３４４℃　４２　５４　６７　８７　９７　２６５℃　７４　８９　９６ 　９８　９８　１．４第３表 ハイブリッド形成速度に対するオリゴヌクレオチド濃度の効果相対濃度　５０　 ２０　１０　２　１ ハイブリッド化％　２３　１４　５．５　０．８　０．６相対速度　３８　２３ 　９　１．５”１長いＤＮＡフラグメントの単離を次の実験で実施した：総λＤ ＮＡ　（制限酵素バッファー１３５μｍ中に５μｇ）を制限エンドヌクレアーゼ Ｈｉｎｆ　１の１５単位によって消化させ、生成した１４３制限フラグメントを ウシ腸ホスファターゼ（１単位）によって脱ホスフォリル化した。３７℃での１ 時間後に、ＥＧＴＡ４μｍを加え、混合物を６５℃でさらに４５分間インキュベ ートし、フェノール抽出し、エタノール沈降させた。

混合物をキナーゼ標識バッファー（１０ｘＰＮＫバツフアー８μＬ　Ｏ，ＬＭＤ ＤＴ１μｍ、ＰＮＫ酵素４μｍ、蒸留水３０μ１１１５μＣｉ　−”Ｐ、　ＡＴ Ｐ）５０μｍ中に溶解し、３７℃において１時間インキュベートし、１００μｍ まで補充し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５カラムを降下させ、非 結合ヌクレオチドを除去した。

バロチニガラスビーズ（１００μｍ１ジエンコンス）のアリフートをバクテリオ ファージλの右結合性端部の配列、すなわち３’　−ＣＣＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡ ５゛によって誘導し、アンモニア中で脱保護し、洗浄し、少量をＵ形毛細管の底 部に入れた。この底部を制御可能な温度ブロック中で４０℃に保持し、毛細管の 上部左アームと右アームにプラスチック注射器のジャケットをかぶせ、それに熱 水を供給することによって、これらのアームを６７℃に維持した。ハイブリッド 形成溶液を加えた（０．ＩＭ　ＮａＣ１，７５μ！、５′端部　１０ｐｒｒ＋ｏ ｌ、ビーズ上のオリゴヌクレオチドに相補的な左λ結合性端部　３３ｆｍｏｌを 含む一１総放射能約７００，０００ｃｐｍ）。

ポンプを毛細管のアー１１の一つに取り付け、それぞれ４０℃と６７℃とに維持 した毛細管の部分の間にハイブリッド形成溶液を前後に循環させた。ビーズに対 する左端部のハイブリッド化は４０℃で生じ、溶液中に再アニールした二つの粘 着性λ端部が６７℃において変性した。

４時間後に、ハイブリッド形成溶液を除去し、ビーズを徹底的に洗浄してから、 熱ＴＥ中に溶離させた。溶液のアリコートをポリアクリルアミドゲル上に入れた 。オートラジオグラフィーは洗液（ｗａｓｈ）中に正確なサイズの１帯のみと溶 離レーン（ｅｌｖｔｉｏｎ　１ａｎｅ）とを明らかにした。左端部の全体で１１ ０００ｃｐが理論量の５％に相当するビーズによって結合された。

要約すると、この実験は長いＤＮＡフラグメントの複合混合物からの高度に特異 的な息離を実証する。

オリゴヌクレオチドを単離し、新規なサポートのハイブリッド形成挙動を調べる ためのもう一つの容易で便利な方法は、カラムクロマトグラフィーによる方法で ある。

ガラス毛細管（直径１．０ｍｍ）の１端を引き伸ばして、非常に狭い先細の開口 を形成した。次にこの開口を他端からの粉砕ガラス粒子の充填とそれらをガラス に粘着させるためのブンゼンバーナーの火炎中での焼結とによって塞いだ。トリ クロロエタン中のシクロロンメチル−シランの溶液に通し、エタノールで洗浄す ることによって、毛細管の内側をシラン化した（ｓ　ｉ　１ａｎｉｓｅｃｉ）。

ガラスピーズ約４０ｍｇをガラスフリット上に！き、カラムの頂部を注入ポンプ によって駆動可能な庄射器に結合すせた。このようにして、放射性ハイブリッド 形成溶液と洗浄溶液とを異なる速度で、典型的には３〜１０μｍ７分の範囲内の 速度でカラムに供給することができた。

典型的な実験では、ＴＥ中０．１ＭＮａｃ１．０．１％ＳＤＳの溶液（ｐＨ７， ５）１ｍｌ中の標識オリゴヌクレオチド０．２μｍｏ］　（３４，ＯＯＯｃｐｍ ）をカラムに３μ】７分の速度で供給した。ジャケット付きカラムを３５℃に維 持した。９０μｍ分画をミクロ遠心管に回収して、放射能量をセレンコツ計測に よって測定した。Ｏ，１Ｍ　ＮａＣ］洗浄溶液を同様にして供給して、回収した 。ジャケット内の温度を高めることによってオリゴヌクレオチドを回収すること ができた。

このようにして、オリゴヌクレオチドの７０％がガラスピーズに結合し、高温に おいて溶離され、０．１％のみの物質がサポートに残留することが判明した。

非相補的オリゴヌクレオチド（位［７において不適合）を用いた対照実験は、３ ５℃での洗浄後に、供給した８０．ＯＯＯｃｐｍ中の４００ｃｐｍが残留するこ とを示した。４０℃では、１４０ｃｐｍ＝Ｑ、２％のみが残留した。

サポート上の接近可能なオリゴヌクレオチドの％を測定した。０．１３ｐｍ。

１キナーゼ標識オリゴヌクレオチドと５μｍｏｌ非標識オリゴヌクレオチドをビ ーズ４０ｍｇに供給した。全体で約３ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドを含む、サ ポートにハイブリッド化した物質の１０％（約５００ｆｍｏｌ）が合成中の脱ト リイル化（ｄｅｔｒｉｙｌａｔ　１ｏｎ）から測定された。

この結果から、サポート上のオリゴヌクレオチドの１／６０００が使用条件（３ ５℃、低塩）下でハイブリッド化し、不適合オリゴヌクレオチドの無視できる結 合が生ずることが算出される。溶融はこの場合にも非常に急激であり、オリゴ・ ヌクレオチドの大部分は４８℃における二つの９０μｍ分画中に溶離した。

これらの実験は誘導ビーズが核酸のクロマトグラフィー分離に有用であることを 示唆する。

参考文献 １、ラングダール　フレイ　エイ（Ｌａｎｇｄａ　１　ｅ　Ｊ　Ａ）とマルコル ムエ・イ　ディ　（Ｍａｌｃｃｌｍ　Ａ　Ｄ）（１９８５）ｒセファクリルに結 合したＤＮＡを用いた迅速遺伝子検出方法（Ａ　ｒａｐｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏ ｆ　ｇｅｎｅ　ｄｅｔｅ：ｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ＤＮＡ　ｂｏｕｎｄ　ｔｏ　 ５ｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｊ、ジーン（Ｇｅｎｅ）１９８５．３６　（３Ｌ　２０１ 〜２１０２、シード　ビー（Ｓ　ｅ　ｅ　ｄ　Ｂ）　（１９８２）「核酸の結合 とハイブリッド形成のためのジアゾ化可能なアニルアミン　セルロース　ペーパ ー（Ｄｊ、ａｚｏｔｉｚａｂｌｅ　ａｎｙｌａｍｉｎｅ　ｃｅｌｌ。

ｓｅ　ｐａｐｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｉｄ ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）Ｊ、ヌクル、アシトスレ ス、（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１０．１７９９〜１８１０゜３　アル フレイ（Ａｌｌｆｒｅｖ）とイノウニ（Ｔｎｏｕｅ）（１９７８）「固体４サポ ートに共有結合したＤＮＡ上のＤＮＡ結合蛋白質のアフィニティクロマトグラフ ィ−（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏｆ　ＤＮＡ−ｂｉ ｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔａｉｎｓ　ｏｎ　ＤＮＡ　ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　ａｔｔ ａｃｈｅｄ　ｔｏ　５ｏｌｉｄ　５ｕｐｐｏｒｔｓ）Ｊ、メソッドスセル　パイ オル（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）１７．２５３−２７０゜ ４．７ネマン　エッチ（Ｂａｎｅｍａｎｎ　Ｈ）；ベストホー、７　ビー（Ｗｅ ｓｔｈｏｆｆ　Ｐ）およびヘルマン　ｌ−’−（Ｈｅｒｒｍａｎｎ　Ｇ）（１９ ８２）「マクロ孔質サポートへの変性ＤＮＡ固定：１　種々の結合方法の効率（ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ＤＮＡ　ｔｏ　Ｍ ａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　５ｕｐｐｏｒｔｓ：Ｉ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　 ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ｊヌクル、ア シトスレス、１０．７１６３〜７１８０゜ ５、アステル　ンー　アール（Ａｓｔｅｌｌ　ＣＲ）とスミス　エム（Ｓｍ　］ ｔｈ　Ｍ）（１９７２） 「オリゴヌクレオチド−セルロースカラムの合成と性賀（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａ ｎｄ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｃｅ１ １ｕｌｏｓｅ　Ｃｏｌｕｍｎｓ）Ｊバイオケミストリー（ＢｉｏｃｈｅｍｉｓＳ 号、１９６８．２８０９〜１３゜ ７、マトイッチ　エム　ディ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｊ　Ｍ　Ｄ）とカルーサースエ ム　エッチ（Ｃａｒｕｔｂｅｒｓ　Ｍ　Ｈ）、ジェイ、アム、ケム、ツク、（Ｊ 、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）、１９８１．１０３．３１８５〜３１９１゜ ８、ビューケイジ　ニス　エル（ｂ　ｅ　ａ　ｕ　ｃ　ａ　ｇ　ｅ　Ｓ　Ｌ）と カルーサースエム　エッチ テトラヘドロン　レタース（Ｔｅｔ、ｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）２２ 巻、２０号、１８５９〜１８６２゜ ９、アダニス　ニス　ビー（Ａｄａｍｓ　Ｓ　Ｐ）等、フレイ　アム、ケム、ツ ク、１９８３．１０５．６６１〜６６３゜１０、スブロート　ディ　ニス（Ｓ’ ｐｒｏａｔ　Ｄ　Ｓ）とブラウン　ディ　エム（Ｂｒｏｗｎ　Ｄ　Ｍ） ニュークレイツク　アシトス　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ）１３巻、８号、１９８５．２９７９〜２９８７゜１１、フレア　ア ール（Ｃｒ　ｅ　ａ　Ｒ）とホーン　ティ（Ｈｏｒｎ　Ｔ）、二ニークレイツク 　アシトス　リサーチ、８巻、１０号、１９８０．２３３１〜４８゜ １２、アンドルース　エイ（Ａｎｄｒｕｓ　Ａ）等、テトラヘドロン　レタース ２９巻、８号、８６１〜４頁、１９８８゜１３、アプライド　バイオシステニス 　ユーザー　ブレティン（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｓｅｒ　Ｂ ｕｌｌｅｔｉｎ）、４３号、１９８７年１０月１日発行、［メチルホスフオンア ミジト試薬と、ＤＮＡのメチルホスフォオート同族体の合成と精製（Ｍｅｔｈｙ ｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄｉｔｅｒｅａｇｅｎｔｓ　ａｎｃｌ　ｔｈｅ　５ ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔｈｙｌ　 ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ　ａｎａｌｏｇｓ　ｏｆ　ＤＮＡ）Ｊ。

１４、ミラー　ビー　ニス（ｌｖＮｌｌｅｒ　Ｐ　Ｓ）等、二ニークレイツク　 アシトス　リサーチ、１１巻、６２２５〜６２４２頁、１９８３゜１５．７−ノ ルド　エル　フレイ（Ａｒｎｏｌｄ　Ｌ　Ｊ）とベルブ　アールビー（Ｂｅｒｇ 　ＲＰ）、モレキュラー　バイオシステムス社（ＭｏｌｅｃｕＪａｒ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、）、ＰＣＴ出願第ＷＯ３５１０１０５１号。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　３年　３月２２う佼

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．オリゴヌクレオチド合成に適した誘導サボートの製造方法であって、ヒドロ キシル基含有サボートにヌクレオシド試薬を、オリゴヌクレオチド鎖から保護基 の除去に用いる条件に安定な共有ホスフォジエステル結合によって結合させるこ とから成る方法。
2. ２．、次の工程： （ａ）サボートにヌクレオシドを結合させる工程；（ｂ）サボート付きヌクレオ シド上で保護基含有オリゴヌクレオチド鎖を合成する工程； （ｃ）オリゴヌクレオチド鎖から保護基を除去する工程から成るサボートに結合 したオリゴヌクレオチドの製造方法であって、サボートがヒドロキシル基を有し 、それによって工程（ａ）においてヌクレオシドがサボートに工程（ｃ）で用い る条件に安定な共有ホスフォジエステル結合によって結合することを特徴とする 方法。
3. ３．サボートが孔質ガラスまたはガラスビーズである請求項１または２に記載の 方法。
4. ４．サボートがヒドロキシアルキル基を含有する請求項１〜３のいずれかに記載 の方法。
5. ５．ヌクレオシド試薬がヌクレオシド３′−ホスフォールアミジトである請求項 １〜４の何れかに記載の方法。
6. ６．ヌクレオシド試薬がヌクレオシド３′−ホスフィットである請求項１〜４の 何れかに記載の方法。
7. ７．ヌクレオシド試薬がヌクレオシド３′−水素ホスフォネートである請求項１ 〜４の何れかに記載の方法。
8. ８．ヌクレオシド試薬がヌクレオシド３′−メチルホスフォンアミジトである請 求項１〜４の何れかに記載の方法。
9. ９．工程Ｃにおいてホスフォトリエステル基から、ヌクレオチド塩基のＮ原子か らおよび鎖の最後のヌクレオチドの５′位置から保護基を除去する請求項２〜８ のいずれかに記載の方法。
10. １０．構造式−Ｏ−ＰＹ−Ｏ−（式中、Ｙは保護されたまたは保護されない酸素 原子である）で表される共有ホスフォジエステル結合によってサボートに結合し たヌクレオシドを含む、オリゴヌクレオチド合成に適した誘導サボート。
11. １１．サボートが孔質ガラスまたはガラスビーズである請求項１０に記載の方法 。
12. １２．オリゴヌクレオチドが末端ホスフォネート基を介して構造式：−Ｏ−ＰＯ ２−Ｏ−（ＣｎＨ２ｎ）−（式中、ｎは＞３である）によって表される共有ホス フォジエステル結合によってサボートに結合するサボート結合オリゴヌクレオチ ド。
13. １３．サボートが孔質ガラスまたはガラスビーズである請求項１２に記載のサボ ート結合オリゴヌクレオチド。