JPH01165370A - 免疫活性ポリペプチド及びその製法 - Google Patents
免疫活性ポリペプチド及びその製法Info
- Publication number
- JPH01165370A JPH01165370A JP63276322A JP27632288A JPH01165370A JP H01165370 A JPH01165370 A JP H01165370A JP 63276322 A JP63276322 A JP 63276322A JP 27632288 A JP27632288 A JP 27632288A JP H01165370 A JPH01165370 A JP H01165370A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- immunoactive
- subunit
- glycine
- polypeptide
- polypeptide according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
る毒性のない又は毒性が低減された免疫活性ポリベブチ
ドに係る。
ドに係る。
さらに、本発明は、該ポリペプチドの製法及び該ポリペ
プチドの少なくともｌを治療上の有効量で含有してなる
抗百日咳ワクチンにも係る。
プチドの少なくともｌを治療上の有効量で含有してなる
抗百日咳ワクチンにも係る。
百日咳は、桿菌である百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｉｓ）によって起る呼吸器系の病気であり
、カタル期又は発作の間に、呼吸器系を介して、患者か
ら罹患し易い健康者に伝染する。
ｐｅｒｔｕｓｉｓ）によって起る呼吸器系の病気であり
、カタル期又は発作の間に、呼吸器系を介して、患者か
ら罹患し易い健康者に伝染する。
百日咳は痙幸、大脳障害を生ずることがあり、時には、
特に幼児及び母性の抗百日咳抗体が欠けた新生児では死
亡する場合があるため、このような病気に対して有効な
ワクチンが望まれている。
特に幼児及び母性の抗百日咳抗体が欠けた新生児では死
亡する場合があるため、このような病気に対して有効な
ワクチンが望まれている。
現在では、マーシオレートで殺菌し、５６℃で処理した
病原菌を含有する抗百日咳ワクチンが使用されているが
、この場合、たとえ永久免疫を与えることができるとし
ても、望ましくない副作用があること又はその調製及び
精製に由来する問題があること等のため、完全には満足
できるものではい。
病原菌を含有する抗百日咳ワクチンが使用されているが
、この場合、たとえ永久免疫を与えることができるとし
ても、望ましくない副作用があること又はその調製及び
精製に由来する問題があること等のため、完全には満足
できるものではい。
かかる理由から、欠点のない抗百日咳ワクチンの調製が
熱望されている。
熱望されている。
百日咳菌は、それ自体、毒性を有しておらず、その毒性
は、第１期（毒性期）の間における各種物質、すなわち
溶血素（ＩＩＩｓ）、アデニルサイクラーゼ（Ａｄｃ）
、皮膚壊死毒素（Ｄｎｃ）、線維性血球凝集素（Ｆｈａ
）及び百日咳毒素（ＰＴ）の合成に相関することが知ら
れている。特にＰＴは、百日咳菌によって生ずる主な毒
性ファクターである ［Ｗｅｉｓｓ Ａ、らｒｌｎｆｅ
ｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、Ｊ ４２．３３１−４１（１９８３
） ： Ｗｅｉｓｓ＾。
は、第１期（毒性期）の間における各種物質、すなわち
溶血素（ＩＩＩｓ）、アデニルサイクラーゼ（Ａｄｃ）
、皮膚壊死毒素（Ｄｎｃ）、線維性血球凝集素（Ｆｈａ
）及び百日咳毒素（ＰＴ）の合成に相関することが知ら
れている。特にＰＴは、百日咳菌によって生ずる主な毒
性ファクターである ［Ｗｅｉｓｓ Ａ、らｒｌｎｆｅ
ｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、Ｊ ４２．３３１−４１（１９８３
） ： Ｗｅｉｓｓ＾。
らｒＪ、 Ｉｎｆ、 Ｄｉｓ、Ｊ １５０．２１９−２
２２（１９８４）］だけでなく、該細菌によって生ずる
感染に対する主な保護抗原の１つでもある。
２２（１９８４）］だけでなく、該細菌によって生ずる
感染に対する主な保護抗原の１つでもある。
事実、菌体ワクチンによって免疫された者では抗ＰＴ抗
体が見出され［Ａｓｈｗｏｒｔｈ Ｌ、Ａ、ＥらｒＬａ
ｎｃｅｔＪｉｏ月号、 ８７ｇ−８８１（１９８３）］
、ホルムアルデヒドにより無毒化したＰＴを使用し、エ
ーロゾルを介して又は小脳を経由して感染させたマウス
では保護免疫が獲得されている［５ａｔｏ Ｙ、らｒｌ
ｎｆ、 ａｎｄ １ｍｍ、Ｊ４１、３１３（１９８３）
］。百日咳毒素が新たな抗百日咳ワクチンの調製におけ
る必須の成分ではあっても、その使用は、毒性に関連す
る多くの欠点によって制限される。
体が見出され［Ａｓｈｗｏｒｔｈ Ｌ、Ａ、ＥらｒＬａ
ｎｃｅｔＪｉｏ月号、 ８７ｇ−８８１（１９８３）］
、ホルムアルデヒドにより無毒化したＰＴを使用し、エ
ーロゾルを介して又は小脳を経由して感染させたマウス
では保護免疫が獲得されている［５ａｔｏ Ｙ、らｒｌ
ｎｆ、 ａｎｄ １ｍｍ、Ｊ４１、３１３（１９８３）
］。百日咳毒素が新たな抗百日咳ワクチンの調製におけ
る必須の成分ではあっても、その使用は、毒性に関連す
る多くの欠点によって制限される。
実際問題として、ＰＴは、リンパ球増加、ヒスタミン感
受性、低血糖、エピネフリンの血糖上昇効果に対する不
応性及びランゲルハンス島の活性化の如き望ましくない
病態生理学上の効果を誘発する。
受性、低血糖、エピネフリンの血糖上昇効果に対する不
応性及びランゲルハンス島の活性化の如き望ましくない
病態生理学上の効果を誘発する。
さらに、現在使用されているワクチンにおけるＰＴの存
在は、発熱、水泡、神経系の変調及び死亡等の副作用の
主原因であり、このため、最近ではワクチンの使用が激
減し、新たな百日咳の流行を招いている。
在は、発熱、水泡、神経系の変調及び死亡等の副作用の
主原因であり、このため、最近ではワクチンの使用が激
減し、新たな百日咳の流行を招いている。
ホルムアルデヒドによるＰＴの無毒化処理では、毒性の
ない免疫原性タンパク質が得られる（Ｓａｔ。
ない免疫原性タンパク質が得られる（Ｓａｔ。
らの上記文献参照）が、該タンパク質は純粋、再現性か
つ安定な形では得られないことによるいくつかの欠点が
ある。
つ安定な形では得られないことによるいくつかの欠点が
ある。
発明者らは、従来法の欠点を解消できると共に、簡単か
つ経済的に実施可能な方法によって純粋なものとして得
られるポリペプチドを見出し、本発明に従った。従って
、本発明の目的は、抗百日咳ワクチンの調製に使用され
る毒性のない又は毒性が低減された免疫活性ポリペプチ
ドにある。
つ経済的に実施可能な方法によって純粋なものとして得
られるポリペプチドを見出し、本発明に従った。従って
、本発明の目的は、抗百日咳ワクチンの調製に使用され
る毒性のない又は毒性が低減された免疫活性ポリペプチ
ドにある。
本発明の他の目的は、該ポリペプチドの製法にある。
本発明のさらに他の目的は、該ポリペプチドの少なくと
もｌを治療上の有効量で含有してなるワクチンにある。
もｌを治療上の有効量で含有してなるワクチンにある。
本発明の他の目的は、以下の記載及び実施例から明らか
になるであろう。
になるであろう。
百日咳毒素は５つの異なるサブユニットを含有するタン
パク質であり、その毒性は、真核生物の細胞膜を介して
のメツセージの伝達に関与するＧＴＰと結合するタンパ
ク質のＡ叶−リポリシレージョン（ｒｉｂｏｓｆｌａｔ
ｉｏｎ）による。該ＰＴは異なる官能性を有する２つの
フラクションを含有する。その１つ（Ａ）はサブユニッ
トＳ１を含有し、他方（Ｂ）は相互にサブユニットＳ５
によって結合された２つのダイマー Ｄｉ（Ｓ２＋３４
）及びＤ２（Ｓ３＋ ３４）内に位置するサブユニット
Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４及びＳ５を含有する。
パク質であり、その毒性は、真核生物の細胞膜を介して
のメツセージの伝達に関与するＧＴＰと結合するタンパ
ク質のＡ叶−リポリシレージョン（ｒｉｂｏｓｆｌａｔ
ｉｏｎ）による。該ＰＴは異なる官能性を有する２つの
フラクションを含有する。その１つ（Ａ）はサブユニッ
トＳ１を含有し、他方（Ｂ）は相互にサブユニットＳ５
によって結合された２つのダイマー Ｄｉ（Ｓ２＋３４
）及びＤ２（Ｓ３＋ ３４）内に位置するサブユニット
Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４及びＳ５を含有する。
フラクションＡは酵素的に活性な部分、すなわちＰＴの
有毒性部分を代表するものであり、一方、フラクション
Ｂは真核生物細胞膜リセプターに結合され、その中にサ
ブユニットＳ１を導入し得る。
有毒性部分を代表するものであり、一方、フラクション
Ｂは真核生物細胞膜リセプターに結合され、その中にサ
ブユニットＳ１を導入し得る。
特開昭６２−２２８２８６号には、該サブユニットをコ
ードづけする遺伝子のクローニング、シーケンス及び発
現が開示されており、この遺伝子が主オペロンに分類さ
れることが記載されている。
ードづけする遺伝子のクローニング、シーケンス及び発
現が開示されており、この遺伝子が主オペロンに分類さ
れることが記載されている。
さらに、サブユニットＳ１のＡ叶−リボシレーション活
性は、ハイブリッドプラスミドＰＴＥ２２５によって形
質転換された微生物を培養することによって測定されて
おり、このサブユニットがＰＴに匹敵する酵素活性を有
することが知られている。
性は、ハイブリッドプラスミドＰＴＥ２２５によって形
質転換された微生物を培養することによって測定されて
おり、このサブユニットがＰＴに匹敵する酵素活性を有
することが知られている。
従って、百日咳毒素の免疫特性及び保護特性を有するが
、無毒性又は毒性が低減されているタンパク質を得るた
めに、該タンパク質の酵素活性に関する位置及び基礎と
なるアミノ酸を確認した。
、無毒性又は毒性が低減されているタンパク質を得るた
めに、該タンパク質の酵素活性に関する位置及び基礎と
なるアミノ酸を確認した。
特に、下記の位置及びアミノ酸であることが判明した：
８位チロシン、９位アルギニン、５０位フェニルアラ
ニン、５３位トレオニン、１２９位グルタミン酸、１２
１位グリンン、１２４位アラニン、１０９位アスパラギ
ン酸、９９位グリシン、１３５位アルギニン、１５９位
トレオニン及び１１１位チロシン。
８位チロシン、９位アルギニン、５０位フェニルアラ
ニン、５３位トレオニン、１２９位グルタミン酸、１２
１位グリンン、１２４位アラニン、１０９位アスパラギ
ン酸、９９位グリシン、１３５位アルギニン、１５９位
トレオニン及び１１１位チロシン。
これらアミノ酸の１又はそれ以上を異種の各種アミノ酸
で置換することにより、異った毒性のタンパク質が得ら
れることを見出し、本発明に至った。
で置換することにより、異った毒性のタンパク質が得ら
れることを見出し、本発明に至った。
本発明によれば、アミノ酸ｌから８０までの３１領域に
おける！又はそれ以上の部位で、アミノ酸を、免疫特性
を変質させることなくその酵素活性を破壊又は低減させ
得る他のアミノ酸で直接変異誘発置換することによって
変性せしめた百日咳毒素のサブユニットＳ１を含有する
ポリペプチドが合成される。
おける！又はそれ以上の部位で、アミノ酸を、免疫特性
を変質させることなくその酵素活性を破壊又は低減させ
得る他のアミノ酸で直接変異誘発置換することによって
変性せしめた百日咳毒素のサブユニットＳ１を含有する
ポリペプチドが合成される。
特に、かかる合成ポリペプチドとしては、下記の如き置
換することによって変性せしめた百日咳毒素のサブユニ
ットＳ１を含有するものである。
換することによって変性せしめた百日咳毒素のサブユニ
ットＳ１を含有するものである。
−８位チロシン及び９位アルギニンが、それぞれアスパ
ラギン酸及びグリシンによって置換されたもの ＝５０位フェニルアラニン及び５３位トレオニンが、そ
れぞれグルタミン酸及びイソロイシンで置換されたもの 一１２９位グルタミン酸がグリシンで置換されたもの 一１２１位グリシンがグルタミン酸で置換されたもの ＝１２４位アラニンがアスパラギン酸で置換されたもの −１０９位アスパラギン酸及び１２４位アラニンが、そ
れぞれグリシン及びアスパラギン酸で置換されたもの 一９９位グリシンがグルタミン酸で置換されたもの −１０９位アスパラギン酸がグリシンで置換されたもの 一１３５位アルギニンがグルタミン酸で置換されたもの ＝１５９位トレオニンかりシンで置換されたもの一１１
１位チロシンがグリシンで置換され、かつ１１３位にア
ミノ酸Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙが挿入されたも
の 特に、本発明によるポリペプチドは、 ａ） ＤＮＡ分子の１又はそれ以上の位置において、所
定のアミノ酸をコードづけする塩基配列を所望のアミノ
酸をコードづけする塩基配列で置換することによって抗
百日咳毒素のサブユニットＳ１をコードづけする遺伝子
を直接変異誘発により変性させ、 ｂ）該変性サブユニットＳ１をコードづけする遺伝子を
含有するＤＮＡフラグメントをクローニングベクターに
結合させてハイブリッドプラスミドを構成し、 Ｃ）前記工程ｂ）で得られたハイブリッドプラスミドに
よって宿主微生物を形質転換させ、ｄ）炭素源、窒素源
及び無機塩の存在下、適切な培地中で形質転換微生物を
培養し、 ｅ）培地又は菌体から、変性サブユニットＳ１を含有す
るポリペプチドを採取すること からなる方法によって調製される。
ラギン酸及びグリシンによって置換されたもの ＝５０位フェニルアラニン及び５３位トレオニンが、そ
れぞれグルタミン酸及びイソロイシンで置換されたもの 一１２９位グルタミン酸がグリシンで置換されたもの 一１２１位グリシンがグルタミン酸で置換されたもの ＝１２４位アラニンがアスパラギン酸で置換されたもの −１０９位アスパラギン酸及び１２４位アラニンが、そ
れぞれグリシン及びアスパラギン酸で置換されたもの 一９９位グリシンがグルタミン酸で置換されたもの −１０９位アスパラギン酸がグリシンで置換されたもの 一１３５位アルギニンがグルタミン酸で置換されたもの ＝１５９位トレオニンかりシンで置換されたもの一１１
１位チロシンがグリシンで置換され、かつ１１３位にア
ミノ酸Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙが挿入されたも
の 特に、本発明によるポリペプチドは、 ａ） ＤＮＡ分子の１又はそれ以上の位置において、所
定のアミノ酸をコードづけする塩基配列を所望のアミノ
酸をコードづけする塩基配列で置換することによって抗
百日咳毒素のサブユニットＳ１をコードづけする遺伝子
を直接変異誘発により変性させ、 ｂ）該変性サブユニットＳ１をコードづけする遺伝子を
含有するＤＮＡフラグメントをクローニングベクターに
結合させてハイブリッドプラスミドを構成し、 Ｃ）前記工程ｂ）で得られたハイブリッドプラスミドに
よって宿主微生物を形質転換させ、ｄ）炭素源、窒素源
及び無機塩の存在下、適切な培地中で形質転換微生物を
培養し、 ｅ）培地又は菌体から、変性サブユニットＳ１を含有す
るポリペプチドを採取すること からなる方法によって調製される。
本発明に従い、タンパク質の酵素活性に関連するＳｌの
アミノ酸領域を確認するため、Ｓｌをコードづけする遺
伝子を制限酵素（異なる部位で切断する）で処理した。
アミノ酸領域を確認するため、Ｓｌをコードづけする遺
伝子を制限酵素（異なる部位で切断する）で処理した。
得られたＤＮＡフラグメント（異なる長さの３′及び１
５′末端配列が欠けている）を、公知の一般的方法に従
って操作して、発現プラスミド内でクローン化させた。
５′末端配列が欠けている）を、公知の一般的方法に従
って操作して、発現プラスミド内でクローン化させた。
ついで、削除された配列のＤＮＡフラグメントを含有す
るベクターを使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）の形質転換を行った。
るベクターを使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）の形質転換を行った。
選択培地で菌体をスクリーニングすることによって得ら
れた陽性の形質転換体を、適切な培地中、温度３０℃な
いし４０℃で２０分間ないし５時間培養した。
れた陽性の形質転換体を、適切な培地中、温度３０℃な
いし４０℃で２０分間ないし５時間培養した。
この時間の経過後、培地から菌体を回収し、リゾチーム
処理及び音波処理によって溶菌せしめた。
処理及び音波処理によって溶菌せしめた。
このようにして抽出したタンパク質について酵素活性を
測定するため分析に供した。
測定するため分析に供した。
このタンパク質のＡＤＰ−リボシレージョン活性を、Ｍ
ａｎｎｉｎｇらによる方法［「ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
）ｊ世、 ７４９−７５６ （１９８４）］に従って操
作してテストした。
ａｎｎｉｎｇらによる方法［「ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
）ｊ世、 ７４９−７５６ （１９８４）］に従って操
作してテストした。
得られた結果（後述の実施例２の第１表に示す）は、１
７９位のアミノ酸に続＜８１配列は、初めのアミノ酸１
０個とは異なり、ＡＤＰ−リボシレージョンには必要で
ないことを示した。
７９位のアミノ酸に続＜８１配列は、初めのアミノ酸１
０個とは異なり、ＡＤＰ−リボシレージョンには必要で
ないことを示した。
従って、サブユニットＳｌの酵素的に活性な領域はアミ
ノ酸ｌから１８０までで構成される。
ノ酸ｌから１８０までで構成される。
本発明によれば、この領域に存在する活性部位の同定を
行ったところ、これら部位の少なくとも１つが変換され
ていた。
行ったところ、これら部位の少なくとも１つが変換され
ていた。
実際問題として、Ｓｌをコードづけする遺伝子はプラス
ミドＰＴＥ２５５から単離されており、その構造は制限
酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌｌＩでの消化によって明ら
かにされ、特開昭６２−２２８２８６号に報告されてい
る。
ミドＰＴＥ２５５から単離されており、その構造は制限
酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌｌＩでの消化によって明ら
かにされ、特開昭６２−２２８２８６号に報告されてい
る。
Ｓｌをコードづけする遺伝子を含有する６００塩基対（
ｂｐ）のＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動によって消
化混合物から分離し、電気溶出した後、直接変異誘発に
よって変性して、インビトロにおいて、ＤＮＡ分子の所
定部位で変異を生じさせ、該変異の効果をインビトロ又
はインビボでテストした。
ｂｐ）のＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動によって消
化混合物から分離し、電気溶出した後、直接変異誘発に
よって変性して、インビトロにおいて、ＤＮＡ分子の所
定部位で変異を生じさせ、該変異の効果をインビトロ又
はインビボでテストした。
この方法による所望塩基の置換は、下記の手法の１つに
従って実施される。
従って実施される。
−ＤＮＡにおける所定部位で塩基類似体を取込ませるこ
と −誤った方式でヌクレオチドを取込ませること一限定さ
れた配列を有するオリゴヌクレオチドのインビトロでの
合成の間に変異を生じさせること −ＤＮＡの塩基と反応する化学的変異誘発物質（たとえ
ば亜硫酸水素ナトリウム）を使用すること 本発明では、Ｓｌをコードづけする遺伝子を、Ｚｏｌｌ
ｅｒ Ｍ、Ｊ、らの方法［ｒＤＮＡＪ ３．４７９−４
８８（１９８４）］に従って操作して、限定された配列
を有する合成オリゴヌクレオチドを使用して変性させた
。
と −誤った方式でヌクレオチドを取込ませること一限定さ
れた配列を有するオリゴヌクレオチドのインビトロでの
合成の間に変異を生じさせること −ＤＮＡの塩基と反応する化学的変異誘発物質（たとえ
ば亜硫酸水素ナトリウム）を使用すること 本発明では、Ｓｌをコードづけする遺伝子を、Ｚｏｌｌ
ｅｒ Ｍ、Ｊ、らの方法［ｒＤＮＡＪ ３．４７９−４
８８（１９８４）］に従って操作して、限定された配列
を有する合成オリゴヌクレオチドを使用して変性させた
。
実施にあたり、６００ｂｐのＤＮＡフラグメントをベク
ターでクローン化し、該ＤＮＡのシングルら線クローン
フラグメントを単離した。この目的に適するベクターは
、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）、ｐＥＭＢＬ ［Ｄｅｎｔｅら［ヌクレイツク・ア
シッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）Ｊ １１．１６４５−１６５５ （１９
８３）］又はＭ１３ファージ［Ｖｉｅｒａ及びＭｅｓｓ
ｉｎｇ ｒジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ １９．２６３ （１
９８２）］から選ばれる。本発明では、市販の旧ｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＳＫベクターを使用した。
ターでクローン化し、該ＤＮＡのシングルら線クローン
フラグメントを単離した。この目的に適するベクターは
、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）、ｐＥＭＢＬ ［Ｄｅｎｔｅら［ヌクレイツク・ア
シッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）Ｊ １１．１６４５−１６５５ （１９
８３）］又はＭ１３ファージ［Ｖｉｅｒａ及びＭｅｓｓ
ｉｎｇ ｒジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ １９．２６３ （１
９８２）］から選ばれる。本発明では、市販の旧ｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＳＫベクターを使用した。
該ベクターを好適な制限酵素で処理し、ついで、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの存在下、リガーゼ混合物中の６００ｂ
ｐ ＤＮＡフラグメントに結合させた。
ＤＮＡリガーゼの存在下、リガーゼ混合物中の６００ｂ
ｐ ＤＮＡフラグメントに結合させた。
得られた混合物を使用して大腸菌の形質転換を行い、ア
ンピシリンを含有する培地上で形質転換体を選別した。
ンピシリンを含有する培地上で形質転換体を選別した。
ベクター及び６００ｂｐ ＤＮＡフラグメントを包含す
るハイブリッドプラスミドを含有する陽性のクローンを
、ファージが存在する液状媒体に懸濁化させ、温度３０
ないし４０℃に２ないし１０時間維持した。
るハイブリッドプラスミドを含有する陽性のクローンを
、ファージが存在する液状媒体に懸濁化させ、温度３０
ないし４０℃に２ないし１０時間維持した。
この時間の経過後、ファージを沈殿させ、遠沈によって
溶液から分離し、ｐＨ７，５の緩衝液中に再度悲劇化さ
せ、水−エチルエーテル飽和フェノールで抽出し、つい
でエタノール及び酢酸アンモニウムで抽出してシングル
ら線ＤＮＡを沈殿させた。
溶液から分離し、ｐＨ７，５の緩衝液中に再度悲劇化さ
せ、水−エチルエーテル飽和フェノールで抽出し、つい
でエタノール及び酢酸アンモニウムで抽出してシングル
ら線ＤＮＡを沈殿させた。
ついで、このＤＮＡの一定量を使用し、直接変異誘発に
よって８１を変性させた。この目的のため、１−１８０
３１領域の所定部位に存在するｌ又はそれ以上のアミノ
酸をコードづけする塩基を、異なるアミノ酸をコードづ
けする他の塩基で置換するヌクレオチド約２０でなるオ
リゴヌクレオチドを合成させた。特に、Ｓｌをコードづ
けする遺伝子の下記変異体を調製し得るオリゴヌクレオ
チドを合成した。
よって８１を変性させた。この目的のため、１−１８０
３１領域の所定部位に存在するｌ又はそれ以上のアミノ
酸をコードづけする塩基を、異なるアミノ酸をコードづ
けする他の塩基で置換するヌクレオチド約２０でなるオ
リゴヌクレオチドを合成させた。特に、Ｓｌをコードづ
けする遺伝子の下記変異体を調製し得るオリゴヌクレオ
チドを合成した。
４１ニブライマーＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＴＣＴＡＣＧＧ
Ｔを使用して、チロシン（８）及びアルギニン（９）を
それぞれアスパラギン酸及びグリシンに置換させた。
Ｔを使用して、チロシン（８）及びアルギニン（９）を
それぞれアスパラギン酸及びグリシンに置換させた。
相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
６２０−ＣＧＣＣＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＡ
ＣＴＣＣＣＧＣＣＣＧ−６５０から６２０−ＣＧＣＣＡ
ＣＣＧＴＡＧＡＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＣＣＣＧＣＣＣ
Ｇ−６５０に変化した。
６２０−ＣＧＣＣＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＡ
ＣＴＣＣＣＧＣＣＣＧ−６５０から６２０−ＣＧＣＣＡ
ＣＣＧＴＡＧＡＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＣＣＣＧＣＣＣ
Ｇ−６５０に変化した。
２２ニブライマーＴＧＧＡＧＡＣＧＴＣＡＧＣＧＣＴＧ
Ｔを使用して、フェニルアラニン（５０）及びトレオニ
ン（５３）をそれぞれグルタミン酸及びイソロイシンに
置換させた。相当する遺伝子は、このような変性により
、その配列が７５０−ＡＧＣＧＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣＣ
＾ＣＣＡＧＣ−７７０から７５０−ＡＧＣＧＣＴＧＡＣ
ＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣ−７７０に変化した。
Ｔを使用して、フェニルアラニン（５０）及びトレオニ
ン（５３）をそれぞれグルタミン酸及びイソロイシンに
置換させた。相当する遺伝子は、このような変性により
、その配列が７５０−ＡＧＣＧＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣＣ
＾ＣＣＡＧＣ−７７０から７５０−ＡＧＣＧＣＴＧＡＣ
ＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣ−７７０に変化した。
２５；プライマーＣＴＧＧＣＧＧＣＴＴＣＧＴＡＧＡＡ
Ａを使用して、グリシン（９９）をグルタミン酸に置換
させた。
Ａを使用して、グリシン（９９）をグルタミン酸に置換
させた。
相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
９１０−ＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣ−９２０から９１０−
ＴＡＣＧＡＡＧＣＣＧＣ−９２０に変化した。
９１０−ＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣ−９２０から９１０−
ＴＡＣＧＡＡＧＣＣＧＣ−９２０に変化した。
１７：プライマー ＣＴＧＧＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
ＧＣＧＣＣを使用して、アスパラギン酸（１０９）をグ
リシンに置換させた。相当する遺伝子は、このような変
性により、その配列が９３０−ＧＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡ
−９４０から９３０−ＧＴＣＧＧＣＡＣＴＴＡ−９４０
に変化した。
ＧＣＧＣＣを使用して、アスパラギン酸（１０９）をグ
リシンに置換させた。相当する遺伝子は、このような変
性により、その配列が９３０−ＧＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡ
−９４０から９３０−ＧＴＣＧＧＣＡＣＴＴＡ−９４０
に変化した。
２７；プライマーＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧ
Ｇを使用して、グリシン（１２１）をグルタミン酸に置
換させた。
Ｇを使用して、グリシン（１２１）をグルタミン酸に置
換させた。
相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
９５６−ＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＴ−９６６から９５６−
ＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＴ−９６６に変化した。
９５６−ＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＴ−９６６から９５６−
ＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＴ−９６６に変化した。
１６：プライマーＧＣＣＡＴＡＡＧＴＧＣＣＧＡＣＧＴ
ＡＴＴＣを使用して、アラニン（１２４）をアスパラギ
ン酸に置換させた。相当する遺伝子は、このような変性
により、その配列が９７６−ＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣ−
９８４から９７６−ＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣ−９８６に
変化した。
ＡＴＴＣを使用して、アラニン（１２４）をアスパラギ
ン酸に置換させた。相当する遺伝子は、このような変性
により、その配列が９７６−ＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣ−
９８４から９７６−ＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣ−９８６に
変化した。
１７１６： １６及び１７の変異を併せて包含する。
２８；プライマーＧＣＣＡＧＡＴＡＣＣＣＧＣＴＣＴＧ
Ｇを使用して、グルタミン酸（１２９）をグリシンに置
換させた。
Ｇを使用して、グルタミン酸（１２９）をグリシンに置
換させた。
相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
９９０−ＡＧＣＧＡＡＴＡＴＣＴ−１０００から９９０
−＾ＧＣＧＧＧＴＡＴＣＴ−１０００に変化した。
９９０−ＡＧＣＧＡＡＴＡＴＣＴ−１０００から９９０
−＾ＧＣＧＧＧＴＡＴＣＴ−１０００に変化した。
２９ニブライマーＧＣＧＧＡＡＴＧＴＣＣＣＧＧＴＧＴ
Ｇを使用して、アルギニン（１３５）をグルタミン酸に
置換させた。相当する遺伝子は、このような変性により
、その配列が１０１０−ＧＣＧＣＡＴＴＣＣＧＣ−１０
２０から １０１０−ＧＧＡＣＡＴＴＣＣＧＣ−１０２
０に変化した。
Ｇを使用して、アルギニン（１３５）をグルタミン酸に
置換させた。相当する遺伝子は、このような変性により
、その配列が１０１０−ＧＣＧＣＡＴＴＣＣＧＣ−１０
２０から １０１０−ＧＧＡＣＡＴＴＣＣＧＣ−１０２
０に変化した。
３１ニブライマーＴＡＣＴＣＣＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧＴ
Ｃを使用して、トレオニン（１５９）をリシンに置換さ
せた。相当する遺伝子は、このような変性により、その
配列が１０７０−ＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣ
ＡＣＧＡＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡ−１０９０から １０７
０−ＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＧＡＡＡ
ＡＣＧＧＡＧＴＡ−ＩＱ’ｌＯに変化した。
Ｃを使用して、トレオニン（１５９）をリシンに置換さ
せた。相当する遺伝子は、このような変性により、その
配列が１０７０−ＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣ
ＡＣＧＡＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡ−１０９０から １０７
０−ＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＧＡＡＡ
ＡＣＧＧＡＧＴＡ−ＩＱ’ｌＯに変化した。
２６：プライマーＣＧＣＣＡＣＣＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧ
ＴＡＴＴＣＧＡを使用して、チロシン（１１１）をグリ
シンに置換させた。さらに、プライマーフラグメントの
部分複製によって、１１３位においてアミノ酸ＡｓｐＴ
ｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙの挿入が生じた。相当する遺伝子
は、このような変性により、その配列が９３０−ＧＴＣ
ＧＡＣＡＣＴＴＡＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴ−９５０から９
３０−ＧＴＣＧＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡＣＴＧ
ＧＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴ−９５０に変化した。
ＴＡＴＴＣＧＡを使用して、チロシン（１１１）をグリ
シンに置換させた。さらに、プライマーフラグメントの
部分複製によって、１１３位においてアミノ酸ＡｓｐＴ
ｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙの挿入が生じた。相当する遺伝子
は、このような変性により、その配列が９３０−ＧＴＣ
ＧＡＣＡＣＴＴＡＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴ−９５０から９
３０−ＧＴＣＧＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡＣＴＧ
ＧＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴ−９５０に変化した。
上記オリゴヌクレオチドを、プライマー中に存在する変
異部取込みベクターのすべてのヌクレオチド配列を複製
するＤＮＡポリメラーゼ用プライマーとして使用した。
異部取込みベクターのすべてのヌクレオチド配列を複製
するＤＮＡポリメラーゼ用プライマーとして使用した。
プローブとしてプライマー自体を使用するハイブリダイ
ゼーション法によって、所望の変性を受けたＳ１遺伝子
を包含するベクターを単離した。
ゼーション法によって、所望の変性を受けたＳ１遺伝子
を包含するベクターを単離した。
ついで、Ｓａｎｇｅｒ Ｆ、らの方法［ｒＰ、Ｎ、Ａ、
Ｓ、Ｊ ７４゜５４６３ （１９７７）］によって、変
性遺伝子の正確なヌクレオチド配列を確認した。
Ｓ、Ｊ ７４゜５４６３ （１９７７）］によって、変
性遺伝子の正確なヌクレオチド配列を確認した。
変性遺伝子を含有するベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩ
及びＨｉｎｄＩ［［で消化して、変性Ｓ１をコードづけ
する遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを公知のもの
の中から選ばれる発現プラスミドでクローン化した。
及びＨｉｎｄＩ［［で消化して、変性Ｓ１をコードづけ
する遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを公知のもの
の中から選ばれる発現プラスミドでクローン化した。
このハイブリッドプラスミドを使用して、大腸菌、枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）及び酵母の
中から選ばれる宿主微生物を形質転換させた。
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）及び酵母の
中から選ばれる宿主微生物を形質転換させた。
特に、本発明では、プラスミドＰＥｘ ３４（Ｃｅｎｔ
ｅｒｆｏｒ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
ハイデルベルグ、西独）及びＥ、 ｃｏｌｔ Ｋ１２−
△Ｈ１−△ｔｒｐ ［Ｒｅｍａｎｔ Ｅ、らｒＧｅｎｅ
Ｊ １５．８１−９３ （１９８１）］を使用した。
ｅｒｆｏｒ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
ハイデルベルグ、西独）及びＥ、 ｃｏｌｔ Ｋ１２−
△Ｈ１−△ｔｒｐ ［Ｒｅｍａｎｔ Ｅ、らｒＧｅｎｅ
Ｊ １５．８１−９３ （１９８１）］を使用した。
ついで、形質転換せしめた微生物を、液状培地中、炭素
、窒素及び無機塩の存在下、温度３０ないし４５℃で２
０分ないし５時間培養した。
、窒素及び無機塩の存在下、温度３０ないし４５℃で２
０分ないし５時間培養した。
この時間の経過後、遠沈によって菌体を培地から採取し
、常法によって溶菌化した。
、常法によって溶菌化した。
タンパク質を含有する溶菌生成物を分析して、その酵素
活性を測定した。
活性を測定した。
得られた結果（後述の実施例３に報告する）は、＄１の
配列において１０９位（１７位）及び１２４位（１６位
）（これらのいずれか一方又は両方）及び１２１位（２
７位）のアミノ酸を置換することによって、ＡＤＰ−リ
ボシレーシジン活性の良好な低減（５−８０％）、従っ
て毒性の良好な低減が達成されたことを示した。さらに
、８位及び９位（４１位）、５０位及び５３位（２２位
）及び１２９位（２８位）のアミノ酸を置換させること
によってサブユニットＳ１の酵素活性が完全に消失した
。
配列において１０９位（１７位）及び１２４位（１６位
）（これらのいずれか一方又は両方）及び１２１位（２
７位）のアミノ酸を置換することによって、ＡＤＰ−リ
ボシレーシジン活性の良好な低減（５−８０％）、従っ
て毒性の良好な低減が達成されたことを示した。さらに
、８位及び９位（４１位）、５０位及び５３位（２２位
）及び１２９位（２８位）のアミノ酸を置換させること
によってサブユニットＳ１の酵素活性が完全に消失した
。
このサブユニットは、インビボにおいて特殊な抗体を生
じさせ、抗ＰＴ保護モノクロナール抗体と反応し得る（
サブユニット２８）。
じさせ、抗ＰＴ保護モノクロナール抗体と反応し得る（
サブユニット２８）。
従って、このような変性サブユニットを含有するポリペ
プチドは抗百日咳ワクチンの調製に適している。
プチドは抗百日咳ワクチンの調製に適している。
変性サブユニットＳｌに加えてＰＴサブユニット８２゜
Ｓ３． Ｓ４及びＳ５の少なくとも１つを含有するポリ
ペプチドが好適である。
Ｓ３． Ｓ４及びＳ５の少なくとも１つを含有するポリ
ペプチドが好適である。
特に、抗百日咳毒素によって示されるものと同じ配列及
び配置を有するサブユニットＳ２． Ｓ３． Ｓ４及び
Ｓ５を有するポリペプチドが好適である。
び配置を有するサブユニットＳ２． Ｓ３． Ｓ４及び
Ｓ５を有するポリペプチドが好適である。
このような好適なポリペプチドは、ＰＴオペロン内に含
有されるＳｌをコードづけする遺伝子を変性させ、変性
サブユニットＳ１及びサブユニットＳ２゜Ｓ３． Ｓ４
及びＳ５の１又はそれ以上を含有するポリペプチドをコ
ードづけするプラスミド（変性Ｓ１遺伝子はその領域を
含有する）を構成せしめることによって調製される。
有されるＳｌをコードづけする遺伝子を変性させ、変性
サブユニットＳ１及びサブユニットＳ２゜Ｓ３． Ｓ４
及びＳ５の１又はそれ以上を含有するポリペプチドをコ
ードづけするプラスミド（変性Ｓ１遺伝子はその領域を
含有する）を構成せしめることによって調製される。
本発明によれば、それぞれＳ１変性サブユニツト２２．
２８及び４１をコードづけする遺伝子を含有するプラス
ミドＰＴＥ ２５５−２２、ＰＴＥ ２５５−２８及び
ＰＴＥ ２５５−４１は、Ｅ、ｃｏｌｉ（ＰＴＥ ２５
５−２２）、Ｅ、ｃｏｌｉ（ＰＴＥ ２５５−２８）及
びＥ、ｃｏｌｉ（ＰＴＥ ２５５−４１）として、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・センターに寄託されてい
る（各寄託番号、 ＡＴＣＣ６７５４２、ＡＴＣＣ６７
５４３及びＡＴＣＣ６７５４４）。
２８及び４１をコードづけする遺伝子を含有するプラス
ミドＰＴＥ ２５５−２２、ＰＴＥ ２５５−２８及び
ＰＴＥ ２５５−４１は、Ｅ、ｃｏｌｉ（ＰＴＥ ２５
５−２２）、Ｅ、ｃｏｌｉ（ＰＴＥ ２５５−２８）及
びＥ、ｃｏｌｉ（ＰＴＥ ２５５−４１）として、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・センターに寄託されてい
る（各寄託番号、 ＡＴＣＣ６７５４２、ＡＴＣＣ６７
５４３及びＡＴＣＣ６７５４４）。
以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、限
定するものではない。
定するものではない。
実施例１
ユニット領域の同定
１叉
プラスミドＰＴＥ ２５５１０μ９を緩衝溶液（５０Ｊ
！ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ２（ｐＨ７，４）、１０１Ｍ Ｍ
ｇＢｔ、１１００Ｉ ＮａＣｌ２）１００μｍ２に懸濁
化させ、制限酵素Ｘｂａｌ （ＢＲＬ） ３０単位（Ｕ
）により３７℃で２時間消化し、消化混合物のそれぞれ
１０ｕＱを酵素Ｎｃｏｌ、 Ｂａ１ｄＳＮｒｕ１１Ｓａ
ｌＩ及びｓｐｈ ＋の１つ（各３０）により３７℃で２
時間以上処理した。
！ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ２（ｐＨ７，４）、１０１Ｍ Ｍ
ｇＢｔ、１１００Ｉ ＮａＣｌ２）１００μｍ２に懸濁
化させ、制限酵素Ｘｂａｌ （ＢＲＬ） ３０単位（Ｕ
）により３７℃で２時間消化し、消化混合物のそれぞれ
１０ｕＱを酵素Ｎｃｏｌ、 Ｂａ１ｄＳＮｒｕ１１Ｓａ
ｌＩ及びｓｐｈ ＋の１つ（各３０）により３７℃で２
時間以上処理した。
このようにして消化したＤＮＡ混合物（それぞれ７５ｂ
ｐ Ｘｂａｌ −Ｎｃｏ［、３７７ｂｐ Ｘｂ、ａ
ｌ−Ｂａｌｌ、 １６５ｂｐ Ｘｂａｌ−Ｎｒｕｌ
、３５５ｂｐ Ｘｂａｌ−３ＡＩＩ及び５０３ｂｐ Ｘ
ｂａｌ−８ｐｈＩフラグメントを含有する）に、Ｋｌｅ
ｎｅｗポリメラーゼラージフラグメント３Ｕ及びデシキ
シヌクレオチドｄＡＴＰ、 ｄＴＴＰＳｄＣＴＰ及びｄ
ＧＴＰの各５０ｘＭを含有する溶液２μρを添加して分
子末端を修繕した。
ｐ Ｘｂａｌ −Ｎｃｏ［、３７７ｂｐ Ｘｂ、ａ
ｌ−Ｂａｌｌ、 １６５ｂｐ Ｘｂａｌ−Ｎｒｕｌ
、３５５ｂｐ Ｘｂａｌ−３ＡＩＩ及び５０３ｂｐ Ｘ
ｂａｌ−８ｐｈＩフラグメントを含有する）に、Ｋｌｅ
ｎｅｗポリメラーゼラージフラグメント３Ｕ及びデシキ
シヌクレオチドｄＡＴＰ、 ｄＴＴＰＳｄＣＴＰ及びｄ
ＧＴＰの各５０ｘＭを含有する溶液２μρを添加して分
子末端を修繕した。
混合物を室温（２０−２５°Ｃ）に１５分間及び６５℃
にさらに３０分間維持し、酵素ポリメラーゼを不活性化
した。この時間の経過後、混合物をリガーゼ緩衝液（８
６ＪＦＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣρ（ｐＨ７，６）、１ｉＭ
ＡＴＰ、 １０ｘＭＭｇＣＱｔ１１０ｊ＋Ｍジチオトレ
イトール）で２００μＱに希釈し、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼｔＵの存在下、１５℃に１夜維持して、上記フラグメ
ントを失ったＤＮＡ分子を再度相互に結合させた。つい
で、リガーゼ混合物を使用して、５０３！Ｍ Ｃａ＋Ｊ
！ｚでの処理［Ｍａｎｄｅｌ Ｍ。
にさらに３０分間維持し、酵素ポリメラーゼを不活性化
した。この時間の経過後、混合物をリガーゼ緩衝液（８
６ＪＦＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣρ（ｐＨ７，６）、１ｉＭ
ＡＴＰ、 １０ｘＭＭｇＣＱｔ１１０ｊ＋Ｍジチオトレ
イトール）で２００μＱに希釈し、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼｔＵの存在下、１５℃に１夜維持して、上記フラグメ
ントを失ったＤＮＡ分子を再度相互に結合させた。つい
で、リガーゼ混合物を使用して、５０３！Ｍ Ｃａ＋Ｊ
！ｚでの処理［Ｍａｎｄｅｌ Ｍ。
及びＨｉｇａ ｒｌ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ Ｊ ５３．１
５４ （１９７０）］によって調製したに１２− ＨＬ
ｔｒｐ大腸菌を形質転換させた。
５４ （１９７０）］によって調製したに１２− ＨＬ
ｔｒｐ大腸菌を形質転換させた。
アンピシリン３０μ９／ＲＱを含有するＬＢアーガー［
１０９／Ｑ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ （ＤＩＦ
ＣＯ）、５ｇ／σＢａｃｔ。
１０９／Ｑ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ （ＤＩＦ
ＣＯ）、５ｇ／σＢａｃｔ。
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ （ＤＩＦＣＯ）、５９／
（ｌ ｔｉａｃ（ｌＪ上に菌体を置き、３０℃で１８時
間インキュベートすることによって形質転換を選別した
。正確なヌクレオチド配列を特定するため、組換えプラ
スミドを分析に供した。
（ｌ ｔｉａｃ（ｌＪ上に菌体を置き、３０℃で１８時
間インキュベートすることによって形質転換を選別した
。正確なヌクレオチド配列を特定するため、組換えプラ
スミドを分析に供した。
これにより、以下のハイブリッドプラスミドか同定され
た。
た。
ＰＴＥ ＮＣＯ
Ｓ１遺伝子は、アミノ酸２５５から２１１まででなるサ
ブユニットＳＬのカルボキシ末端配列をコードづけする
部分を失っている。
ブユニットＳＬのカルボキシ末端配列をコードづけする
部分を失っている。
ＰＴＥ ＮＲＵ
Ｓ１遺伝子は、アミノ酸２５５から１８０まででなるサ
ブユニットＳ１のカルボキシ末端配列をコードづけする
部分を失っている。
ブユニットＳ１のカルボキシ末端配列をコードづけする
部分を失っている。
ＰＴＥ ＢＡＬ
Ｓ１遺伝子は、アミノ酸２５５から１２４まででなるサ
ブユニットＳ１のカルボキシ末端配列をコードづけする
部分を失っている。
ブユニットＳ１のカルボキシ末端配列をコードづけする
部分を失っている。
ＰＴＥ ５ＡＬ
Ｓ１遺伝子は、アミノ酸２５５から１１０まででなるサ
ブユニットＳｌのカルボキシ末端配列をコードづけする
部分を失っている。
ブユニットＳｌのカルボキシ末端配列をコードづけする
部分を失っている。
ＰＴＥ ５ＰＨ
８１遺伝子は、アミノ酸２５５から６８まででなるサブ
ユニットＳ１のカルボキシ末端配列をコードづけする部
分を失っている。
ユニットＳ１のカルボキシ末端配列をコードづけする部
分を失っている。
ドづけ遺伝子含有ハイブリッドプラスミドの構成
プラスミドＰＴＥ ２５５３プローブ（各１０μ９）を
、緩衝溶液（５０ｚＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，４
）、１０ｘＭ ＭｇＣｌ２ｔ、５０ｘＭ ＮａＣｌ２）
１００μＱ中、３７°Ｃ，３時間で、それぞれ制限酵素
５ｐｈｌ、 ５ａｉｌ及びＢａ１ｌ（各３０Ｕ）で消化
した。
、緩衝溶液（５０ｚＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，４
）、１０ｘＭ ＭｇＣｌ２ｔ、５０ｘＭ ＮａＣｌ２）
１００μＱ中、３７°Ｃ，３時間で、それぞれ制限酵素
５ｐｈｌ、 ５ａｉｌ及びＢａ１ｌ（各３０Ｕ）で消化
した。
各溶液に、デシキシヌクレオチドｄＡＴＰＳｄＴＴＰ。
ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの各５０ｘＭを含有する溶液２μ
ｇと供に、 Ｋｌｅｎｏｗラージフラグメントポリメラ
ーゼ３Ｕを添加し、２０−２５℃に１５分間維持した後
、６５℃に３０分間維持して酵素を不活性化させた。
ｇと供に、 Ｋｌｅｎｏｗラージフラグメントポリメラ
ーゼ３Ｕを添加し、２０−２５℃に１５分間維持した後
、６５℃に３０分間維持して酵素を不活性化させた。
ついで、各溶液に、制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ ３０Ｕを
添加し、得られた混合物を３７℃に３時間し、ついで１
．５％アガロースゲル上に負荷し、７０Ｖで３．５時間
泳動させた。
添加し、得られた混合物を３７℃に３時間し、ついで１
．５％アガロースゲル上に負荷し、７０Ｖで３．５時間
泳動させた。
このようにして、各混合物について２つのバンドが分離
され、１つはＳｌの削除部分を含有し、他はＰＥｘ ３
４プラスミド及びＳｌの部分を含有していた。
され、１つはＳｌの削除部分を含有し、他はＰＥｘ ３
４プラスミド及びＳｌの部分を含有していた。
その後、Ｍａｎｉａｔｉｓの方法［「モレキュラー・ク
ローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： ａ １ａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）ＪＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、 １９ｇ２］によって、５２０ｂｐ
Ｓｐｈｌ−ＨｉｎｄＩ［［，３７２ｂｐ Ｓａｌ ｌ−
Ｈｉｎｄｌｎ及び３９４ｂｐＢａｌｌ−１１ｉｎｄｌＩ
［フラグメントを電気溶出した。これらフラグメントの
各１１００ｎを、リガーゼ混合物３０μｇ中、Ｔ４リガ
ーゼ１０の存在下で、予め制限酵素Ｂａｍ旧で消化し、
ポリメラーゼ及びデシキシヌクレオチド溶液で処理しか
つ制限酵素旧ｎｄｌＩ［で消化したプラスミドＰＥｘ
３４と結合させた。
ローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： ａ １ａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）ＪＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、 １９ｇ２］によって、５２０ｂｐ
Ｓｐｈｌ−ＨｉｎｄＩ［［，３７２ｂｐ Ｓａｌ ｌ−
Ｈｉｎｄｌｎ及び３９４ｂｐＢａｌｌ−１１ｉｎｄｌＩ
［フラグメントを電気溶出した。これらフラグメントの
各１１００ｎを、リガーゼ混合物３０μｇ中、Ｔ４リガ
ーゼ１０の存在下で、予め制限酵素Ｂａｍ旧で消化し、
ポリメラーゼ及びデシキシヌクレオチド溶液で処理しか
つ制限酵素旧ｎｄｌＩ［で消化したプラスミドＰＥｘ
３４と結合させた。
リガーゼ混合物を使用して、大腸菌に１２−△肛−△ｔ
ｒｐを形質転換させ、首記Ａ、で述べた如く、アンピシ
リンを含有するＬＢアーガー上で形質転換体を選別した
。
ｒｐを形質転換させ、首記Ａ、で述べた如く、アンピシ
リンを含有するＬＢアーガー上で形質転換体を選別した
。
陽性クローンから抽出したプラスミドの中で、適当なフ
レームにクローン化フラグメントを含有するものについ
て、抗百日咳毒素抗体を使用するウェスタンプロット法
によって同定を行った。
レームにクローン化フラグメントを含有するものについ
て、抗百日咳毒素抗体を使用するウェスタンプロット法
によって同定を行った。
これらのプラスミド（ＰＴＥ ＳＰＨ／ＨＩＮＤ、 Ｐ
ＴＥ ２５５／ＳＡＬ及びＰＴＥ ２５５／ＢＡＬと略
称する）は、それぞれアミノ酸１−６７．１−１０９及
び１−１２３でなるサブユニットのアミノ末端部をコー
ドづけするＳ１遺伝子配列を失っていた。
ＴＥ ２５５／ＳＡＬ及びＰＴＥ ２５５／ＢＡＬと略
称する）は、それぞれアミノ酸１−６７．１−１０９及
び１−１２３でなるサブユニットのアミノ末端部をコー
ドづけするＳ１遺伝子配列を失っていた。
ミドの構成
上記Ａ、の如くして得られたプラスミドＰＴＥ ＮＣＯ
のサンプル２ ツ（１０μ＋＋）を、緩衝溶液（５０ｘ
Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＱ（ｐＨ７，４）、ｌｏｚＭ Ｍ
ｇＣＱ２．５０１Ｍ ＮａＣｆ２） １００μ（中、そ
れぞれＢｓｔＮｌ（ＢＲＬ） ３０Ｕ及びＢａ１ｌ（Ｂ
ＲＬ）３０Ｕにより３７℃、３時間で消化した。
のサンプル２ ツ（１０μ＋＋）を、緩衝溶液（５０ｘ
Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＱ（ｐＨ７，４）、ｌｏｚＭ Ｍ
ｇＣＱ２．５０１Ｍ ＮａＣｆ２） １００μ（中、そ
れぞれＢｓｔＮｌ（ＢＲＬ） ３０Ｕ及びＢａ１ｌ（Ｂ
ＲＬ）３０Ｕにより３７℃、３時間で消化した。
ついで、消化混合物を、ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ及びｄＴ
ＴＰ２１Ｍの存在下、Ｋｌｅｎｅｖポリメラーゼ３Ｕに
より２０−２５℃で１５分間処理して末端部を補完し、
６５℃で３０分間インキュベートした後、ＤＮＡを再度
制限酵素１１ｉｎｄＩ［［３０Ｕにより３７℃、３時間
で切断した。
ＴＰ２１Ｍの存在下、Ｋｌｅｎｅｖポリメラーゼ３Ｕに
より２０−２５℃で１５分間処理して末端部を補完し、
６５℃で３０分間インキュベートした後、ＤＮＡを再度
制限酵素１１ｉｎｄＩ［［３０Ｕにより３７℃、３時間
で切断した。
消化混合物を１．５％アガロースゲル上に負荷し、７０
Ｖで３．５時間泳動し、上述の如くして、５２７１）Ｉ
）ＢｓｔＮｌ−１＋１ｎｄＩＩＩ及び２７９ｂｐ Ｂａ
１ｌ−１１ｉｎｄＩＩＩフラグメントを電気溶出した。
Ｖで３．５時間泳動し、上述の如くして、５２７１）Ｉ
）ＢｓｔＮｌ−１＋１ｎｄＩＩＩ及び２７９ｂｐ Ｂａ
１ｌ−１１ｉｎｄＩＩＩフラグメントを電気溶出した。
これらフラグメント１１００ｎを、リガーゼ混合物中、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ７Ｕの存在下、１５℃、１８時間
で、前記Ｂ、で述べた如く予め処理したプラスミドＰＥ
ｘ ３４に結合させた。ついで、上述の如くして、大腸
菌の形質転換及び形質転換体の選別を行った。陽性のク
ローンから抽出した組換えプラスミドの中で、正しいフ
レームに挿入されたフラグメントを同定した。
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ７Ｕの存在下、１５℃、１８時間
で、前記Ｂ、で述べた如く予め処理したプラスミドＰＥ
ｘ ３４に結合させた。ついで、上述の如くして、大腸
菌の形質転換及び形質転換体の選別を行った。陽性のク
ローンから抽出した組換えプラスミドの中で、正しいフ
レームに挿入されたフラグメントを同定した。
該プラスミド（ＰＴＥ ３４Ａ及びＰＴＥ ＮＣＯ／Ｂ
ＡＬ）は、それぞれアミノ酸ｌ−５２及び２５５−２１
１でなるサブユニットＳ１の一部分をコードづけする遺
伝子及びアミノ酸１−１２４及び２５５−２１１でなる
部分をコードづけする遺伝子を失ったＳ１遺伝子を含有
していた。
ＡＬ）は、それぞれアミノ酸ｌ−５２及び２５５−２１
１でなるサブユニットＳ１の一部分をコードづけする遺
伝子及びアミノ酸１−１２４及び２５５−２１１でなる
部分をコードづけする遺伝子を失ったＳ１遺伝子を含有
していた。
Ｄ、 ＰＴＥ １６−Ａ及び１８−Ｂプラスミドの構成
プラスミドＰＴＥ ２５５１０μ９を、緩衝溶液（１０
０ｉＭＴｒｉｓ−１１ＣＱ、 ５０１Ｍ ＮａＣａ、１
０１Ｍ Ｍｇ５Ｏ，）１００μｍ２中、ＥｃｏＲＩ ３
０Ｕで、ついで緩衝溶液（１０３！Ｍ ＣａＲｔ、１０
ｍＭ ＭｇＣＱ、、 ０．２Ｍ ＮＮａＣＣ１２０ｆｆ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ （ｐＨ８）、ｌｘＭ ＥＤＴＡ）
中、Ｂａｌ ３１（ＢＲＬ） ＩＵで３７℃において消
化した。混合物の一定量を１．３．５及び１０分後に取
出し、ついで５′末端部の削除フラグメントをＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断し、ゲル電気泳動によって精製し、溶出後
、上述の如くしてプラスミドＰＥｘ ３４に結合させた
。得られたりガーゼ混合物を使用して大腸菌を形質転換
させ、上述の如く操作して、形質転換体を選別した。
プラスミドＰＴＥ ２５５１０μ９を、緩衝溶液（１０
０ｉＭＴｒｉｓ−１１ＣＱ、 ５０１Ｍ ＮａＣａ、１
０１Ｍ Ｍｇ５Ｏ，）１００μｍ２中、ＥｃｏＲＩ ３
０Ｕで、ついで緩衝溶液（１０３！Ｍ ＣａＲｔ、１０
ｍＭ ＭｇＣＱ、、 ０．２Ｍ ＮＮａＣＣ１２０ｆｆ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ （ｐＨ８）、ｌｘＭ ＥＤＴＡ）
中、Ｂａｌ ３１（ＢＲＬ） ＩＵで３７℃において消
化した。混合物の一定量を１．３．５及び１０分後に取
出し、ついで５′末端部の削除フラグメントをＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断し、ゲル電気泳動によって精製し、溶出後
、上述の如くしてプラスミドＰＥｘ ３４に結合させた
。得られたりガーゼ混合物を使用して大腸菌を形質転換
させ、上述の如く操作して、形質転換体を選別した。
陽性のクローンから抽出したプラスミドから、正しいフ
レームに挿入されたＳ１遺伝子フラグメントを含有する
プラスミド（そのヌクレオチド配列を分析によって確認
）を単離した。
レームに挿入されたＳ１遺伝子フラグメントを含有する
プラスミド（そのヌクレオチド配列を分析によって確認
）を単離した。
このようにして得られたプラスミドから、Ｓ１アミノ末
端部をコードづけする配列を持たないＳ１遺伝子を含有
するプラスミドを選別した。
端部をコードづけする配列を持たないＳ１遺伝子を含有
するプラスミドを選別した。
特に、プラスミドＰＴＥ１６−Ａは最初のアミノ酸１０
個をコードづけするヌクレオチドが欠けており、従って
、アミノ酸１ｌ−Ｌ（５を含有するタンパク質をコード
づけするものであり、一方、プラスミドＰＴＥ １８−
Ａはアミノ酸１４９−２３５を含有するタンパク質をコ
ードづけするものである。
個をコードづけするヌクレオチドが欠けており、従って
、アミノ酸１ｌ−Ｌ（５を含有するタンパク質をコード
づけするものであり、一方、プラスミドＰＴＥ １８−
Ａはアミノ酸１４９−２３５を含有するタンパク質をコ
ードづけするものである。
実施例２
変性サブユニットＳ１の発現及びそのＡＤＰ−リボＡ、
前記実施例１の如くして調製したプラスミドで形質転
換させた大腸菌Ｋ１２−△ＨＬ−△ｔｒｐを、液状ＬＢ
培地２ＯｘＱ中、滑らかに撹拌しながら３０℃で１夜培
養した。
前記実施例１の如くして調製したプラスミドで形質転
換させた大腸菌Ｋ１２−△ＨＬ−△ｔｒｐを、液状ＬＢ
培地２ＯｘＱ中、滑らかに撹拌しながら３０℃で１夜培
養した。
各培地１０１をＬＢ培地４００ｇ（＋＝接取し、３０℃
で２時間、４２°Ｃで２．５時間培養した。
で２時間、４２°Ｃで２．５時間培養した。
その後、培養物を４℃において１００００回転の速度で
１５分間遠心分離し、上澄み液を排出し、菌体を回収し
、溶液（２，５％ショ糖、ＩＯＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
２（ｐＨ８，０）、ｌ ｍＭ ＥＤＴＡ）３．２ｍＱ中
に再度懸濁させた。
１５分間遠心分離し、上澄み液を排出し、菌体を回収し
、溶液（２，５％ショ糖、ＩＯＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
２（ｐＨ８，０）、ｌ ｍＭ ＥＤＴＡ）３．２ｍＱ中
に再度懸濁させた。
この溶液にリゾチーム溶液（４０ｍ９／肩Ｑ）０．１ｉ
（２及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ Ｏ，８ｖｔＱを添加し、
ついで３７℃で３０分間反応させた。
（２及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ Ｏ，８ｖｔＱを添加し、
ついで３７℃で３０分間反応させた。
各溶液に細胞溶解緩衝液（１％、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １
００．５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（２（ｐＨ６，０）、
６３ｄ ＥＤＴＡ） ８ Ｊ１１２を加え、０℃に１５
分間、３７°Ｃに３０分間維持した。
００．５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（２（ｐＨ６，０）、
６３ｄ ＥＤＴＡ） ８ Ｊ１１２を加え、０℃に１５
分間、３７°Ｃに３０分間維持した。
音波処理を１分間行った後、溶融した菌体及び含まれて
いた部分を含有する混合物をｔｏｏｏｏ回転の速度で１
０分間遠心分離し、上澄み液を排出し、沈殿物をＩＭ尿
素ＳｉＱ中に再度懸濁化させ、３７℃に３０分間維持し
た。
いた部分を含有する混合物をｔｏｏｏｏ回転の速度で１
０分間遠心分離し、上澄み液を排出し、沈殿物をＩＭ尿
素ＳｉＱ中に再度懸濁化させ、３７℃に３０分間維持し
た。
混合物を再度遠心分離し、沈殿物及び含まれていた部分
を回収し、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ） Ｓ ｍＱ中に溶
解し、−２０℃で保存した。
を回収し、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ） Ｓ ｍＱ中に溶
解し、−２０℃で保存した。
Ｂ、ＡＤＰ−リボシレージョン活性の分析＾ＤＰ−リボ
シレージョンテストを実施する前に、含まれていた部分
を含有する溶液を遠心分離し、沈殿物を８Ｍ尿素１００
μσ中に再度懸濁化させた。
シレージョンテストを実施する前に、含まれていた部分
を含有する溶液を遠心分離し、沈殿物を８Ｍ尿素１００
μσ中に再度懸濁化させた。
Ｍａｎｎｉｎｇらによる方法［ｒＪ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅ
ｍ、ｊ罎組。
ｍ、ｊ罎組。
７４９−７５６ （１（Ｊ８４）］に従ってＡ叶−リボ
シレージョンテストを行った。
シレージョンテストを行った。
実施にあたり、各溶液１０μりを１００１Ｍジチオトレ
イトール溶液２０μｇと共に２０−２５℃で３０分間プ
レインキユベートシ、ついで牛の網膜のホモゲネート（
ＲＯ３）ｌＯμ（１，水８０μｇ、Ｔｒｉｓ−ＩＩＣＩ
２ （ｐＨ７，５）５ μ（ｌ、 １１００ＪＩＩ Ａ
ＴＰ溶液１μρ、１０ｍＭ ＧＴＰ溶液１μＬチミジン
１０ｘＱ及び”ＰＮＡＤ １ μｃ（１ｎＣ１）を添加
した。
イトール溶液２０μｇと共に２０−２５℃で３０分間プ
レインキユベートシ、ついで牛の網膜のホモゲネート（
ＲＯ３）ｌＯμ（１，水８０μｇ、Ｔｒｉｓ−ＩＩＣＩ
２ （ｐＨ７，５）５ μ（ｌ、 １１００ＪＩＩ Ａ
ＴＰ溶液１μρ、１０ｍＭ ＧＴＰ溶液１μＬチミジン
１０ｘＱ及び”ＰＮＡＤ １ μｃ（１ｎＣ１）を添加
した。
ついで、混合物を室温（２０−２５℃）で３０分間反応
させ、遠心分離後、ＲＯＳを含有する残渣を回収し、亜
硫酸ドブノルナトリウム（ＳＤＳ）緩衝液３０μρ中に
溶解させ、１２．５％ポリアクリルアミドゲル上に負荷
した。２５ＪＩＡで４時間電気泳動させた後、ゲルを温
度８０℃において減圧乾燥させ、オートラジオグラフィ
ーに供した。放射線活性のバンドをゲルから分離し、シ
ンチレーション（ＥｃｏｎｏｆｌｕｏｒｌＮＥＮ）によ
ってｔＬ５ｉｆ２に懸濁化させ、ベーターカウンターで
計数した。
させ、遠心分離後、ＲＯＳを含有する残渣を回収し、亜
硫酸ドブノルナトリウム（ＳＤＳ）緩衝液３０μρ中に
溶解させ、１２．５％ポリアクリルアミドゲル上に負荷
した。２５ＪＩＡで４時間電気泳動させた後、ゲルを温
度８０℃において減圧乾燥させ、オートラジオグラフィ
ーに供した。放射線活性のバンドをゲルから分離し、シ
ンチレーション（ＥｃｏｎｏｆｌｕｏｒｌＮＥＮ）によ
ってｔＬ５ｉｆ２に懸濁化させ、ベーターカウンターで
計数した。
このようにして、変性タンパク質のＡＤＰ−リボンレー
ジョンを定量した。
ジョンを定量した。
得られた結果を第１表に示す。
第 １ 表
変性Ｓ１遺伝子を 変性Ｓ１のＡＤＰ−含有する
７°ラスミド リネ゛ンレーン！ン活性（
Ｘ）ＰＴＥ ＮＣＯ１００ 〃Ｎｌ？υ ６
０” ＢＡＬ 〃 ＳＡＬ 〃 ＳＰＨ 〃 １６−Ａ 〃 ３４−＾ ＳＰＨ／Ｉ（ＩＩＩＤ ２５５／ＢＡＬ ２５５／Ｓ八Ｌ ＮＧＯ／ＢＡＬ ８−Ａ この表から明らかなように、サブユニットＳ１の＾ＤＰ
−リボシレージョン活性に関しては、５′末末端列とは
逆に、Ｎｒｕ部位（１７９位）に続く配列は必ずしし必
要ではない。
７°ラスミド リネ゛ンレーン！ン活性（
Ｘ）ＰＴＥ ＮＣＯ１００ 〃Ｎｌ？υ ６
０” ＢＡＬ 〃 ＳＡＬ 〃 ＳＰＨ 〃 １６−Ａ 〃 ３４−＾ ＳＰＨ／Ｉ（ＩＩＩＤ ２５５／ＢＡＬ ２５５／Ｓ八Ｌ ＮＧＯ／ＢＡＬ ８−Ａ この表から明らかなように、サブユニットＳ１の＾ＤＰ
−リボシレージョン活性に関しては、５′末末端列とは
逆に、Ｎｒｕ部位（１７９位）に続く配列は必ずしし必
要ではない。
実施例３
プラスミドＰＴＥ２５５１０ｕ９を緩衝液［ＬＯｘＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＣ（ｐｎ ７．５）、 ５０１Ｍ
ＮａＣｆ２． ｌＯｘＭ ＭｇＣｌ２＊コ１００μ
１２中に懸濁化させ、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
ｌｎの各３０Ｕにより３７°Ｃ，３時間で消化した。
Ｔｒｉｓ−ＨＣＣ（ｐｎ ７．５）、 ５０１Ｍ
ＮａＣｆ２． ｌＯｘＭ ＭｇＣｌ２＊コ１００μ
１２中に懸濁化させ、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
ｌｎの各３０Ｕにより３７°Ｃ，３時間で消化した。
ついで、消化混合物を１．３％アガロースに負荷し、８
０屑Ａ、 ３時間で溶出した。
０屑Ａ、 ３時間で溶出した。
このようにして操作することにより、２つのバンドが分
離された。１つはベクターを含有する３５００ｂｐであ
り、他方はサブユニットＳ１をコードづけする遺伝子を
含有する６００ｂｐである。
離された。１つはベクターを含有する３５００ｂｐであ
り、他方はサブユニットＳ１をコードづけする遺伝子を
含有する６００ｂｐである。
６００ｂｐのバンドを電気溶出し、このフラグメント０
．２μ９及び予め制限酵素Ｅｃｏ旧及びＨｉｎｄｌ［Ｉ
で消化したプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ。
．２μ９及び予め制限酵素Ｅｃｏ旧及びＨｉｎｄｌ［Ｉ
で消化したプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ。
サンディエゴ、カリフォルニア）０．３ｎｇを、緩衝溶
液（６６ｘＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣρ（ｐＨ７，５）、１
ｍＭ ＡＴＰ、１ｈ＋ＭＭｇＣＬ、１０＋＋＋Ｍジチオ
トレイトール）２０μρ中に懸濁化させ、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼＩＵの存在下、１５℃、１８時間で相互に結合
させた。
液（６６ｘＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣρ（ｐＨ７，５）、１
ｍＭ ＡＴＰ、１ｈ＋ＭＭｇＣＬ、１０＋＋＋Ｍジチオ
トレイトール）２０μρ中に懸濁化させ、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼＩＵの存在下、１５℃、１８時間で相互に結合
させた。
ついで、リガーゼ混合物を使用して大腸菌ＪＭ１０１（
安定させたもの）を形質転換させ、アンビンリン１００
μｇ／Ｒ（１％ＩＰＴＧ（イソプロピル−β〜Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド） ２０μ９／＋（及びＸ−Ｇａ１
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラ
クトピラノシド）２０μ９／ＭＱを含有するＬＢアーガ
ー上で形質転換体を選別した。
安定させたもの）を形質転換させ、アンビンリン１００
μｇ／Ｒ（１％ＩＰＴＧ（イソプロピル−β〜Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド） ２０μ９／＋（及びＸ−Ｇａ１
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラ
クトピラノシド）２０μ９／ＭＱを含有するＬＢアーガ
ー上で形質転換体を選別した。
恒温室において３７℃で１８時間培地をインキュベート
した。Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫベクター及び６００
ｂｐＤＮＡフラグメントを包含するハイブリッドプラス
ミドを含有する白色の菌体を使用し、下記の如く操作し
てクローン化フラグメントのシングルら線ＤＮＡを単離
した。
した。Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫベクター及び６００
ｂｐＤＮＡフラグメントを包含するハイブリッドプラス
ミドを含有する白色の菌体を使用し、下記の如く操作し
てクローン化フラグメントのシングルら線ＤＮＡを単離
した。
すなわち、白色の菌体を、ＬＢ液体培地１ 、５ｚＱ、
中で、５９０■における光学密度（ＯＤ）が約０．１５
に達するまで培養した。
中で、５９０■における光学密度（ＯＤ）が約０．１５
に達するまで培養した。
つづいて、この培養物に、Ｆｌファージ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎ）のＬＢ懸濁液（５ｘｌＯ”ファージ／１）ＩＯ
μρを添加し、得られた溶液を３７°Ｃに６−８時間維
持した。
ｇｅｎ）のＬＢ懸濁液（５ｘｌＯ”ファージ／１）ＩＯ
μρを添加し、得られた溶液を３７°Ｃに６−８時間維
持した。
その後、遠沈によって菌体を培地から分離し、上澄み液
を回収した。この上澄み液１々ｅに２０％ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）及び２．５２℃Ｍ ＮａＣＱを添
加してファージを沈殿させた。
を回収した。この上澄み液１々ｅに２０％ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）及び２．５２℃Ｍ ＮａＣＱを添
加してファージを沈殿させた。
室温（２０−２５℃）に１５分間維持した後、Ｅｐｐｅ
ｎｄｏｒｆ遠心分離機において、２０℃、１２０００
ｇで５分間遠心分離し、このようにして得られたファー
ジをＴＥ緩衝液（ＩＯＪＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ （
ｐＨ７，５）、１１Ｍ ＥＤＴＡ）１００μＱ中に懸濁
化させた。
ｎｄｏｒｆ遠心分離機において、２０℃、１２０００
ｇで５分間遠心分離し、このようにして得られたファー
ジをＴＥ緩衝液（ＩＯＪＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ （
ｐＨ７，５）、１１Ｍ ＥＤＴＡ）１００μＱ中に懸濁
化させた。
ついで、この溶液を、■容の水−飽和フェノールで１回
、エチルエーテルで２′回抽出処理し、ファージ水溶液
にエタノール２５０μＱ及び３Ｍ酢酸アンモニウム１０
μｇを添加してシングルら線ＤＮＡを沈殿させた。遠沈
によってＤＮＡを混合物から分離し、ＴＥ緩衝液２０μ
ｇに再度懸濁させ、直接変異誘、発［Ｚｏｌｌｅｒらｒ
ＤＮＡｊ ３．４７９−４８８ （１９８４）］に使用
した。
、エチルエーテルで２′回抽出処理し、ファージ水溶液
にエタノール２５０μＱ及び３Ｍ酢酸アンモニウム１０
μｇを添加してシングルら線ＤＮＡを沈殿させた。遠沈
によってＤＮＡを混合物から分離し、ＴＥ緩衝液２０μ
ｇに再度懸濁させ、直接変異誘、発［Ｚｏｌｌｅｒらｒ
ＤＮＡｊ ３．４７９−４８８ （１９８４）］に使用
した。
この目的のため、所望のアミノ酸の少なくとも１つをコ
ードづけする塩基を他のアミノ酸をコードづけするよう
に変化させたオリゴヌクレオチドを、自動装置 Ｉ
Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ）によって合成した。
ードづけする塩基を他のアミノ酸をコードづけするよう
に変化させたオリゴヌクレオチドを、自動装置 Ｉ
Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ）によって合成した。
該オリゴヌクレオチド（プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＳＫ内でクローン化されたシングルら線ＤＮＡ内に存
在する配列に対して相補的である）は、プライマー内に
存在する変異部分を取込む全Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔヌク
レオチド配列を転写するＤＮＡポリメラーゼ用のプライ
マーとして使用される。
ｔＳＫ内でクローン化されたシングルら線ＤＮＡ内に存
在する配列に対して相補的である）は、プライマー内に
存在する変異部分を取込む全Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔヌク
レオチド配列を転写するＤＮＡポリメラーゼ用のプライ
マーとして使用される。
実際には、合成オリゴヌクレオチド３ｍＭに、１０ｘＭ
ＡＴＰ ２ ＢＱＳＫｉｎａｓｅ ＩＯＸ （５５０
ｉＭ Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ！（ｐＨｇ、ｏ）、ｌｏｏｆ
ｆＭ ＭｇＣＬ）緩衝液２μＱ、 １１００ＩＩＩジチ
オトレイトール（ＤＴＴ） １μσ及びＫｉｎａｓｅｉ
リヌクレオチド（Ｂｏｃｈｒｉｎｇｅｒ） ５ Ｕを添
加し、最終容量を２０μＱとした。
ＡＴＰ ２ ＢＱＳＫｉｎａｓｅ ＩＯＸ （５５０
ｉＭ Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ！（ｐＨｇ、ｏ）、ｌｏｏｆ
ｆＭ ＭｇＣＬ）緩衝液２μＱ、 １１００ＩＩＩジチ
オトレイトール（ＤＴＴ） １μσ及びＫｉｎａｓｅｉ
リヌクレオチド（Ｂｏｃｈｒｉｎｇｅｒ） ５ Ｕを添
加し、最終容量を２０μＱとした。
混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、７０°Ｃ
に１０分間維持して酵素を不活性化させた。
に１０分間維持して酵素を不活性化させた。
Ｋｉｎａｓｅ ＩＯＸ ｌ答中にシングルフィラメント
（マトリックスとして使用）１μ９、Ｉ ＪＡＭ Ｔｒ
ｉｓ −ＨＣ（２（ｐＨ８，０） −１０ｄ ＭｇＣＱ
ｔ ｗｉ衝液液１ｕＱ含有する液をプライマー２μＱに
添加した。
（マトリックスとして使用）１μ９、Ｉ ＪＡＭ Ｔｒ
ｉｓ −ＨＣ（２（ｐＨ８，０） −１０ｄ ＭｇＣＱ
ｔ ｗｉ衝液液１ｕＱ含有する液をプライマー２μＱに
添加した。
混合物を８０℃に約３分間維持し、ついで室温に約１時
間維持した。
間維持した。
１ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ２ （ｐＨ８，０） −１０
ｉ＋Ｍ Ｍｇ（４を緩衝液１０ｕＱ、０．０５ＪＩＭ
ＡＴＰＳｌ ｘＭ ＤＴＴ、 ４種類のデシキシヌクレ
オチド０．５ｍＭ％Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１０及びｌ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｋｌｅｎｏｗ
）２．５Ｕを順次添加した。
ｉ＋Ｍ Ｍｇ（４を緩衝液１０ｕＱ、０．０５ＪＩＭ
ＡＴＰＳｌ ｘＭ ＤＴＴ、 ４種類のデシキシヌクレ
オチド０．５ｍＭ％Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１０及びｌ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｋｌｅｎｏｗ
）２．５Ｕを順次添加した。
混合物を１５°Ｃで１夜インキユベートし、ついで上述
の如き大腸菌ＪＭ １０１の形質転換に使用した。
の如き大腸菌ＪＭ １０１の形質転換に使用した。
変異誘発に使用したプライマーをプローブとして使用す
るハイブリッドプラスミド法によって、変異Ｓ１遺伝子
を含有するプラスミドを確認した（３２Ｐと符号づけす
る）。実施にあたっては、形質転換された培養物を含有
するニトロセルロースフィルターを、５ｘ ５ＳＣ（Ｌ
Ｘ ５ＳＣ＝ ０．０１５Ｍ ＮａＣＱ、 ０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐｔｌ ７） １．ＯＸ Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ（１％ＢＳ八、１％Ｆｉｏｌｌ、１％ ポ
リビニルピロリドン）及び０．２％硫酸ドデシルナトリ
ウム（ＤＳＤ）中、２〇−２５°Ｃ１１８時間でハイブ
リダイズし、５ＸＳＳＣ中、下記の温度で２時間洗浄し
た。
るハイブリッドプラスミド法によって、変異Ｓ１遺伝子
を含有するプラスミドを確認した（３２Ｐと符号づけす
る）。実施にあたっては、形質転換された培養物を含有
するニトロセルロースフィルターを、５ｘ ５ＳＣ（Ｌ
Ｘ ５ＳＣ＝ ０．０１５Ｍ ＮａＣＱ、 ０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐｔｌ ７） １．ＯＸ Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ（１％ＢＳ八、１％Ｆｉｏｌｌ、１％ ポ
リビニルピロリドン）及び０．２％硫酸ドデシルナトリ
ウム（ＤＳＤ）中、２〇−２５°Ｃ１１８時間でハイブ
リダイズし、５ＸＳＳＣ中、下記の温度で２時間洗浄し
た。
２５及び２６位の変異体 ４５℃２８．２２
及び２９位の変異体 ４８°Ｃ２７位の変異体
５４℃３１及び４１位の変異体
４６°Ｃ８ａｎｇｅｒ Ｆ、らの方法［ｒＰ、Ｎ
、Ａ、ｓ、Ｊ ７４．５４６３（１９７７）］に従って
遺伝子のヌクレオチド配列の分析を行うことによって、
変異の誘発を確認した。
及び２９位の変異体 ４８°Ｃ２７位の変異体
５４℃３１及び４１位の変異体
４６°Ｃ８ａｎｇｅｒ Ｆ、らの方法［ｒＰ、Ｎ
、Ａ、ｓ、Ｊ ７４．５４６３（１９７７）］に従って
遺伝子のヌクレオチド配列の分析を行うことによって、
変異の誘発を確認した。
上述の如く操作することにより、変性Ｓ１をコードづけ
する遺伝子を含有する下記のプラスミドを調製した。
する遺伝子を含有する下記のプラスミドを調製した。
４１ニブライマーＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＴＣＴＡＣＧＧ
Ｔを使用して、チロシン（８）及びアルギニン（９）を
それぞれアスパラギン酸及びグリシンに置換させた。相
当する遺伝子は、このような変性により、その配列が６
２０−ＣＧＣＣＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＣＣＴＡＴＧＡＣ
ＴＣＣＣＧＣＣＣＧ−６５０から ６２０−ＣＧＣＣＡ
ＣＣＧＴＡＧＡＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＣＣＣＧＣＣＣ
Ｇ−６５０に変化した。
Ｔを使用して、チロシン（８）及びアルギニン（９）を
それぞれアスパラギン酸及びグリシンに置換させた。相
当する遺伝子は、このような変性により、その配列が６
２０−ＣＧＣＣＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＣＣＴＡＴＧＡＣ
ＴＣＣＣＧＣＣＣＧ−６５０から ６２０−ＣＧＣＣＡ
ＣＣＧＴＡＧＡＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＣＣＣＧＣＣＣ
Ｇ−６５０に変化した。
２２； プライマーＴＧＧＡＧＡＣＧＴＣＡＧＣＧＣＴ
ＧＴを使用して、フェニルアラニン（５０）及びトレオ
ニン（５３）をそれぞれグルタミン酸及びイソロイシン
に置換させた。相当する遺伝子は、このような変性によ
り、その配列が７５０−ＡＧＣＧＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣ
ＣＡＣＣＡＧＣ−７７０から７５０−ＡＧＣＧＣＴＧＡ
ＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣ−７７０に変化した。
ＧＴを使用して、フェニルアラニン（５０）及びトレオ
ニン（５３）をそれぞれグルタミン酸及びイソロイシン
に置換させた。相当する遺伝子は、このような変性によ
り、その配列が７５０−ＡＧＣＧＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣ
ＣＡＣＣＡＧＣ−７７０から７５０−ＡＧＣＧＣＴＧＡ
ＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣ−７７０に変化した。
２５： ブライマーＣＴＧＧＣＧＧＣＴＴＣＧＴＡＧＡ
ＡＡを使用して、グリシン（９９）をグルタミン酸に置
換させた。相当する遺伝子は、このような変性により、
その配列が９１０−ＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣ−９２０か
ら９１０−ＴＡＣＧＡＡＧＣＣＧＣ−９２０に変化した
。
ＡＡを使用して、グリシン（９９）をグルタミン酸に置
換させた。相当する遺伝子は、このような変性により、
その配列が９１０−ＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣ−９２０か
ら９１０−ＴＡＣＧＡＡＧＣＣＧＣ−９２０に変化した
。
１７； ブライマー ＣＴＧＧＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧ
ＣＧＣＧＣＣを使用して、アスパラギン酸（１０９）を
グリシンに置換させた。相当する遺伝子は、このような
変性により、その配列が９３０−ＧＴＣＧＡＣＡＣＴＴ
Ａ−９４０から９３０−ＧＴＣＧＧＣＡＣＴＴＡ−９４
０に変化した。
ＣＧＣＧＣＣを使用して、アスパラギン酸（１０９）を
グリシンに置換させた。相当する遺伝子は、このような
変性により、その配列が９３０−ＧＴＣＧＡＣＡＣＴＴ
Ａ−９４０から９３０−ＧＴＣＧＧＣＡＣＴＴＡ−９４
０に変化した。
２７：ブライマーＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧ
Ｇを使用して、グリシン（１２１）をグルタミン酸に置
換さ仕た。相当する遺伝子は、このような変性により、
その配列が９５６−ＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＴ−９６６か
ら９５６−ＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＴ−９６６に変化した
。
Ｇを使用して、グリシン（１２１）をグルタミン酸に置
換さ仕た。相当する遺伝子は、このような変性により、
その配列が９５６−ＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＴ−９６６か
ら９５６−ＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＴ−９６６に変化した
。
１６：ブライマーＧＣＣＡＴＡＡＧＴＧＣＣＧＡＣＧＴ
ＡＴＴＣを使用して、アラニン（１２４）をアスパラギ
ン酸に置換させた。相当する遺伝子は、このような変性
により、その配列が９７６−ＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣ−
９８４から９７６−ＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣ−９８６に
変化した。
ＡＴＴＣを使用して、アラニン（１２４）をアスパラギ
ン酸に置換させた。相当する遺伝子は、このような変性
により、その配列が９７６−ＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣ−
９８４から９７６−ＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣ−９８６に
変化した。
１７１６： １６及び１７の変異を併せて包含する。
２８ニブライ？ −ＧＣＣＡＧＡＴＡＣＣＣＧＣＴＣＴ
ＧＧを使用して、グルタミン酸（１２９）をグリシンに
置換させた。相当する遺伝子は、このような変性により
、その配列が９９０−ＡＧＣＧＡＡＴＡＴＣＴ−１００
０から９９０−ＡＧＣＧＧＧＴＡＴＣＴ−１０００に変
化した。
ＧＧを使用して、グルタミン酸（１２９）をグリシンに
置換させた。相当する遺伝子は、このような変性により
、その配列が９９０−ＡＧＣＧＡＡＴＡＴＣＴ−１００
０から９９０−ＡＧＣＧＧＧＴＡＴＣＴ−１０００に変
化した。
２９ニブライマーＧＣＧＧＡＡＴＧＴＣＣＣＧＧＴＧＴ
Ｇを使用して、アルギニン（１３５）をグルタミン酸に
置換させた。相当する遺伝子は、このような変性により
、その配列が１０１０−ＧＣＧＣＡＴＴＣＣＧＣ−１０
２０から１０１０−ＧＧＡＣＡＴＴＣＣＧＣ−１０２０
＋、：変化した。
Ｇを使用して、アルギニン（１３５）をグルタミン酸に
置換させた。相当する遺伝子は、このような変性により
、その配列が１０１０−ＧＣＧＣＡＴＴＣＣＧＣ−１０
２０から１０１０−ＧＧＡＣＡＴＴＣＣＧＣ−１０２０
＋、：変化した。
３１： ブライ？ −ＴＡＣＴＣＣＧＴＴＴＴＣＧＴＧ
ＧＴＣを使用して、トレオニン（１５９）をリシンに置
換させた。
ＧＴＣを使用して、トレオニン（１５９）をリシンに置
換させた。
相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
１０７０−ＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＧ
ＡＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡ−１０９０から １０７０−Ｇ
ＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＧＡＡＡＡＣＧ
ＧＡＧＴ＾−１０９０に変化した。
１０７０−ＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＧ
ＡＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡ−１０９０から １０７０−Ｇ
ＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＧＡＡＡＡＣＧ
ＧＡＧＴ＾−１０９０に変化した。
使用して、チロシン（１１１）をグリシンに置換させた
。さらに、ブライマーフラグメントの部分複写によって
、１１３位においてアミノ酸Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙの挿入が生じた。相当する遺伝子は、このような
変性により、その配列が９３０− ＧＴＣＧＡＣＡＣＴ
ＴＡＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴ−９５０がら９３０− ＧＴ
ＣＧＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＣ
ＧＡＣＡＡＴ−９５０に変化した。
。さらに、ブライマーフラグメントの部分複写によって
、１１３位においてアミノ酸Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙの挿入が生じた。相当する遺伝子は、このような
変性により、その配列が９３０− ＧＴＣＧＡＣＡＣＴ
ＴＡＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴ−９５０がら９３０− ＧＴ
ＣＧＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＣ
ＧＡＣＡＡＴ−９５０に変化した。
Ｓ１遺伝子を含有するプラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄＩ［で再度消化し、ゲル電気泳動によっ
て、消化混合物から上記変異部分を有するＤＮＡフラグ
メントを分離し、電気溶出し、上述の如く操作して、リ
ガーゼ混合物中、ＰＥｘ ３４Ｂベクター内でクローン
化した。
Ｉ及びＨｉｎｄＩ［で再度消化し、ゲル電気泳動によっ
て、消化混合物から上記変異部分を有するＤＮＡフラグ
メントを分離し、電気溶出し、上述の如く操作して、リ
ガーゼ混合物中、ＰＥｘ ３４Ｂベクター内でクローン
化した。
リガーゼ混合物を使用して、大腸菌に１２−△ｌ１１−
△ｔｒｐを形質転換させ、アンピシリン３０μ９／ｖＱ
を含有するＬＢアーガー培地上、３０’Ｃで形質転換体
を単離した。
△ｔｒｐを形質転換させ、アンピシリン３０μ９／ｖＱ
を含有するＬＢアーガー培地上、３０’Ｃで形質転換体
を単離した。
ついで、変異プラスミドを含有する陽性のクローンを、
実施例２に記載の如くしてＬＢ液体培地中で培養し、溶
菌処理後、得られたサブユニットＳ１のＡＤＰ−リボシ
レージョン活性を測定した。
実施例２に記載の如くしてＬＢ液体培地中で培養し、溶
菌処理後、得られたサブユニットＳ１のＡＤＰ−リボシ
レージョン活性を測定した。
結果を第２表に示す。
第 ２ 表
変異サブユニット 変異サブユニットの
ＡＤＰ−リボシレージョン活性（！Ａ）ＢｐｐＢ
１００ＢｐｐＢは百日
咳菌の５ａｌｌまでの遺伝子部分を含有するハイブリッ
ドである。
ＡＤＰ−リボシレージョン活性（！Ａ）ＢｐｐＢ
１００ＢｐｐＢは百日
咳菌の５ａｌｌまでの遺伝子部分を含有するハイブリッ
ドである。
上述の結果から、変異体２８では、唯１つのアミノ酸の
置換によって酵素活性が完全に失なわれており、特に興
味深いものであることが理解される。
置換によって酵素活性が完全に失なわれており、特に興
味深いものであることが理解される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 抗百日咳ワクチンの調製に使用される毒性のない又
は毒性が低減された免疫活性ポリペプチドにおいて、ア
ミノ酸１から１８０までのＳ１領域における１又はそれ
以上の部位で、アミノ酸を、免疫特性を変質させること
なくＳ１の毒性を破壊又は低減させ得る他のアミノ酸で
直接変異誘発置換することによって変性せしめた百日咳
毒素のサブユニットＳ１を含有することを特徴とする、
免疫活性ポリペプチド。 ２ 請求項１記載のものにおいて、百日咳毒素のサブユ
ニットＳ２、Ｓ３、Ｓ４及びＳ５の少なくとも１つを含
有してなる、免疫活性ポリペプチド。 ３ 請求項２記載のものにおいて、前記サブユニットＳ
２、Ｓ３、Ｓ４及びＳ５が天然の百日咳毒素に存在する
ものと同じ配列を有するものである、免疫活性ポリペプ
チド。 ４ 請求項１記載のものにおいて、置換される位置及び
アミノ酸が、８位チロシン、９位アルギニン、５０位フ
ェニルアラニン、５３位トレオニン、１２９位グルタミ
ン酸、１２１位グリシン、１２４位アラニン、１０９位
アスパラギン酸、９９位グリシン、１３５位アルギニン
、１５９位トレオニン及び１１１位チロシンである、免
疫活性ポリペプチド。 ５ 請求項１記載のものにおいて、Ｓ１領域の８位チロ
シン及び９位アルギニンが、それぞれアスパラギン酸及
びグリシンで置換されてなる、免疫活性ポリペプチド。 ６ 請求項１記載のものにおいて、Ｓ１領域の５０位フ
ェニルアラニン及び５３位トレオニンが、それぞれグル
タミン酸及びイソロイシンで置換されてなる、免疫活性
ポリペプチド。 ７ 請求項１記載のものにおいて、Ｓ１領域の１２９位
グルタミン酸がグリシンで置換されてなる、免疫活性ポ
リペプチド。 ８ 請求項１記載のものにおいて、Ｓ１領域の９９位グ
リシンがグルタミン酸で置換されてなる、免疫活性ポリ
ペプチド。 ９ 請求項１記載のものにおいて、Ｓ１領域の１２１位
グリシンがグルタミン酸で置換されてなる、免疫活性ポ
リペプチド。 １０ 請求項１記載のものにおいて、Ｓ１領域の１２４
位アラニンがアスパラギン酸で置換されてなる、免疫活
性ポリペプチド。 １１ 請求項１記載のものにおいて、Ｓ１領域の１０９
位アスパラギン酸及び１２４位アラニンが、それぞれグ
リシン及びアスパラギン酸で置換されてなる、免疫活性
ポリペプチド。 １２ 請求項１記載のポリペプチドの製法において、 ａ）ＤＮＡ分子の１又はそれ以上の位置において、所定
のアミノ酸をコードづけする塩基配列を所望のアミノ酸
をコードづけする塩基配列で置換することによって抗百
日咳毒素のサブユニットＳ１をコードづけする遺伝子を
直接変異誘発により変性させ、 ｂ）該変性サブユニットＳ１をコードずけする遺伝子を
含有するＤＭＡフラグメントをクローニングベクターに
結合させてハイブリッドプラスミドを構成し、 ｃ）前記工程ｂ）で得られたハイブリッドプラスミドに
よって宿主微生物を形質転換させ、ｄ）炭素源、窒素源
及び無機塩の存在下、適切な培地中で形質転換微生物を
培養し、 ｅ）培地又は菌体から、変性サブユニットＳ１を含有す
るポリペプチドを採取すること、 を特徴とする、免疫活性ポリペプチドの製法。 １３ 請求項１２記載の製法において、前記工程ａ）で
使用するサブユニットＳ１をコードづけする遺伝子が百
日咳毒素オペロン内に含有されたものである、免疫活性
ポリペプチドの製法。 １４ 請求項１２記載の製法において、前記工程ｂ）で
使用するＤＮＡフラグメントが、百日咳毒素のサブユニ
ットＳ２、Ｓ３、Ｓ４又はＳ５をコードづけする少なく
とも１つの遺伝子を含有するものである、免疫活性ポリ
ペプチドの製法。 １５ 請求項目１４記載の製法において前記遺伝子が百
日咳毒素をコードづけするオペロンに分類されるもので
ある、免疫活性ポリペプチドの製法。 １６ 請求項１２記載の製法において、前記工程ｃ）で
使用する微生物が、大腸菌、桿菌及び酵母でなる群から
選ばれるものである、免疫活性ポリペプチドの製法。 １７ 請求項１６記載の製法において、前記微生物が大
腸菌である、免疫活性ポリペプチドの製法。 １８ 形質転換微生物Ｅ．ｃｏｌｉ（ＰＴＥ ２５５−
２２）ＡＴＣＣ６７５４２、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＰＴＥ ２
５５−２８）ＡＴＣＣ ６７５４３、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｐ
ＴＥ ２５５−４１）ＡＴＣＣ ６７５４４。 １９ 請求項１記載のポリペプチドの少なくとも１を治
療上の有効量で含有してなる抗百日咳ワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT22481A/87 | 1987-11-02 | ||
| IT22481/87A IT1223334B (it) | 1987-11-02 | 1987-11-02 | Polipeptidi immunologicamente attivi con una tossicita' alterata utili per la preparazione di un vaccino antipertosse |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8160348A Division JP2857105B2 (ja) | 1987-11-02 | 1996-06-20 | 免疫活性ポリペプチド及びその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01165370A true JPH01165370A (ja) | 1989-06-29 |
| JP2728275B2 JP2728275B2 (ja) | 1998-03-18 |
Family
ID=11196853
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63276322A Expired - Lifetime JP2728275B2 (ja) | 1987-11-02 | 1988-11-02 | 免疫活性ポリペプチド及びその製法 |
| JP8160348A Expired - Lifetime JP2857105B2 (ja) | 1987-11-02 | 1996-06-20 | 免疫活性ポリペプチド及びその製法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8160348A Expired - Lifetime JP2857105B2 (ja) | 1987-11-02 | 1996-06-20 | 免疫活性ポリペプチド及びその製法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7410646B1 (ja) |
| EP (1) | EP0322533B1 (ja) |
| JP (2) | JP2728275B2 (ja) |
| AT (1) | ATE123062T1 (ja) |
| CA (1) | CA1341582C (ja) |
| DE (1) | DE3853876T2 (ja) |
| ES (1) | ES2072857T3 (ja) |
| HK (1) | HK192995A (ja) |
| IT (1) | IT1223334B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH022383A (ja) * | 1987-11-24 | 1990-01-08 | Connaught Lab Ltd | 遺伝子操作による百日ぜきトキシンの無毒化 |
| JPH04368337A (ja) * | 1990-06-21 | 1992-12-21 | Sclavo Spa | 無細胞抗百日咳菌ワクチン |
| JP2015533148A (ja) * | 2012-10-12 | 2015-11-19 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 混合ワクチン用の架橋されていない無細胞百日咳抗原 |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR0168039B1 (ko) * | 1987-09-04 | 1999-01-15 | 로버트 디. 웨스트 | 재조합 dna에서 유도한 보르데텔라 외독소 소단위체의 유사체 및 그를 포함하는 백신 |
| US5332583A (en) * | 1987-11-24 | 1994-07-26 | Connaught Laboratories Limited | Vaccine containing genetically-detoxified pertussis holotoxin |
| US5244657A (en) * | 1987-11-24 | 1993-09-14 | Connaught Laboratories Limited | Genetic detoxification of pertussis toxin |
| US5358868A (en) * | 1987-11-24 | 1994-10-25 | Connaught Laboratories Limited | Genetic detoxification of pertussis toxin |
| IT1223529B (it) * | 1987-12-18 | 1990-09-19 | Sclavo Spa | Epitopo immunodominante protettivo contenuto nella subunita' s1 della tossina della pertosse |
| AP8900132A0 (en) * | 1988-07-22 | 1991-01-14 | Smithkline Biolog | Bordetella pertussis vaccine |
| ATE127347T1 (de) * | 1989-04-28 | 1995-09-15 | Sclavo Spa | Pertussistoxin-mutanten, dieselbe produzierende bordetella-stämme und ihre verwendung als vakzin gegen pertussis. |
| US5786189A (en) * | 1989-11-29 | 1998-07-28 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine |
| US5856122A (en) * | 1993-08-24 | 1999-01-05 | University Of Alberta | Modification of pertussis toxin |
| GB9908263D0 (en) * | 1999-04-13 | 1999-06-02 | Binding Site The Limited | Eliciting improved immune responses |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| GB0313242D0 (en) * | 2003-06-09 | 2003-07-16 | Imp College Innovations Ltd | Pulmonary immunopathology |
| GB0313916D0 (en) | 2003-06-16 | 2003-07-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine composition |
| EA015964B1 (ru) | 2006-09-07 | 2012-01-30 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Вакцина |
| EA201490303A1 (ru) | 2007-05-02 | 2014-05-30 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Вакцина |
| AR077636A1 (es) | 2009-07-08 | 2011-09-14 | Abbott Biologicals Bv | Vacuna viral y uso de la misma |
| GB201105981D0 (en) | 2011-04-08 | 2011-05-18 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel process |
| US20140037680A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-06 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Novel method |
| SG11201500573RA (en) | 2012-08-06 | 2015-02-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Method for eliciting in infants an immune response against rsv and b. pertussis |
| CN105007936B (zh) | 2013-03-08 | 2018-10-02 | 扬森疫苗与预防公司 | 无细胞百日咳疫苗 |
| AU2014304545A1 (en) | 2013-08-05 | 2016-02-25 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Combination immunogenic compositions |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62228286A (ja) * | 1986-01-28 | 1987-10-07 | スクラーボ・エセ・ピ・ア | ボルデテラ・パ−タツシス染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩフラグメント |
| JPH04501051A (ja) * | 1987-09-04 | 1992-02-27 | アムジエン・インコーポレーテツド | 組換え型ｄｎａ由来ボルデテラ毒素サブユニット類似体 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3781541T2 (de) * | 1986-12-23 | 1993-05-06 | Univ Leland Stanford Junior | Modifiziertes pertussistoxin. |
| GB8727489D0 (en) * | 1987-11-24 | 1987-12-23 | Connaught Lab | Detoxification of pertussis toxin |
-
1987
- 1987-11-02 IT IT22481/87A patent/IT1223334B/it active
-
1988
- 1988-10-25 DE DE3853876T patent/DE3853876T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-25 ES ES88117742T patent/ES2072857T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-25 EP EP88117742A patent/EP0322533B1/en not_active Revoked
- 1988-10-25 AT AT88117742T patent/ATE123062T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-11-01 CA CA000581889A patent/CA1341582C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-02 JP JP63276322A patent/JP2728275B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-17 US US08/261,692 patent/US7410646B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-12-21 HK HK192995A patent/HK192995A/en not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-06-20 JP JP8160348A patent/JP2857105B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62228286A (ja) * | 1986-01-28 | 1987-10-07 | スクラーボ・エセ・ピ・ア | ボルデテラ・パ−タツシス染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩフラグメント |
| JPH04501051A (ja) * | 1987-09-04 | 1992-02-27 | アムジエン・インコーポレーテツド | 組換え型ｄｎａ由来ボルデテラ毒素サブユニット類似体 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH022383A (ja) * | 1987-11-24 | 1990-01-08 | Connaught Lab Ltd | 遺伝子操作による百日ぜきトキシンの無毒化 |
| JPH04368337A (ja) * | 1990-06-21 | 1992-12-21 | Sclavo Spa | 無細胞抗百日咳菌ワクチン |
| JP2015533148A (ja) * | 2012-10-12 | 2015-11-19 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 混合ワクチン用の架橋されていない無細胞百日咳抗原 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1223334B (it) | 1990-09-19 |
| IT8722481A0 (it) | 1987-11-02 |
| US7410646B1 (en) | 2008-08-12 |
| CA1341582C (en) | 2008-10-07 |
| JPH09157293A (ja) | 1997-06-17 |
| JP2728275B2 (ja) | 1998-03-18 |
| ATE123062T1 (de) | 1995-06-15 |
| EP0322533B1 (en) | 1995-05-24 |
| ES2072857T3 (es) | 1995-08-01 |
| EP0322533A1 (en) | 1989-07-05 |
| JP2857105B2 (ja) | 1999-02-10 |
| HK192995A (en) | 1995-12-29 |
| DE3853876D1 (de) | 1995-06-29 |
| DE3853876T2 (de) | 1995-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2728275B2 (ja) | 免疫活性ポリペプチド及びその製法 | |
| US8445662B2 (en) | Mycobacterium tuberculosis fusion protein and uses thereof | |
| JPS62228286A (ja) | ボルデテラ・パ−タツシス染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩフラグメント | |
| JP2655583B2 (ja) | 新規な百日咳毒素変異体、このような変異体を生産し得るボルデテラ菌株及び抗百日咳菌ワクチンの開発に於けるそれらの使用 | |
| US4883761A (en) | Pertussis toxin gene: cloning and expression of protective antigen | |
| EP0584284A1 (en) | Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs | |
| JPH06504909A (ja) | 結核の診断及び抑制に用いるマイコバクテリウムポリペプチド及びそれをコードする核酸 | |
| JP2008067707A (ja) | 分類不可能なハエモフィルスインフルエンザエのｌｋｐピリン構造遺伝子およびオペロン | |
| US6713072B1 (en) | Immunologically active polypeptides with altered toxicity useful for the preparation of an antipertussis vaccine | |
| US5962240A (en) | Mycobacterium proteins and applications | |
| JP3998155B2 (ja) | 空胞形成毒素欠損Ｈ．ｐｙｌｏｒｉおよび関連する方法 | |
| CN101451145A (zh) | 基于t细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用 | |
| Schooten et al. | T cell epitopes on the 36K and 65K Mycobacterium leprae antigens defined by human T cell clones | |
| US5026636A (en) | Methods and compositions for production of mycoplasmal adhesins | |
| US5925546A (en) | Immunologically active polypeptides with altered toxicity useful for the preparation of an antipertussis vaccine | |
| JPH022387A (ja) | 免疫学的に活性なペプチド | |
| JP2003533990A (ja) | 百日咳菌、パラ百日咳菌および気管支敗血症菌のペルタクチンの繰返し領域の多型性を有するポリペプチド、ならびに診断および免疫原性組成物におけるその使用 | |
| CA2330935C (en) | A mutant human hepatitis b viral strain and uses thereof | |
| US20030049265A1 (en) | Heliobacter pylori antigen | |
| US7232671B2 (en) | Pertussis toxin gene: cloning and expression of protective antigen | |
| AU2903700A (en) | Vaccine | |
| EP0573435B1 (en) | Acellular vaccine | |
| HK1122312A (en) | A mycobacterium tuberculosis fusion protein and uses thereof | |
| JPH06500548A (ja) | エントアメーバヒストリティカ免疫優性表面抗原 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RVTR | Cancellation due to determination of trial for invalidation |