JPH04501427A

JPH04501427A - レトロウィルスの逆転写酵素の特異的抑制剤と、その医薬への応用

Info

Publication number: JPH04501427A
Application number: JP2508415A
Authority: JP
Inventors: ブル，エルベール，アー．; リシュティ，ミリア; ビュク，アンリ
Original assignee: アンスチチュ　パストゥール
Priority date: 1989-06-02
Filing date: 1990-06-01
Publication date: 1992-03-12
Also published as: EP0427843B1; FR2647792B1; EP0427843A1; WO1990014825A1; FR2647792A1; DE69017594D1; ATE119392T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はレトロウィルスの逆転写酵素の特異的抑制剤と、それを含む医薬組成物に関するものである。

真核生物中で繁殖する外膜を有するウィルスの糖タンパク質はアミノ酸の繰り返し単位：Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ（ここで、Ｘ＝Ｐ　ｒ　ｏまたはＡｓｐを除く任意のアミノ酸）を含んでいる。

この繰り返し単位はドリコール（初期ポリペプチド鎖を有する）に結合された中間体の転写時にＮ−オリゴ糖の受容部位（ｓｉｔｅ　ａｃｃｐｔｅｕｒ）として働く。従って、ポリプレノール型中間体の合成と転写機構を遮断したり、オリゴ糖を処理して錯体または“マンノース含有量の多い″ハイブリッドにすることを目的とする全ての化学治療法の開発では、短いオリゴ糖鎖または基本オリゴ糖鎖を作ることになる。この複合糖質の変性によりウィルスおよび受容体の結合タンパクの三次構造および四次構造を変化させて、ウィルスの進入：固定、融合（細胞対細胞、ウィルス対細胞）およびその放出が防がれる。２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ｄＧｌｃ）を適当に用いた場合に独特な抗ウィルス作用が示されることは知られでおり、陰部庖疹の治療に有効に用いられている〔ブロッホ（Ｂｌｏａｇｈ　Ｈ，Ａ、）達の「ヘルペスウィルスとウィルス化学療法（Ｈｅｒｐｅｓｅ　ｖｉｒｕｓａｎｄ　ｖｉｒｕｓ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）　Ｊコノ（Ｒ，Ｋｏｎｏ）編、２１１′２１４頁１エルセビエ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、Ｔムステルダム、１９８５年；ブロッホ（Ｂｌｏｕ−ｇｈ　）１．Ａ、）とシュンドーリ（Ｇｉｕｎｔｏｉｉ　Ｒ，）の「アメリカ医学異語（Ｊ、　Ａｎｄ、１ｌｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、）Ｊ　、２４１．　２７９８〜２’８０１．１９７９年〕。

最近、２ｄＧ］ｃがＨＩＶ、その他のレトロウィルスおよびこれらの結合タンパクに対して抗ウィルス作用を有することが報告された〔ブロッホ（Ｂｌｏｕｇｈ　Ｈ，Ａ、）、バラエル（ＰａｕｗｅｌｓＰ、）、クラーク（ＣＩｅｒｃｑＥ、）、コニ、、−（ＣｏｎｉｅａｕｘＪ、）、ゴールドバーブ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ　Ｓ、）、シリ−（Ｔｈｉｒｙ　Ｌ、）のｒＢｉｏｃｈｅｍ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、Ｊ　、　１４１．　３１〜３６．１９８６年；　ブ０７ホ（ｅｎｏｕｇｈｌｌ、Ａ、）達の「ヘルペスウィルスとウィルス化学療法（Ｈｅｒｐｅｓｅｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｖｉｒｕｓ　ｃｈｅｍｏ−ｔｈｅｒａｐｙ）Ｊコノ（Ｒｏにｏｎｏ）編、２１１〜２１４、エルセビエ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、アムステルダム、１９８５）。

本発明者達はグリコジル化抑制剤（ｉｎｈｉｂｉｔｔｅｕｒ　ｄｅ　ｇｌｙｃｏｓｙｌ−ａｔｉｏｎ）がＨＩＶとある種のレトロウィルス、すなわちウシの白血球ウィルスおよびヒヒの内在性ウィルスの固定、侵入および融合をブロックするのに効果的であることを世界で最初に発表した〔ブ０７ホ（Ｂｌｏｕｇｈ　Ｈ，Ａ、）　ｒＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏａ＋−ｒａｕｎ、　」１４１．　３１〜３６．１９８６年；　ブ０７ホ（Ｂｌｏｕｇｈ　Ｈ，Ａ、）達の「ヘルペスウィルスとウィルス化学療法（Ｈｅｒｐｅｓｅ　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄｖｉｒｕｓ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）　Ｊ　：２ノ（Ｒ，Ｋｏｎｏ）編、２１１〜２１４　、エルセビｘ　（Ｂｌｓｅｖｉｅｒ）、アムステルダム、１９８５；シリ−（Ｔｈｉｒｙ　Ｌ、）、ブ０７ホ（Ｂｌｏｕｇｈ　Ｈ，Ａ、）達の「ウィルス病生理学（Ｖｉｒａｌ　Ｐａｔｈ−ｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、ガラｔ７　（Ｒ，Ｇａ１ｌｏ）編、イタリー、１９８４年〕。

すなわち、グリコジル化抑制剤はレトロウィルスに感染した細胞（例えば、ヒヒの内在性ウィルスに慢性感染した細胞）の溶解を促すということを示した。ヘルペスウィルスの場合〔ガッラー（Ｇａｌｌｈｅｒ　１１．Ｒ，）、レビタン（Ｌｅｖｉｔａｎ　Ｄ、Ｓ、）およびブロッホ（Ｂｌｏｕｇｈ　Ｈ，Ａ、）　’ウィルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」、５５、１９３〜２０２．１９７３年］と、人間への感染症への治療は成功している［シＩＪ　−（Ｔｈｉｒｙ　Ｌ、）達「ウィルス病態生理学（Ｖｉｒａｌ　Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）Ｊガフ　０　（Ｒ，Ｇａ１１ｏ）編、イタリー、１９８４年；　ブ０７ホ（ＢｌｏｕｇｈＨ，Ａ、）　とシュンドーリ（Ｇｉｕｎｔｏｌｉ　Ｒ，）　ｒアメリカ医学異語（Ｊ。

Ａｍ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、）Ｊ　、２４１．２７９９８〜２８０１．１９７９年〕。２−デオキシ−Ｄ−グルコース等の化合物を用いて治療に成功した患者数は７０００Å以上にのぼる（アメリカ合衆国特許第４３１５００１号と第４６０３ｉ２２号）。

現在、ＡＩＤＳの治療に用いられている２つの医薬すなわち５′−アジドチミジンすなわちシトプシン（ＡＺＴ）と３′。５°−ジブジキシシチジンは有害であることが分かっている。しかも、これらの医薬はそれらをリン酸化するのに細胞キナーゼを必要とし、これを用いないと効果がない。

本発明者は逆転写酵素（クローン化された酵素および／または精製された酵素）に直接作用する化合物を用いる方法を選択した。ぞして、グルコース類縁体とアルコール型のある種の脂肪族化合物に金を付加して、これらの化合物に少なくとも１つの５−Ａｕ結合を作るとＨＩＶ−１やＡＭＶのようなレトロウィルスの逆転写酵素に対して有効な抗ウィルス作用が生じるということを発見した。

これらの化合物の多くはリウマチ性関節炎の治療用（免疫抑制薬）として入手することができ〔ペイン（Ｐａｙｎｅ　Ｂ、　Ｈ，）とワルーロッパおよびアメリカ合衆国ではこの疾患の治療に用＾）れている。

本発明の第１に対象は、少なくとも１つのＳ　−Ａｕ結合を有する有機チオ化合物で構成されるレトロウィルスの逆転写酵素の特異的抑制剤にある。

この有機チオ化合物は特にチオグルコースであり、特にＯＨがＳＡｕ基または５ＡｕＲ基（ここで、Ｒは有機残基を表す）で置換されたグルコースまたはグルコース類縁体であるチオグルコースである。このチオグルコースは脂肪族アシル鎮を含んでいてもよい。

チオグルコースの例としては下記の式：の１−・β−Ｄ−オーロチオグルコースと、下記の式：の（２，３，４，６−テトラ−０−アセチル−１−チオ−β−Ｄ −グルコースビラナサト−５）（トリアセチルホスフィン）金が挙げられる。

後者の化合物は“ＡＩＪＲＡＮＯＰＩＮ”の商標で市販されている。

また、−３Ａｕ官能基を有する脂肪族チオ化合物でもよい。この−３Ａｕ官能基を有するチオ化合物の例としては下記の式：％式％の化合物が挙げられる。

本発明はさらに、有効成分として上記の化合物の少なくとも一方を薬理学または獣医学的有効量で含むことを特徴とするヒトおよび動物におけるレトロウィルスを原因とする疾患の治療および予防用の医薬組成物を対象とする。

この医薬組成物は特にヒトの免疫不全ウィルスＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶ２ｔ−原因とする疾患、ＡＭＶＣ＋−リ筋芽細胞腫ウィル：ｚ、　（Ａｖｉａｎ　Ｍｙｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ））を原因とする疾患、ＦＬＹ　［ネコ白血病ウィルス（Ｐｅｌｉａｎ　Ｌｅｕｋｅ−ｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）　］を原因とする疾患およびＥＩＡＶ［ウマ伝染性貧血症ウィルス（Ｅｑｕｉｎｅ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ａｎｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）］を原因とする疾患の治療と予防に用いられる。

本発明の医薬組成物として特に好ましいものは有効成分をリポソーム中にカプセル化したものである。そのためには、バロン（Ｂａｒｏｎ　Ｃ，）とブ０７ホ（Ｂｌｏｕｇｈ　Ｈ，Ａ、）のｒｌｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　」９．３３〜３９．１９８５年に記載の方法で、オクチルグルコシド中性洗剤を用いるのが好ましい。この方法を用いると、ＣＤ、分子と、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌ　１ｎｅ）およびコレステロールに対する量が増加したホスファチジル七’ＩＪン（ｐｈｏｓ−ｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）とを含むリポソームが調製できる。従って、本発明の化合物はリポソーム中に安定に封入することができる。

調製物は全て不活性雰囲気下でガラス容器中で貯蔵しなければならない。この方法を用いることによって、上記の化合物を細胞間物質へ向かって迅速に接近させることができるようになり、しかも、中枢神経系の細胞と単核細胞の上記の化合物に対する透過性を大きくすることができる。変形実施態様としては、オクチルグルコシドの合成で必要なものと同様な脂肪族アシル鎖Ｃｓ−Ｃｓを付加して変性した化合物を用いることもできる。この方法を用いると、上記の化合物は細胞間物質へ向かって迅速に接近でき、しかも、中枢神経系の細胞と単核細胞の透過性を大きくすることができる。これらの化合物、例えばプロビルオーロチオグルコシド、ヘキシルオーロチオグルコシドおよびオクチルオーロチオグルコシド等は合成することができる〔バロン（Ｂａｒｏｎ　Ｃ，）とブＯ−７ホ（Ｂｌｏｕｇｈ　Ｈ，Ａ、）　ｒｌｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　Ｊ　ｓ９．３３〜３９．１９８５年〕。

本発明の化合物自体は一２０℃の水性溶液で少なくとも２週間は安定である。

本発明の医薬組成物では、少なくとも１つのグリコジル化抑制剤、例えばＨＩＶ −１の進入（固定、侵入、融合）を遮断する２−デオキシ−Ｄ−グルコースや、シトプシン（Ａ　Ｚ　Ｔ）またはその誘導体、特にそのリン酸化誘導体（シトプシントリホスフェート）を上記有効成分と組み合わせることができる。

本発明の医薬組成物は特に静脈内投与の形をしているが、経口投与することもできる。

本発明の他の対象は、上記の化合物を用いたヒトおよび動物におけるレトロウィルスを原因とする疾患の治療および予防用医薬組成物の製造方法にある。

本発明のさらに他の対象は、上記の有機チオ化合物の有効量を投与して、ヒトおよび動物におけるレトロウィルスを原因とする疾患を治療および予防する方法にある。この場合、シトプシン（ＡＺＴ）またはそのリン酸化誘導体と組み合わせて投与することもできる、上記のＳＡｕ官能基を有する化合物が所望の作用を示すということは確認されている。１−β−Ｄ−チオグルコースや５−β−Ｄ−チオグルコースのような親の化合物もｇ　ｐ　１２０やｇｐ４１のグリコジル化反応を抑制する作用はあるが、濃度が２ｍＭ以上になると細胞毒性を示し、ポリメラーゼに対して全く効果がない。

また、本発明の化合物は、その鋭化合物の類縁体よりも毒性が低いということは、光学顕微鏡を用いた細胞複製時間とトリバンブルー排除時間の測定から確認されている。

以下、添付の図１から図８を参照して本発明の詳細な説明するが、以下の実施例は本発明を何ら限定するものではない。

図１、図２は逆転写酵素ＨＩＶ−ＲＴおよびＡ　Ｍ　Ｖ　−ＲＴの活性に対するオーロチオグルコースの効果を示すオートラジオグラフである。

図３はＲＮＡおよびＤＮＡマトリックスを用いて逆転写酵素に対するオーロチオグルコースの効果を比較したオートラジオグラフである。１−オクチルグルコシドの濃度は１〜１００１１Ｍの範囲にある。

図４はオーロチオグルコースのインビトロ活性に対するデオキシリボヌクレオチド（ＴＰ３、ウェル１〜４）の濃度と逆転写酵素の濃度（ウェル５〜２０）との効果を示すオートラジオグラフである。

図５は、ＡＭＶ−ＲＴによるＤＮＡ鎮の延長に対するオーロチオグルコースの効果を示すオートラジオグラフである。

ウェル１は抑制剤を添加しないで行ったｄＡＴＰ、ＴＴＰの存在下でのＡＭＶ− ＲＴによるヌクレチオド重合反応の停止に対応し、矢印は６つのヌクレチオドに対するバンドを表す。

ウェル２はｄ−ＡＴＰＳＴＴＰおよびｄＮＴＰの存在下でのＡ　Ｍ　Ｖ−ＲＴによる６つのヌクレチオドの重合後のオーロチオグルコースの添加による鎖伸長の抑止効果を表している。

ウェル３は抑制剤が存在しない場合にＡＭＶ−ＲＴによる６つのヌクレチオドの重合後に反応が停止せず、鎮が伸長することを示す図。

図６はオーロチオグルコースによる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　１ａＣｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼ１の抑制効果を示す図。

図７はオーロチオプロバノールによる逆転写酵素ＨＩＶＩ−ＲＴの抑制効果を示す図。

図８はリン酸化されたＡＺＴによるＨ　Ｉ　Ｖ　Ｉ　−ＲＴの抑制効果を示す図。

操作方法ウィルスの自己複製能を、感染した細胞（慢性感染）の前処置および／または非感染細胞ＣＥＭまたはＭＴ−４の前処置によってＨＩＶ−１に感染する前にテストした。ウィルスの自己複製能は、部分的に精製したウィルスのＲ，Ｔ、（逆転写酵素）活性を測定して調べた。また、これらの溶解ウィルス調製物の培養は、抑制剤（潜在的）の濃度を種々変化させて、ブロッホ（Ｂｌｏｕｇｈ　Ｈ，Ａ、）達の”Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｃｏｍａ＋ｕｎ、”、　１４１．　３１〜３６．１９８６に記載の方法で行った。

（グリコプロティン合成に対する医薬効果）ＣＥＭまたはＭＴ−４細胞をＨＩＶ −１に感染させた。感染の４時間後、細胞の半分を２．５〜５．９　μｃｉのＭ　ａ　ｎ　−２−’ＨｔたはＧＩ　ｅＮＡｃ−６−３Ｈで標識した。培地を変化え、新鮮な抑制剤（潜在的）と適当なアイソトープを２．５μＣｉ　（または５ μＣｉ）だけ添加した。感染後３日と７日後に細胞を溶解させ、その細胞溶解液を１２．０００　ｇで遠心分離した。カラム上での免疫沈澱によってｇ　ｐ　１２０とｇｐ４１とを互いに分離し、これらを１２％ポリアクリルアミドゲルとフルオログラフィーで分析した［クマラサミイ（Ｋｕｍａｒａｓａｍｙ　Ｒ，）とブＯ−７ホ（Ｂｌｏｕｇｈ　！（、Ａ、）　“ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、’　１０９．１．１０８〜１１１５．１９８２年］。ウィルスを回収し、速度を制御しながら５〜４０％のクエン酸す）　ＩＪラムまたはメトラブミド勾配中で遠心分離して精製し、同様に分析した。

（融合）慢性感染細胞または未感染のＭＴ−４細胞を種々の抑制剤で予備処理し、ブロッホ（Ｂｌｏｕｇｈ　Ｈ，Ａ、）の’Ｂｉｏｃｈｅｍ：Ｂｉｏｐｈｙｓ。

（：ｏｍｍｕｎ、’、旦１，３１〜３６．１９８６年に記載の方法で、融合テスト−多核細胞の数のカウント−を行った。

（逆転写酵素）精製され、クローンニングされた酵素的に活性な酵素を大腸菌（Ｂｓｃｈａｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１）内で調製した［ハイジ（）ｌｉｚｉ　Ａ）、マクギＳｃｉ、υＳＡ’　８５．１２１８〜１２２２．１９８８年に記載の方法コ。

Ｒ，Ｔ、の定量は、ＤＮＡマトリックス（無作為およびＨＩＶシーケンスで）と放射能で標識したプライマー（開始釦）とを用いて行った。ＤＮＡマトリックスとプライマーとの間に錯体が形成された後にＲ，Ｔ、を添加し、培養した。抑制剤は錯体の形成前または後に種々の濃度で添加した。鎖の開始と伸長は２０％Ｐ、　Ａ、　Ｄ、　Ｇ、を用して調べた“シヱーン（Ｓｈａｎｅ　Ｄ、　Ｌ）グツドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ　Ｍ、Ｆ、）、エコール（Ｂｃｈｏｌｓ　Ｎ、Ａ、）　 ”核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）”　１６．１２１８〜１２２２．１９８８年］。また、生成物の分析はオートラジオグラフによって行った。各種のマトリックスと条件を用いて各官能基を区別した。また、トリ骨髄芽球腫症（ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｅ）ウィルスから得られる市販のＲｌＴ、も使用することができた。

Ｒ，Ｔ、の抑制剤効果の測定は以下のように行った：（Ａ）下記を含む反応混合物１７１を調製する：ＤＮＡマトリックス　１０−’ＭＤＮＡブライ７−　４ＸＩＯ−”　Ｍ／ＤＮＡプライマー　５°［”Ｐ］ＨＩＶ−ＲＴ緩衝液　２ｔｔｌ　（［１０ｘ〕５００ｍＭ　）リスＨＣｌ５ｐＨ？、８　、ＭｇＣｌ２６０ｍＭ；ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏ− ｔｈｒｅｉｔｏｌ）　５００ｍＭ　；　ＫＣＩ　５００ｍＭ）蒸留水　２０　ｎｍ　、　３７℃で再蒸留した水。

（Ｂ）ＨＩＶ−ＲＴ（７）１単位を１０分間、３７℃で添加する。

（１単位は、基質としてのポリ（Ａ）−（ｄＴ）、Ｓで酸中の不溶性生成物中に１ｎＭの（’Ｈ〕ＴＭＰを含む酵素活性に対応する）。

（Ｃ）各ｄＸＴＰを０．２５ｍＭ含むデオキシヌクレチオドトリホスフェード（ｄＸＴＰ）の混合物を、最終混合物の容積が２０μｌとなるように３７℃で５分かけて添加する。

（Ｄ）抑制剤をテストするために、各生成物（容積は一定）を種々の濃度でｄＸＴＰの混合物に添加（Ｂ段階と同じ）する。反応混合物を３７℃で、１０ｎ１間培養する。

（Ｅ）９０％ホルムアミド中のＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　ＩＯｎＭで反応を停止させる。

（Ｆ）サンプルを９０℃で５分間加熱し、尿素の存在下で２０％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で生成物を分離する。

（Ｇ）伸長・合成等の差をオートラジオグラフによって検出し、抑制剤を使用いない「対照」と比較する。

抑制剤として１−オーロチオグルコースを用いてＨＩ　Ｖ−ＲＴとＡＭＶ−ＲＴについて行ったテスト結果は図１と図２のオートラジオグラフに示しである。

１−オーロチオグルコースの量が比較的低い３μＭ以下でも、４０ｎｍのＨＩＶ −Ｒ，Ｔ、−’基質錯体を遮断するのに有効であることが明らかである（図１）。種々のＲＮＡマトリックスを用いた時の同様な比較結果も得た。図３はＤＮＡとＲＮＡのマトリックス濃度を種々変えて得られたオートラジオグラフである。

同様に、上記抑制剤を遊離酵素に直接作用させることもできる。

すなわち、Ａｕ置換した類縁体と錯体化されていない酵素とを一緒に培養することによって遊離酵素に直接作用させることができる。１−オーロチオグルコースの濃度をより高くしなければならない点を除いて、ＡＭＶで得られた結果（図２）に匹敵する結果が得られている。

また、１−オーロチオグルコースの抑制作用に対するデオキリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）濃度の影響を調べるテストも行った。

すなわち、上記方法によってＤＮＡおよびＲＮＡマトリックスを用いて、ＮＴＰの濃度を２５０　ｎＭ〜２５０μｍの範囲で変えて実験を行った。

図３のウェル１〜４に示すように、オーロチオグルコースの抑制定数（Ｋｉ）には変化がないことが観察され、これは、この分子が、ｄＮＴＰとは異なる結合塵を有しているということ示唆している。

また、オーロチオグルコースの抑制活性に対するＨＩＶＩ−ＲＴ濃度の影響もテストした（図４のウェル５〜２０）。

各重合段階での１−オーロチオグルコースの効果ある種のポリメラーゼは、それらのマトリックスに結合された時または逆転写（ＤＮＡの重合）に実際に組み込まれた時に種々の医薬の抑制効果に対して大きな耐性を示すということは多数の文献で指摘されている。

従ッテ、Ｈ■Ｖエウィルスの逆転写酵ｉ　（ＨＩＶＩ−ＲＴ）に対する１−オーロチオグルコースの伸長段階での効率を、溶液中の遊離酵素に対する効率と比較するテストを行った。

すなわち、１−オーロチオグルコースによる抑制効果を以下に対してテストした：（ａ）　遊離酵素に対して（ｂ）　マトリックスと錯体化した酵素に対して（ｃ）　伸長段階にある酵素に対してこれらのテストは上記と同様に実施した。

（ａ）の場合には、反応緩衝液中で１−オーロチオグルコースの濃度を種々変化させて、３０℃で５分間、酵素を予備培養し、次いで、プライマー（開始釦）− マトリックスハイブリッドと、デオキシリボヌクレチオド（ｄＸＴＰ）とを混合物に添加し、３７℃で５分間培養した。

（ｂ）の場合には、プライマー（開始釦）−マトリックスハイブリッドと一緒に酵素を３７℃で１０分間培養し、次いで、種々の濃度の１−オーロチオグルコースと、デオキシリボヌクレチオド（ｄＸＴＰ）とを添加し、その混合物を３７℃ で５分間培養した。

（Ｃ）の場合には、酵素、プライマー−マトリックスハイブリッドおよび４つのデオキシリボヌクレオチドの中の２つを添加して３７℃で５分間培養した。濃度を大きくしたＩ−オーロチオグルコースと一緒に他の２つのデオキシリボヌクレオチドを同時に添加し、３７℃で５分間培養した。この場合には、１−オーロチオグルコースを添加する前に、ＨＩ　Ｖ　Ｉ　−ＲＴは複数回の伸長サイクルを行った。

（ｂ）と（Ｃ）の場合には１−オーロチオグルコースに対して同じ感受性が観察された。これに対して、遊離酵素を用いた実験の場合には、抑制定数（Ｋｉ）を３３％に小さくすると、１−オーロチオグルコースによる抑制に対する感受性が大幅に増大することが観察された。

（ａ）の場合について記載した方法を用いて実験を行って、抑制定数（Ｋｉ）の変化を酵素濃度の関数で測定した。その結果、酵素濃度が大きくなると抑制定数（Ｋｉ）が大きくなることが分かった。

また、オーロチオグルコースの濃度を高くした状態で酵素とプライマーーマトツリクスハイブリッドとを濾過した実験も行った。実験条件は上記と同じである。

この実験条件（酵素濃度は０．１５％Ｍ〜１ｎＭの範囲で変え、オーロチオグルコースの濃度は０．１μＭ〜１００μＭの範囲で変える）では、酵素−マトリックス結合は弱いということが示された。

従って、オーロチオグルコースの抑制作用は酵素に対して行われ、マトリックスのシーケンス（ＤＮＡまたはＲＮＡ）には無関係であるということが分かる。この抑制剤はマトリックス上の酵素の結合サイトを緩めている。

また、オーロチオグルコースはインビトロでヒトのＤＮＡポリメラーゼに対して弱い抑制作用を有している。

鋭化合物、例えば、１−チオグルコースや５−チオグルコースは約３．５％Ｍの濃度で（インビトロのＡＬＥＸ細胞やＭＴ−４細胞に対する）グリコジル化反応に有効であるが、ウィルスのＲ，Ｔ、に対しては効果はないということが分かっている。

しかも、細胞に対する毒性が強過ぎるため、臨床で使うことは制効果は、ＨＩ　Ｖ　Ｉ−ＲＴと０〜２ｍＭの濃度のオーロチオプレパノールとを含む調製物の効果を示す図７のオートラジオグラフから確認される。

種々の研究から、化合物（Ｉ）の作用機構はＡＺＴ）！Ｊホスフェートの作用機構とは完全に異なり、しかも、それよりもはるかに有効であることが分かっている。

これらの研究の一つが図８に示されている。図８は、ＨＩＶＩの逆転写酵素（ＨＩＶ−１−ＲＴ）と、濃度が０．１μＭ〜１ｍＭのＡＺＴとを含む調製物のオートラジオグラフである。この結果を図１の結果と比較することによって、１−オーロチオグルコースは、３′−アジド−ＤＴＰＰの１５００倍の効果があることが分かる。

また、アジドプシン（ＡＺＴ）とオーロチオグルコースとの作用は付加的であり、これらの２つの化合物に相乗作用があることが分かる。

シトプシン（ＡＺＴ）／オーロチオグルコースの組合せによって、逆転写酵素の半分の抑制効果を観察するのに必要なＡＺＴの投与量よりも少ない量のＡＺＴを投与すればよいということが分かる。

本発明の新規化合物は静脈中または筋肉中に投与できる。本発明の新規化合物を含む組成物は、例えば注射用水性賦形剤中に金３５％を含む化合物を添加した注射可能な溶質の形にすることがでる。この溶質は、はぼｐＨ７の注射用塩化ナトリウム溶液０．９％と一緒にして、例えば容量２ｍ１７のアンプルにすることができる。

投与量は治療すべき疾患や症状によって変えられる。治療開始時には、４〜６回分の投与量を週に１回か２回に分けて投与する投与頻度にすることができる。その後、３か月の間、月に２回注射し、その後は月に１回注射することができる。

ＡＩＤＳの治療の場合は、予防のために、６か月間、月に１回投与することができる。血清反応陽性を変化させるための治療を３か月間行い、それを例えば２回繰り返すことができる。

ヒトの場合、１投与量当たりの有効量は約２５〜１００■の範囲で変えることができ、体重１ｋｇ当たり１．５〜２．５■の範囲で変える。

経口投与用には通常の賦形剤を用いてカプセルや錠剤の形で用いることができる。安定剤や適当な添加剤、例えばラフ）　−ス等と組み合わせることもできる。

１投与当たりの有効成分量は、ヒトの場合、体重１ｋｇ当たり２．５〜５．０■ の範囲で変えることができる。最初の数か月、例えば３か月間は毎日投与し、その後、間隔を広くし、特に２日毎に投与する。

いくつかのＤＮＡポリメラーゼに対してテストをした。

（１）　ヒトの胎盤のＤＮＡポリメラーゼα［ソ連、ノボシトリスクのオルガ　ラブリッグ（Ｏｌｇａ　ＬＡＶＲＩＫ）博士から提供されたもの］（２）部分的に精製されたラット肝臓のＤＮＡポリメラーゼα［フランス、ピルジュイフのレコンド（Ａ、　Ｍ、　ｄｅ　ＲＥＣＯＮＣＯ）博士から提供されたちの］。

（３）　大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１）のＤＮＡポリメラーゼＩ　［ＢＲＬから提供されたもの］。

これらの実験によって、ヒトのＤＮＡポリメラーゼαは投与濃度が１ｍＭ以下ではオーロチオグルコースによる抑制に感受性がなく、一方、ラットＤＮＡポリメラーゼαはオーロチオグルコースに感受性があるが、それは濃度が１００μＭより大きい場合だけであり、大腸菌ポリメラーゼＩは、濃度が５０μＭより高い時にオーロチオグルコースに感受性があることが分かった。

図６はオーロチオグルコースによる大腸菌（Ｂｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　１ａＣｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼ１の抑制効果を示すオートラジオグラフである。

本発明の化合物を含む組成物はリポソームを用いて投与することができる。このリポソームは、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン：コレストロール：ジアセチルホスフェードを２　：　１．５　＋　０．２２の比で含んだもので構成することができる。

オーロチオグルコースを含んだリポソームは、リバルビリンを含むリポソームの調製方法について記載した方法で調製することができる［ケンデ（Ｋｅｎｄｅ）とアルタ−（Ａｌｔｅｒ）　“抗菌剤と化学療法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍ　Ｔｈｅｒ）’　２７．９０３〜９０７．１９８５年］。このリポソームはオーロチオグルコース２５％を含むことができ、その量は原子吸光分析によって調べることができる。このリポソームはバロン（Ｂａｒｏｎ）の方法［“Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ”９．３３〜４３．１９８３年コを用いて洗剤中に溶かし、透析することによって調製することもできる。

そのようなオーロチオグルコースを含むリポソームを、週齢５〜６週間の雌のスイスマウスに、マウスの体重２５ｇ当たりオーロチオグルコース３７６５マイクログラム当量で用いて、腹膜組線内投与した。１２日間毎日注射した。１４日後でも毒性の徴候は全く見られず、致死率はゼロであった（マウス６匹について）。

当然のことながら、上記の指示は一般的な状況についてものであり、問題とする疾患の特定の状態に適合させなければならない。しかし、下記の場合には禁忌に注意を払う必要がある：妊娠、肝不全、腎不全および子供の治療。

ＦＩＧ、Ｉ　ＦＩＧ、２ＨＩＶ１−ＲＴ　ＡＭＶ−ＲＴＪＪＭ　ＡｕＴ　ＪＪＭ　ＡｕＴＦ工ＧＬＡＲＥ　３ＦＩＧすＲＥ４ＦＩＧ’ＪＲＥ　５Ｆ工ＧｔＪＲＥ　６Ｆ工（ＡＲε７ＺＴ−ＴＰ％ｗ１〜−一嘲−１ｒＸＧ’ＪＲＥ　８国際調査報告一纏−−−銅一轄障＆　ｋ　ｘテ／Ｉ＋ＤＱｌ’ｌ／ｌｌＭｏ−＋国際調査報告ＦＲ９０００３８７ＳＡ　３７６４８

Claims

【特許請求の範囲】

１．少なくとも１つのＳ−Ａｕ結合を有する有機チオ化合物を用いたヒトおよび動物におけるレトロウイルスを原因とする疾患の治療と予防用医薬製造方法への使用。
２．有機チオ化合物がチオグルコースであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
３．チオグルコースが、グルコース、またはＯＨがＳＡｕ基またはＳＡｕＲ基（ここで、Ｒは有機残基である）によって置換されたグルコース類縁体であることを特徴とする請求項２に記載の使用。
４．チオグルコースがＣ３−Ｃ８脂肪族アシル鎖を付加した変性チオグルコースであることを特徴とする請求項２または３に記載の使用。
５．変性チオグルコースがプロピルオーロチオグルコシド、ヘキシルオーロチオグルコシドまたはオクチルオーロチオグルコシドであることを特徴とする請求項４に記載の使用。
６．チオグルコースが１−β−Ｄ−オーロチオグルコースであることを特徴とする請求項３に記載の使用。
７．チオグルコースが（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β −Ｄ−グルコピラナサト−５−トリアセチルホスフィン−金であることを特徴とする請求項３に記載の使用。
８．上記有機チオ化合物が脂肪族化合物であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
９．上記のＳ−Ａｕ官能基を有する脂肪族チオ化合物が下記の式：ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ａｕ・Ｎａ２ＳＯ３の化合物であることを特徴とする請求項８に記載の使用。
１０．上記チオグルコースがジドブジン（ＡＺＴ）またはその誘導体、特にリン酸化誘導体と一緒に用いられることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
１１．有効成分として少なくとも１つのＳ−Ａｕ結合を有する有機チオ化合物で構成されるレトロウイルス逆転写酵素に特異的な抑制剤を薬理学および獣医学上の有効量で含むことを特徴とするヒトおよび動物におけるレトロウイルスを原因とする疾患の治療および予防用の医薬組成物。
１２．上記有機チオ化合物がチオグルコースであることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
１３．チオグルコースがグルコースまたは一つのＯＨがＳＡｕ基またはＳＡｕＲ基（ここで、Ｒは有機残基である）によって置換されたグルコース類縁体であることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
１４．チオグルコースがＣ３−Ｃ８脂肪族アシル鎖を付加した変性チオグルコースであることを特徴とする請求項１２または１３に記載の組成物。
１５．変性チオグルコースがプロピルオーロチオグルコシド、ヘキシルオーロチオグルコシドまたはオクチルオーロチオグルコシドであることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
１６．チオグルコースは１−β−Ｄ−オーロチオグルコースであることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
１７．チオグルコースが（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ− β−Ｄ−グルコピラナサト−５−トリアセチルホスフィン−金であることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
１８．上記有機チオ化合物が脂肪族化合物であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
１９．上記のＳ−Ａｕ官能基を有する脂肪族チオ化合物が下記の式：ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ａｕ・Ｎａ２ＳＯ３の化合物であることを特徴とする請求項１８に記載の組成物。
２０．ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＡＭＶ、ＥＩＡＶおよびＦＬＶウイルスを原因とする疾患の治療に用いることを特徴とする請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
２１．上記有効成分がリボン−ムをリポソーム内にカプセル化されていることを特徴とする請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
２２．上記有効成分が２−デオキシ−Ｄ−グルコースのような少なくとも１つのグリコシル化反応抑制剤と組み合わせて用いられることを特徴とする請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
２３．上記チオ有機化合物がジドブジン（ＡＺＴ）またはその誘導体、特にリン酸化誘導体と組み合わせて用いられることを特徴とする請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
２４．静脈内に投与できる形態であることを特徴とする請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
２５．経口投与できる形態であることを特徴とする請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
２６．１つのＳ−Ａｕ結合を有する有機チオ化合物を有効量投与することを特徴とするヒトおよび動物におけるレトロウイルスを原因とする疾患の治療および予防方法。
２７．上記有機チオ化合物がチオグルコースであることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
２８．上記チオグルコースがフルコースまたは１つのＯＨがＳＡｕ基またはＳＡｕＲ基（ここで、Ｒは有機残基である）によって置換されているグルコース類縁体であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
２９．上記チオグルコースがＣ３−Ｃ８脂肪族アシル鎖を付加した変性チオグルコースであることを特徴とする請求項２７または２８に記載の方法。
３０．変性チオグルコースがプロピルオーロチオグルコシド、ヘキシルオーロチオグルコシドまたはオクチルオーロチオグルコシドであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
３１．チオグルコースが１−β−Ｄ−オーロチオグルコースであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
３２．チオグルコースが（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ− β−Ｄ−グルコピラナサト−５−トリアセチルホスフィン−金であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
３３．上記有機チオ化合物が脂肪族化合物であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
３４．上記のＳ−Ａｕ官能基を有する脂肪族チオ化合物が下記の式：ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ａｕ・Ｎａ２ＳＯ３の化合物であることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
３５．上記チオ化合物がリポソーム内にカプセル化されていることを特徴とする請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
３６．上記チオ化合物が２−デオキシ−Ｄ−グルコースのような少なくとも１つのグリコシル化反応抑制剤と一緒に組み合わせて用いられることを特徴とする請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の方法。
３７．上記チオ化合物がジドブジン（ＡＺＴ）またはその誘導体、特にリン酸化誘導体と組み合わせて用いられることを特徴とする請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の方法。