JPH04501504A - Ｄｎａの増幅方法および差し引き方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、２つの断片混合物のうちの一方に特有なりＮＡ断片の単離方法に関し 、特に、その断片を新規なリンカ−／プライマー操作法によって増幅する方法に 関する。

Ｓ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ、編、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ　、Ｑ ９８５＞、　７３゜Ｓ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ、編、　ＴＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　 ０ｘｆｏｒｄ　（１，９８５）、　３゜Ｂｒ１ｔｔｅｎ、　Ｒ，Ｊ、およびＫｏ ｈｎｅ、　Ｄ、Ｂ、、　５ｉｅｎｃｅ、　（１９６８）、　１６１：５２９゜ Ｄａｖｉｄｓｏｎ、　Ｂ、、　Ｇｅｎｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　Ｅａｒｌｙ 　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、（１９７６）。

Ｂ、Ｎ、　Ｆｉｅｌｄｓおよびり、Ｍ、　Ｋｎｉｐｅ、編、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒ ｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８６）　１６１゜ Ｋｏｈｎｅ、Ｄ、Ｅ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７７）　１６（２ ）：５３２９゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　（１９８２）、２８０゜２つの細胞もしくは体液の起源の１つに特有の核酸 配列を同定し単離する性能は、医学に重要な用途がある。１つの用途は、所定の メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）種が存在しているかもしくは存在していな いかに基づいて、ある種の疾病状態を理解し予測する用途である。例えば、特定 の細胞のタイプの中の特異的タンパク質をコードするｍＲＮＡが存在しないかま たは変化しているということは、遺伝性疾患の直接原因であることが多い。他方 、付加されたｍＲＮＡの種が存在することは。

悪性の形質転換の開始、またはその他の点で検出できない感染因子の潜伏的存在 を知らせる信号となる。鎌状赤血球貧血。

その他の異常血色素症および地中海貧血症のようないくつかの遺伝性疾患は、高 存在率のｍＲＮＡの性質もしくは存在の変化が原因であるが、遺伝性疾患の多く 　（高比率）は、低存在率のｍＲＮＡによってコードされる特異的タンパク質が 存在していないかまたはこのタンパク質が変化していることが、原因であるかも しくは原因となっているらしいことが示されている。

これらの疾患には、特にレシューナイハン症候群、ハンター症候群、フルラー症 候群、ティーサックス病、およびアデノシンデアミナーゼ欠損症が含まれる（Ｓ ｔａｎｂｕｒｙの文献参照）。

その異常な活性化によって悪性の形質転換をもたらすいくつかの癌遺伝子が存在 することも知られているので（ＶａｎＢｅｖｅｒｏｗの文献参照）、　ｍＲＮＡ 種の変化を検出することは、そのような形質転換を早期に検出するのに重要な用 途になる。

非反復性配列の単離法のその他の用途は９診断と、ウィルスなどの細胞もしくは 体液起源の因子の研究における用途である。例えば、ウィルス特異的ｍＲＮＡの 転写は、潜伏性ウィルス感染症の再活性化の最初の指標である（Ｋａｕｆｆｍａ ｎの文献参照）。またこの方法は、ウィルス因子の単離と同定にも用いることが できる。

ゲノムの非反復性配列の単離法は、細胞活性化、胚の発生もしくは細胞周期の進 行における遺伝子の発現の研究、および疾患に関連するゲノム領域の存在もしく は不存在に関係する遺伝子疾患の分析に用途がある。

非反復性ｍ　ＲＮ　Ａ　＊相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）もしくはゲノム断片の検 出と単離における大きな問題の１つは、起源材料に存在する多数の高存在率の種 によって引き起こされる妨害である。例えば、いずれの与えられた細胞系にも、 　１０．０００〜３０．０００の全く異なるｍＲＮＡ種があり（Ｄａｖ　１ｄｓ ｏｎの文献参照）、これらの濃度範囲は、１細胞当たり数十万分子（高存在率の 種の場合）から１細胞当たりわずかに数分子（低存在率の種の場合）、の範囲に わたっている。したがって９問題の非反復性の種の存在率が比較的低い場合には 、非反復性種の比率は１０６中に対して１というような低い値であり得る。

非反復性配列種の単離と分析とを目的とする多くの核酸ハイブリダイゼーション の手法が従来開発されてきた。これらの方法は、ワトソンークリック型塩基対の 相互作用によって配列特異的方式で再結合する変性核酸の能力に依存している（ Ｂｒ　１ｔｔｅｎの１９６８年と１９８５年の文献参照）。復元が起こる比率は 、試料に存在する配列の複雑さ１色々な種の絶対的濃度および相対的濃度、　Ｄ ＮＡ断片の長さ、および反応が行われる条件によって決定される（）ｔａｍｅｓ の文献参照）。

あるハイブリダイゼーション法では９選択した遺伝子プローブｃＤＮＡは標識化 され、一本領形で、　ｍＲＮＡ転写体の飽和混合物に添加される。プローブ関運 転写体の種の存在は、二本鎖物質中に取り込まれた標識化プローブｃＤＮＡの量 によって評価される。この方法は、一般に、高存在率および中程度の存在率の転 写体については適しているが、バックグラウンドのレベルが高いため、低存在率 のｍＲＮＡの同定と分析に必要な感度を欠いている。

従来のｃＤＮＡライブラリーとフィルターとのハイブリダイゼーション法は、２ つの異なる起源由来の低存在率のｍＲＮＡの差異を同定するのに使用され得る　 （Ａｎｄｅｒｓｏｎの文献参照）。しかしほとんどすべての低存在率のｍＲＮＡ の存在を保証するには百方を越えるライブラリークローンが必要なので、この方 法をスクリーニングプログラムには事実上利用できない。

核酸差し引き法（ｎｕｃｌｅｉ＋、ａｃｉｄ　５ｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓ）も、類縁細胞タイプ間の低存在率ｍＲＮＡの差異の研究に使用 することが提案されている（！Ｊａｎｉａｔｉｓの文献参照）。この方法では、 ２種の起源由来のｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ調製物を完全にハイブリダイズさせ た後、ハイブリダイズしていない残りを。

問題の種の存在について検査する。この方法では、従来実施されてきたように、 特に問題の種が比較的低存在率のｍＲＮＡの場合には、比較的多量のｍＲＮＡお よび／またはｃＤＮＡの出発物質が必要である。このような制限があるため、非 反復性の種の全濃度が低い場合、対象の多数の体液もしくは細胞の試料について この方法を用いることが不可能となっている。

４、発明の要旨 従って９本発明の目的は、２つの混合物の一方に特有なＲＮＡもしくはゲノムの 配列を単離する方法で、従来技術に付随する多くの上記問題点を克服した方法を 提供することである。

本発明より特定された目的は、ゲノムもしくはＲＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡ断片の 混合物中に低濃度および／または低モルの比率で存在する非反復性種の同定が可 能な方法を提供することにある。

本発明の他の特定の目的は１反復断片の増幅および／または選択の工程で必要な 分析の度合と感度を増大し得る方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、非反復性配列を単離する方法に用いられる。新規な リンカ−／プライマーＤＮＡの増幅法を提供することにある。

本発明には、１つの局面においては９次の方法が含まれる。

すなわち、２つの断片混合物のひとつに特有の二本鎖ＤＮＡ断片、　（つまり、 陽性の起源由来の二本鎖ＤＮＡ断片混合物中には存在するが、陰性の起源由来の 断片混合物には存在しない断片）を単離する方法が含まれる。この方法を実施す る際には、二本鎖リンカ−を断片混合物の各々に連結し１次に以下の工程を連続 的に繰り返すことによって各混合物中の断片の数を増幅させる：（ｉ）該断片を 変性して一本鎖の断片を産生させること、（ｉｉ）その配列が各鎖の一つの末端 におけるリンカ−領域に相補的であるプライマーと、該一本領とをハイブダイズ させて鎖／プライマー複合体を形成させること、および（ｉｎ）該鎮／プライマ ー複合体を、ポリメラーゼとデオキシヌクレオチドとの存在下で二本鎖断片に変 換すること。所望の断片の増幅が達成された後、２つの断片混合物を変性し９次 いで、２つの混合物に結合しているリンカ一部分がハイブリダイズしない条件下 でハイブリダイズさせる。次に、陽性起源の混合物に特有のＤＮＡ種、すなわち 陰性起源の混合物由来のＤＮＡ断片とハイブリダイズしないＤＮＡ種、を選択的 に単離する。

断片混合物は、ゲノムＤＮＡから得られるか、またはメツセンジャーＲＮＡ調製 物由来であり得る。ひとつの好適な実施態様においては、２つの混合物における 断片は各々平滑末端とされ９次いで別の平滑末端のプライマーと連結する。陽性 起源の断片に連結したリンカ−は、該断片を選択された制限エンドヌクレアーゼ で切断することの可能な内部制限部位を有しており、この方法で単離される非反 復性断片を、適切なベクタークローン化部位に挿入することによって、クローン 化することができる。

好適な実施態様においてはまた。陰性起源の断片は、ハイブリダイズさせる前に ビオチン化され、ハイブリダイズーう・フン反応時には大過剰モル濃度で存在し ている。陰性起源の断片は、その断片を開裂させることが可能で、かつビオチン 化ヌクレオチドの存在下、ポリメラーゼを用いて充填してビオチン化することの 可能な内部粘着末端制限部位を有していることが好ましい。

上記の方法で単離された種は、さらに増幅および選択され。

非反復性配列の富化が促進される。

また本発明には、二本鎖ＤＮＡ断片の増幅法が含まれる。この方法は次の工程を 包含するユニ重鎖リンカ−を断片に連結し、各断片中の２つの鎖を、断片を変性 することによって複製して、リンカ−鎖の末端を有する一本鎖の断片を調製する 工程：この−重鎖を、プライマー（各断片鎖のリンカ−鎖末端に相補的な配列の プライマー）とハイブリダイズさせて。

鎖／プライマー複合体を生成する工程；および、得られた鎮／プライマー複合体 を、ポリメラーゼとデオキシヌクレチドとの存在下において、二本鎖断片に変換 する工程。上記断片を複製する工程は、所望の程度の増幅が達成されるまで繰り 返して行なわれる。

以下の発明の詳細な説明を、添付図面を参照して読むことにより１本発明の前記 の目的およびその他の目的、そして本発明の特徴がより充分に理解される。

図面の簡単な説明 第１図は本発明のリンカ−／プライマー二本鎖増幅法のダイアダラムである。

第２Ａ図から第２Ｃ図は、末端を平滑化した二本鎖断片（実線）の反対側の末端 に連結した１本発明を実施するのに用いられるリンカ−の３つの例の配列を示す 。

第３図は９本発明を実施する際の、増幅されたｃＤＮＡ断片をビオチン化する一 方法を示す。

第４図は、ある断片源に特有のＤＮＡ断片を単離する１本発明のダイアダラムを 示す。

第５図は所定のウィルス因子に感染した個体に特有のＲＮＡ由来の配列を単離す るのに用いられる。第４図に示す単離法の説明図である。

第６図は、第１図の増幅法の説明図であり、この方法は。

感染した動物由来の胆汁中にＥＴ−ＮＡＮＢウィルス因子が存在することを確認 し、感染した個体中にウィルス因子が存在することを検定するのに用いられる。

第１図は９本発明による二本鎖ＤＮＡ断片の増幅法を示す。

二本鎖断片は一般に断片混合物中に存在し、そして典型的には、メツセンジャー ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）転写種から産生されたｃＤＮＡ断片の混合物中に存在して いるが、ゲノムＤＮＡ断片もしくは直線状にしたベクターもしくはベクター断片 も適当である。

血清もしくは胆汁のような細胞もしくは体液の試料からｍＲＮＡ種を単離する方 法がよく知られている。１つの方法は、バナジル−ＲＮＡ複合体を形成し、クロ ロホルム／フェノールでタンパク質を抽出し１次いで冷エタノールで沈澱させる 方法である。第２の方法では、　ＲＮＡをグアニジンイソチオシアナート混合物 からフェノールで抽出し９次にクロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、 水性相から冷エタノールでＲＮＡを沈澱させる（詳細は１本願に引用した！Ｊａ ｎｉａｔｉｓの文献１８８〜１９８頁とその他の文献を参照されたい）。

一般に、真核ｍＲＮＡは９個体の支持体に結合させたオリゴｄＴを用いてアフィ ニティークロマトグラフィーで単離され得るポリＡ終止配列により特徴づけられ る。さらに、もしくはその代わりに、単離された全ＲＮＡは、密度勾配遠心分離 法もしくはアガロースゲル電気泳動法でさらに分画してＲＮＡ種の所望のサイズ の両分を得ることができる。

単離されたｍＲＮＡ転写体からの二本鎖ｃＤＮＡの調製は、従来のオリゴｄＴ法 で行うか、または第１鎮（第１のストランド）合成のランダムブライミングで行 われる。前者の方法は、ポリＡ　ＲＮＡのみに由来する二本鎖ｃＤＮＡが所望の 場合に有利である。

この方法では、　ＲＮＡ転写体はオリゴｄＴでプライムされ、４種のすべてのデ オキシヌクレオチドの存在下で、逆転写酵素によって、第１鎖ｃＤＮＡの合成が 促進される。第１鎖合成による生成物により形成される３°側ヘアピンは、公知 の方法（ＭＨｌｉａｔｉｓの文献２１３〜２１６頁）に従って、イー、コリＤＮ Ａポリメラーゼを用いる第２鎮（第２のストランド）の合成をプライムするのに 用いられる。

ｃＤＮＡ二本鎖を形成するランダムブライミング法が好ましいのは、（ａ）二本 鎖の形成がポリＡ種に限定されない場合、または（ｂ）全長の二本鎖ｃＤＮＡが 必要でない場合である。第１鎮ｃＤＮＡの合成には、市販されている任意の配列 のプライマーが利用される。

第２鎖の合成に続いて、　ｃＤＮＡ断片は２例えば、材料の項で後述するように 、イー・コリＤＮＡポリメラーゼ■の大断片（クレノー断片）で粘着末端を充填 する（埋める）ことによって、末端を平滑化することが好ましい。

ゲノムＤＮＡ断片は、断片混合物もしくは精製調製物のいずれも９本発明の方法 による増幅に適している。選択された細胞源由来のゲノムＤＮＡは標準的な方法 で単離することができ。

この方法は典型的には逐次、フェノールおよびフェノール／クロロホルムで抽出 し、エタノールで沈澱させる方法である。

単離されたＤＮＡは、さらに分画され１問題の染色体もしくは染色体領域が得ら れる。二本鎖ＤＮＡは、１種もしくはそれ以上の選択された制限エンドヌクレア ーゼで部分的にもしくは完全に消化することによって断片にすることが好ましい が。

機械的剪断を利用することもできる。断片にされたゲノムピースはサイズ分画を 行うか、またはさらに反復ＤＮＡ配列を除くために処理される。二本鎖ＤＮＡ断 片のその他の起源としては、染色体外物質を含めることができ９例えばミトコン ドリアＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡウィルス、またはその生活環の一部として二本鎖中 間体を有するウィルス（例えばレトロウィルス）を含めることができる。

ｃＤＮＡ断片を製造するのに使用される。ゲノムＤＮＡ断片もしくはＲＮＡ転写 体の細胞源には、培養された細胞系、単離された細胞、または組織（もしくは全 器官もしくは全微生物）から得られた細胞のタイプが含まれる。細胞源は、２つ の類縁細胞源の１つに特有な特定のＲＮＡ転写体もしくはゲノム物質を同定もし くは単離したい場合の各種差し引き法にとって重要である。ＤＮＡ＄よび／また はｍＲＮＡ転写体を含む体液源は主として、該体液が９問題のウィルス因子また は他の微生物を含有していることが分かっているかもしくは含有している疑いの ある場合に１重要である。例えば、実施例３は、腸感染非Ａ非Ｂ型（ＥＴ−ＮＡ ＮＢ）肝炎ウィルスをマカクサルに感染させる前と後で採取した胆汁から単離し たＲＮＡから調製したｃＤＮＡ断片混合物について説明している。

線状化もしくは断片化したプラスミドＤＮＡ、または断片化したファージＤＮＡ は、増幅したい場合があるＤＮＡ断片のその他の起源である。ベクターＤＮＡは 、精製した。プラスミドもしくはファージＤＮＡから、従来の方法によって得ら れ９選択された制限エンドヌクレアーゼによる消化で、線状化および／または断 片化が行われる。実施例１では、　ｐｈｉＸ１７４ファージをＨａｅｍで消化し て得たＤＮＡ断片、および線状化したｐｉＡＮ１３プラスミドについて述べる。

（以下余白） 本発明の重要な特徴によれば、増幅されるべき二本鎖ＤＮＡ断片は、その両側の 末端がリンカ−に連結され、鎖を重複させるためのブライミング配列が提供され る。そのリンカ−としては、典型的には、長さが約２０〜３０塩基対で所定の塩 基対配列を有する短い二本鎖ＤＮＡ断片が好ましい。リンカ−の一方の末端は、 断片の両側の末端に酵素により連結するよう設計されている。断片が末端を平滑 化したｃＤＮＡもしくはゲノムの断片の場合には、このリンカ−末端もまた。実 施例１に記載されているように、　Ｔ４ｆｆＮＡ　ＩＪガーゼの存在下で断片末 端に連結するように末端が平滑化されている。ＤＮＡ断片の混合物がゲノム［］ ＮＡをエンドヌクレアーゼで消化することによって調製され、そして粘着末端を 有する断片が産生される場合には、断片に連結する末端において相補的粘着末端 を有するリンカ−を調製することができる。

リンカ−を含む連結反応はリンカ一対リンカ一連結反応も起こすので、リンカ− は、ダイマーが制限エンドヌクレアーゼによる消化で選択的に切断できるよう設 計されたものが好ましい。これは１選択された制限部位の配列の１／２の配列を 有するリンカ−の平滑末端を構築することによって実施することができる。平滑 末端の二量体化によって形成される制限部位は、まれな切断部位が好ましく、そ の結果、　ＤＮＡ断片にリンカ−を付加した後、関連するエンドヌクレアーゼで 断片を消化した場合に、有意な数の断片を内部で開裂させることはなく、一端に のみにリンカ−を有する断片が生産される。

第２図は９両側の断片末端に連結されたリンカ−の例　Ａ　。

Ｂ、もしくはＣを有するＤＮＡ断片（実線）を示す。図かられかるように、３つ の各リンカ−は、その平滑末端にＮｒｕｌｉ位の１７２をもっているので、平滑 末端の連結で形成されたリンカ−ダイマーはＮｒｕ　Ｉによる消化で切断するこ とができる。ＤＮＡ断片へのリンカ−の連結には方向性があり、リンカ−の自己 連結は、リンカ−が１つの付着端を有するため、ダイマーの生成のみに限定され ることに注目すべきである。リンカ−は、上記のように平滑末端とした断片に連 結され、これを第１図の上部に示す。対応する断片の粘着末端に連結するための 、１つの粘着末端を有する類似のリンカ−も同様に採用され得ることが理解され る。

第２図かられかるように、リンカ−は、断片の増幅後に切断し得る１またはそれ 以上の内部制限部位を有することが好ましい。リンカ−の内部制限部位は、３つ の目的に役立つ。

第１に、増幅された断片が、後述の第■節に記載されているＤＮＡ差し引き法に 用いられる場合には、その制限部位は、２つの断片の混合物のひとつの中にある リンカ−の主要部分を開裂させるのに利用され得、２つの異なる混合物由来の鎖 のリンカ−領域間のハイブリダイゼーションが阻止され、同じリンカ−が両方の 断片混合物の増幅に利用され得る。第２に。

リンカ−切断部位は、増幅された断片（または第■節の差し引き法におけるハイ ブリダイズした断片）に、クローニングベクター中にクローン化するための所望 の粘着末端部位を連結させることができる。第３に、第■節で明らかになるよう に、リンカ−制限部位は、断片をビオチン化するために、−市販のビオチン化さ れたｄｕｔｐおよびｄＡＴＰヌクレオチドで充填することのできるＡＡＴＴ突出 部をつくり出す。

第２図の３つの代表的なリン々−について示されているような１選択された配列 を有する合成二本鎖オリゴヌクレオチドリンカーは、市販の自動オリゴヌクレオ チド合成機を用いて調製することができる。あるいは、注文設計の合成オリゴヌ クレオチドは１例えば５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｇｅｎｅｎｔｉｃｓ社（米国、カリ フォルニア州、サンジエゴ）から購入することができる。

Ｃ８断片の増幅 上記の方法の工程を第１図の上部に示す。これらの工程には、第２図に示すよう に、二本鎖断片を入手すること、平滑末端化すること、およびリンカ−を断片の 両側の末端に連結してリンカ−を有する断片を調製することが含まれ９次いで選 択されたエンドヌクレアーゼで処理して、リンカ−の多量体をその平滑末端連結 部で切断する。

上記にようにして得られたリンカ−断片は、下記の工程により断片の複製を繰り 返すことによって増幅される。まず断片を、大過剰モル（典型的には、１０６〜 １０９モル過剰）の一本領オリゴヌクレオチドブライマーと混合する。そのプラ イマー配列は断片末端のリンカ−と相同である。すなわちそのプライマーの配列 および長さは、中程度の緊縮度の再アニーリング条件下で２つの鎖の相補的リン カ−領域とのハイブリダイゼーションを促進する配列および長さである。その他 の必要条件は、変性された断片鎖のリンカ−領域にハイブリダイズさせる場合に は、プライマーは、ポリメラーゼで触媒させる鎖の複製をプライムできなければ ならないということである。すなわち、プライマーの内部末端は遊離の３°−Ｄ Ｈを与える。第２図に示すリンカ−の場合、好ましいプライマーの配列は次のと おりであるニ リンカ−Ａとしては、　ｄ（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３ ’）リンカ−Ｂとしては、　ｄ（５’−ＧＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３’ ）リンカ−Ｃとしては、　ｄ（５’−ＧＡＣＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＧ−３” ）。

望ましい配列を有する一重鎖オリゴヌクレオチドプライマーは、従来の方法で調 製されるか、または前記のような商業的研究所から入手できる。

変性断片とプライマーとは、典型的には、約３７℃〜６０℃に冷却され、プライ マーは断片のリンカ−末端とハイブリダイズすることができる。冷却時間はごく 短時間で典型的には約５分間末端とし、長時間再アニーリングした場合に予想さ れる鎮−鋼量のハイブリダイゼーションを最小限に留める。この時点もしくはプ ライマー添加の段階で、４種のデオキシヌクレオチド、および必要に応じて、第 ２の鎖のプライムされた複製を触媒できるＤＮＡポリメラーゼが添加され１次に 、得られた反応混合物は、酵素による鎖複製に適した温度とされる。

下記実施例１に記載した方法では、デオキシヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼ とは断片を変性する前に添加した。熱変性を行った後、混合物を５０℃で２分間 アニールし、７２℃で５〜１２分間保持して第２鎖の複製をプライムした。使用 されるＤＮＡポリメラーゼは、　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ（サーマ ス・アクアティカス）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｇ　ＤＮＡポリメラーゼ ）であり、短時間ならば、９５℃までは比較的熱に対して安定である。

単一の添加されたプライマーは各ＤＮＡ鎖中０３′末端リンカー領域とハイブリ ダイズし、従って断片数が２倍になることが、上記および第１図から理解される 。上記の複製法は、加熱による断片の変性、冷却による断片鎖−プライマー複合 体の形成、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下での複合体の第２鎖の複製を包含 し、所望の濃度の断片が得られるまで繰り返される。上記の実施例では、熱に安 定なＴａｇポリメラーゼを採用しているが、３つの複製工程は、単に断片混合物 を変性温度に加熱しく断片のＴｍを越える温度）、短時間冷却して断片／プライ マー複合体を生成させ、そして、第２鎖を合成するのに充分な時間インキュベー トすることによって実施される。

断片の濃度は、複製の各ラウンドで２倍になるので、約１０ラウンドの複製で１ ０３倍の増幅が達成され、約２０ラウンドの複製で１０６倍の増幅が達成される 。従って、最初にピコグラム量のＤＮＡ断片を使用し、約２０ラウンドの複製を 行うと、マイクログラム量の断片物質が得られる。

実施例１は、断片増幅法を、線状化ＤＮＡプラスミド（ｐｉＡＮ１３）と、ファ ージｐｈｉＸ１７４断片の）Ｉａｅ　ｍによる消化で生成した断片混合物に適用 した例を示す。実施例３は、断片増幅法を。

胆汁の試料から単離したｍＲＮＡの混合物由来のｃＤＮＡ断片混合物に適用した 例を示す。

Ｄ、用途 この増幅法は、限られた量のゲノムもしくはｃＤＮＡの断片物質しか入手できな い場合のＤＮＡ二本鎖断片の増幅法および／またはＤＮＡ配列が未知の場合の二 本鎖ＤＮＡ物質の単純な増幅法として有用である。例えば、実施例３に報告され ているプローブ結合法についての研究では、腸感染非Ａ非Ｂ型肝炎（ＥＴ−ＮＡ ＮＯ）ウィルス因子に感染した胆汁由来のｃＤＮＡ断片の数を。

数桁の大きさで増大させるのに、この方法が使用された。この増幅法によって、 胆汁中に存在する比較的少量のウィルス因子を、増幅されたｃＤＮＡ画分として 容易に同定できる。

この増幅法は、クローニングに利用され得る単一の断片もしくは複数の断片の量 を増幅してクローン化の効率を高めるのに有用である。そのクローン化法の一つ の有利な特徴は。

選択されたクローニングベクターに適した末端クローン化部位を有する増幅断片 を提供する性能である。

その外の用途には、下記の第■節で述べるが、２つの断片混合物の増幅が含まれ ており、これはＤＮＡのハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ差し引きに用いら れ、２つの断片混合物の１つに特有の断片を単離する方法である。

この方法は、さらに処理するため２例えばさらに富化するために利用できる断片 物質の量を増加させるための、精製。

富化もしくは副分画されたＤＮＡ断片に適用することができる。

例えば、第■節に述べる断片単離法では、単離された非反復性配列の断片は、さ らに増幅および選択を行うことによってさらに富化することができる。他の例と しては、ゲル電気泳動法で得たＤＮＡＮ側副は選択的に増幅することができる。

この場合、断片混合物には９分画の前に、末端リンカ−が連結され、その選択さ れた断片のバンドがさらに、ゲル内でそのまま単離されるかまたは選択的に溶離 した後、プライマー。

ポリメラーゼおよびヌクレオチドを添加し、加熱ど冷却の複製工程を繰り返して 、単離される。

第４図は９本発明による２つの断片混合物の一つから非反復性配列を単離する方 法の流れ図である。この２つの断片混合物を３本願では陽性および陰性起源の混 合物と呼び、それぞれ核酸種の陽性起源および陰性起源由来のものである。陽性 起源は、細胞、細胞群９組織器官、副細胞画分、またはベクター断片を含むＲＮ Ａ転写体もくはゲノムの断片という他の所定の起源であり、いくつかの異なる配 列の種が含まれている。陰性の起源は、陽性起源と類似しているが、１またはそ れ以上の陽性起源の種を欠いている。

陽性および陰性の起源の例としては、微生物因子に感染した細胞もしくは組織の 試料（陽性起源）および微生物因子に感染していない上記試料（陰性起源）があ る。感染因子に関連する核酸種は、ゲノム物質もしくはＲＮＡ転写体の種のいず れの形態であっても、感染したく陽性）起源に特有なものである。同様に、陽性 と陰性の種は、感染もしくは非感染の被検体それぞれから得た血清もしくは胆汁 のような体液である。

本発明の方法を遺伝病の研究に用いる場合には、陽性起源は、典型的には、その 細胞に関連する正常のタンパクの全範囲を産生じ得る通常の細胞系もしくあ組織 であり、そして。

陰性起源はｍＲＮＡ種が変化したかもしくは欠失した疑いのある遺伝子的に変化 した細胞である。すなわち、陽性起源は、遺伝子が変化した陰性起源には存在し ない正常なｍＲＮＡ種を産生する。

他の例として、細胞の悪性形質転換は、悪性常態に関連する新ＲＮＡ転写体の発 現によって証明されるように、癌遺伝子の活性化が引き金となって引き起こされ ることが知られている。このようなＲＮＡ種の単離および同定に本発明の方法を 適用する場合には、悪性の細胞もしくは組織は、非反復性の（腫瘍関連の）　Ｒ ＮＡ種の陽性起源として役立ち、正常な非形質転換の細胞もしくは組織は陰性起 源として役立つ。転写体もしくはＤＮＡ二本鎖断片の陰性と陽性の起源の他の例 も考えられる。

第４図に示す陽性および陰性の起源はｍＲＮＡ種の混合物を与え、これらは、上 記ＩＡ節で述べたように対応する二本鎖ＤＮＡ断片に変換される。２つの混合物 中の二本鎖断片は、末端が平滑化され、　１８節で述べたように、断片の両側の 末端が、それぞれリンカ−に連結される。陽性起源断片に連結されたリンカ−は 、陰性起源断片に連結されたリンカ−と異なる方が好ましい。例えば、実施例１ で述べた方法において、陽性起源断片は第２図のリンカ−八に連結され、陰性起 源物質はリンカ−Ｃに連結される。異なる配列を有するリンカ−を２つの断片混 合物に連結することによって、２つの混合物がハイブリダイズする場合にリンカ −がハイブリダイズするという間過が回避される。あるいは、リンカ−が、実質 的にすべてのリンカ−を、ハイブリダイゼーション前に陰性起源の断片混合物か ら、制限エンドヌクレアーゼによる消化で除くことが可能な制限部位を有してい るならば、同じリンカ−を両方の断片混合物に連結してもよい。

各断片混合物は次に、前記ＩＣ節で述べたように複製を繰り返して増幅される。

好ましい態様では、増幅された陰性起源断片の鎖は、ビオチン化されるかさもな ければリガンドが連結される。そのリガンドは、該リガンドを有する鎖もしくは 二本鎖種を、アフィニティークロマトグラフィーによって。

選択的に結合したり除去するのに使用され得る。二本鎖断片をビオチン化する方 法は各極短られている。例えば、　Ｂｌｏ−１ｌ−ＩＪＴＰおよびＢｌｏ−７− ｄＡＴＰのようなビオチン標識されたデオキシヌクレオチドを、複製の最終ラウ ンドにおいて複製中の増幅反応混合物に含有させることができる。二本鎖断片は 、製造者であるＣｌｏｎｔｅｃｈ社（米国、カリフォルニア州、パロ・アルド） が提供するブｏ）フルに記載されている標準法で、容易に光を用いてビオチン化 することができる。ある好ましい方法においては、増幅された断片は、エンドヌ クレアーゼ、例えば５’−ＡＡＴＴ−３’粘着末端をつくり出す、　Ｅｃｏ　Ｒ １で処理される。

その粘着末端は、　Ｂｌｏ−１ｌ−ＵＴＰおよび／またはＢｌｏ−７−ｄＡＴＰ 　（両者ともに市販されている）の存在下でクレノー断片で充填される。

ここで２つの断片混合物は、結合し熱変性され、−重鎖形になる。陰性起源の断 片は、実質的に過剰モル量で存在することが好ましく、典型的には約１０倍の過 剰量であり、その結果、陽性起源混合物中の非反復性でない断片が、陰性起源の 断片由来の相補鎖と高い確率でハイブリダイズすることが保証される。

陽性と陰性の起源の断片は、２つの異なる混合物中のリンカ−間でのハイブリダ イゼーションが起こらない条件下で／’％イブリダイズする。このことは、先に 述べたように、２つの混合物中で異なる配列のリンカ−を用いるか、ハイブリダ イゼーションの前に陰性起源断片の混合物においてリンカ−を開裂させるか、ま たはリンカ−のハイブリダイゼーションが起こらない条件下で断片鎖をハイブリ ダイズさせることによって達成される。あるいは、ハイブリダイゼーション混合 物は、陽性起源リンカ−の末端領域とハイブリダイズしその結果内部鎮リンカ− のハイブリダイゼーションを防止するのに有効な大過剰モル量のプライマーオリ ゴヌクレオチドを含有していてもよい。

このハイブリダイゼーション反応は、　Ｈａｍｅｓの文献に詳細に述べられてい るような古典的なハイブリダイゼーションか。

またはより好ましくは、　Ｋｏｈｎｅの文献に記載されているフェノールエマル ジョン再会合法（ＰＥＲＴ）のような迅速なハイブリダイゼーション法、もしく はＴｈｏｍｐｓｏｎの文献に記載されているグアニジンチオシアナート法により 実施され得る。

ＰＥＲＴハイブリダイゼーション法において、断片は、好ましくはフェノール反 応混合物巾約５〜５０μｇ／＋＋＋ｊ！の最終［ＩＮＡ濃度でハイブリダイゼー ションが行われ、その反応は６０〜７０℃で５〜６時間まで行われる。アニーリ ングの度合は、　２８０ｎｍにおける濃色シフトによるか、または反応混合物の 一部分を緩衝液で希釈し、それを迅速にヒドロキシアバタイ）　（ＩＩＡＰ）カ ラムを通過させること（Ｋｏｈｎｅの文献参照）によって追跡することができる 。

グアニジンチオシアナート法では、８ｍＭＤＴＴと２０ｍＭクエン酸ナトリウム （ｐＨ５，８）を含有する４Ｍがグアニジンチオシアナート溶液中好ましくは約 ５〜５０μｇ、／ｍｌの最終ＤＮＡ　０度で。

断片のハイブリダイゼーションが行われる。得られた混合物を６５℃で５分間加 熱して、完全に変性を行い９次いで、完全にハイブリダイゼーションが行われる まで、２６℃で７２時間までの時間インキュベートする　（Ｔｈｏｍｐｓｏｎの 文献参照）。ＤＮＡ／ＤＮＡのハイブリダイゼーションは上記のようにして確認 することができる。

Ｂ、非反復性配列の断片の単離 ハイブリダイゼーションに続いて、非反復性でない断片を優先的に結合させるの に有効な固体支持体を９反応成分と接触させる。好ましい実施態様においては、 陰性起源の鎖がビオチン化されている場合に４反応成分はアビジンもしくはスト レプトアビジンのカラムで分離される。このカラムは、それによりハイブリダイ ゼーションが行われる。ビオチン化鎖の全部と非ビオチン化鎖（陽性起源）を結 合するのに有効である。ビオチン他領は大過剰モル量で存在するので、陽性起源 由来のほとんどすべての共通配列の鎖がビオチン化された相補鎖に結合し、アフ ィニティークロマトグラフィーで除去される。

ストレプトアビジンカラムを用いてのハイブリダイゼーション混合物の分離法は 実施例２で詳細に述べる。簡単に述べると、ハイブリダイゼーション混合物をス トレプトアビジン−アガロースと充填したカラムを通過させ、溶離緩衝液で充分 に洗浄する。いくつかの洗浄液由来の溶出液をプールし。

核酸をエタノール沈澱法で濃縮し、陽性起源の物質に特有な配列について富化さ れた断片混合物が得られる。

本発明の重要な特徴によれば、単離された断片は、陽性起源の断片に最初に連結 させた末端リンカ−を有しているので。

１節で述べた増幅法によってさらに増幅することができる。

陽性起源のリンカ−が陰性起源の断片のリンカ−と異なる場合には、増幅（”陽 性起源”プライマーを用いる）をさらに追加して行うことによって、陽性起源の 断片を選択的に増幅して、陽性起源に特有の配列をらに富化させることができる 。

第４図に示すように、単離された増幅物質は、陰性起源の断片（この断片は必要 に応じてらに増幅を追加して行うことができる）と再度ハイブリダイズさせるこ とができ９次いで。

非反復性断片がアフィニティークロマトグラフィーによって再度単離され、富化 が促進される。

最終的に単離された断片は、　ＤＮＡポリメラーゼで処理されて二本鎖種の鎖複 製が完全に行われ９次に選択されたリンカ一部位エンドヌクレアーゼで処理され 、クローン化などに適した断片末端が提供される。代わりに、もしくは、さらに 。

単離された断片に公知の方法で放射標識し、　ＤＮＡプローブとして使用しても よい。

Ｃ１用途 第５図は差し引き法の一用途を示す。すなわち選択された組織のような感染起源 、または胆汁のような体液中のＲＮＡ転写体内に存在するウィルス因子の単離お よびクローニングへの用途である。ここでは、感染起源（陽性起源）と非感染起 源（陰性起源）から単離されたＲＮＡ混合物が、　ｃＤＮＡ二本鎖断片混合物を 調製するのに用いられ、その混合物は末端が平滑化され９選択されたリンカ−に 連結され、そして、増幅される（１節参照）。陰性起源断片をビオチン化した後 、２つの断片混合物を合併して、変性させ、再アニールし、アフィニティークロ マトグラフィーで分離する（■節参照）。単離された断片は、その末端リンカ− 領域に選択された制限部位を有しており、その部位で切断され、λｇｔ１１ベク ターのような適切な発現ベクター中にクローン化される。得られたλｇｔｌｌフ ァージは、陽性起源物質に特有の配列について富化された断片ライブラリーを構 築する。

ウィルス抗原を産生ずる望ましい単離物を選択するため。

宿主細胞を、ライブラリーファージに感染させ、感染した個体由来の抗血清と反 応させ、ウィルス関連抗体を、ウィルス抗原を産生ずる宿主細胞に結合させる。

次に、細胞を洗浄して未結合の抗体を除去し、レポーター標識抗ヒ）ＩｇＧ抗体 と接触させて、ウィルス特異的抗体と結合した細胞を標識化する。これらの細胞 は、レポーターの存在によって同定される。

ウィルス挿入物を含有するベクターは、連続して抗原を産生ずるために使用され るか、またはライスル配列のプローブの起源として使用することができる。

あるいは、断片ライブラリー中のクローン化され単離された断片は、ＤＮＡプロ ーブを用いて同定し選択することができる。−例として、上記のようにして生じ た断片ライブラリーをレプリカプレート処理をし、１節に述べたようにして調製 された。感染起源および非感染起源由来であり、標識化されたｃＤＮＡプローブ とハイブリダイズさせることができる。プローブのハイブリダイゼーションは、 従来のサザンプロット法で実施することができる。ウィルス因子挿入物を含有す るこれらのライブラリーベクターは、陽性起源ｃＤＮＡプローブ中に存在するウ ィルス因子ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズするが。

陰性起源のプローブとはハイブリダイズしない。

上記のＤＮＡ差し引き法およびプローブ選択法に類似の方法は、癌遺伝子を発現 する細胞、または遺伝病に関連する。転写体が不完全な細胞に特有の核酸断片を 同定し単離するのに利用することができる。

第６図は、１節に記載した増幅法を、上記のように同定された非反復性配列断片 のクローンが実際に陽性起源に特有なことを確認するのにどのように利用するこ とができるかを示している。ここでは、陽性起源および陰性起源から調製した２ つのｃＤＮＡ断片の混合物が１節で述べたように増幅され９次にゲル電気泳動法 で分画されている。サイズ分画されたゲル断片を９次に従来のサザンプロット法 でフィルターに移し。

プローブを標識した後、単離された問題のクローン化挿入物とハイブリダイズさ せる。プローブの配列が、陽性起源の断片に特有なものであれば、第６図に示す ように、増幅された陽性起源断片とのみハイブリダイズするのが認められる。第 ６図に示すようにプローブが結合した領域は、増幅された断片がある範囲の大き さを有しているので予想されることであるが、かなり広い。増幅されたｃＤＮＡ 断片をスクリーニングするこの方法は、実施例３で詳細に述べる。この実施例で は。

この方法が、単離されたＥＴ−ＮＡＮ［ｌ断片挿入物が、感染した胆汁起源由来 のｃＤＮＡに特有なものであることをｍ認するのに使用された。

以下の実施例は、上記の、断片増幅・断片単離法を例示しているが、その方法も しくはその適用の範囲を決して限定するものではない。

プラスミドｐｉＡＮ１３はＢｒ１ａｎ　５ｅｅｄ博士（ＭＩＴ）から入手した。

サプレッサー陽性菌株であるイー・コリＫＭ３９２株は１（ｅｖｉｎ　Ｍ。

ｏｒｅ博士（ＤＮＡＸ　、米国、カリフォルニア州、パロアルト）から入手した 。サプレッサーマイナス菌株であるイー・コリＬＧ７５株は、　Ｂｒ１ａｎ　５ ｅｅｄ博士（ＭＩＴ）から入手した。λファージｃｈ２１ａは、　Ｆｒｅｄｅｒ ｉｃｋ　Ｂｌａｔｔｎｅｒ博士（ライスコンシン大学）かＰ３プラスミドを有す るイー・コリＭＣ１０６１株は、　Ｂｒ１ａｎ　５ｅｅｄ博士（ＭＩＴ）から入 手した。

熱転移酵素（子ウシ胸腺）、アルカリホスファターゼ（子ウシ腸）、ポリヌクレ オチドキナーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー断片）およびＳ ｌヌクレアーゼはＢｏｅｈ口ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌｓ社（米国、インディアナ州、インディアナポリス）から得た。ｐｈｉＸｌ 、７４断片は、　ｐｈｉＸ１７４ファージをＨａｅ　ｍで完全に消化することに よって調製されるが。

ＢＲＬ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国、メリーランド州、ベテスダ）から 入手した。

リメラーゼは、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社（米国、マサチュ ーセッツ州、ヘハリー）から入手し、ストレプトアビジンアガロースはＢｅｔｈ ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ社（米国、メリーランド州。

ベテスダ）から入手した。低ゲル化温度アガロース　（Ｓｅａ　ＰＩａｑｕｅ） はＦＭＣ（米国、メイン州、ロックランド）から入手した。ニトロセルロースフ ィルターは、　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１から入手した。

合成オリゴヌクレオチドリンカーとプライマーは、市販の自動オリゴヌクレオチ ド合成機を用いて調製した。あるいは。

注文設計の合成オリゴヌクレオチドは１例えば、　５ｙｎｔｈｅｔｉｃＧｅｎｅ ｔ　ｉｃｓ社（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）がら購入し得る。ｃＤ ＮＡ合成キットおよびランダムブライミングラベリングキットは、　Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社（Ｂに）Ｂ）（米国 、インディアナ州、インディアナポリス）から入手した。

アニーリング前または標識のための一本鎖のキナーゼ処理は、　５０ｍＭ）リス 　（ｐＨ７，６）、　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　５ｍＭジチオトレイトール、１ 〜２ｍ１Ｊ　ＡＴＰ　、　１．７ｐｍｏｌ　ｒ　”Ｐ−ＡＴＩ’　（２，９ｍ　 Ｃｉ　／ｍｍｏｌｅ）、　０．１ｍＭスペルミジン、　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡの 存在下、　ｌｎｍｏｌｅ（７）基質に対して、過剰量１例えば約１０単位のポリ ヌクレオチドキナーゼを用いて達成される。

部位特異的ＤＮＡ切断は、適切な単一（もしくは複数）の制限酵素で処理して行 われるが、その条件は当該技術分野で一般に理解されている。その詳細はこれら 市販の制限酵素のメーカーが指定する条件である。例えば、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　ＢｉｏｌａｂＳ社の製品カタログを参照のこと。一般に、約１μｇのプ ラスミドもしくはＤＮＡ配列は、約２０μβの緩衝溶液中で、３７℃にて１時間 の消化で、１単位の酵素によって切断される。本願の実施例では、典型的には、 過剰の制限酵素を用いて、　ＤＮＡ基質が消化されるのを完全にしている。

約３７℃において約１〜２時間のインキュベート時間が適当であるが、これを変 化させることも可能である。各々インキュベーションを行った後、タンパクはフ ェノール／クロロホルムで抽出することによって除去され１次いでエーテル抽出 され得、そして、核酸がエタノール（７０％）で沈澱させることによって、水性 画分から回収される。必要に応じて、切断された断片のサイズ分離が、標準的な 方法を用いて、ポリアクリルアミドゲルもしくはアガロースゲルの電気泳動法に よって行われ得る。サイズ分離の一般的な説明は、　Ｍｅｊｌｌｏｄｓ　ｉｎＥ ｎｚｙｍｏ　ｌｏｇｙ　（１９８０年）、６５巻、　４９９−５６０頁に見られ る。

制限酵素で切断された断片は、　５０ｍＭ）リス（ｐｌ！７．６＞、　５０ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ　ＭｇＣ１□、　６ｍＭ　ＤＴＴおよび０．１〜１．　ＯｍＭ 　ｄＮＴＰ中で。

２０℃〜２５℃にて約１５〜２５分間インキュベートし、４種のデオキシヌクレ オチドトリホスファート（ｄＮＴＰ）の存在下で、大断片のイー・°コリＤＮＡ ポリメラーゼＩ　（クレノー試薬）で処理することによって末端が平滑化され得 る。このクレノー断片により、４種のヌクレオチドの存在下にて、５”側の一本 鎖突出部が充填される。必要に応じて、突出部の性質によって規定される制限内 で、前記のもしくは選択されたｄＮＴＰの１つだけを供給することにより９選択 された修復が実施され得る。

クレノー試薬による処理の後、得られた混合物はフェノール／クロロホルムで抽 出し、エタノールで沈澱させる。適切な条件下Ｓ１ヌクレアーゼで処理すると、 　ＤＮＡのどの一本鎖部分も加水分解を受ける。特に、　ｃＤＮＡの合成で形成 された５°ヘアピンのニラキング（ｎｉｃｋｉｎｇ）が達成される。

連結は、以下の標準的な条件および温度下で、１５〜５０μｌの体積で行われる 。例えば、　２０ｍＭ）リス−ＣＩ（ｐＨ７，５）、　１０ｍＭＪＪｇＣ１２、 １０ｍＭ　ＤＴＴ、　３３ｍｇ／ｍＩＢＳＡ、　１０ｍＭ　〜５０ｍ！ＪのＮａ Ｃ１，および４０ｍ！、ｌ　ＡＴＰ、　０．０１〜０．０２　（Ｗｅｉｓｓ）単 位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ、１４℃（”粘着末端”の連結用）、または１　ｍＭ 　ＡＴＰ、　０．３〜０．６　（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４Ｕガーゼ、１４℃（” 平滑末端”の連結用）の条件下で行われる。分子間の”粘着末端”の連結は９通 常、１ｄあたり３３〜１００ｍｇの全ＤＮＡ濃度（５〜１１００ｎの最終濃度） で行われる。分子間の平滑末端の連結は、　１ｍＭの最終濃度で行われる。

”ベクター断片”を用いるベクター構築法では、ベクター断片は通常、細菌由来 のアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシの腸由来のアルカリホスファ ターゼ（Ｃ’ＩＰ）で処理して５′リン酸を除去し、ベクターの自己連結を防止 する。消化は、約１０ｍＭのトリス−）ＩＣＩ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ中、ｐＨ１ ８で、約１単位／■のＢＡＰを用い６０℃で１時間行われるか、または、ベクタ ー１■当り１重位のＣＩＰを用いて３７℃にて約１時間行われる。

核酸断片を回収するために、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出して、エ タノールで沈澱させる。あるいは、追加の制限酵素による消化および望ましくな い断片の分離により２重に消化されたベクターにおいては、再連結が防止される 。

（以下余白） 実施例Ｉ Ａ、　ｐｉＡＮ１３プラスミドの修飾および増幅プラスミドｐｉＡＮ１３は、ア ンバー変異を抑制することのできによる消化によって直線状とし、第２図にＡで 示す配列を有するリンカ−に、　０．：３−０．６　Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４　Ｄ ＮＡリガーゼの存在下で、１：１００モル比にて連結させる。リンカ−の粘着末 端を、クレノー断片を用いる従来の方法により充填し１次いＩ　Ｕンカーを、上 記のような連結条件下でプラスミド断片の平滑末端に連結した。Ｓｍａ　Ｉで処 理して過剰のＳｍａＩ！Ｊンカーを除去した後、断片を再環化した。これは、断 片濃度が約１μｇ　／　ｒｒｄｌで、　４，０００単位／ｒｒＬｌのＤＮＡリガ ーゼの存在下、約１４℃で１８時間行なった。したがって、得られたプラスミド は、修Ｐ３プラスミドを有するイー・コＵＭＣ１０６１株を、上記再環化したプ ラスミドで形質転換させた。満足すべきプラスミドの選択は、カナマイシン、ア ンピシリンおよびテトラサイクリンの存在下での細菌の増殖に基づいて行った。

プラスミドを耐性の細菌コロニーから単離し、Ｓｍａｌで切断して、所望のＡ配 列末端リンカ−を有し、平滑末端であり線状化された断片を調製した。

１．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚを含有する１０ｍＭ　）リス−Ｃ１緩衝液＜ｐＨ８，３ ）　（緩衝液Ａ）の１００μβに、ｌＸｌ０−３μｇの線状化プラスミド。

２μＭの、配列がｄ　（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３°） のプライマー、各々２００μｍのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、およびｄ ＴＴＰ、ならびに５単位のサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕ ａｔｉｃｕｓ）　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）を添加した。反応 混合物を９４℃まで加熱して１分間変性させ、５０℃まで冷却して２分間プライ マーのアニーリングを行い９次いで７２℃まで加熱して５〜１２分間Ｔａｑポリ メラーゼでプライマーの延長を行った。逐次、加熱、冷却およびポリメラーゼの 反応を行う複製反応を、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　ｔ ｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒを利用して、さらに２５回繰り返して行なった。

Ｂ、ｐｈｉＸ１７４断片の増幅 １ａｅＩＩＩ平滑末端断片１１００ｎを含有する５０μｌの溶液に、第２図のＣ にその配列を示すリンカ−３００ｎｇを添加し、ＤＮＡＩＪガーゼの存在下、リ ンカ−の連結を前述のように実施した。混合物をＮｒｕ　Ｉで処理し、リンカ− ダイマーを切断した。

１００　ｕ　ｌの緩衝液Ａに、ｌｎｇのｐｈ　１Ｘ１７４／Ｈａｅ　ＩＩＩ断片 、２μＭの、配列がｄ（５°−ＣＡＣＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＧ−３”）のプ ライマー、各々２００μＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ 、ならびに５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加した。反応混合物を９４℃ まで加熱して１分間変性させ、５０℃まで冷却して２分間プライマーのアニーリ ングを行い９次いで７２℃まで加熱して５〜１２分間Ｔａｑポリメラーゼによっ てプライマーの延長を行った。この複製反応工程を上記のように２５回繰り返し た。増幅された断片は、この後では、　ｐｈｉＸ／リンカ−Ｃ断片と呼ばれる。

ｐｈ　１Ｘ１７４断片の第２の調製物を同様の方法で増幅したが、　ｐ＋ＡＮ１ ３の増幅に採用した配列へのリンカ−を使用した。この調製物は、この後では、 　ｐｈｉＸ／リンカ−Ａ断片と呼ばれる。

Ａ、増幅されたｐｈｉＸ１７４断片のビオチン化実施例ＩＢで調製した増幅ｐｈ ｉＸ１７４／リンカーＣ断片をＥ、ｃｏＲＩで処理し、　ＡＡＴＴ配列の突出部 を有する５“突出末端を得る。得られた断片を、既知の方法（Ｍａｎ　ｉａｔ　 ｉｓの文献１１３頁参照）に従ってクレノー充填反応でビオチン化する。簡単に 述べると１反応混合物は、　１００ｍＭリン酸カリウム　（ｐＨ７，２）、２　 ｍＭ　ＣＯＣｌ２．０．２ｍＭ　ＤＴＴ、　４０ｎＭＢｉｏ−７−ｄＡＴＰ、　 １００μＭ　ｄＴＴＰおよび１００単位／ｍ１のクレノー断片、中に断片が１０ ０μｇ／ｍｌの割合で含有されてなる。２５℃で４５分間インキュベートした後 、６５℃で１０分間加熱することによって反応を停止させる。

Ｂ、ハイブリダイゼーション反応 増幅されたｐｉＡＮ１３ベクターを１種々のモル比で、実施例ＩＢで調製された ｐｈｉＸ／’ＪンカーＡ断片と混合する。ｐｉＡＮ１３　：ｐｈｉＸ／リンカ− Ａ断片の重量比が１　：　１００．　１　：　３０Ｊ、；ヨび１＝３で含有され ている混合物を調製する。次に各混合物を。

前述のようにして調製したビオチン化ｐｈ　ｉＸ／リンカ−Ｃ断片の１０倍過剰 モル量と、　２Ｍグアニジンイソチオシアナート含有アニーリング用緩衝液（ｐ Ｈ４５，８）中で混合する。この混合物を６５℃で５分間加熱し１次に２５℃に 冷却し、１２時間ハイブリダイズさせる。

Ｃ，アフィニティークロマトグラフィーによる分離シラン化処理を施したガラス ウールを充填し１ｒｎ１のシラン処理をしたシリンジに、０．５−のストレプト アビジン−アガロースを充填し、１ｍＭＥＤＴＡを含有する］、ＯｍＭ）リス− Ｃ１，０，５ＭＮａＣ１，ｐ）１７．０　（溶離緩衝液）で洗浄する。前記の３ 種の各ハイブリダイゼーション混合物の一部を、エタノール（７０％）で沈澱さ せ、　１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ１７，０中に再懸 濁し９次いで、数倍容積のカラム溶離緩衝液で洗浄したカラムに注入する。

各混合物について、ストレプトアビジンカラムからの溶出液の両分を合併し、エ タノールで沈澱させてＤＮＡを濃縮する。

そのＤＮＡを緩衝液Ａに溶解させて０．０１ｎｇ／ｍ１の濃度とし。

配列ｄ　（５’　−ＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３’　）を有する前 記のプライマー２μＭ、そして、各々２００μＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄ ＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ならびに５単位のＴａｑポリメラーゼと混合する。その 反応混合物を、９４℃で１分間変性させ、５０℃に冷却してプライマーのアニー リングを行い１次いで７２℃で５〜１２分間プライマーの延長を行う。

粘着末端をつくり出す。その断片（１３ｎｇ／ｍｆ）を、６０ｎｇ／ｄのＮｏｔ 　Ｉで消化したファージＣｈ２１ａＬＪと混合し、そして。

キャプシド化を行った後、そのファージを、サプレッサー陽性菌株であるイー・ コリＫＭ３９２株、サプレッサーマイナス菌株であるイー・コ１ＪＬＧ７５株に 感染させるのに使用する。ＫＭ３９２株中でｔ生されるプラークの数は９組換え 体ファージの全数の尺度となる。なぜなら、この菌株がファージのアンバー変異 を抑制することができるのでそのＡおよびＢの遺伝子のファージの発現を行なわ せるためである。これに対して、　ＬＧ７５株では、　ｐｉＡＮ１３断片が組み 込まれたファージだけがプラークを産生ずる。なぜなら、サプレッサーマイナス 細菌菌株中でファージが増殖するには５ｕｐＦ遺伝子が必要だからである。

したがってこの２種の宿主菌株のプラークの比率が、断片混合物中のｐｉＡＮ１ ３断片の比率を示す。対照として、ハイブリダイゼーションを行ないストレプト アビジン分離を行う前の３つの混合物中の断片の比率もまた測定する。

Ａ、胆汁由来のｃＤＮＡ ＥＴ−ＮＡＮＢに対して陽性のヒトのボランティアの大便から得た大便の１０％ 懸濁液を、２頭のマカクザルに静脈注射した。

上記陽性であることは、上記大便中のウィルス様粒子（ＶＬＰ）が公知のＥＴ− ＮＡＮＢ患者由来の免疫血清と結合することによって証明された。上記動物は、 接種後２４〜３６日の間にアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベ ルが上昇し、感染の前急性期にその大便中に２７〜３０ｎｍのＶＬＰを排せつし た。上記動物は、接種物中のＶＬＰに対して血清反応が陽性となっ、た。

感染させた各動物の胆管にカニユーレを挿入して約１ｃｃの胆汁を収集した。標 準的なＲＮＡ単離法を用い熱フェノールで抽出することによって胆汁からＲＮＡ を抽出した。Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社（米国、インディア ナ州、インディアナポリス）から入手したｃＤＮＡ合成キットを用いて、第１鎮 世代についてのランダムプライマーにより、上記単離されたＲＮＡから二本鎖ｃ ＤＮＡを形成させた。

非感染マカクザルの胆汁由来のｃＤＮＡ断片混合物を同様に作製した。

Ｂ、大便由来のｃＤＮＡ ヒトの大便の試料から得たｃＤＮＡは次のようにして調製した。

健康な個体もしくはＥＴ−ＮＡＮＢに感染した個体由来の大便試料の１０％懸濁 液を、３０％スクロースの密度勾配クッションの上に重層し、　５Ｗ２７０−夕 を用い、１５℃にて６時間、　２５ｋｇで遠心分離した。ペレット化した物質は 、感染した大便試料中に存在するＥＴ−ＮＡＮＢ感染に特徴的な２２７−３２ｎ のＶＬＰ粒子を含有していた。感染試料と非感染試料の両方のスクロース勾配ペ レットからＲＮＡを単離し、そして、単離されたＲＮＡを、実施例１に記載した ようにしてｃＤＮＡ断片を調製するのに用いた。

Ｃ，ｃＤＮＡ断片混合物の増幅 感染胆汁起源および非感染胆汁起源由来のｃＤＮＡ断片混合物。

および感染ヒト大便起源および非感染ヒト大便起源由来のｃＤＮＡ断片混合物を 、各々９本発明の方法に従ってリンカ−／プライマー複製法で増幅した。簡単に 述べれば、各試料中の断片ヲＤＮＡ　Ｐｏｌ　Ｉで平滑末端とし、フェノール／ クロロボルムで抽出し、エタノールで沈澱させた。末端を平滑化した物質を。

実施例１に記載したのと同様の条件下で、第２図に示すリンカ−Ａと連結し、そ の混合物をＮｒｕ　Ｉで消化してリンカ−のダイマーを除いた。各混合物の最終 濃度を緩衝液Ａ中０．０１μｇ／ｍｌとし、この液に、配列ｄ　（５’−ＧＧＡ ＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３°）を有するブライ７−２　μＭと、　ｄ ＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、＃ヨヒｄＴＴＰ各々の２００μＭとを添加し た。その反応混合物を９４℃まで加熱して１分間変性させ２次に５０ｔにまで冷 却して２分間プライマーのアニーリングを行い１次に７２℃に加熱して５〜１２ 分間Ｔａｑポリメラーゼによるプライマーの延長を行った。加熱。

冷却およびポリメラーゼ反応を逐次実施する上記複製反応を。

Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅ ｒを利用してさらに２５回繰り返した。

Ｄ、増幅したｃＤＮＡ混合物のスクリーニング上記の由来の４つの増幅ｃＤＮＡ 断片混合物を、２％アガロースマｌ−ＩＪソックス使用するアガロースゲル電気 泳動法で分画した。ＤＮＡ断片をアガロースゲルからニトロセルロース紙へ移し た後、そのフィルターを、　ＥＴ−ＮＡＮＢウィスル因子に結合したランダム標 識化”Ｐ　１．３３ｋｂ断片とハイブリダイズさせた。

この断片の派生物および配列は、　ＡＴＣＣＮＣ１６７７１７にＤＩ）ＴＺ　Ｋ ＦＩ　（ＥＴｌ、　１）プラスミド中に保持されており９本出願と同じ日に出願 された本出願人による特許出願“Ｅｎｔｅｒｉｃａｌｌｙ　Ｔｒａｓｍｉｔｔｅ ｄ　Ｎｏｎ−Ａ／ＮｏｎＢ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒａｌ　Ａｇｅｎｔ”に 記載されている。クローン化された断片は、上記ｐＴＺ−ＫＦＩ（）ｉＴｌ、　 １＞プラスミドをＥ、ｃｏＲＩで消化し、（ｉｉ）遊離した１、　３３ｋｂのＥ Ｔ−ＮＡＮＢ断片を単離し、そして。

（ｉｉｉ）単離された断片をランダムに標識化することによって得られた。

分画されたｃＤＮＡ混合物とプローブのハイブリダイゼーションは、従来のサザ ンプロット法（Ｍａｎｉａｔｉｓの文献３８２〜３８９頁参照）で行った。第６ 図は、感染胆汁起源（Ａ）、非感染胆汁起源（Ｂ）、感染ヒト大便起源（Ｃ）、 および非感染ヒト大便起源（Ｄ）由来、のｃＤＮＡで得らえたハイブリダイゼー ションのパターンを示す。図から明らかなように、　ＥＴ−ＮＡＮＢプローブは 。

両方の感染起源から得た増幅断片とハイブリダイズしたが。

非感染起源のいずれから得られた配列とも非相同であった。

この方法は９本願発明の用途を示す。なぜなら、増幅前のｃＤＮＡの当量のハイ ブリダイゼーション分析法では、検出可能なハイブリダイゼーションシグナルが 得られないからである。

本発明を、特定の態様、方法、構成および用途を参照して説明してきたが９種々 の変更および改変を９本発明から逸脱することなく行うことのできることは、当 業者に明らかである。

Ｍｌｕｌ　Ｅ。。８．巴Ｎｒｕ″ＦＩＧ、　２Ｃ隅佐廷４、　【４性払４゜ ＋　ランフ′へ７°ライマー、子乏・ｔ＃鳴　十ＦＩＧ、５　ｊｌ￥再屑ル結ｇ ｔ　クツーンｌ乙国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．陽性起源由来の二本鎖ＤＮＡ断片の混合物中には存在するが，陰性起源由来 の二本鎖ＤＮＡ断片の混合物中には存在しない二本鎖ＤＮＡ断片の単離法であっ て，次の工程を包含する方法： 二本鎖リンカーを，陽性起源の断片，および陰性起源の断片にそれぞれ連結する 工程； 次の（ｉ），（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のステップを連続して繰り返して行なう ことにより，各断片混合物中のリンカーを保持する各断片の数を増幅する工程： （ｉ）該断片を変性して一本鎖の断片を産生させること，（ｉｉ）その配列が各 鎖の一つの末端におけるプライマー領域に相補的である一本鎖プライマーと，該 一本鎖とをハイブリダイズさせて鎖／プライマー複合体を形成させること，およ び（ｉｉｉ）該鎖／プライマー複合体を，ポリメラーゼとデオキシヌクレオチド との存在下で二本鎖断片に変換すること； ２つの増幅された断片混合物中の増幅された断片を変性させ，そして，２つの混 合物中において，変性された断片をハイブリダイズさせる工程，ここで該ハイブ リダイゼ−ションは，陽性起源の鎖と結合しているリンカー領域が，陰性起源の 鎖と結合しているリンカー領域とハイブリダイズしない条件下で行われる；およ び 該第２の混合物由来のＤＮＡ断片の鎖とハイブリダイズしないＤＮＡ種を選択的 に単離する工程。
2. ２．前記断片混合物か，陽性起源および陰性起源のそれぞれから単離されたメッ センジャ−ＲＮＡ由来であり，そして，各混合物中の二本鎖断片が混合物中のメ ッセンジャ−ＲＮＡ種を二本鎖ｃＤＮＡ断片に変換することによって調製される ，請求項１に記載の方法。
3. ３．前記腸性の起源が，選択された微生物に感染した個体由来の体液の試料であ り，そして，第２の起源が，非感染の個体から得られた同じ体液の試料である， 請求項１に記載の方法。
4. ４．前記各混合物中の断片が平滑末端を有し，該断片に連結しているリンカーが 平滑末端を有し，その平滑末端が，平滑末端−平滑末端リンカーダイマー中に， 選択された制限エンドヌクレアーゼで切断可能な制限部位を形成する，請求項１ に記載の方法。
5. ５．前記陽性起源の断片に連結しているリンカーと，前記陰性配列の断片に連結 しているリンカーとが非相同性の配列を有する，請求項４に記載の方法。
6. ６．請求項４に記載の方法であって，前記陽性起源の断片に連結しているリンカ ーか内部制限部位を有し，その部位において該断片は，選択された制限エンドヌ クレアーゼにより切断され得，そして，該方法が，該エンドヌクレアーぜによる 消化の後，単離された二本鎖ＤＮＡ断片を，適切なベクタークローン化部位にク ローン化することを包含する，方法。
7. ７．前記ハイブリダイゼーションが，過剰モル量の陰性起源断片中で行われる， 請求項１に記載の方法。
8. ８．前記陰性起源の断片が，前記ハイブリダイゼーションの前にビオチン化され ，そして前記除去が，アフィニティークロマトグラフィーによるビオチン化二本 鎖断片の除去を含む，請求項１に記載の方法。
9. ９．前記陰性起源の断片に連結しているリンカーが，選択された制限エンドヌク レアーゼで開裂されて粘着末端を形成することが可能な内部制限部位を有し，そ して，前記陰性起源の断片が，増幅した断片を選択されたエンドヌクレアーゼで 消化し，次いでビオチン化デオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼを用い て粘着末端を充填することによりビオチン化される，請求項８に記載の方法。
10. １０．さらに次のステップを連続して繰り返すことにより，単離された断片の富 化混合物中の各断片の数を増幅することを包含する，請求項１に記載の方法：（ ｉ）断片を変性して一本鎖の断片を調製する工程，（ｉｉ）該一本鎖と，その配 列が各鎖の一つの末端におけるプライマー領域に相補的である−本鎖プライマー と，をハイブリダイズさせて，鎖／プライマー複合体を形成させること，および （ｉｉｉ）該鎖／プライマー複合体を，ポリメラーゼとデオキシヌクレオチドと の存在下で二本鎖断片に変換すること。
11. １１．陽性起源の混合物に特有の二本鎖断片をさらに単離する，請求項１０に記 載の方法であって，富化混合物および第２の起源の混合物中で，単離された断片 を変性し，そして，２つの混合物中において，変性された断片をハイブリダイズ させる工程，ここで該ハイブリダイゼーションは，陽性起源の鎖と結合している リンカー領域が，陰性起源の鎖と結合しているリンカー領域とハイブリダイズし ない条件下で行われる；および 該第２の混合物由来のＤＮＡ断片の鎖とハイブリダイズしないＤＮＡ種を選択的 に単離する工程， を包含する方法。
12. １２．二本鎖ＤＮＡ断片の増幅方法であって，二本鎖リンカーを断片に連結する 工程；該断片を変性させて，リンカー鎖の末端を有する一本鎖の断片を調製する 工程； 該一本鎖を，その配列が各断片の鎖のリンカー鎖の末端と相補的であるプライマ ーとハイブリダイズさせて，鎖／プライマー複合体を調製する工程； 該鎖／プライマー複合体を，ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドの存在下 で，二本鎖断片に変換する工程；および 該変性，ハイブリダイゼーションおよび変換工程を，所望の増幅度が達成される まで繰り返す工程；を包含する方法。
13. １３．前記断片かゲノム断片である，請求項１２に記載の方法。
14. １４．前記断片が，メッセンジャ−ＲＮＡ種を二本鎖ｃＤＮＡ断片に変換するこ とによって調製される，請求項１２に記載の方法。