JPH04501658A

JPH04501658A - ウイルスのヌクレオチド配列

Info

Publication number: JPH04501658A
Application number: JP1509499A
Authority: JP
Inventors: グリフィン，アネッテ　メアリー; ロッス，ルイース　ジョセフ　ノーマン; スコット，サイモン　デビッド; ビンズ，マシュー　マッキンリー
Original assignee: メリアル
Priority date: 1988-09-13
Filing date: 1989-09-13
Publication date: 1992-03-26
Anticipated expiration: 2017-06-17
Also published as: WO1990002802A3; EP0748631A3; EP0434747B1; JPH04502852A; JP3339854B2; AU4325089A; EP0434721B1; IL113339A; AU633272B2; EP0748631A2; US6100088A; US5744143A; WO1990002803A3; US5958425A; AU4214289A; JP3292371B2; IL91627A; IL113339A0; EP0748631B1; WO1990002803A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ウィルスのヌクレオチド配列本発明はウィルスのヌクレオチド配列に関するもので、病気に対する免疫性を、付与するワクチンに関連したウィルスのヌクレオチド配列を提供することを目的とする。

従来技術ヘルペスウィルスは、大きな二重鎖ＤＮＡウィルスで、エンベロープによって囲まれた２０面体カプシドからなる。このウィルスは、生物学的特性とゲノム構造とにもとづいてアルファ、ベータ、およびガンマヘルペスウィルスに分類される［Ｒｏｉｚｍａｎ、　Ｂ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｉｎｔｅｒ−ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８．２０１−２１７コ。トリヘルペスウィルスには、鶏に発生するリンパ腫症の一種であるマレック病を引き起こすマレック病ウィルス（ＭＤＶ）（ガンマヘルペスウィルス）［総説：　Ｐａｙｎｅ、　Ｌ、Ｎ。

（ｅｄ）　Ｍａｒｅｋ’ｓ　Ｄｉ＠ｅａａｅ　（１９８５）、　Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｂｏａｔｏ獅撃■A鶏の呼吸器系上部に感染して致死または排卵減少を引き起こす感染性咽頭気管炎ウィルス（ＩＬＴＶ）　（アルファウィルス）とが含まれる。

最近、われわれの研究室において偶然にも、多くの保護された遺伝子を同定することを可能とするような、ＭＤＶ、ＩＬＴＶおよび哺乳類のヘルペスウィルス、特に水痘性口内炎ウィルス（ＶＺＶ）および単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）との間における顕著なアミノ酸配列の相同性（ホモロジー）が発見された。これらには、ＨＳＶの糖タンパク質、ｇＢ、ｇＣおよびｇＨに相同なＭＤＶおよび七面鳥ヘルペスウィルス（ＨＶＴ）のアミノ酸配列、ＴＫおよびリボ核酸還元酵素遺伝子に相同なＩＬＴＶ、ＭＤＶおよびＨＶＴのアミノ酸配列、そしてｇＢおよびＶＺＶの遺伝子３４および３５に相同なＩＬＴＶのアミノ酸配列も含まれる［Ｂａｃｋｍａｓｔｅｒ、　Ａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　８９．２０３３−２０４２］。

ＭＤＶの株は３つの血清型に分類されている。１型は病原性の株とその弱毒株、２型は天然の非病原性法、そして３型はＨＶＴが含まれる。１０年以上前から、ＨＶＴによる種痘がマレック病に対して顕著な有効性を示すことが知られている。

しかし最近になって、ＨＶＴによる種痘に対して抵抗性を示すＭＤＶが単離されている。このようなウィルス毒性が非常に高いＭＤＶによる鶏の損失は、米国、ヨーロッパおよび中東の地域において発生している。しかし、ＨＶＴ、２型ＭＤＶおよびＭＤＶ高ウィつス毒性株を弱毒化して得た株からなる混合物を用いることによって、そのような損失を確実ではないが減少させることが可能である。

このような知見、すなわちＨＶＴまたは２型ＭＤＶによって共有されないＭＤＶ型特異的エピトープが存在するということは、われわれに抗原的には従来のワクチンよりもＭＤＶに関係した改良型ワクチンを作ることが可能であることを結論させた。［総説：　Ｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ｂｉｇｇｓ　ｉｎ　Ｇｏｌｄｍａｎ　Ｊ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｍ、Ａ、　（ｅｄｓ）Ｌｅｕｋａｅｍｉａ　ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｎ＋ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　uｉｒｕｓ−１ｎｄｕｃｅｄ　Ｔｕｍｏｕｒ、　ｐ１３−３１．　Ｍａｃｍｉｌｌａｎ、　１９８６］いくつかのヘルペスウィルス抗原は、組換えワクシニアウィルス内で発現されたときに保護免疫を与えることが示される。これらには、ＨＳＶのｇＢ　［ＣａｎｔｉｎＥ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９ｇ？）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４．５９０８−５９１２］、gＳＶのｇＤ　［Ｐａｏｌｅｔｔｉ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　（ｔ９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８P．１９３ −１９７］および偽狂犬病ライ＃Ｘ　（ＰＲＶ）（１）ｇＰ５０．ＨＳＶ（ＤｇＤ（７）相同タンパク質（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）　［Ｍａｒｃｈｉｏｌｉ、　Ｃ，Ｃ，ｅｔ　ａｌ、　（１９ｇ？）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１．３９７７−３ X８１］が含まれる。なぜなら、ウィルスの貫通および感染力にｇＢが必須であること、またヘルペスウィルス間で保存されているｇＢとその相同タンパク質は重要な免疫源であるからである。さらに、感染細胞の表層にｇＢが存在することは、体液性免疫応答および細胞性免疫応答にとって重要な標的となる［Ｂｌａｃｋｌａｗｓ、　Ｂ、Ａ。

ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８．１１０３−１１１４　（１９８７）；　ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ−Ｔａｙｌｏｒ、　ＥA　ｅｔ　ａｌ。

（１９８８）　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９．１７３１−１７３４］。

最近になって報告されたＨＳＶの糖タンパク質ｇＨもまた感染力にとって必須なものであり、また重要な免疫源でもある［Ｄｅｓａｌ、　Ｐ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９．１１４７−１１５６コ。また、ｇＣの相同タンパク質であるＰＲＶのｇｌＩＩも中和抗体の主標的および細胞毒性Ｔ細胞の主標的として重要であるが、かならずしも必須のタンパク質ではないことが知られている。しかし興味深いことは、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）によって感染された細胞のＴ細胞介在細胞毒性反応における即時型初期タンパク質の期待はずれな出現である［Ｋｏｚｉｎｏｗｓｋｉ　Ｕ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　（１９ｇ？）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１゜２０５４−２０５８］、同様な抗原は、マレック病における潜伏感染リンパ球および形質転り病の腫瘍組織から確立されたリンパ珠芽細胞系において即時型初期ＲＮＡ転写産物が検出されるからである。

また、ポックスウィルスワクシニアをベクターとして用いて作られた多くの組換えワクチンが報告されており、また外来遺伝子発現のためにヘルペスウィルスをベクターとして用いた場合も報告されている。よって、肝炎抗原はＨＳＶで発現されている［５ｈｉｈ、　Ｍ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　（Ｉ９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８P゜５８６７−５８７０］。またヒト組織プラズミノーゲン活性因子はＰＲＶで発現されている［Ｔｈｏｍｓｅｎ、　Ｄ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｇｅｎｅ　５７．２６１−２６５］。これら両者の場合、外来遺伝子は非必須的なヘルペス遺伝子のクローン化断片内に挿入され、相同遺伝子組換えによってウィルスベクターに組み込まれる。肝炎ウィルス遺伝子は、ヘルペスウィルスプロモーターに融合され、また組換えＤＮＡはＨＳＶのＴＫ遺伝子に挿入される。組換えＤＮＡと野生型Ｈ３ＶＤＮＡとの同時トランスフェクションにつづく相同遺伝子組換えによって肝炎抗原を発現するＴＫ−ウィルスが得ちれる。

ＰＲＶの場合、ＵｓにマツピングされたｇＸ遺伝子を外来遺伝子の挿入部位として用いられる。ここで用いれる戦略は、ＨＳＶのＴＫ遺伝子をＴＫ欠失ＰＲＹ突然変異体（ＴＫ陽性ウィルス）に挿入することを含むものである。そして、ブラズミノーゲン活性因子はＨＳＶのＴＫ遺伝子のクローン化断片に挿入し、この組換え体を相同遺伝子組換えによってＰＲＶに導入する。ＴＫ−ウィルスを前記のヒト遺伝子を発現するものとして選別する［前掲、Ｔｈｏ＋ｎａｅｎ　ｅｔ　ａｌ、］。同様に、ＶＺＶをベクターとして使用する［Ｌｏｗｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ−Ｕ、Ｓ、＾、　８４．３８９６−３９００１　、いくつかのヘルペスウィルス遺伝子も毒力（ｖｉｒｕｌｅｎｃａ）に関連しており、またインビトロの系における増殖に必須のものでないことが知られている。これらにはＨＳＶのＴＫ遺伝子［Ｊａｍｉｅｓｏｎ、　Ａ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９７４）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　２４．４６５−４８０；　Ｆｉｅｌｄ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｗｉｌｄｙ、　Ｐ、、　（１９８７）　Ｊ、@Ｈｙｇｉｅｎｅ　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）　８１．２６７−２７７］およびＰＲＶのＴＫ遺伝子が含まれる。実際、ＰＲＶはＴＫ活性の欠失によって容易に減少される［Ｔａｔａｒｏｖ、　Ｇ、　（１９６８）　Ｚｅｎｔｒａｌｂｔ。

Ｙｅｔ、　Ｍｅｔ、　Ｍεｄ　１５Ｂ、　８４８−８５３１．さらに、ＰＲＶのバルサ（Ｂａｒｔｈａ）株の減少はＵ３にマツピングされた非必須的糖タンパク質ｇ１の欠失にもとづ＜　［Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１．４０３０−４０３２］。

長い非反復配列の側面を守る間在繰り返し領域（ＴＲＳ）に存在するＨ３Ｖマツピングの遺伝子は、病原性に関係している［Ｒｏｓｅｎ、＾、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ　５．　１５７−１７５；　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｒ，Ｌ、ｅ　ａｌ、（１９８３）　Ｖｉｒｏｌｏ（ｙ　１３１．　１８０|１９２コ　。

ＨＳＶのいくつかの付加的な遺伝子はインビトロの系における増殖には非必須であるが、毒力に関係していると報告されている。これらには、ＵＬ２４　（Ｓａｎｄｅｒｓ、　Ｐ、Ｇ、、　（１９ｇ２）、　Ｊ、　（ｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３．２７７−２９５）、リボ核酸還元酵素の大サブユニット（Ｃｏｄｓｔｅｉｎ　Ｄ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｗｅｌｌｅｒ、　Ｓ、に、　（１９８８）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２．１９６−２０５）AｇＣ（Ｄｒａｐｅｒ　Ｋ、Ｇ、　ｅｔ、　ａｌ、　（１９８４）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５１．５７８−５８５）　、ｄＵＴＰアーゼ（Ｆｉｓ■ ｅｒ、　Ｆ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｐｒｅｓｔｏｎ、　Ｖ、Ｇ、　（１９８６）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１４８．１９０−！９７）　、そしてＵＬ５T およびＵＬ５６　（ＭａｅＬｅａｎ、　Ａ、Ｒ，ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎ、　Ｓ、Ｍ、　（１９ｇ？）　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８．P ３３９−１３５０）が含まれる。さらに、ＵｓにおけるＨ３Ｖマツピングのいくつかの遺伝子もまた、インビトロ系における増殖に非必須である［Ｗｅｂｅｒ、　Ｐ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　５ｃｉｅｎｃｅ２３６．５７６−５７９］。

本発明の概要本発明は、ひとつのヌクレオチド配列を提供するものであり、このヌクレオチド配列に関連した野生型ウィルス内において前記ヌクレオチド配列に結合して存在する他の配列から遊離したもので、このヌクレオチド配列は、（ａ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子のＭｖＴ相同遺伝子、（ｂ）ＨＳＶ（７）ｇＣ遺伝子（７）ＨＶＴ相同遺伝子、（ｃ）ＭＳＶのｇＨ遺伝子（７）ＨＶＴ相同遺伝子、（ｄ）ＩＬＴＶ＋７）ＴＫ遺伝子、（ｅ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子（Ｆ）ＩＬＴＶ相同遺伝子、（ｆ）ＩＬＴＶ（７）ＯＲＦ２、（ｇ）ＩＬＴＶの０ＲＦ３、（ｈ）ＩＬＴＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）、（ｉ）ＨＶＴのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）、（ｊ）ＭＤＶのりボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）、（１）ＨＳＶ−Ｉ（７）即時型初期遺伝子Ｉ　Ｅ　１７５（ｉ’）ＨＶＴ相同遺伝子、（ｍ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ６８のＨＶＴ相同遺伝子、そしてそれらの配列にマイナーな変異が生じたマイナー変異配列である。

前記（ａ）から（ｍ）に記載されたそれぞれの配列は、それぞれの配列を発現させるのに必要な停止および開始シグナルおよびプロモーターを含む他の５゛および３′非遺伝暗号配列（ノンコーディング配列）と結合したものであろう。そのような付加された配列はいわゆる自然発生的なものか、あるいは非対応ものであろう。

特に、プロモーターは前記（１）および（ｍ）のひとつと結合しているであろう。

前記した「マイナー変異配列」という言葉の意味は、その配列が本来コードしている遺伝子発現産物そのもののあるべき姿を損なうことがないようなヌクレオチド配列の変化であり、例えば相互のヌクレオチドのマイナー置換である。ある抗原を遺伝暗号化（コード）するためにベクターに挿入される配列の場合、配列にとって必須なこととは配列がタンパク質または糖タンパク質をコードしていることを意味する。その抗原の持つ抗原性に悪影響を及ぼすことがないようなアミノ酸配列の保存的な置換が生じて同様な抗原が遺伝子発現されるような配列内における保守的変化（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｃｈａｎｇｅｓ）はこのようなマイナー変異に含まれるものであろう。特に、抗原をコードする配列のなかで、抗原タンパク質そのものをコードする部分のみが使用される。そのような部分とは、例えば、ＨＶＴのｇＨ遺伝子に相当するヌクレオチド配列の２７３−３２０または８６７−９２６およびそれらのマイナー変異に該当する領域である０本発明のさらなる態様はこれらの配列およびこれらの配列によりコードされるペプチドによってなされる。

挿入部位に相当する配列の場合、ウイウルスの感染力と複製とに関しては、なんら必須的なものではなく、また組換えを可能とするような配列と相同な配列のみが必要とされる。よって、特定の配列への特定のヌクレオチド配列の挿入は、挿入される場所から下流に向けてリーディングフレームを完全に変化させるものとなるであろう、抗原をコードする配列の場合では、このような変化は好ましくないアミノ酸配列を生ずることを意味する（フレームシフトがどこに生ずるかに依 ′存する）が、挿入部位の場合は相同性の度合いはほとんど同じであるので、組換えが容易に行なえるであろう。

挿入部位においてヌクレオチドの相同性が７５％存在した場合、通常その配列はマイナー変異と見なされるが、少なくとも８０．８５．９０，９５または９９％の相同性があることが好ましい、このような相同性（ｈｏｍｅｌｏｇｙ）の度合いは上記の配列（ａ）ないしくｆ）および（ｘ）のそれぞれの全体に実質的に関係している。短い配列は、このような長い配列を単離または同定するためのプローブとして用いられるが、この場合は正確なハイブリダイゼーションを行なわせるために高い相同性が必要とされる。

よって、本発明はさらに上記配列（ａ）ないしくｍ）のいずれかの少なくとも一部分に対して９０％（好ましくは９５％、９９％または１００％）の相同性を有する少なくとも１３のヌクレオチド副配列を提供するものである。

上記したように、配列（ａ）ないしくｃ）、　（ｅ）、　（ｆ）、　（１）および（ｍ）は抗原発現配列として好適であり、またＭＤＶのＴＫ領域配列は抗原発現遺伝子の挿入のための非必須的部位部位として好適である。よって、配列（ｂ）は両方の機能に好適である。

これらの配列は、ここで開示された配列情報と、例えばオリゴヌクレオチドプローブの合成および野生型のＤＮＡとそのプローブとのハイブリダイゼーションとを含む標準的技術を用いることによって自然発生的な（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉＢ）のＩＬＴＶ、ＨＶＴおよびＭＤＶウィルスから容易に単離可能である。

抗原ＩＬＴＶおよびＨＶＴ配列、すなわち配列（ａ）から（ｃ）、　（ｅ）、　（ｆ）、　（１）および（ｍ）は、適当な宿主、特にＨＶＴまたはＭＤＶ内において現される。ひとつのＩＬＴＶ配列の挿入のための好適な非必須部位はＨＳＶのｇＣ遺伝子のＭＳＶ相同遺伝子、ＨＶＴまたはＭＤＶのＴＫ遺伝子、ＨＶＴまたはＭＤＶリホヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子、およびＭＤＶのすボヌクレオチド還元酵素（小サブユニット）遺伝子を含む。

第二に本発明は、ＭＤＶ、ＨＶＴおよびＩＬＴＶの挿入または欠失突然変異を提供するものである。すなわち、（ｉ）ＨＶＴの場合、ＨＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領域の突然変異またはＴＫ遺伝子のりボヌクレオチド還元酵素遺伝子の突然変異であり、（ｉｆ）ＭＤＶの場合、ＨＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領域の突然変異またはりボヌクレオチド還元酵素遺伝子（小サブユニット）の突然変異またはりボヌクレオチド還元酵素遺伝子（大サブユニット）の突然変異であり、（ｉ　ｉ　１）ＩＬＴＶの場合、ＴＫ遺伝子、０ＲＦ３またはりボヌクレオチド還元酵素遺伝子（大サブユニット）の突然変異である。

これらの突然変異は同定された領域の遺伝子コード配列または遺伝子非コード領域にあると考えられる。

ＨＶＴ、ＭＤ　Ｖ、およびＩＬＴＶのそれぞれの突然変異体は、鳥禽（ベクターが複製される）類のなかで遺伝子発現されることが望まれる他の配列からなるベクターと同様に、非対応抗原コード配列（ｈｅｔｅｌｏｇｏｕｍ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａｅｑｕｅｎｃｅａ）のためのウィルスベクターとして利用できるであろう、このような配列として、もちろんこれらに限定されるものではないが、　（ａ）ないしくｂ）、　（ｅ）、（ｆ）、　（１）および（ｍ）が含まれる。

非対応（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）という言葉は、ここではウィルスゲノムに関係した場所に見出されていない抗原発現配列（ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｇｅｎｅ）を意味している。

すなわち、抗原発現遺伝子はＩＬＴＶの病原性株から単離可能で、これよりも病原性の低い株のＴＫ領領域挿入れると考えれる。この挿入が自然発生的に生ずるウィルスでは起こらない場合、非対応と見なされる。

また非対応配列は、鳥脳を髄炎（流行性根せん）、鳥インフルエンザ（鳥禽ペスト）、鳥白血病、ニューキャッスル病（ＰＭＶ２ないしＰＭＶ７）以外の鳥バラマイキソパイラス（ａｖｉａｎ　ｐａｒａｍｙｘｏｉｒｕａｅｓ）　、鳥レオウィルス病（腸の病気、鍵しよう炎）、ニワトリ貧血にワトリ貧血剤によって起こる）、胞子虫症、エラグドロップ症候群（ＥＤＳ７６）、伝染性上皮腫、感染性気管支炎、感染性粘液傷痕（グンボロ（Ｇｕｍｂｏｒｏ）　）　、封入体肝炎（アデノウィルス）、七面鳥リンパ増殖性疾患（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｄｉｓｅａｓｅ）　、ニューキャッスル病、ニワトリの細網内皮増殖症、七面鳥の細網内皮増殖症、ロタウィルス腸炎、七面鳥出血性腸炎および七面鳥鼻炎（ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）のいずれか一つの疾患に関係した抗原をコードするものである。

よって、本発明にもとづくベクターは多価ワクチンによる保護を可能とする。

例えば、ＭＤＶ抗原の遺伝暗号配列（コード配列）を持っＩＬＴＶを含むワクチンは、ＩＴＬおよびマーク病からワクチンを接種された生物を保護する。

さらに、突然変異ＩＬＴＶウィルスそれ自体は、弱毒化されたウィルスとしてワクチンに利用される潜在的可能性があり、また挿入された非対応配列を持つ必要性はない。

本発明にもとづく欠失または挿入突然変異体の調製の簡易的な方法は、適当な細胞に、例えばＴＫ領領域同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）　、欠失または挿入変異されたものと全ウィルスＤＮＡまたは全ウィルス（例えば野生型（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）のウィルス）を導入することである。

そのようなウィルスのむき出しとなったＤＮＡが感染性を有することはすでに知られており、切断しないで調製した。リン酸カルシウムによる沈澱によってＤＮＡを調製するのが好ましい。

この方法に用いられる適当な細胞とは、ニワトリ胚繊維芽細胞（ｅ＋ｍｂｒｙｏ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）　、ニワトリ腎臓細胞およびアヒル胚繊維芽細胞であり、これらはベトリ皿に単層からなる細胞集団として播種されることによって好適に増殖する。相同遺伝子組換えによって形質転換ＤＮＡと全ウィルスＤＮＡとを感染細胞内で互いに組換え、そして目的とする組換え体をスクリーニングする。このスクリーニングは、例えば適当なプローブによるハイブリダイゼーションか、あるいは問題となっている領域の遺伝子産物に対する適当な抗体を用いた免疫アッセイによる検知手段によって行なわれる。

相同遺伝子組換えが行なわれるためには、ウィルスＤＮＡは複製されなければならない、現在のところＮＤＶ、ＨＶＴ、またはＩＬＴＶのための細胞フリーの複製系は知られていないが、もしそのような系が可能となったら、本発明はそのような系で実施されよう。複製および組換えが行なわれる環境は決定的なものではない。

免疫学的に利用可能なウィルス抗原をコードすることに関与したＩＬＴＶおよびＨＶＴ領域は、適当なベクター（例えばＨＶＴ、または伝染性上皮腫ウィルス、細菌また菌類などのような他のベクター）に挿入される。ウィルスベクターの場合（特にヘルペスウィルスベクターおよび腸炎ウィルスベクター）、抗原をコードしている配列（適当な配列（フランキング配列）が両端にある）と、上記した適当な宿主細胞内にあるベクターゲノムとの間にそのような挿入がなされる。

宿主にとって内在（ｅｎｄｏにｅｎｏｕ＠）的なものであるプロモーターは、非対応（ウィルス抗原をコードする）配列の対照遺伝子発現として用いられる。細菌および菌類の場合、抗原をコードする配列はすでに知られている方法またはこれから発見されるであろう方法によって挿入されよう、サルモネラ菌の非毒性株をそのような宿主として用いることが可能である。非対応配列は宿主ゲノムに挿入されるか、または自律的に複製するプラスミドによって運ばれる。

フランキング配列は、非対応配列が挿入される少なからずすべての領域が含まれる。もし、すべての領域が用いられるとしたら、その領域の配列は形質転換されたベクターに残るであろう、しかし、そのような領域には機能的な欠失が生ずる。もし、その領域の全部ではなく一部をフランキング配列として用いた場合、機能的な欠失と同様の構造的欠失が生ずるであろう。

よって、ＩＴＬＶの欠失または挿入突然変異のそのような構成は、ワクチンの改良につながる。一方、ＨＶＴ、鳥類伝染性上皮腫ウィルスまたは他のベクターに組み込まれたＩＬＴＶの糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）または他のＩＬＴＶタンパク質の発現は、効果的なワクチンの製造を可能とする。

ウィルスまたはベクターとしてＨＶＴ、ＭＤＶまたはＩＬＴＶを含むワクチンを合成するするために、ウィルスをニワトリ胚繊維芽細胞のような適当な細胞内で増殖させる。この場合に用いる培地は１９９培地（ウェルカムまたはフローラボラトリーズ）のような標準的な培養液を使用し、この培養液で３７℃、３ないし４日間増殖させる。つぎに、細胞をトリプシン処理し、１０％ジメチルスルホキシドと４％牛血清を含む培養液に懸濁する。その後、細胞をアンプルに入れて密閉し、そのアンプルを液体窒素保存する。

通常、予防接種（ワクチン投与）は生後１日経過したニワトリのひよこに対しておこなわれ、約１，０００プラ一ク形成単位を筋肉注射することによってワクチン投与が実施される。この後、数日で免疫ができる。

本発明にもとづくワクチンは、ＭＤＶに感染しゃすい鳥（ｆｏｗｌ）　、例えば商業的に利用される鶏、七面鳥、あひる、がちょうなどの家禽類を保護するために用いられるものである。

以下、本発明の好適な実施態様を添付した図を参照しながら実施例にもとづいて説明する。

第１図は、ＢａｍＨ１部位の分布とｇＢおよびＴＫ遺伝子の位置を示すＭＤＶの地図である。

第２図は、ＭＤＶのＲＢＩＢ株に存在するｇＢ遺伝子のヌクレオチド配列を示すもので、ＭＤＶの各ヌクレオチドに添えられた番号が記されている。ＨＶＴのｇＢ遺伝子に該当する部分のヌクレオチド配列のところには下線が引かれている。

相同性は垂直の棒によつて示されている。そして、ＭＤＶのｇＢ遺伝子とＨＶＴのｇＢ遺伝子と間のアミノ酸の違いは線の上の線によって示されている。

第３図は、ｇＨ（破線）、ＴＫ（黒塗）および主キャプシドタンパク質（ＭＣＰ、点）の各遺伝子の位置を示すもので、またそれぞれのＨｉｎｄＩＩＩ部位をＨで表わしている。

第４図は、ＨＶＴのｇＨ遺伝子に該当するヌクレオチド配列のほぼ全体を示すもので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上に示した。

第５図は、ＨＶＴのＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列を示すもので、ＨＶＴの各ヌクレオチドに添えられた番号が記されている。ＭＤＶのＴＫ遺伝子に該当する部分のヌクレオチド配列のところには下線が引かれている。相同性は垂直の棒によって示されている。そして、ＭＤＶのＴＫ遺伝子とＨＶＴのＴＫ遺伝子と間のアミノ酸の違いは線の上の線によって示されている。

第６図は、ＭＤＶのＲＢＩＢ株に存在するｇＣ遺伝子のヌクレオチド配列を示すもので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上に示した。

第７図は、ＴＫ遺伝子クラスターを含むＩＬＴＶゲノムの５４００塩基対からなるヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を示すものである。メインのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）産物のための予想されたアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下にアルファベットの頭文字で表わした。このアミノ酸配列の上に位置するヌクレオチド配列がそれぞれのアミノ酸に対応するコドンを示している。また、ＴＡＴＡボックスの位置は下線で示した。０ＲＦ４はＩｎ、ＴのＴＫ遺伝子配列である。

第８図は、ＩＬＴＶのＴＫ含有部分における遺伝子の配置を示すものである。

ＩＬＴＶＤＮＡを生じさせるＥｃｏＲｌ　（ｐＩＬＥｃｌ）およびＢａｌＩＩ（ｐＩＬＢｇ２）部位を含み、かつオーバーラツプされたｐＵｃ１３プラスミドクローンが示されている。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は矢印によって示された転写方向を持つオーブンボックスとして示されている。

第９図は、ＩＬＴＶのｇＢ遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すものである。

第１０図は、ＩＬＴＶのりボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すものである。

第１１図は、ＶＺＶ６２／Ｈ５Ｖ−１，７７）ＩＥ−１７５遺伝子（７）ＨＶＴ相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すものである。

第１２図は、ＨＶＴのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すものである。

第１３図は、ＭＤＶのりボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すものである。

第１５図は、Ｈ５Ｖ−１のＩＥ−１７５遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すものである。

第１６図は、Ｈ３Ｖ−１のＩＥ−６８遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すものである。

第１７図は、ウィルスゲノムの非必須領域と、プラスミドベクターにクローン化されたＤＮＡの相同領域との相同遺伝子組換えを示すものである。そして、第１８図は、プラスミドｐＩＬＢｇ２の地図であり、この地図は制限部位とＴＫ遺伝子、０ＲＦ３および０ＲＦ５の位置とを示している。

実施例ニ一般的アプローチバクテリオファージベクターＭ１３にクローン化された鳥ヘルペスウィルスの短配列を選んで、それを興味ある遺伝子全体が含まれていると考えられる長めの断片を同定するためのプローブとして用いた。このような同定は制限断片のサザンブロットハイプリダイゼーションによってなされた。詳しくは、以下に説明する。

ウィルスの株　ＮＤＶの高い癌誘発性（ｈｉｇｈ　ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）を有するＲＢＩＢ株（Ｓｃｈａｔ、　Ｋ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌ、　１１．５９３−６０５．１９８２）を米国のコーネル大学Ｂ、カルネツク（Ｂ、Ｃａ１ｎｅｋ）教授から入手した。このウィルスの精製は、ニワトリ腎臓細胞の組織培養中においてプラークを形成させることによって行なった。

ニワトリＳＰＦおよびＲＩＲ内で２度継代し、ひよこ胚線維芽細胞（ｃｈｉｃｋ　ｅｒｍｂｒｙｏ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ＣＥＦ）内で４回継代した。ニワトリの遺伝的抵抗性Ｎ−系統株に接種した場合に生ずる悪性腫瘍によって高い癌誘発性が示された。

ウェルカムリサーチ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｒｅａｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｅｃｋｅｎｈａ＋＊、　Ｋｅｗｎｔ）から得たＨＶＴのＦＣｌ２６株（ｌｉｔｔｅｒ、　Ｒ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａ１．　Ｊ、　Ｙｅｔ、　Ｒｅｓ、　３１．５２５−５３８．１９７０）を、ＣＥＦ内で１４回継代した。つづいて我々の研究室においてアヒル胚繊維芽細胞（ＤＥＦ）およびＣＥＦ内で増殖させた。そして、プラーク精製を行ない、さらにＣＥＦ内で増殖させた。本実施例のクローニングに用いるウィルスＤＮＡは元の単離から数えて２４回の継代がなされたウィルスから抽出した。

組織培養　ＣＥＦは１９９培養液（ライニルカム社製）を含む回転ボトル中において培養された。なお、この培養液には、ベニシルン、ストレプトマイシン、ファンジゾン（Ｆｕ（ｉｘｏｎｅ）　（レグド、ティー、エム；　Ｒｅｇｄ、Ｔ、Ｍ）および前記牛血清が添加されている（Ｒｏｓｓ、　Ｌ、Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　２８．３７−４７．１９７５）　。

ＣＫＣは１００ｍペトリ皿中で培養した（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ、　Ａ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｂｉｇｇｓ　Ｐ、Ｍ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　２１５．５２８−５３０．１９６７）　。

ＭＤＶ−ＤＮＡの単離　ＲＢＩＢ感染細胞（ｃｅｌｌ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ＲＢＩＢ）を、回転ボトルのＣＥＦからなる単層に、感染の程度が一細胞あたり約０．００１プラ一ク形成単位（ｐ　ｆ　ｕ）となるようにして植つけて、３７ ℃で培養した。培養３日目で、培養液を捨てて新しい培養液と交換した。交換された新しい培養液は、２％牛血清を含む１９９培養液である。そして、ゾーン遠心法によって感染細胞の細胞質分画からウィルスを単離した（Ｌｅｅ、　Ｙ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　（ｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　５１．２４５−２５３．１９８０）。ウィルスＤＮＡは、精製ウィルスをサルコシル、プロテナーゼにおよびトリス緩衝液でもって一晩、３７℃で処理し、それをグリセロール勾配でもってゾーン遠心（前掲、Ｌｅｅ、　Ｙ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　）によって精製した。高分子量のウィルスＤＮＡをエタノールによって沈澱させた後、１０ｍＭのトリス／ＩｍＭのＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁した。

ＩＬＴＶ−ＤＮＡ（７）単離（ａ）感染ＣＫＣを採集し、播種後２〜３日経過したＰＢＳで洗った後にポルチックスルによる攪拌をおこない、氷冷ＴＥ感傷液に再懸濁した。非イオン性の界面活性剤であるＮＰ４０　（最終濃度１％）を添加して攪拌し、氷うえて１５分間、インキュベートした。ＲＮアーゼ処理後、試料を２００　Ｏｒ、ｐ、＋ａ、　５分間遠心した。

遠心後、上清を採り、ＳＤＳ　（最終濃度１％）およびプロテナーゼＫ（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃、３０分間、インキニーベートした。この混合物を２図のフェノール／クロロホルム処理、および１図のクロロホルム処理をおこない、続いて、ｌ／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを含むエタノール処理することによってＤＮＡを沈澱させた。

（ｂ）また、ウィルスＤＮＡを以下の方法によりウィルス感染細胞の培養液化ら単離下。感染後２〜３日目日日のウィルス感染細胞の培養駅を厚め、３０００ｒ、ｐ、ｍ、、５分間、４℃の条件でベンチトップ遠心機により遠心処理した。遠心後、上清を再び１９．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、の回転数により超遠心（ソーパル）を４℃、１時間の条件でおこなった。この超遠心処理によって得られたウィルスペレットをＴＥ緩衝液に再懸濁し、ＲＮアーゼンでＲＮＡの消化をおこなった。

そして、既に述べたようにしてＳＤＳおよびプロテアーゼに処理をおこなって、ウィルスをこわした。

最後に破壊されたウィルスから既に述べた方法によりＤＮＡを抽出した。

ＭＤＶ−ＤＮＡのクローニング　１μｇのＭＤＶを制限酵素ＢａｍＨ１によって切断し、これをジフオスフオリレートｐＵｃ１３ＤＮＡのＢａｍＨ１制限部位に連結した。一方、使用する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＴＧＩ株細胞を標準的方法（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６６、５５７−５８０．１９８３）によって形質転換し、この形質転換細胞をアンピリジンおよびＸ−ｇａｌ存在下で培養した。白いコロニーを採取し、ニックトランスレーションされたＭＤＶ−ＤＮＡとの雑種形成（ハイプリ代走−ション）によってその存在またはＭＤＶ挿入部位について調べた（Ｃｒｕｎｓｔｅｉｎ　Ｍ、　ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、Ｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２．３９６１．P９７５）　Ｌ陽性コロニーを小量で培養し、そしてホルムス（Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｄ、Ｓ、）およびクイグレイ（ＱｕｉＨｌｅｙ、　Ｍ、）の方法（Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｄ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｑｕｉｇｌｅｙ、　Ｍ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　P１４、１９３−２９７．１９８１）によってプラスミドＤＮＡを単離した。挿入部位の大きさは、組換えＤＮＡをＢａｍＨ１消化し、それをアガロース電気泳動することによって調べた。その結果、工ないし１８キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも少ない塩基対からなるＭＤＶ挿入部位を有するプラスミドが得られた。

ＩＬＴＶ−ＤＮＡのりｏ−＝ンＩＬＴＶ−ＤＮＡの旦旦旦Ｒ１および旦ｄＩＩライブラリーを既に述べたようなｐＵＣＢに含まれるウィルスＤＮＡのクリーニング消化（ＣＩｏｎｉｎｇ　Ｄｉｇｅｒｔｓ）によって得た。

ウィルスＤＮＡのランダムシーフェンシング　ソニケーション処理したウィルスＤＮＡ断片をジフォスフオリレートＭ１３．ｍｐｌｏ　（アマ−ジャムインターナショナルＰＬＣ）のＳｍａＩ制限部位にクローン化し、ＭＤＶ挿入部位を含むプラークをＮＤＶ−ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって同定した。

そして、その配列を３５Ｓ−ｄＡＴＰを用いたジデオキシ方法（Ｓａｎ（ｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７４．５４６３−５４６７）によって同定した。

同様な方法をＭＤＶ−ＤＮＡのクローン化断片の配列決定に用いた。この場合、プラークはｐＵｃ１３含有コロニーを避けるために標識された挿入部位とのハイブリダイゼーションによって決定した。

実施例１：ＭＤＶのｇＢ遺伝子ＨＶＴのＭ１３クローンは、ＭＤＶのＢａｍＨ１断片Ｉ３とハイブリダイズされたＨ３ＶおよびｖｚｖのｇＢ遺伝子に対して相同性を示す（第１図参照）０ＭＤＶのＲＢＩ株のＢＢａｍＨ１ライブラリーから得たこの断片のシーフェンシングが示すことによれば、その遺伝子のＮＨ３末端から始まる１／３の部分がＩ３を含んでいた。この遺伝子の残りの部分は、隣接する制限断片に３と同定された。

第１図は、２．６ｋｐの長さからなる遺伝子の位置を示す地図である。その遺伝子から転写されたｍＲＮＡの長さは２．６ｋｐと推測される。翻訳されたタンパク質の長さはアミノ酸、８６５個に相当した（第３図）、これはシグナル配列ドメインの部分を構成する約２０のアミノ酸も含まれる。ＭＤＶ−ｇＢ遺伝子の初期翻訳配列は他のヘルペスウィルスのｇＢ遺伝子と共通な部分、例えばシスティン残基の列および脂質二重層を広げることが可能な疎水性配列が存在する（Ｆｅｌｌｅｔ、　Ｐ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５３．２４３−２５３．１９８５）　、　１．かじ、ＭＤＶのｇＢ遺伝子はＨ５ＶのｇＢ遺伝子とたった４８％のアミノ酸配列の相同性しか認められず、２３個のアミノ酸（１８５１−１９２０残基、第２図）の挿入およびグリコシレージョンによるエクストラ部位の存在など独特の姿を示す、ＨＶＴのｇＢ（第２図）に該当する限定された配列データ（７０２塩基）とＭＤｖのｇＢの配列とを比較すると、これら２つの糖タンパク質に関して７６．９％の核酸の相同性と８７．１％のアミノ酸の相同性とが認められた。ＭＤＶのｇＢと比較してＨＶＴのｇＢにおけるアミノ酸置換は、ウィルス中和に関連したＨ５ＶのｇＢのドメインと等価な領域（１３２３ −１４３３残基）に特に集中した（前掲、Ｐｅ１ｌｅｔ　Ｐ、Ｅ。

ｅｔ　ａｌ、　１９８５）　、　ＭＤＶおよびＨＶＴのｇＢ間におけるアミノ酸置換もまた、未知の機能に関連した他の領域に集中された。

実施例２：　ＨＶＴのｇＨ遺伝子およびＭＤＶのｇＨ遺伝子Ｈ３ＶのｇＨ遺伝子に相同な配列を含むＨＶＴのＭ１３クローンは、遺伝子同定およびマツピングに関するわれわれの初期の研究において同定された（前掲、Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９８８）　ｅこのクローンは、プローブとして用いた場合、ＨＶＴの６ｋｂからなるＨｆｎｄＩＩＩ断片とハイブリダイズ（雑種形成）する（第３図）、シーフェンス（配列決定）によって、この断片がカルボキシ末端を含むおよそ１／４のｇＨ遺伝子を含むことが明らかになった。ｇＨ遺伝子の残りの部分を有する隣接するＨｉｎｄＩＩＩ断片（３，２ｋｂ）はＨｔｎｄＩＩＩ部位と重なり合うＨＶＴのクローン化ＨｐａＩ断片とハイブリダイゼーションされた。

第４図は、ＨＶＴのｇＨ遺伝子の遺伝暗号領域（コード領域）とフランキング配列とを示すものである。ＨＶＴのｇＨ遺伝子と、Ｈ３ＶＩ、ＶＺＶおよびＥＢＶに含まれるその相同遺伝子との間におけるアミノ酸の同一性（％）は、それぞれ２０．２４および２０であった（アミノ酸が最大重なり合った数６３０．６４４および１５３からそれぞれ推定した）。

実施例３：　ＨＶＴのＴＫ遺伝子とＭＤＶのＴＫ遺伝子ＨＶＴ（７）ＴＫ遺伝子の全遺伝暗号領域（１０５３ｂｐ）は、前記した３、２ｋｂｐからなるＨｆｎｄＩＩＩ断片を含むものである（第３図）、遺伝子全体およびフランキング領域の配列は第５図に示した。同様に、ＭＤＫのＴＫ遺伝子はＭＤＶの３．６ｋｂｐからなるＢａｍＨＩＫ２断片を含むものである。ＭＤＫのＴＫ遺伝子の完全な配列を第１４図に示した。ＭＤＶおよびＨＶＴのＴＫ配列の比較空、２つの遺伝子は６０％のアミノ酸の同一性を有することがわかった。これとは対照的に、ＨＶＴのＴＫ遺伝子とＨ３ＶＩ、ｖｚｖおよびＥＢｖのＴＫ遺伝子間の同一性はそれぞれたったの３０．２７および２４％であった（アミノ酸が最大重なり合った数３２０．３３２および１９３からそれぞれ推定した）、ＨＶＴおよびＭＤＶのＴＫ遺伝子から予想されるアミノ酸配列は、リン酸化に関連したいくつかのウィルスおよび真核生物のタンパク質のためのＡＴＰおよび（または）ＣＴＰ結合部位の特徴を示した（Ｇｅｎｔｒｙ、　Ｇ、Ａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　ＡＳｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、　８２．６８ｉ５−６８１９）。これらの保守的な配列は外来遺伝子の発現および挿入のための好適な部位として、またＴＫ−欠失突然変異体を産生ずるのに好適である。

実施例４：ＭＤＶ　（ｇＰ５７−６５）（ｇＣ相同遺伝子）　（７）Ａ抗原遺伝子Ａ抗原遺伝子は、Ｈ３Ｖの相同遺伝子として同定されたことからワクチンの開発にとって大変興味深い遺伝子であり、免疫源（主要グリコポリペプチド産物をコードする）として、また非必須領域として用いられる。このＡ抗原遺伝子は、ＭＤＶのＢａｍＨＩＢ断片の中に置かれており（Ｉｓｆｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　１９８７）　、　ＭＤＶのＧＡ株に関してはヌクレオチド配列が決定されている（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ　ａｎｄ　Ｖｅｌｉｃｅｒ、Ａｂｓｔｒａｃｔ　０Ｐ１８．５１．　Ｖｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９−１４　`ｕｇｕｓｔ、　（１９８７）　Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、　Ｃａｎａｄａ；　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２．２３７４−２３７９）　、前記したランダムなシーフェンス決定に関する研究過程において、Ａ抗原遺伝子発現産物であるＭ１３クローン（Ｎｏ、１３０）を同定した。よって、このクローンをＡ抗原を含むＭＤＶのＲＢＩＢ株から得られた２、３ＫｂｐのＥｃｏＲ１／ＰｖｕＩＩ断片を同定するのに用いた。そして、この断片を標準的な方法により、ＳｍａＩ／ＥｃｏＲ１によって裂かれたｐＵｃ１３ベクターにクローン化した。ＭＤＶのＲＢＩＢのＡ抗原の配列と予想されるアミノ酸配列とは第６図に示した。ＭＤＶおよびＨＶＴのＡ抗原領域は非必須遺伝子であり、よってＭＤＶおよびＨＶＴ内の部位として好適であり、その中に相同遺伝子組換えによって他の遺伝子が挿入されよう、このことはいくつかの証拠から支持される。それらの証拠を以下に示す。

（１）われわれの研究において、他のＲＢＩＢのＡ抗原が単離され、かつ配列決定された。これは３′からＡ抗原ＡＴＧコドンまでのＴが４５塩基つらなった（Ｔ’ｓ　４５　ｂａａｅｓ　３’　ｔｏ　ｔｈｅ　Ａ　ａｎｔｉ（ｅｆｔ　ＡＴＧ　ｃｏｄｏｎ）余分な（エクストラ）Ｔ残基を有する。このエクストロラＴは遺伝子に機能的なＡ抗原をコードさせるのを不可能にするようなフレームシフト変異を引き起こす。この遺伝子は複製ＭＤＶからクローン化可能であるので、その結果Ａ抗原はウィルスにとって非必須的なものであることになる。

（２）同様な研究から、ＭＤＶ（７）Ａ抗原はＨ５Ｍ）ｇ（ＪＪ、！１．びＰＲＶ（７）ｇ　ｐ　ＩＩＩ糖タンパク質と相同であることが明らかになった。これら２つの相同遺伝子は非必須的なものと考えられている（Ｈ５Ｖ相対体にとって、ロセンタルらの文献：　Ｒｏａｓｎｔｈａｌ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６Ｌ　２４３８−２４４７を見よ。

（３）ＭＤＶの株であって寒天ゲル分散試験によってＡ抗原が欠如していると判定された株（ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ、　Ａ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　４．５５７−５６４．１９６９）またはより感度の高い２次元免疫沈降試験において低レベルの検出結果を示す株が報告されている（Ｖａｎ　Ｚａａｎｅ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１２１．１３３−１４６）　ｅさらに、Ａ抗原は主要な分泌糖タンパク質であり、Ａタンパク質にある外来エピトープを示すための好適な場所（ｌｏｃａｔｉｏｎ）であろう。これによって、Ａ抗原遺伝子内にあるフレーム内のエピトープをコードしているオリゴヌクレオチドをコードすることが可能であろう。

ＨＶＴおよびＩＬＴＶベクタニニ遺伝子を入　るための２つの可能性がある、すなわち、（１）ベクターの非必須的遺伝子への挿入、（２）ベクターの該当する得電子との置換。

これは、ＭＤＶおよびＨＶＴのいくつかの遺伝子間において実質的に相同な領域においてのみ可能である。

５：ＨＶＴ　ＩＬＴＶまた）ｔＭＤＶのｔ”ｌ？’　ｉ伝子ヘノ入（ａ）ベクターのＴＫ遺伝子座への挿入（１）ＨＶＴ、ＩＬＴＶまたはＭＤＶは鳥ペルペスウイルスの遺伝子の挿入および発現のためのベクターとして用いられることが可能であろう。特にＭＤＶのＲＢＩＢ株のｇＢ、ｇＣ，ｇＨまたハｇ　Ｃｌ’ｒ、、ＩＬＴｖに挿入される。また、ＩＬＴＶのｇＢおよびＤＳ−１７はＨＶＴまたはＭＤＶに挿入される。これらは、挿入された遺伝子と結合したプロモーター、非対応（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）プロモーター、或はこれらの異なるクラスにある遺伝子（例えば、ｇＢ遺伝子発現に好適な即時型初期プロモーター）を用いるであろう。

（２）ＩＬＴＶは、烏ベルペスウイルスの遺伝子とは無関係な遺伝子を挿入および発現させるための一般的なベクターとして利用可能であり、また、最適な発現のためのプロモーターを操作する必要とする遺伝子の挿入に用いられる方法は、Ｈ３Ｖへの肝炎抗原の挿入に関する既知の方法（前掲、５ｈｉｈ　ｅｔ　ａｌ、１９８４）に基づく。

既に述べた方法に因って得られたＭＤＶおよびＨＶＴのＤＮＡは、ＤＮＡ抽出中にＤＮＡの切断が起こらないような予防策を講じることによって、間宣誓をそこなわず、ＤＮＡを保護することができる。

ストウおよびウィルキーの方法（前掲、ＳｔＩ＆　Ｗｉｌｋｉｅ　Ｊ、　（ｅ＋ｘ、　Ｖｉｒｏｌ、　３３．４７７、１９７６）によって得られたウィルスＤＮＡのリン酸カルシウム沈澱物をＣＥＦからなるサブコンフルエント（３℃ｂ−ｃｏｎｆ　１ｕｅｎｔ）な単層に添加した。１時間、３７℃で吸着させた後、培養液を添加して細胞が密集した状態（コンフルエントな状態）となるまで１〜２日間培養した。コンフルエントな状態からなる１９９培地（ウェルカム）と、前記培養駅の一部を置き換えた（１：１または２８１）、そして、プラークが形成されるまで１．３７℃で培養した。通常、このプラーク形成は４〜５日後に見られるようになる。、１μｇのＨＶＴ−ＤＮＡあたり、約２００のプラークが得られ、また１μｇのＭＤＶ−ＤＮＡあたり、約５０のプラークが得られるであろう０組換えウィルスの相同遺伝子組換えおよび単離のために、目的とする遺伝子を前記したような１０：１ないし２２：１のＴＫまたはｇＣおよび野生型ウィルスと共形質転換したような非必須的遺伝子へ、挿入する。或は、完全な野生株を共感染（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）に用いることが可能であるゆＨＶＴのＦｃ−１２６株のＴＫ、遺伝子への外来抗原遺伝子を挿入することに用いられる制限酵素は、且主ユＩ１．旦５ｚ１２８６、ＤｒａＩＩＩ、及旦旦ＲＩ。

旦土ユ旦ＩＩ、旦旦互工、Ｋ互！■およびＮ１」Ｊ、Ｉ　Ｉおよび旦１ｈ工である。

これらの制限酵素による切断（消化）部位は、ＴＫ遺伝子の発現を妨害する外来ＤＮＡの挿入部位として用いられ、ＴＫ遺伝子部分がこれらの酵素（またＥＣ旦にも利用可）の組合せによる二重消化によって取り除かれて、不活性化させる。

これらの酵素のいくつかは、プラスミドベクターに消化部位をもち、このような部位にウィルスＤＮＡ断片がクローン化される。よって、ベクターを切断することなしにクローン化されたＤＮＡを直線化するために制限酵素による部分消化の手法が用いられよう。

前記した酵素群には、フランキング遺伝子活性を阻害するようなものは含まれておらず、Ｈ３Ｖ−１相同遺伝子がウィルスの増殖に重要な役割を果たす。ウィルスの組換えは、　［プラーフリフット（ｐｌａｑｕｅｌｉｆｔｓ）　Ｊによって検知することが可能である。このプラークリフトは、寒天培地にへばりついた感染細胞と、放出されたウィルスとをニトロセルロースに移すことによって、そのニトロセルロース上で、細胞からの変性ＤＮＡと、ウィルスとをハイブリダイゼーションするもので、細胞のＤＮＡはヴイラレアル５の文献（Ｖｉｌｌａｒｅａｌ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　１９６、１８３−１８５．１９７７）に記載された好適なプローブとする。プローブと雑種形成されたウィルスは、単層培養回収できる。

同様の方法が目的とするニブトープを発現する組換えウィルスを単離することに用いることが可能である０例えば、　「プラークリフト」に用いられるニトロセルロースに抗体処理をほどこし、つづいて結合したフォスファターゼまたは標識プロティンあのような適当な検知システムを用いることによって、この結合した抗体の存在を検出することができる。そして、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）　（前掲、Ｒｏｓａ、　Ｎ、　１９８５）　（Ｓｃｈａｔ、　Ｋ、　Ａ、　ｅｔ、　ａｌ、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４．１５９−２７O．１９８４）またはＦＭＡＵを含む培地で増殖させることによってＴＫ−ウィルスを選別する。適当なプロモーターをもつ遺伝子をまず最初にクローン化ＴＫ遺伝子（化７図）に挿入する。次に、この組換えＤＮＡをひよこ胚線維芽細胞または、ニワトリ腎臓細胞中にベクターの感染ＤＮＡと同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させる。

この戦略の主な利点は、前記選別方法が目的とする遺伝子を含むウィルスの組換え体を得るチャンスを増大させることである。また、最適な発現に適したプロモーターの選択が可能となることである。よって、即時型プロモーターの利用は、潜伏性（ｌａｔｅｎｔｌｙ）感染細胞における発現を可能とする。

（ｂ）ベクターのｇＣ遺伝子座における挿入、Ａ抗原ＣＨ５ＶのｇＣ遺伝子ＨＶＴおよびＭＤＶ相同遺伝子）は生体内（動態）およびガラス器内（劫亘史）系（ｇＣに関するセツション参照）でのウィルス増殖にとって必須なものではないので、その部分は外来遺伝子の挿入および発現のための好適な部位となるであろう。

さらに、Ａ抗原は、豊富にある抗原の一つであり、また分泌されるものであることから、外来タンパク質の免疫特性を強化することに利用できる。

この人抗原遺伝子座におけるウィルス組換え体の単離は目的とする遺伝子の少なくとも一部がｇＣ遺伝子にあるクレームにまず挿入され、そして間宣誓ウィルスＤＮＡとともに形質転換されることによって達成される。配列特異的プローブまたは特異的抗体によるウィルスプラークのスクリーニングは、組換え体の単離を可能とする。

施１６：ＨＶＴにおけるＩＬＴＶｉ　子とその相ｐ′伝子との実施例５に示した方法によって、置換はクローン化されたＩＬＴＶ配列と感染性ＨＶＴ−ＤＮＡとの同時トランスフェクションによって達成される。

ＩＬＴＶから誘導された遺伝子をＨＶＴのそれに対応するものと置換することが効果的であろう。

ＩＬＴＶ配列とエピトープとを発現する組換え体は、ＩＬＴＶ特異的モノクローン抗体または、既に述べたユニークＩＬＴＶ配列に対する抗ペプチド抗体を用いることによって検出できる。

この方法の利点は、プロモーターの操作を必要としないことと、相対的に単純な方法から成るということである。しかし、相同な部分を持つ遺伝子に限定される。

、流側７：ＩＬＴｖのＴＫ−然　を′るための略　然欠失を遺伝子のどの場所にでも生じさせることが可能である。例えば、ＡＴＰおよびＣＴＰ結合部位をリン酸化するような酵素とＩ−ての機能に必要な遺伝子のドメンに対してである。これは、制限酵素による二重消化（ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅａｔｉｏｎ）によって達成される。ここで用いられる制限酵素は、Ｓｎ且Ｂ１または旦ｃｌＩである。

二重消化後、適当な断片を再結合させ、つづいて、ウィルスＤＮＡとの同時トランスフェクションまたは、ウィルス感染細胞へのトランスフェクションを実施する。制限酵素の選択などによる第７図、第８図およびプラスミドｐＩＬＢｇの地図（第１８図）を参照してもらいたい、ＴＫ−ウィルスはアシクロビル（ａｃｕｃｌｏｖｉｒ）　（前掲、Ｒｏｓｓ、　Ｎ、　１０５）または、ＦＭＡＵ　（前掲、５ｃｂａｔ、　Ｋ、ａ。

ｅｔ　ｍｌ、　１９８４）の存在下よって、ハイブリダイゼーションによって、プラーク精製クーロンにおけるに遺伝子の欠失う部位の不存在に関して調べた。

ＩＬＴＶの欠失う突然変異対それ自体をワクチン合成のための弱毒化ウィルスとして用いること、また挿入されたヘテロな抗原遺伝子配列をもつものとして用いることが可能である。

理Δｍ　ヘルペスウィルスプロモーターまたは他の適当な配列なたはシグナル塩基による調整下にある機能的β−ガラクトリダーゼ遺伝子は、ＴＫ活性によって重要なＴＫ遺伝子のドメインにまず誘導される。そして、組換え体ＤＮＡは間宣誓ウィルスだＮと共形質転換するか、もしくはウィルス感染細胞にトランスフェクションして、相同遺伝子組換えをおこす。アセロビルまたはＦＭＡＵ存在下における選別はＴＫ−挿入突然変異体を生じさせるであろう、もし、β−ガラクトリダーゼが導入されたとしたら、突然変異体はＸ−ｇａｌ存在下で青い色のプラークが生じることによって検出される。

必要に応じてＴＫ遺伝子とそれを囲む配列を他の適当なベクターにサブクローン化することができる。

流側８　：　ＨＶＴ　ヘノＭＤＶ（７）ＲＢ　Ｉ　Ｂ　に　る　Ｄ゛　子の（本発明の範囲に囲まれないが、類似の方法を示す）ＨＶＴ（７）ＴＫ遺伝子をプラスミドベクターｐＵＣＢに７ｏ−化し、ｐＴＫＩＢと呼ばれるプラスミドを作る。このプラスミドを、例えばＴＫ遺伝子のみをもつプラスミドを切断する制限エンドヌクレアーゼＲｓｒＩＩ（第５図のヌクレオチド配置１９７．酵素認識部位（ＧＧＡＣＣＧ）によって直線化する。これによって、　「粘着性（ｓｔｉｃｋｙ）　Ｊ端末が生じ、この生じた端末を通常の方法（参考文献：＃Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”、　ｅｄ、　Ｍａｎｉａｔｉａ　Ｔ、、　Ｆｒ１狽≠モ■@Ｅ。

Ｆ、、　ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ（Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２）によって修復する。

ＲＢ１’ＢのｇＢ　遺伝子を独自に２つのプラスミド上にクーロン化し、それぞれＲＢＩＢ一旦ａｍＨ１−Ｉ、およびＲＢＩＢ一旦ａ　ｍ、ＨＩ　Ｋｓと命名した。一つのプラスミド上にある完全な複製ｇＢ遺伝子を生じさせる為に、両方のプラスミドを旦ａｍＨ１で切断し、そして切断を連結（レゲーション）した。目的通りに作られた組換え体をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。しかし、前記したように、完全なｇＢ配列は実質的に旦旦旦ＲＩ／５ａｌＩで切断し、両端を修復してそのプラスミドを前記のように合成されたＰＴＫＩＢにクローン化した。また、ＭＤＶのｇＢオープンリーディングフレームは、ＨｉｎｃＩＩおよびＮａｅＩによる消化によって、プラスミドＭＳＢ２７から切り出され、部分的にｍＩによって切断されたＨＶＴのＴＫプラスミドｐＴＫＩＢに連絡される。ＴＫとｇＢの両配列を含む組換え体プラスミドはハイブリダイゼーションによって同定され、さらにサザンプロットによって分析される。そして、組換え体プラスミドはＨＶＴつオルス（ウィルスＤＮＡ）を含む細胞に誘導され、ＴＫ遺伝子へｇＢ遺伝子を誘導することにようる相同遺伝子組換えがおこなわれる。ＪＶＴウィルス組換え体はアシクロビルまたはＦＭＡＵによって選別され、或は標識ｇＢプローブによって検出される。

実施例９：ＨｖＴに　入されるＲＢＩＢ（１’）ＣＣＡ　原　゛　子末端が鈍くなった（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄｅｄ）　Ｐ　ＴＫ　Ｉ　Ｂを実施例８に示されるようにして合成した。ＲＢＩＢのｇＣ遺伝子を制限エンドヌクレマーゼ旦立旦ＲＩおよび旦１旦ｄＩＩＩ　（ｐｕｃ１３ポリリンカーに含まれる部位）によって、プラスミドｐＭＢ４１９（実施例４）から切断した。これによって生じた粘着性末端を標準的なプロトコールに基づいて再び修復した。末端を修復されたｇＣ断片を実施例８に示したようにして直線化された末端修復ｐＴＫＩＢにクローン化した（クローニングは、制限酵素による獲られるクローンの分析放射性同位元素標識断片によるブロービング、またはＤＮＡセークエンシング、または、これらの組合せによって変化に富んだものである。）ＨＶＴの中にクローン化されたＲＢＩＢのｇＣ遺伝子をもつプラスミドを、リン酸カルシウムによる沈澱またはエレクトロポレーシヨン（を気穿孔）によってＨＶＴ−感染細胞に１−ランスフェクションさせた。ｇＣ遺伝子の両端をクロスオーバー（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ）させたＨＶＴウィルスとＨＶＴのＴＫプラスミドのフランキング配列との間の相同遺伝子組換えは、ＲＢＩＢのｇＣ遺伝子をＨＶＴウィル゛スゲツムへ運ぶ。ウィルス組換え体は前記のようにして、ＴＫ−として選別され、またはブロービングによって同定される。類似の方法として、既に述べられ、かつ図に示された並列情報は、それらの遺伝子などをここで開示したＩＬＴＶの非必須的ゲノムに挿入するためのクローニング戦略を提供するために用いられるものであり、またはＩＬＴＶ中の抗原遺伝子を作るために利用される。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．ヌクレオチド配列であって、前記配列は前記配列と結合した野生株ウイルス内において前記配列に隣接する配列は含まれず、また前記配列は以下のグループから選ばれることによって成り立つ：（ａ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、（ｂ）ＨＳＶのｇＣ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、（ｃ）ＨＳＶのｇＨ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、またはその２７３−３２０または８６７−９２６の部分、（ｄ）ＩＬＴＶのＴＫ遺伝子、（ｅ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子と相同なＩＬＴＶの遺伝子、（ｆ）ＩＬＴＶのＯＲＦ２、（ｇ）ＩＬＴＶのＯＲＦ３、および（ｈ）ＩＬＴＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子、（ｉ）ＨＴＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子、（ｊ）ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（小サブユニット）遺伝子、（ｋ）ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子、（ｌ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ−６８と相同なＨＶＴの遺伝子、そして（ｍ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ−１７５と相同なＨＶＴの遺伝子。
２．請求の範囲第１項記載にもとづく配列であって、前記配列は遺伝暗号部分と（または）、前記配列の少なくとも５′もしくは３′側の非遺伝暗号部分とによって構成さることを特徴とする。
３．請求の範囲第１項または第２項（ｃ配列を除く）記載にもとづく配列と適当な宿主で複製可能なＤＮＡとを含むことを特徴とするプラスミドベクター。
４．請求の範囲第３項記載にもとづくプラスミドベクターであって、前記ベクターはＭＤＶ−、ＨＶＴ−、またはＩＬＴＶ−感受性細胞に適当なベクターであることを特徴とする。
５．ＭＤＶ、ＨＶＴ、またはＩＬＴの挿入または火矢突然変異体であって以下の特徴を有する：（ｉ）ＨＶＴの場合、ＨＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領域の突然変異またはＴＫ遺伝子のリボヌクレオチド還元酵素遺伝子の突然変異であり、（ｉｉ）ＭＤＶの場合、ＨＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領域の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（小サブユニット）の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（大サブユニット）の突然変異であり、また（ｉｉｉ）ＩＬＴＶの場合、ＴＫ遺伝子、ＯＲＦ３またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（大サブユニット）の突然変異である。
６．請求の範囲第５項記載の突然変異体ウイルスであって、非必須的部分の遺伝子は前記突然変異の領域に挿入まれることを特徴とする。
７．請求の範囲第６項記載の突然変異体ウイルスであって、前記相同な遺伝子は抗原、またはＨＶＴ、ＭＤＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＶ、ＩＢＤ、ニューキャッスル病もしくはエイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）と結合した前記抗原の部分をコードすることを特徴とする。
８．請求の範囲第１項記載のＨＶＴのｇＨ遺伝子の部分のいずれか一つによってコードされたことを特徴とするペプチド。
９．請求の範囲第５項記載にもとづく突然変異体を調製するための方法であって、前記方法は、（ｉ）（ａ）前記領域の欠失または挿入突然変異体コピーと、（ｂ）ＭＤＶ、ＨＶＴ、またはＩＬＴＶから得られた全ウイルスＤＮＡまたは全ＨＶＴ、ＭＤＶまたはＩＬＴＶウイルスのいずれか一方と相同遺伝子組換えを行なうこと、そして（ｉｉ）組換え体ウイルスを単離することからなる。
１０．請求の範囲第１１項記載の方法であって、前記（ｉ）において前記突然変異体コピーと、全ウイルスＤＮＡまたは全ウイルスのいずれか一方とを適当な細胞に導入するもので、また前記細胞内に取り込また前記ＤＮＡの複製過程中に前記組換えが起こることを特徴とする。
１１．請求の範囲第５項記載にもとづく突然変異体ＩＬＴウイルスとＩＬＴＶ感受性細胞とを含むワクチンであって、前記ウイルスは少なくとも前記突然変異の結果により弱毒化されていることを特徴とする。
１２．請求の範囲第５項、第６項、または第７項記載にもとづく突然体と、感受性細胞とを含み、ＭＤＶ、ＨＶＴ、またはＩＬＴＶに対して効果的であることを特赦とするワクチン。
１３．ＩＬＴＶ、ＨＶＴ、またはＭＤに対して効果的な種痘ベクターであって、前面ベクターは家禽内で複製可能な微生物を含むもので、前記微生物は配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｃ）、（ｆ）、（ｌ）または（ｍ）のいずれか一つまたは複数にもとづいた異種で複製可能なＤＮＡを含むＩＬＴＶまたはＨＶＴベクターを有することを特徴とする。
１４．キャリアメジウムと請求の範囲第１３項記載にもとづくベクターとからなることを特徴とするワクチン。
１５．請求の範囲第１４項記載にもとづくワクチンであって、前記キャリアメジウムはＩＬＴＶ−、ＨＶＴ−、またはＭＤＶ−感受性細胞を含むもので、また前記ベクターはＩＬＴＶ、ＨＶＴ、またはＭＤＶであることを特徴とする。
１６．病気治療のための家禽への種痘方法であって、前記方法は前記家禽に、請求の範囲第１１項、第１２項、第１４項、および第１５項のいずれか一項記載の非毒性免疫量のワクチンを接種をすることを特徴とする。
１７．請求の範囲第１６項記載にもとづく方法によって種痘されたことを特徴とする家禽。