JPH04502772A - 標的器官内での遺伝子の発現用医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 機能性がある外来遺伝子の生体内送達方法技術分野 本発明は、生体内で、哺乳動物器官の細胞中に外来遺伝子を取り込む方法に関す る。より具体的には、本発明は、遺伝物質の静脈注射による生体内での肺細胞の 一過性形質移入法を提供するものである。

技術の背景 機能性があるＤＮＡは、対象となる遺伝子の一過性発現（一過性形質移入といわ れる）または宿主ゲノム中への外来遺伝子の取り込みを原因とする宿主細胞の永 久形質転換のいずれかに帰着する種々の技術によって導入され得る〔バーガー（ Ｂｅｒｇｅｒ）らによる“Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉ ｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＢｎｚｙｍｏＩｏｇｙ 、　１５２．６９２−６９４　（１９８７）、ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ）らによ る“Ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈ ｕｍａｎ　Ｋ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｇｅｎｅｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅ ｄ　１ｎｔｏ　ｍｏｕｓｅ　ｐｒｅ−Ｂ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｂｙ　ｅｌ ｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ″Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　８１：　７１６１−７１６５　（１９８４）　）　。カチオン性リポソームと 複合化したプラスミド（リポソーム−ＤＮＡ複合体といわれる）は、細胞培養の 形質移入に用いられてきた。

かかる形質移入のためのリポソームの使用はりボフエクション（ｌｉｐｏｆｅｃ ｔｉｏｎ）といわれてきた。細胞の形質移入に使用される多くの技術のうち、リ ボフエクションは簡便さと高い形質移入効率という利点を提供するということが 分かってきた〔ブリラグハム（Ｂｒｉｇｈａｍ）らによる“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｇｅｎｅ　１ｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｌ ｕｎｇ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　Ｊｉｐｏ ｆｅｃｔｉｏｎ　１ｖｉｔｈａ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ″Ａｍ、　Ｊ、 　Ｒｅ５ｔ）、　Ｃｅ１１．　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１：　９５−１００（ １９８９）　、フェルブナ−（Ｆｅｌｇｎｅｒ）らによる“Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉ ｏｎ：　ＡＨｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ、　ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅ ｄ　ＤＮＡ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ″Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８４：　７４１３−７４１７　（１９８７） 　）。

カネダらによるサイエンス（Ｓｃｉ、　）第２４３巻１９８９年１月付の第３７ ５〜３７８頁には、プラスミド−ＤＮＡと核タンパク質が成体ラットの門脈への 注射によってラットの肝臓の非分裂細胞の中に同伴導入される、生体内での形質 移入技術を開示しており、これはプラスミド−ＤＮＡが核タンパク質によって肝 臓細胞核の中に送られるものである。ウー（Ｗｕ）らは、１９８８年１０月１５ 日に発行されたＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ第２６３巻階２９の第１４６２１〜１４６２４頁で、プラスミドか、静脈注 射された特定の肝臓ガラクトース受容複合体のリガンドに結びつけられる生体内 形質移入技術を開示し、肝臓において特定の遺伝子発現を行ったことを明らかに した。

本発明は、哺乳動物器官の細胞中での望ましい外来産物の発現をもたらす生体内 リポフエクション技術を提供する。

発明の要旨 本発明によれば、哺乳動物器官の細胞中で外来遺伝子を生体内工発現する方法が 提供され、その方法は哺乳動物の中に望ましい遺伝子産物の遺伝子発現誘導物質 を注射する段階を含むものである。該誘導物質は、カチオン性リポソームキャリ アーと複合体を形成している。該誘導物質は、哺乳動物器官の細胞中にリボフェ クションされる。該誘導物質の遺伝子発現及び機能が活性化され、哺乳動物器官 の細胞中で望ましい遺伝子産物を生産する。

図面の説明 添付の図面と共に考慮すれば、以下の詳細な説明を参照することによってより理 解が深まるので、本発明の他の効果が容易に認識されるだろう。

第１図は、金属チオネインプロモーターによって推進されるヒト成長ホルモンを コードする領域を含有するプラスミドを静脈注射した後のマウスの肺におけるヒ ト成長ホルモン遺伝子の発現を示している。データは組織１ｇ当たりが２４時間 で発現するｈＧＨのｎｇ数として表示されており、プロットした全ての値は２匹 の動物から得られたデータの平均値である。コントロールの値は図中のデータか ら差し引いである。腎臓または肝臓のいずれにおいても最小限の外来遺伝子の発 現しか認められないが、肺においては該遺伝子は培養した内皮細胞においてみら れるのと類似の時間的推移で発現されている。

第２図は、ＤＮＡ−リポソーム複合体を注射したあと７２時間経過後のマウスの 器官におけるＣＡＴ活性を示している。

第３図は、リポソーム−ＤＮＡ複合体を注射したあと３日間の肺ＣＡＴ活性を示 している。

発明の詳細な説明 全体として、本発明は、哺乳動物器官の細胞中で外来遺伝子を生体内で発現する 方法を提供する。該方法は、哺乳動物の中に望ましい遺伝子産物の遺伝子発現誘 導物質を注射する段階を含む。

例えば、該遺伝子発現誘導物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡのような遺伝物質であり 得る。該遺伝子産物は、例えば、成長ホルモンのようなポリペプチドまたはタン パク質であり得る。

該誘導物質は、カチオン性リポソームキャリアーと複合体を形成している。その ようなキャリアーの例は、ガイセルブルク９ＭＤ　（Ｇａｉ　ｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ、　Ｍ　Ｄ　）の有限会社ベセスダ生命工学研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｉｆｅ　Ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉ ｅｓ、　Ｉｎｃ、　）によって製造されているＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ〜である。

ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ〜剤は、かつて生体外で細胞を形質移入するのに使用され てきた。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ〜剤は、イオン性の相互作用によってＤＮＡと複 合体を形成しているカチオン性すピドＬＮ−〔１（２，３−ジオレイルオキシ） プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム・クロリドを含有する。一般 に該複合体は細胞膜と溶料したあと、細胞の中に形質移入する。高度に効率的な 形質移入操作としてリボフエクションを利用する方法が、フェルブナ−らによっ て報告されている（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ 、Ａ、第８４巻、第７４１３〜７４１７頁１９８７年１１月；りびＮａｔｕｒｅ 第３３７巻第３８７〜３８８頁１９８９年１月２６日〕。

カチオン性リポソームキャリアーを利用すると、遺伝物質は哺乳動物器官の細胞 内にリボフエクションされる。遺伝物質の遺伝子発現及び細胞機能は活性化され て、哺乳動物器官の細胞内で望ましい外来産物を生産する。即ち、遺伝物質の特 定の発現ベクターの発現が促進され得るのである。

より具体的には、予定された遺伝物質を含有する、キャリアーと結合したプラス ミドが、哺乳動物の形質移入する器官の近接の血流中に静脈注射される。かかる プラスミドキャリアー複合体を気管に注入すると、肺の細胞内で高頻度の形質移 入が起こるということが分かってきた。その遺伝子発現は一過性である。形質移 入された遺伝子の生体内での一過性の発現は、何らかの遺伝的異常に必ずしも関 連しない急性または亜急性状態の予防及び処置を含む遺伝子治療に利用できる。

該急性異常は、長期間の治療を必要とせず、一時的な治療によって治癒され得る 。このことから、本発明は、遺伝子異常を正すための道具として使用されるのみ ならず、ヒトの病的状態に広く適用し得る治療方法の新たなカテゴリーとしても 使用され得る。従って、プラスミド形質移入の一過性にある種の有用性があるの である。

実験的データ １、ヒト成長ホルモンをコードする領域の発現プラスミドの説明 カリフォルニア州サン・シュアン・キャピストラノ（Ｓｕｎ　ＪｕａｎＣａｐｉ ｓｔｒａｎｏ）のニコルス診断学研究所（Ｎｉｃｈｏｌｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ 　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から得られたプラスミド構造体を使用した。そのプ ラスミド、即ち、ＰＸＧＨ５は、マウスの金属チオネイン（ｍＭＴ−１）プロモ ニターによって推進されたヒト成長ホルモンのコード領域を含むｐＵＣ１２中の ６．７キロベースの構造体である。プラスミドＤＮＡは、大腸菌中で増殖させた 。プラスミドＤＮＡは、アルカリ性で溶菌して単離し、塩化セシウム及び臭化エ チジウム中で同密度平衡勾配遠心法によって精製した〔マニアチス（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ）らによる１９８２年のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ ：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、］　。

研究所／バーラン（Ｈａｒｌａｎ）Ｓ　Ｄ　マウス（メス、２０〜２５ｇ）で行 った。ＤＮＡ注射２４時間前から実験の終了まで、全てのマウスに５０００　ｐ ｐｍのＺ　ｎ　Ｓ　Ｏ４を含む水を飲ませた。この量の亜鉛で遺伝子導入マウス の金属チオネインプロモーターが活性化されることが分かっている〔パルミタ− （Ｐａｌｍｉｔｅｒ）らによる“叶ａｍａｔｉｃ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｍ１ｃ ｅ　ｔｈａｔ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ｆｒｏｍ　ｅｇｇｓ　ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔ ｅｄｗｉｔｈ　ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎ ｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｇｅｎｅｓ″、迫胆匹３００：　６１１−６１５　（１９８ ２）　）。リポソーム（リポフェクションＴＭ）１５０ｕｇと複合体を形成して いる３０ｕｇのｐＸＧＨ５ＤＮＡを、各々のマウスの尾の静脈から、２５ゲージ 針を使用して３００ｕｌの総容量で静脈注射した。ＤＮＡの注射後、ｊ、３及び ５日目にベンドパルビタールの腹腔内注射によってマウスを殺し、無菌条件下で 肺、肝臓及び腎臓を摘出した。該器官の重量を測定し、細かく切って、培地１９ ９を２ｒＩ！加えた６０ｍｍのペトリ皿に置いた。

膣口を５％ＣＯ３中、３７℃で２４時間インキュベートしたあと、内容物を遠心 分離し、培地について成長ホルモンを分析した。成長ホルモン産生量をｈＧＨ濃 度及び培地の総容量（２ｍ７りから産生量として計算し、これを器官の重量で標 準化し、組織１ｐ当たりが２４時間で発現するｈＧＨＯｎｇ数として表示した。

形質移入されていない５匹のコントロールマウスで同様の測定を行った。

２、結　果 生体内形質移入 プラスミド−リポソーム複合体を注射していないマウスから摘出した肺、肝臓及 び腎臓を２４時間インキュベートした培地からは極めて低レベルの免疫反応性ｈ ＧＨＬか測定されなかった。組織１ｐ当たりが２４時間で産生じたｈＧＨのｎｇ 数の計算値は、肺＝０．２６．腎臓＝０．２６．肝臓＝０．０６（全ケースにお いてＮ＝５の平均値）であった。プラスミド−リポソーム複合体の静脈注射復興 なる間隔で摘出したマウスの器官におけるｈＧｈ遺伝子の発現を第１図に示した 。腎臓及び肝臓のいずれにも成長ホルモンは殆ど産生じなかった。しかしながら 、形質移入したマウスから摘出した肺には、かなりの量の成長ホルモンが産生じ た。ｈＧＨ産生は、注射後２４時間で増加し、注射後３日でピークに達し、注射 後５日では衰えている。この時間的推移は培養した内皮細胞において見られたの と類似している。

３、実験２ 原核（細菌の）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ ＡＴ）を含有するプラスミドをＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ〜剤と結合させた。該リポ ソーム−ＤＮＡ複合体をマウスに注射した。

該マウスの肺ではＣＡＴ遺伝子が発現していることが認められた。

ＣＡＴは、通常はいかなる哺乳動物の細胞にも存在しないので、ＣＡＴ活性が測 定されたということは該遺伝子の発現が成功したという絶対的な指標である。従 来、このプラスミド構造体は通常ＣＡＴ活性がｍＲＮＡレベルに比例する培養細 胞中で使用された。

第２図は、ＤＮＡ−リポソーム複合体の注射から７２時間後のマウスの器官内で のＣＡＴ活性を示し、第３図は、リポソーム−ＤＮＡ複合体の静脈注射から３日 後の肺のＣＡＴ活性を示している。周辺の器官には活性が検出されないのに肺に は非常に高い活性量がある。肺の格別な形質移入は、おそら（肺が注射位置に対 して最初の抹消器官であるからと思われる。ＤＮＡ−リポソーム複合体が気管か ら与えられた場合は、図に示されているように、静脈から注射した場合よりもよ り高い活性量が肺において現れている。腹腔内注射では、注射をしてから６日ま でいかなる器官においてもＣＡＴ活性が認められない。

４、ディスカッジョン 本発明の方法は、遺伝物質の注入によって宿主細胞の中に直接に外来遺伝子を導 入することを可能にする。特別に合成されたカチオン性リポソームと結合したＤ ＮＡは、培養した細胞の中に高い効率でプラスミドや他の遺伝子ベクターを導入 することができる。該プラスミドが宿主ゲノムに入ることをせず、そして哺乳動 物の細胞内で複製することがないので、ここに示した例を一週間以上続けたとし ても、その遺伝子発現が一過性であるのではないかと思われる。

ＤＮＡ−リポソーム複合体の静脈注射のあと、遺伝子の主要な発現は肺において みられた。このことは、静脈注射後に形質移入された主要な器官が注射位置から 下流の最初の毛細血管床であるということを意味している。従って、器官に流れ 込んでいる動脈にリポソーム−ＤＮＡ複合体を注射することによって、その器官 を選択的に形質移入することが可能である筈である。

かつて、イアンジー（Ｉａｎｎｕｚｚ　ｉ　）及びその仲間達は、エレクトロポ レーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によって、原核遺伝子、ＣＡＴ を含有する、ＳＶ４０プロモーターで推進されたプラスミドをヒト気道上皮細胞 に形質移入した〔イアンジーらによる“Ｔｈｅ　１ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｆｏｒｅｉｇｎ　ｇｅｎｅｓ　 １ｎｔｏ　ｈｕ＋ｎａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｅｉｐｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅ ｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ″、　ＡＭ。

Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐ、　Ｄｉｓ、　１３８：　９６５−９６８　（１９８８）　 ）　。これらの実験は形質移入された細胞におけるＣＡＴ遺伝子の発現を明らか にしている。

ライ−ベル（ＺｗｉｅｂｅＩ）及びその共同研究音速は、ＳＶ４０プロモーター で推進されたｈＧＨまたはアデノシンデアミラーゼコード領域のいずれかを含有 するレトロウィルスベクターを感染させることによって、培養中のウサギの大動 脈内皮細胞を形質転換した〔ライ−ベル（Ｚｗｉｅｂｅｌ）らによる”Ｈｉｇｈ −１ｅｖｅｌ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ 　ｒａｂｂｉｔ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ 　ｂｙ　ｒｅｔｒ。

Ｖｉｒａｌ−ＶｅＣ１ＯｒＳ″５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：　２２０−２４３　（ １９８９））　。該実験は、培養によって幾世代も生き続けた形質転換された細 胞における遺伝子の発現を明らかにしている。本発明者らは、いち早く、ウシの 肺の内皮細胞がりポフエクションにより、ニワトリ肉腫ウィルスプロモーターで 推進されたＣＡＴコード領域を含有するプラスミ）・で非常に高い効率で形質移 入され得ることを明らかにした〔ブリラグハム（Ｂｒｉｇｈａｍ）らによる“Ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｇｅｎｅ　ｉｎ　ｃｕ ｌｔｕｒｅｄ　ｌｕｎｇ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｉｌｏｗ ｉｎｇ　１ｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏ ｒ″Ａｍ、　Ｊ、　Ｒｅ５ｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｉ：９５− １００　（１９８９）　）。

上記で説明した研究は、金属チオネインプロモーターによって推進された、生理 学的に関連する分泌されたヒトタンパク質をコードする機能性がある遺伝子で無 傷の動物の肺を形質移入する方法の使用を明らかにしている。肺における形質移 入された遺伝子の発現の時間的推移は、培養された肺内皮細胞中の同じ遺伝子の 発現の時間的推移と類似している（実験結果は報告されていない）１遺伝子治療 は、一般に、機能性がある遺伝子の導入による永久治療が効果的である遺伝子欠 乏症に主として適用できるものと考えられてきた〔フリートマン（Ｆｒｅｉｅｄ ｍａｎｎ）による“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｔｏｗａｒｄ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｅ　 ｔｈｅｒａｐｙ″５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：　１２７５−１２８１　（１９８９ ））。

しかしながら、極めて多くの疾病が、有益なタンパク質を産生ずる、一時的に作 用するように処理された宿主細胞によって治療され得る。例えば、細胞内酵素、 スーパーオキシドジスムターゼ及びカタラーゼは、酸化による損傷からの肺の決 定的なプロテクターであり得、増加したこれらタンパク質の細胞内レベルが、さ まざまな原因による損傷から肺を保護するかもしれないのである。

プロスタサイクリン及びプロスタグランジンＥ、産生の増加をもたらす内皮プロ スタグランジン・シンセターゼの一時的増加は、かなりの疾病に有益なのかもし れない。分泌された抗タンパク分解酵素、α−１抗トリプシンは、気腫及び他の 肺の疾病の病因において重要であり、このタンパク質を産生させるための肺細胞 の遺伝子工学は、ヒトの疾病状態に対する治療を可能にし得る〔ガーバー（Ｇａ ｒｖｅｒ）らによる“ａ　−１ａｎｔｉｔｒｙｐＳｉｎ　ｇｅｎｅＳ″　Ｎ、　 Ｅｎｇｌ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１４：　７６２−７６６　（１９８６））　。他の多く学理 的可能性を提案できるであろう。

ここに記載したデータは、生きた動物の肺細胞が形質移入によって処理さた結果 、細胞内の及び分泌されたタンパク質の両方をコードする外来遺伝子を発現でき ることを証明している。実験的に遺伝子発現をコントロールできるプロモーター を含む幾らかのプロモーターは、形質移入された遺伝子の発現を推進するのに使 用され得る。プラスミドベクターの使用は、遺伝子の一過性発現を保証するのを 容易にする。このアプローチは、特定の肺細胞及。　び肺細胞応答における種々 のタンパク質のねじれの特定の研究において、遺伝子発現をもたらす分子的メカ ニズムの解明を可能にするであろう。更に、生体内での一過性形質移入は、遺伝 子治療を、広範囲のヒトの疾病に適用できるようにし得る。

以上、本発明を例証的方法で説明してきた。そして、使用してきた用語は、限定 のためというよりむしろ説明することを意図したものであることは理解されるべ きである。

明らかに、上記の教示を考慮して本発明について多くの修飾や変更が可能である 。従って、本明細書で具体的に説明した方法とは異なる方法で、添付の請求項の 範囲内において本発明を実用化することができるということが理解されるべきで ある。ここで、引用文献の数は、単に便宜のために文献を挙げた結果であり、限 定的に解釈するためのものではない。

形質移入後の日数 ＣＡＴ活性（％アセチル化） 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物器官の細胞中で外来遺伝子を生体内で発現する方法であって、前記 方法が：哺乳動物の中に望ましい遺伝子産物を産生する、カチオン性リポソーム キャリアーと複合体を形成している遺伝子発現誘導物質を注射する段階；該誘導 物質を哺乳動物器官の細胞中にリポフェクションする段階；及び該誘導物質の遺 伝子発現及び細胞内機能を活性化して、哺乳動物器官の細胞中で望ましい外来遺 伝子産物を産生する段階を含む方法。
2. ２．前記注射段階が、該誘導物質を含みかつ該キャリアーと結合したプラスミド の該哺乳動物の中への注射として更に定義される、請求項１記載の方法。
3. ３．前記注射段階が、該キャリアーと結合したプラスミドの該哺乳動物の中への 静脈注射として更に定義される、請求項２記載の方法。
4. ４．前記注射段階が、該キャリアーと結合したプラスミドの該哺乳動物の血流中 への静脈注射であって、該哺乳動物器官で遺伝子発現の活性を増加するために該 器官に近接して行うものとして更に定義される、請求項３記載の方法。
5. ５．前記活性化段階が、望ましい遺伝子産物を一時的に産生する誘導物質による 一過性発現及び細胞内機能の活性化として更に定義される、請求項１記載の方法 。
6. ６．該誘導物質が外来核酸である、請求項１記載の方法。
7. ７．該核酸の特定の発現ベクターの発現を促進する段階を更に含む、請求項６記 載の方法。
8. ８．前記注射段階が、ヒト成長ホルモンをコードする領域を含有するプラスミド であって該領域がマウスの金属チオネインプロモークーによって推進されるプラ スミドを含有するキャリアーのマウスヘの静脈注射として更に定義され、前記活 性化段階が、マウスヘの金属チオネインプロモーターであって該マウスの肺のな かでヒト成長ホルモンの産生を活性化するプロモーターの供給として更に定義さ れる、請求項７記載の方法。
9. ９．前記注射段階が、原核遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ ラーゼを含有するプラスミドを含有するキャリアーのマウスヘの注射、及び該マ ウスの肺細胞の中でのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの活性 の活性化として更に定義される、請求項７記載の方法。
10. １０．前記注射段階が、該プラスミドを含有する該キャリアーの気管内注射とし て更に定義される、請求項９記載の方法。