JPH04506599A - 特定の核酸配列を検出する方法及びその応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特定の核酸配列を検出する方法及びその応用本発明は、増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ　）によって得られる少量の核酸を検出する方法及びその応用（ａｐ ｐｌｉｃａｔｉｏｎ　）に関する。

従来記載された最初の増幅方法の一つは、サイキら（ＳＡＩＫＩ　ｅｔａｌ、） によって開発されたポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉ ｎ　ｒｅａｃ目ｏｎ）（ＰＣＲ）である（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、１ ９８５年、２３０巻、１３５０頁）。この技術は、特に２本鎖のＤＮＡ配列を増 幅することを可能にするものであって、鋳型として用いられたＤＮＡ鎖をコピー し、３′ＯＨ末端から始まるオリゴヌクレオチドブライマーの伸長によって相補 的な鎖を与え得るＤＮＡポリメラーゼの繰返し活性に基づくものである。

ＰＣＲ技術は、ｎ回の連続した増幅サイクルを行なうことからなるものであり、 その間、２種のプライマーが、範囲を定める２本鎖ＤＮＡ配列の増幅を指示する 。

増幅サイクルは、ＤＮＡの変性（９５℃）、プライマーのハイブリダイゼーショ ン（３７−５５℃）及びＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長を、連続して 行なうことを可能にする３段階からなる。

ＰＣＨの技術的な基礎は、次の２種の重要な点に基づくニー２種のオリゴヌクレ オチドプライマーの使用（１種はＤＮＡ十鎖に相補的であり、他方はＤＮＡ−鎖 に相補的でかつその３゛末端は反対（ｏｐｐｏｓ　ｉ　ｔｅ）となっている。） −適当なりＮＡポリメラーゼの活性の反復使用。

ＰＣＲは適当な条件下、サイクル（ｎ＋１）回でのＤＮＡポリメラーゼの鋳型と して、サイクル　ｎ回の間で新しく合成された（ｎｅｏｓｙｎｔｈｅｓ　１ｘｅ ｄ）配列全ての使用を可能にする。この結果、サイクル数に応じて目的の核酸配 列の数を指数的に増幅できることになり、これは、指数段階を含む増幅曲線に対 応しており、得られる標的配列の量Ｑは、初期の標的配列の量Ｑ。、増幅因子Ｘ 及びサイクル数ｎに以下の式： Ｑ　＝　Ｑ　ｏ　（１＋ｘ　）　ｎによって関連づけられる。

ＰＣＲは、このように、指数的に標的配列（ｒａｒｇｅ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　 ）と呼ばれる核酸配列を数千倍に増幅することを可能にする。

この増幅技術は、より詳しくはヨーロッパ特許出願（シータス（ＧＥＴＵＳ　） ’）第２０１１８４号に記載されており、そこでは特にＰＣＲにおいて用いられ る２種のオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは一本鎖であり、ＤＮＡポ リメラーゼの存在下伸長物の合成を開始させる（ｐｒｉｍｅ　）ために十分長く あるべきである、と記載している。

この技術の改良又は完璧化（ｐｅｒｆｅｃｊｉｏｎｇ　）がいくつか提案され、 特に各サイクルで酵素を添加するすることを避けるために、１００℃の温度に耐 え得るＤＮＡポリメラーゼ、即ち、ヨーロッパ特許出願（シータス（ＧＥＴＵＳ 　）　）　第２５８０１７号に記載されたＴａｑポリメラーゼが、製造工程の最 初から添加され、高い回数の連続した増幅サイクルを行なうことを可能にしてい る。

このように、ＰＣＲは、クローニングすることなく、標的配列と呼ばれる核酸配 列のかなり多くの増幅を得ることを可能にし、その結果、感度において相当の増 加を得ることを可能にする。増幅された標的配列は、引き続き、種々の分析方法 、例えばドツトプロット法、電気泳動又はシーフェンシング等に直接利用できる 。２種の特許出願（ヨーロッパ特許出願（シータス（ＣＥＴＵＳ　）　）第２０ ０３６２号及び第２２９７０１号）には、特に、試料の中において探されている 核酸配列を検出するために、増幅とハイブリダイゼーションの組み合わせが記載 されている。

それ以降、増幅された配列の検出段階をより簡便にするべくデザインされた変形 及び／又は完璧化が提案されたが、これらは特に、使用されるプライマー及び／ 又はプローブに関連している。

これら完璧化の一つは、２種の異なるプローブの使用である。その一つは、ラベ ル化され、検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｂｅ　）と名づけられて いる。他方は、別の成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　）にアフィニティを持つフラグ メントからなり、捕獲プローブ（ｃａｐｔｕｒｉＢ　ｐｒｏｂｅ　）と名付けら れている［英国特許第２１６９４０３号、フランス特許第８５１９３９４号、コ ーネ　ディ、（ＫＯＩＩＮＥ　Ｄ、　）　（ＡｍｅｒｉｃａｎＣｌｉｎ、　Ｒｅ ｖｉｅｗ、１９８６年　１１月）、米国特許第４４８６５３９号、ヨーロッパ特 許出願第７０６８５号及び第７０６８７号コ　。

変形として、プライマーそのものを修飾して、形成されたハイブリッドの捕獲を 可能にしているものもある（フランス特許出願第８８０３１０７号、ヨーロッパ 特許出願（モレキュラーダイアグツシス社（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＤＩＡＧＮＯ５ ＩＳＩｎｃ、）　）第２９７３７９号）。

別のこの様な完璧化が、ヨーロッパ特許出願（シンテックス（Ｓｙｎｌｅｘ）” ）　、第３００７９６号に記載された方法によって示されている。そこでは、特 に非常に少量の核酸の存在下、その特異性を上げることなく、その感度を上げる ＰＣＨの変形を提案している。

しかしながら、ＰＣＲを慣例的に使用することにより、その非常な感度に関連す る重大な不利益が生じている。即ち、結果の注意深い分析の後に、ホモロガスな 配列による分析試料のコンタミネーション（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ　）に 主として関連づけられるものと、証明された偽陽性（ｆａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖ ｅ）の出現である。

最近の約２年の間に現れたある数の記事は、そのようなコンタミネーションの事 例を記載し、それを解決する手段を提案している： 一ワイ、エム、ディ、口ら（Ｙ、Ｍ、Ｄ、ＬＯｅｔ　ａｌ、　）は、ランセット （Ｌａｎｃｅｔ）　（１９８８年、１１．６７９頁）に載せた記事中において、 その感度によるポリメラーゼ連鎖反応法の不利益を明らかにし、この主な不利益 を軽減するために、増幅前のＤＮＡの鋳型の調製中に特に注意をとることを勧め ている。

一アール、ニー、ギブスら（Ｒ，Ａ、ＧＩＢＢＳ　ｅｔ　ａｌ、）は、ジーンズ アンドデベロップメント（Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　）１９８ ９年、３巻、１０９５−１０９８頁中での記事の中で、以下のようなアドバイス をしている：ＰＣＲを行なうのに使用するすべての試薬、得られた生成物を分析 するのに使用される装置を隔離する；即ち、スクリューストッパーを使用し、エ アロゾルの形成を避けるため、最終反応を行なう前に内容物をフリージングする ことさえする；すでに存在している少量の夾雑物を増幅する危険を減らすために 及び反応生成物の総量を減らすために、増幅サイクルの数を最小限に限定し、そ れぞれの割り当て作業に利用できる複数のセットの異なるピペットを用意する。

−ジー、サーカーら（Ｇ、５ＡＲＫＡＲｅｔ　ａｌ、）は、ネイチャー　（Ｎａ ｔｕｒｅ）　、１９９０年、３４３巻、２７頁中の記事の中で、コンタミネーシ ョンを避けるために、増幅されるＤＮＡ鋳型を加える前に、ＵＶ光線で試料を処 理することを提案している。

一ニス、フォックら（Ｓ、ＫＷＯＫ　ｅｔ　ａｌ、　）は、ネイチャー（Ｎａｔ ｕｒｅ）　、１９８９年、３３９巻、２３７−２３８頁中の記事の中で、コンタ ミネーションを抑制し、避けるために、あるいくつかの数の“グッドラボラトリ ープラクティス″　（”ｇｏｏｄ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒａｃｊｉｃど） を提案している：即ち、ＰＣＲのための調製物及び生成物を物理的に隔離する（ 分離された部屋、ＵＶ光線等）；用いるプロフィール（ｐｒｏｆｉｌｅ　）を高 圧滅菌する；繰返してピペッティングを避けるために、試薬を小さい容器に小分 けする；保護手袋を使用する；こぼすこと（ｓｐｉｌｌａｇｅ）を避ける；エア ロゾルを作らないピペットのようなものを使用する。

しかしながら、コンタミネーションを避けるために種々の上述の著者によって提 案された提案は、いずれの方法においてもヘテロロガスな配列（ｈｅｔｅｒｏｌ ｏｇｏｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）の増幅及び／又は細胞の断片の存在による偽 陽性の問題を未然に防ぐことができない。

このような、ヘテロロガスな配列は、検出すべき標的配列とは異なるが、それに もかかわらず、検出される標的配列の特定のプライマー及びこれら異種の配列間 の不完全なハイブリダイゼーションを引き起こすのに十分に関係のある構造を有 しており、ＰＣＨの最中に標的配列と同様に指数的に増幅される。

確かに、特定の核酸配列を増幅し及び／又は検出する従来の方法は、容易に自動 化しただけであって、以下のことを可能にしていない： １、新しく合成された鎖（ｎｅｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　５ｔｒａｎｄｓ）の 中にプライマーが物理的に取り込まれる直接的な結果として、ＰＣＨ中に指数的 に増幅された異種の配列を除去すること（これらの異種の配列の増幅は偽陽性の 出現に至る）；及び／又は ２、均質相（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｐｈａｓｅ　）中で、即ち、ゲル電気泳 動による分離又は固相の結合支持体上への固定、又は修飾したヌクレオチドプラ イマーの使用又は検出プローブを用いてのハイブリダイゼーションの段階を必要 とすることなく、核酸の検出を行なうこと。

従って、それゆえ本願出願人の目的は、特に均質相において、増幅によって少量 の核酸を検出し同定する定性的、半定性的及び定量的な方法を提供することにあ り、特に、自動化しやす（、特異的であり、高感度で、迅速且つ経済的である点 及び異種の配列及び／または細胞の破片が存在していても検出に実際的な影響を 及ぼさない点において、従来の方法よりも実用上の要件により合致した方法を提 供することにある。

本発明の主題は、少なくとも１種の酵素的増幅を含有する、生物学的試料中に存 在する特定の核酸配列（単一の配列及び／又は核酸配列の混合物）を検出するた めの方法であって、核酸又は核酸類（ｎｕｅｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　）を抽出す るために溶液中に生物学的試料を適当に置いた後に、該方法は以下の段階を使用 して核酸配列又は配列混合物の検出をすることを特徴とする： （１）（ａ）該標的核酸配列又は核酸配列類（ｔａｒｇｅｔｎｕｃｌｅｉｃ　ａ ｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）の少なくとも１種のフ ラグメントを増幅するために、溶液中にある生物学的試料を、少なくとも１対の 適当なプライマーと接触させ、該プライマーと該標的配列又は配列類とをハイブ リダイズさせ、集積（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）のための増幅溶液を得ることがで きるようにし、 （ｂ）上記（ａ）で得られる集積のための増幅溶液を少なくとも１度適当に希釈 すること により標的配列又は配列類を集積する段階；（２）（ｃ）上記（ｂ）で得られる 集積のための溶液のフラクションを、配列が（ａ）で増幅された標的配列中に含 まれる少なくとも１対のプライマーと接触させ、（ｄ）任意の適当な手段によっ て、上記（Ｃ）で得られる２本鎖の標的核酸のコピーを検出することによって得 られる増幅された標的配列を検出する段階。

この後者の増幅を、以下、「第２シリーズの増幅（ｓｅｃｏｎｄ　５ｅｒｉｅｓ 　ｏｆ　ａｍｐｌＮｉｃａｔｉｏｎ）　Ｊと称する。

本発明によれば、段階（ａ）及び（ｂ）は少なくとも一度繰り返される。

本発明の有利な態様の一つによれば、段階（ｂ）における希釈度（ｄｉｌｕｔｉ ｏｎ）は、１１５０〜１／１００．０００である。

この態様の有利な特徴によれば、段階（ｂ）における希釈度は、１１５０〜１１ ５０，０００である。

この特徴の有利な態様によれば、段階（ｂ）における希釈度は、１１５０〜１／ １０，０００、好ましくは、１／２００〜１１５，０００である。

この希釈により、精製され、以下の特性を有する生物学幅を開始することが可能 になるニ ーそれは、一方では、標的配列で集積（ｅｎｒｉｃｈ）されており、 −それは、他方では、必要でない“寄生体（ｐａｒａｓｉｔｅ）”の配列、即ち 、段階（ａ）からの使用されないプライマー（ｕｎｕｓｅｄ　ｐｒｉｍｅ「）　 、ヘテロロガスな配列、最初の生物学的試料に関連する総核酸及び細胞の破片が 除去（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）されている。

段階（ａ）からの使用されないプライマーが希釈されるという事実は、（ａ）か らのプライマーと第２シリーズの増幅時の段階（Ｃ）からのプライマーとの競合 を回避できるという利点をもたらす。更にこれは、第２シリーズの増幅時により 少ないプライマーを使用することを可能にし、後者の取り込みのより良い歩留り （ｙｉｅｌｄ　）を得ることを可能にする。これは、検出のための増幅用のプラ イマーが一般に高価で合成するのが非常に困難であるという理由から、大きな利 点となる。

段階（ａ）における増幅溶液（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ　５ｏｌｕ目ｏｎ　）の希 釈による標的配列の集積は、第２シリーズの増幅時、及び検出時に、欠陥のある ハイブリダイゼーションによって誤った解読開始を惹起するヘテロロガスな配列 及び細胞断片を、増幅するにはほとんど適当ではないような状態にすることがで きる。

本発明の方法は、特に、残存核酸及び生物学的試料由来の各種のヘテロロガスな 配列の量を減少させることによりアッセイの特異性を増加するという利点を有し ている。

本発明に従えば、段階（ａ）におけるプライマーは、標的配列とハイブリダイズ する一本鎖のヌクレオチド配列（−水路プライマー（Ｐｓ））である。

そのようなプライマーは、随意に修飾しても良い。これにより、必要に応じて、 捕獲プライマー又は検出プライマーを得ることが可能となる。

更に本発明によれば、段階（Ｃ）におけるプライマーは、以下のペア（ｐａｉｒ ｓ　）からなる群から選ばれるペア（ｐａｉｒｓ　）である： 捕獲システム（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ　ｓ７ｓｊｅｍ）によって修飾されたプライ マー−検出システム（ｄｅｌｅＣｉｏｎ　Ｂｓｊｅ＋ｎ）によって修飾されたプ ライマー（Ｐｃ−Ｐｄ）のペア、−水路プライマーーー水銀プライマー（Ｐｓｌ −Ｐｓ２）のペア、−水路プライマーー捕獲システムによって修飾されたプライ マー（Ｐｓｌ−Ｐｃ）のペア及び一本鎖プライマーー検出システムによって修飾 されたプライマー（Ｐｓｉ−Ｐｄ）のペア。

捕獲プライマー（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ）　（Ｐ　ｃ　）は、特に 少なくとも１つのアフィニティベア部分（ｍｏｉｅｔ７）によって修飾され、標 的配列とハイブリダイズする一本鎖の核酸配列を意味するものと理解される。例 えば、１種又はそれ以上のビオチンが、オリゴヌクレオチド鎖の一つの末端に結 合されていてもよい。また捕獲プライマーは分枝状のオリゴヌクレオチドでもよ い。

検出プライ７−　（ｄｅｆｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｉｍｅｒ）　（Ｐｄ）は、標的配 列とハイブリダイズする検出システムによって修飾された一本鎖の核酸配列を意 味するものと理解される。例えば、オリゴヌクレオチドの５′末端はリン３２で ラベルされていてもよい。

本発明の他の有利な態様によれば、段階（Ｃ）（第２シリーズの増幅）で使用さ れるプライマーの量は、段階（ａ）で使用されるプライマーの量より実質的に少 ない。

この態様の有利な特徴によれば、段階（Ｃ）で使用されるプライマーの量は、段 階（ａ）で使用されるプライマーの量よりも少なくとも５倍少ない（ａｔ　１ｅ ａｓｔ　１ｉｖｅ　ｊｉｍｅｇｓｍａｌｌｅｒ　）。

第２シリーズの増幅におけるサイクル数は、特に試料の性質及び希釈度に応じて 選択され、これにより、この第２シリーズの増幅に指数的な性格を付与する。

本発明の他の有利な態様によれば、段階（Ｃ）における一対のプライマーが捕獲 プライマーを含むときは、検出段階（２）は、 （ｄ）検出のための増幅溶液を、挿入された捕獲プライマー（Ｐｃ）を保有する 核酸フラグメントを捕獲する適当な支持体に接触させること、及び （ｅ）任意の適当な手段によって該支持体上に保持された２本鎖の標的核酸のコ ピーを検出することからなる。

この検出は、検出プローブ（検出プライマー又はそれに続く適当に標識されたプ ローブとのハイブリダイゼーション）のいずれかによって行なうことができる。

その様な態様のためには、捕獲システムは、アフィニティベア部分（ａｆｆｉｎ ｉｔｙ　ｐａｉｒ　ｍｏｉｅｔｙ）であるのが有利である。そのようなシステム は、オリゴヌクレオチドが、他のアフィニティペア部分を有する支持体に結合で きるようにする。

以下のペアを、特に、アフィニティペアとして挙げることができる：ビオチンー アビジン又はストレプトアビジン（ｓｊｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）　、重金属誘導 体−チオ基（ｔｈｉｏ　ｇｒｏｕｐ）、各種ホモポリヌクレオチド、例えば、ポ リｄＧ−ポリｄＣ。

ポリｄＡ−ポリｄＴ、ポリｄＡ−ポリｄＵ並びに例えば分枝されたプライマーの 場合におけるような特定の配列の種々のオリゴヌクレオチド及び抗原−抗体ペア である。他の成分のペアが、標的核酸のコピー中に取り込まれた捕獲プライマー （Ｐｃ）の固相支持体への特異的捕獲を可能にするに十分な高いアフィニティを 示すときは、それらもまた使用することができる；リガンドとコンジュゲート（ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）は、アフィニティペアの部分であってもよい。

検出システムは、アイソトープ（ｉｓｏｔｏｐｅｓ）　（１２５Ｉ、３５Ｓ、３ ２ｐ）、蛍光体、ランタノイド型蛍光システム、比色酵素システム（アルカリフ ォスファターゼ、ペルオキシダーゼ）、蛍光光度、発光、生物発光又は電気化学 的酵素システム及び２本鎖核酸と相互作用する化合物、特に色素物質又はインタ ーカレーティング剤からなる群から選択されるのが有利である。

この態様の一つの特徴によれば、検出プライマー（Ｐｄ）が、段階（ｃ）におい て標的核酸鎖に挿入された時は、段階（ｅ）における検出は該検出プライマー（ Ｐｄ）によって行われる。

この態様の別の特徴によれば、−水路プライマー（Ｐｓ）が、段階（Ｃ）におい て鎖（ｓｔｒａｎｄ）に挿入された時は、段階（ｅ）における検出は、適当な検 出プローブと、支持体上に保持される２本鎖の標的核酸のコピーとのハイブリダ イゼーションにより行なうか、或いは２本鎖の標的核酸と相互作用する化合物、 特にスペクトルの修飾（ａｐｅｃｔｒａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　）を作り 出せる色素物質又はインターカレーティング剤と接触させ、次いで、２本鎖の核 酸と相互作用する化合物の該スペクトルの修飾を、任意の適当な方法によって、 検出することによって行われる。

本発明による方法の他の態様によれば、段階（Ｃ）における一対のプライマーが 捕獲プライマーを含まない時は、検出段階（２）は、 （ｄ）上述で定義した段階（ａ）、（ｂ）及び（Ｃ）の後に得られる二本鎖の核 酸を、適当な検出プローブに接触させるか、又は二本鎖の核酸と相互作用する化 合物、特にスペクトルの修飾を作り出せる色素物質又はインターカレーティング 剤に接触させ、次いで、２本鎖の核酸と相互作用する化合物の該スペクトルの修 飾を任意の適当な方法によって検出することによる、該増幅された標的配列を均 質な液相中で直接的に検出する工程を包含する。

この態様の一つの有利な特徴によれば、該化合物は、二本鎖のＤＮＡに結合した 後に物理化学的修飾を示す物質から選択される。

４．６−ジアミノノー２−フェニルインドール−２（ＤＡＰり、ビスベンズイミ ド、エチジウム、９−アミノアクリジン、プロフラビン、キナクリン、クロロキ ン、ルカントン（ｌｕｃａｒ＋＋ｈｏｎｅ）　、ヒカントン（ｈｙｃａｎｊｈｏ ｎｅ）、チｏロン（ｊｉｌｏｒｏｎｅ）　、ｍ−ＡＭＳＡ、ダウノマイシン、ア ドリアマイシン、アドリアマイシンＤ、９−ＯＨＮ−メチル−エリブチシン（Ｎ −ｍｅｆｈｙｌ−ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎ　）　、？イトキサンスロン（ｍｉｊｏ ｘａｎＨｒｏｎｅ　）　、プレオマイシン、エリブチシン（ｅｆｈｉｎｏｍＹＣ ｉｎ　）　、ディターカリン（ｄ自ｅｒｃａｌｉｎｅ　）及びこれら化合物の誘 導体、ＨＯＥＣＨＥＴ　３３並びに適当に修飾されたヌクレオチド類を、そのよ うな化合物の制限されない例として挙げることができる。

この特徴の一つの有利な態様によれば、スペクトルの修飾を作り出せる化合物は 、蛍光インターカレーティング剤、例えば、特に、エチジウムブロマイド又はビ ス−ベンズイミド、例えばＨＯＥＣＨＥＴ　３３−２５８である。

そのような態様は、所望の配列を特徴付けるために、溶液中に存在する総標識さ れた二本鎖の核酸を直接測定するだけでよいという利点を有している。

加えてその様な態様は、核酸の検出のために得られる二本鎖の伸長生成物（ｅｘ ｔｅｎｓｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　）の支持体上への固定を必要とする従来法に おいて起こる競合反応を除く利点を有している。

この態様の他の有利な特徴によれば、テストＤＮＡおよび特にテストウィルスＤ ＮＡの連続した（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ）希釈が、少量（０，０１％Ｗ／Ｗのオ ーダー）のゼラチンを含むｐＨ８，３の適当な緩衝液中に、鋳型として使用でき る少なくとも２種の標的配列、４種のデオキシリボヌクレオシドトリフオスフェ ート及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する適当な容量中で第１シリーズの増 幅に供され、その後、該第１シリーズの増幅からの生産物が、第２希釈段階に供 され、次いで好ましくは前記第１シリーズの増幅において使用された物と類似し 、且つ、鋳型として使用できる少なくとも２種の標的配列を含有する増幅媒体中 で、第２シリーズの増幅に供し、その後、該第２シリーズの増幅後に得られる増 幅溶液に、スペクトルの修飾を作り出せる化合物が、該溶液中に存在する可能性 のある２本鎖のウィルスＤＮＡを検出するために、加えられる。

本発明による方法は、従来方法に比較して成る数利点を示すニ ー増大した特異性 一バツクグラウンドの減少 一集積増幅（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ　ａｍｐｌｉｌｉｃａｔｉｏｎ　）後に試料が 高度１　に希釈された場合の増大した感度；要するに、この高い希釈により以下 のことが可能となる： ・標的配列のみについて、はとんどの場合、指数期（ｅｘｐｏｎｅｌｉａｌ　ｐ ｈａｓｅ）とすることができ、即ち、この場合は得られた標的配列のｆｉＱが式 Ｑ　＝　Ｑ　ｏ　（１＋　ｘ　）　ｎによって増幅因子Ｘ及びサイクル数ｎと関 連付けられる；・標的配列／非特異的配列の比を、検圧増幅の最初から実質的に １よりも高くすることができる；・ヘテロロガスな核酸の伸長生成物及び生物学 的媒体（細胞の破片、蛋白質、天然のビオチン、最初の総核酸等）中に存在する 成分と関連のある競合反応を減少させる事ができる。

本発明による方法は、また、捕獲プライマーとして分枝状のオリゴヌクレオチド を使用する場合には、検出増幅時に、同時に且つ同一のテストチューブにおいて 、数種の標的配列の検出増幅を行うこともできる。分枝状のオリゴヌクレオチド を含む二重鎖体（ｄｕｐｌｅｘｅｓ）は、遊離の一水路ＤＮＡ鎖（ｓｔｒａｎｄ ）を有している。この遊離の一水路ＤＮＡ鎖は、支持体に結合された相補的オリ ゴヌクレオチドによって、選択的固定を行うことを可能にする。

加えて、強調すべきは、第１増幅後に行われる希釈により、寄生体シグナルを生 じせしめる可能性があるプライマ１−の２量体化（ｄｉｍｅｒｉｚａｊｉｏｎ） 及び増幅の現象の発生を減少させるために、かなり低いプライマー濃度で作業す ることを可能にし；更に該希釈はより少ないプライマーを使用することを可能に し、それゆえ検出増幅の検出相（ｄｅｊｅｃｔｉｏｎ　ｐｈａｓｅ　）において より良い特異性を有する事が可能になる。

本発明による方法は、特に遺伝子疾患、感染疾患（ウィルス、寄生虫、カビ、バ クテリア等）、ヒト、動物並びに植物の腫瘍疾患の検出、生物学的試料のチェッ ク、及びまた細胞の型別（ｃｅｌｌ　ｔｙｐｉｎｇ　）に適用できる。

加えて、本発明の主題は、使用のために用意され、本発明の方法を実行するため の、使用の準備ができたボックス、キット、又は調整されたセット（ｃｏｏｒｄ ｉｎａｔｅｄ　ｓｅ重）であり、それは、該検出を実行するために必要な量の適 当なバッファーおよび試薬に加えて、少なくとも、次のものを含むニ 一核方法の段階（ａ）を実行するための少なくとも一つの適当なプライマーの適 当な量（ｄｏｇｅｇ　）の第１の対（ｐａｉｒ）−該方法の段階（Ｃ）を実行す るための少なくとも一つの適当なプライマーの適当な量（ｄｏｓｅｓ　）の第２ の対（ｐａｉｒ）及び、必要に応じて、 一核方法の段階（ｅ）を実行するだめの適当な量（ｄｏｓｅｓ　）の適当なプロ ーブ及び／又は 一核酸に結合された時、又は核酸に結合されない時に、スペクトルの修飾を作り 出せる色素物質又はインターカレーティング剤のような、２本鎖の核酸に非共有 結合的に結合する適当な量の少なくとも１種の化合物。

前述の特徴に加えて、本発明はまた本発明の主題である方法を実行する実施例に 関連する以下の記載から明らかになるであろう他の特徴をも包含する。

しかしながら、これらの実施例は単に本発明の主題の例示として与えられている だけであり、いかなる場合においてもその限定を構成するものでないことがはっ きりと理解されなければならない。

以下の実施例において、実施例１から８は、本発明によるハイブリダイゼーショ ンテストの実施態様を記載したものであり、実施例９から１１は、均質相におけ る実施態様（インターカレーティング剤の存在における検出）を記載したもので ある。

■−溶液中における実施態様例 Ａ）放射性化合物による検出； 実施例１：集積増幅（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に用 いられる２種の一水路プライマー（Ｐｓｉ及びＰｓ２）及び検出増幅（ｄｅｊ６ ｃｊｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に用いられる一対のプライマーＰｄ −Ｐｃを使用する本発明の方法による１６型ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａ ｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　、ＨＰＶ１６）の検出。

本発明のハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｊｉｃｎ　）試。

験において、集積増幅時のサイクル数、希釈度及び検出増幅時のサイクル数は、 増幅し検出するべき標的配列（ｔａｒｇｅｔ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　、希釈時及 び試料の性質に依存する。

集積増幅は、特に限定されるものではないが、例えば２０乃至４０口のサイクル 数、１／２００乃至１／１００，０００の希釈から成っていても良く、検出増幅 は３回から１５回のサイクルから成っていても良い。この場合、検出増幅時のプ ライマーの濃度は集積増幅時のプライマー濃度に比べ１０倍も低いにもかかわら ず、最終生成物中への非常に高いレベルのプライマー（約７５％）の組み込みが 達成される。

本願発明の方法を実行する他の実施例は、２つのシリーズの集積増幅からなり、 これは限定されるものではないが次のように考えられるニ ー第１集積増幅（１０〜４０サイクル）、１／２００希釈； −得られた溶液からの第２集積増幅（１０〜４０サイクル）、１／１０００希釈 ； 一検出増幅（３〜１５サイクル）。

−支持体の調製： ここで使用される支持体は、最初にビオチンと結合したウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）でコーティングし、次にアビジン（ａｖｉｄｉｎ）でコーティングされた 。ひれ付き（ｆｉｎｎｅｄ　）ポリスチレンチューブである。

ＢＳＡ−ビオチン５ｇを含むリン酸緩衝液（０，０５Ｍ、ｐＨ７，３）５００μ ｍを、ひれ付きチューブの中で室温にて２時間インキュベートする。液体を除去 し、アビジン５ｍｇ／ｍｌを同じ緩衝液に溶かした溶液５００μｍを加え、室温 にて２時間インキュベートする。支持体上の解放されている部位（ｆｒｅｅ　５ ｉｔｅｓ　）を、変性して超音波処理をしたニシン精子ＤＮＡの２０Ｍｇ／ｍ　 ｌ濃度の溶液でブロック（ｂｌｏｃｋ）する。これらのチューブは、この媒体中 にて数週間＋４℃で保存することができる。

−集積増幅： 試験用ＤＮＡ溶液を、全容量５０μｍ：２つのプライマーＰｓｉ及びＰｓ２それ ぞれ５Ｑｐｍｏｌ、４つのデオキシリボヌクレオシドトリフオスフェート（すな わちｄＡＴＰ。

ｄｃＴＰ％ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）（ベーリンガー　マンハイム；　Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ　ｌＪａｎｎｈｅｉｍ　）それぞれ３００Ｍ。

１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５０ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭトリス−塩酸（ｔｒｉｓ −ＨＣ１）　、ｐＨ８，９，０，０１％（Ｗ／Ｖ）のゼラチン及び２．５ユニツ トのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）を含む媒体中にて第１の 増幅に供する。自動化装置を用いて３０回の増幅サイクルを繰り返す（１サイク ルは、９２℃における変性９０秒、５０℃でのアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎ ｇ）　９０秒及び７２℃での伸張１２０秒に相当する）。

一検出増幅： ５０μｍの容量中で上記の如く増幅した各試料２μｍを４００μｌの水中に希釈 する。この溶液（すなわち集積増幅の１１５０００）２μｍを、下記修飾プライ マーの存在下、上述した増幅媒体中で全容量を２５μｌにした１２サイクルから なる検出増幅に供する：５ｐｍｏｌの５′位がビオチン化された（５’−ｂｉｏ ｊｉｎｙｌａｔｅｄ　）オリゴヌクレオチド、Ｐｃ３及び５ｐｍｏｌの５′位が ３２Ｐで標識されたＰｄ４オリゴヌクレオチド。上記プローブの比活性は５０． ０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌに慎重に制限する；各サンプル当たりの全活性は約２５ ０．０００ｃｐｍである。

図１は実施例１に記載した方法の背景にある原理を示している。集積増幅におけ るプライマーの対は一水路プライマーＰｓｌ及びＰｓ２で示している；検出増幅 におけるプライマーの対は５′位が３２Ｐで標識されたプライマー、Ｐｄ４及び ビオチン化されたプライマー、Ｐｃ３で示して検出増幅で得られた２５μｍの全 てを、ＳＴ固定化緩衝？＆（０，５Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　トリス−塩酸、ｐ Ｈ９，５）が４７５μｍ人ったアビジン−被覆チューブの中に移す。固定化は、 １時間５０℃にて実施される。その後チューブを空にして、１ｍｌの５Ｔ−１％ Ｔｗｅｅｎ２０で、１回は室温にて５分間、１回は５０℃にて５分間洗い、さら に１回は１ｍｌのＯ，ｌＸ５Ｔ−１％Ｔｗｅｅｎ２０で５０℃にて５分間洗う。

チューブ上に保持された放射能を直接チェレンコフカウンティング（Ｃｅｒｅｎ ｋｏｖ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ）で測定する。その結果は、初期全活性（すなわち約 ２５０，０００ｃｐｍ）に対してチューブ中で保持された活性の割合“Ｒ”で表 わす。

実施例２：集積増幅に用いられる２種の一水路プライマーＰｓｉ及びＰｓ２、検 出増幅に用いられるペアＰｃ３−Ｐｓ４及び検出に用いられるプローブＰｄ５を 使用する本発明の方法による１６型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ１６）の検 出。

方法は実施例１と同様である；相違点は検出増幅に用いられるプライマーの対及 び検出に関係する点である。

オリゴヌクレオチドＰｓ４は標識されておらず、１００℃にて試料を変性させた 後、Ｏ，ｌｐｍｏｌの５′位が３２Ｐで標識されたプローブ、Ｐｄ５（３５量体 、３５−ｍａｒ）でハイブリダイゼーションすることにより、検出が達成される 。該プローブの比活性は高＜　（２，５Ｘ１０６ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、各試料当 たりの全活性は約２５０．０００ｃｐｍである。

実施例１に記載したＳＴ固定化緩衝液が４７５μｍ人っているアビジン−コーテ ィングされたチューブ中に、検出用増幅溶液を移した後、標識された検出プロー ブＰｄ５を添加する。

実施例３：疑いのある患者の（５ｕｓｐｅｃｔｅｄ）子宮頚生体組織検査（ｂｉ ｏｐｓｉｅｓ　）におけるＨＰＶ１６ＤＮＡの検出。

生検材料からのＤＮＡが、細胞溶解とタンパクの消化の後にフェノール−クロロ ホルムで常法により抽出される（マニアティスら、モレキュラー　クローニング 、ア　ラボラトリ−マニュアル、コールド　スプリング　）＼−バー　ラボラト リ−１１９８２（Ｍａｎｉａｔｉｉ　ｅｊ　ａｌ、、　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌ ｏｎｉｎｇ、　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２　）　）　ｏ　１２試料中 、４試料は強い陽性（Ｒ＞２５％）を、３試料は陽性（Ｒ＞１０％）を示した； 陰性のものは非常に弱いバックグラウンド（ｂａｃｋｇＩｏｕｎｄ　）を維持し ている（Ｒく１％）（Ｒは初期全活性に対してチューブ中で保持された活性の割 合を示す）。この本発明による技術により得られた値は、フィルター上で行われ る通常のハイブリダイゼーションにより得られる結果と相関しているが、驚くべ きことに、実質的により高い感度を示しＨＰＶ１６の検出。

膝用綿棒を殺菌済ＰＢＳ中に簡単に再懸濁させた後遠心分離機にかける。ペレッ ト（ｐｅｌｌｅ＋　）を２００μｍの水に溶解し１００℃にて１５分間加熱する 。上清を回収し一２０℃で凍結させる。上述した方法（実施例１）に従って処理 した８試料のうち、１試料のみが弱い陽性（Ｒ＝２．５％）を示し、その他の試 料はネガティブコントロール（Ｒく１％）に匹敵する活性を保持していることが 分かった；これらの結果は、フィルターフ１イブリダイゼーシヨン技術で得られ る結果とやはり相関している。

ＨＰＶ１６ウイルスに感染した細胞由来のＤＮＡ及び非感染細胞由来のネガティ ブコントロールとして使用されるＤＮＡを、実施例１に記載した方法に従って集 積増幅に供した。

５０００倍に希釈した後、ビオチン化された捕獲（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ　）プラ イマー、Ｐｃ及び５′位が１２５ヨウ素で標工された検出オリゴヌクレオチド、 Ｐｄの存在下で、フランス特許第８８０８２４０号に開示されている技術に従っ て検出増幅を実施する。標識化は、低比活性（３７５，０００ｃｐｍ／ｍｏｌ　 ）となるように慎重に制限する。

二本鎖体（ｄｕｐｌｅｘ　）の検出は、実施例１に記述したように３２Ｐで標識 されたプライマーについて使用された方法に従って実施する。二本鎖はアビジン コーティングされたチユーブ上にビオチンで固定される。洗浄した後、　ヨウ素 をガンマカウンター（ｇａｍｍａ　ｃｏｕｎｔｅｒ）　を用いて測定する。

Ｂ）非放射性検出： 出。ジニトロフェニル基を有するプライマーの使用。

ＨＰＶ１６ウイルス感染細胞由来のＤＮＡ及び非感染ゲノムＤＮＡを上述した方 法に従って集積増幅に供した後、希釈した（実施例１参照）。検出増幅は、ビオ チン化された捕獲プライマーＰｃ及び５′末端にジニトロフェニル基を有するプ ライマーＰｄの存在下でフランス特許第８８０８２４０号に開示されている技術 に従って実施される。二本鎖の検出は、数段階の処理から成る：１、ＰＢＳ緩衝 液（リン酸緩衝生理食塩水）、１％Ｔｗｅｅｎ２Ｑ、１％ＢＳＡ　Ｃウシ血清ア ルブミン）中にて、ウサギ抗ジニトロフェニル抗体（シグマケミカル社（Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）　）と共に３７℃にて１時間インキュベー トを行う。

２、室温にて３Ｘ４００μｍのＰＢＳ緩衝液、１％Ｔｗｅｅｎ２０．１％ＢＳＡ で洗浄する。

３、同緩衝液で１／３００に希釈した、アルカリフォスファターゼ−結合抗ウサ ギ抗体（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）　）と 共に３７℃にて１時間インキュベートする。

４、ＰＢＳ、１％Ｔｗｅｅｎ２０．１％ＢＳＡで３回室温にて洗浄する。

５、ジニトロフェニルフォスフェートの加水分解による検出（Ｓｉｇｍａ　ｋｉ ｔ）　ｏ　４０５　ｎｍにて記録。

ａ）増幅： 粗抽出物は、Ｈｅ１ａ細胞（ＨＰＶ１８＋）及び繊維芽細胞（ＨＰ　Ｖ−）より 調整した二遠心分離後、細胞ペレットを２５０μｍの水に溶解し、１００℃にて １０分間加熱する。短時間遠心分離して細胞破片（ｃｅｌｌ　ｄｅｂｒｉｓ）を 除き、可溶性核酸を含む上清を回収する。

ＨＰＶ１８と共に集積するための増幅は、各プライマーが５Ｑｐｍｏｌずつの存 在下で、慣用されているＰＣＲ媒体中にて行う。これは３０サイクルから成る： 変性は９４℃にて１分３０、アニーリングは５０℃にて１分そして伸張は７２℃ にて１分３０実施する。

検出増幅は集積溶液の１／８００希釈液を用いて行う。

この増幅は２つの修飾プライマーを使用して実施される：１つは、５゛末端にジ ニトロフェニル残鎖を含むもの、即ち捕獲プライマーであり、もう１つは、ビオ チン残鎖を含むもの、即ち検出プライマーである。増幅媒体は、全容量２５μｍ 中に各プライマーを５ｐｍｏｌずつ含んでいる。サイクル数は１８：変性は９４ ℃にて１分、アニーリングは５５℃にて１分そして伸張は７２℃にて１分間実施 する。

ｂ）チューブの飽和： 小型のスターチューブスヌンクチューブス（Ｓｍａｌｌ−ｍｏｄｅｌ　５ｔａｒ ｔｕｂｅｓ　Ｎｕｎｃ　ｔｕｂｅｓ　）を、０゜０５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸 ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，５，１ｍＭＭｇＣ１２中、抗ＤＮＰ抗体で３７℃に おいて一夜コーティングする。解放されている部位を室温にて３時間、同緩衝液 中に溶解させた２％ＢＳＡ溶液で飽和させた後、チューブをＰＢＳ中で５分間洗 浄し、同緩衝液中で４℃にて保存する。

Ｃ）増幅生成物の固定： 検出増幅生成物１５μｍを、５００μｍのＰＢＳ中にて３７℃で２時間固定化す る。５００μｍのＰＢＳｌｏ、１％Ｂ　Ｓ　Ａ／４％Ｔｗｅｅｎ２０中で５分間 洗浄を実施した後、ＰＢＳ中で５分間洗浄した。

その後、短時間のＢＳＡ飽和を行う（３％ＰＢＳ溶液）：３７℃にて１時間。生 成物をＰＢＳで５分間洗浄する。

アビジン−アルカリホスファターゼ溶液を反応に供する（ＰＢＳにて１／１２５ ００希釈）。この複合体の固定は、室温において３０分間実施する。その後、Ｐ ＢＳで５分間の洗浄を３回行う。

ｄ）蛍光検出： 使用するアルカリホスファターゼ基質は、４−メチルウンベリフェリルフォスフ ェートである。該酵素によってフォスフェートが切断されて、基質は蛍光を発す る。励起波長は３７４ｎｍで、蛍光発光波長は４５０ｎｍである。

０．１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ９，５，０，ＩＭＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２ 中で基質の０．０５Ｍの保存溶液（５ｔｏｃｋ　５ｏｌｌｉｏｎ　）を調製する 。作業溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）はこの保存溶液を１／３０ ０に希釈することにより得られる。各チューブ当たり、この溶液５００μｍが用 いられる。酵素を１５分間反応させると、非常に強い青色蛍光が測定される。

蛍光光度系のキャリブレーション： 緩衝液上で　０％ 陽性ＤＮＡ上で　１００％ 陰性ＤＮＡでの測定：　２％ ブランクでの測定＝　２％ ｅ）発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　）検出：発光の基質はジオキセタン（ｄ ｉｏｘｅｔａｎｅ）誘導体のアダマンチル−１，２−ジオキセタンフォスフェー トである。

発光は酵素の作用に直接依存している。すなわち、フォスフェートが切断される と、解離する不安定な陰イオンが形成される。この切断により発光光線を出す新 しい活性化陰イオンができる。

ｌ　Ｑ　ｍｇ／ｍｌの保存溶液は入手可能である。この溶液を０．０５Ｍ炭酸ナ トリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，５，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２で１００ 倍に希釈し、この溶液５００μｍを各チューブに使用する。１０分間酵素を反応 させた後、発光測定器（ＩｕｍｉｎｏｍＮｅｒ）で光を測定する。

陽性ＤＮＡからのシグナル：　２４５ 陰性ＤＮＡからのシグナル：　４ ブランクからのシグナル＝１．８ この検出方法は、放射性の方法の感度の値を事実上達成している。これは、非放 射性検出用の優れた方法である。

ｆ）比色検出： 使用するアルカリホスファターゼ基質はｐ−ニトロフェニルフォスフェートであ る。酵素反応でフォスフェートがなくなると、４０５ｎｍで光学密度（ｏｐｔｉ ｃａｌ　ｄｅ＋＋５Ｎｙ）が測定される黄色の化合物が生成される。

２錠のホスファターゼ基質、シグマ（Ｓｉｇｍａ）　１０４を、１０　ｍ　ｌの ０．８Ｍジェタノールアミン緩衝液、５ｍＭＭｇ　ＣＩ　２　、　ｐＨ９，８中 に溶解し、５００μｍを各チューブに使用する。暗所にて１０分間酵素を反応さ せた後、２Ｎの水酸化ナトリウムを２５０μｍ加えて反応を停止させる。

陽性ＤＮＡについての測定＋０．３２０Ｄ陰性ＤＮＡについての測定：０．０２ ０Ｄブランクについての測定：　０．０１０Ｄ１１＝均質相中における実施態様 例 実施例８：本発明の均質相中における実施態様による１６型ヒトパピローマウイ ルス（ＨＰＶ１６）ＤＮＡの検出。

種々の試験ＤＮＡ溶液を下記の溶液中にて第１増幅に供した：全容量全５０μｍ 中に、２つのプライマーＰ１及びＢ２それぞれ５０ｐｍｏＬ４つのデオキシリボ ヌクレオシドトリフオスフェート（すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）（ベーリンガー　マンハイム：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　 Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）それぞれ２００．ｃｚＭ、１．５ｍＭＭｇＣ１，５０ｍＭ 　ＫＣＩ、１０ｍＭ　トリス−塩酸、ｐＨ８，３，０，０１％（Ｗ／Ｖ）のゼラ チン及び２．５ユニツトのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）を 含む溶液。自動化装置を用いて３０回の増幅サイクルを繰り返した（１サイクル は、９４℃における変性９０秒、５０℃でのアニーリング９０秒及び７２℃での 伸張１２０秒に相当する）。

上記で増幅した各試料１μｍを１００μｍの水で希釈する。その後、各溶液１μ ｍ　（１／２５００）を、２つのプライマーＢ１とＢ２を５　ｐｍｏｌ含んだ上 述の増幅媒体中、全容量２５μｍで、１５サイクルからなる第２シリーズの検出 増幅に供する。

５μｇ／ｍ　ｌの臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ　）　１ μｍ　（すなわち５１ｇ）を２０μｍの増幅溶液中に添加する；混合物を撹拌し た後、チューブを２５４ｎｍにてＵ、　Ｖ。

を照射して試験する。ＨＰＶ１６ウイルスＤＮＡを含む溶液のみが、検出可能な 蛍光を発する。これにより、陽性試料と陰性試料との高感度の識別が可能となる 。

得られた結果は、コントロールゲルで得られた結果と対イルスＤＮＡの検出。

ＨＰＶ１８ウィルスＤＮＡを含むｐＢｒ３２２プラスミドＤＮＡ及びそれを含ま ないｐＢｒ３２２プラスミドＤＮＡの連続的な希釈液を調製する。このようにし て、次の濃度を得る：１μｌに対してＤＮＡを２０．１０．１及び０．１ｎｇ含 む。

この様にして得た８種のＤＮＡ溶液を、下記の溶液中にて増幅に供した：全容量 ２５μｍ中に、２つのプライマーＰ１及びＢ２それぞれ３μｍｏｌ、　４つのデ オキシリボヌクレオシドトリフオスフェート（２００μＭ）　、１．５ｍＭＭｇ Ｃ１，５０ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ８，３，０，０１％（Ｗ ／　Ｖ　）のゼラチン及び０．２５ユニツトのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む 溶液。

自動化装置を用いて１５回の増幅サイクルを繰り返した：９４℃における変性１ 分３０．５５℃でのアニーリング１分３０及び７２℃での伸張１分。

これら１５サイクルの最後に、５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム溶液１μｍ　（す なわち５ｎｇ）を各チューブに添加し、混合物をすばやく撹拌した後、チューブ を２５４ｎｍでＵＶトランスイルミネーター（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａ＋ｏ ｒ　）にて試験する。

ウィルスＤＮＡ　（２０，１０及び１０ｇ）を含むプラスミド増幅溶液を収容し たチューブは実質的に蛍光を発し、０、ｌｎｇのウィルスＤＮＡを含むプラスミ ドを収容するものはかすかに蛍光を発し、プラスミド単独を収容するものはなん らのシグナルをも発しなかった。

高度に精製され且つ高度に希釈したＤＮＡを増幅して得られる生成物の臭化エチ ジウム検出は、増幅直後に実施すると非常に有意な結果が得られる。

実施例１０：液体媒体中の他の直接検出例。

１）ビスベンズイミド（“ＨＯＥＣＨ３Ｔ　３３−２５８”と呼ばれる）の使用 ： ａ）ＨＩＶウィルスＤＮＡ　（後天性免疫不全症候群）の検出。

健康人及び該ウィルスを保持している人のリンパ球又は単球からのＤＮＡ、該ウ ィルスを保持している人の牌臓からのＤＮＡ又はＨＩＶＩ／ｌａｖ株（５ｔｒａ ｉｎ　）からのインサート（１ｎｓｅｒｔ　）を保有しているプラスミドからの ＤＮＡを１μｍ、実施例１に記載したように５０μｍ容量中にて第１回目の増幅 に供する。

上記増幅した各試料１μｍを２００μｍの水に希釈する。

この溶液２μｍを、最終容量２５μｍ中プライマーＢ１及）びＢ２を用いて、２ ５サイクルから成る第２増幅に供する。

この溶液２０μｌを、最終的に１μｍのＨＯＥＣＩＩＳＴ　３３−２５８を含む １　ｍ　ｌの５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，４，２Ｍ　ＮａＣ１中に希 釈する。

攪拌後、パーキンエル？　−（Ｐｅ「ｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　）　Ｌ　Ｓ　５分光 蛍光計（励起３６０ｎｍ、発光４５０ｎｍ）にて蛍光測定を行う。測定装置は、 二本鎖ＤＮＡの種々の希釈液を用いてあらかじめキャリブレーションを行ったも のである。

キャリブレーション系列： ０、７５　ｕｇ　０．３５μｇ　０．１９μｇ　０．０１μｇ　ｏμｇ　ＤＮＡ １００％　３０％　１５％　９％　０％ＨＩＶＩのｔａｔ遺伝子及びｐｏｌ遺伝 子において、２セツトの異なるプライマーを使用する。

ｐｏｌについての結果： ｔａｔについての結果： ｂ）１６型及び１８型ヒトパピローマウイルスＤＮＡの検出。

ＨＰＶ１８＋（ＨＥＬＡ）及びＨＰＶ１６＋（ＣＡＳＫＩ）細胞上清溶液５μｍ 、（水２５０μｍ中１０６個の細胞）、及びＨＰＶ−陰性の線維芽細胞を、すで に上述した増幅に供する。２００倍希釈後、この溶液２μｍを第２増幅に供し、 蛍光試験を行った。

キャリブレーション系列： １．５μｇ０．７５μｇｏ、３８μｇ０．１９μｇ　０．１μｇ　ｏμｇ　ＤＮ Ａ１００％　４８％　２０％　８％　２％　０％ＨＰＶ１６： ＨＰＶ１８： ２）ＤＡＰＩの使用： ａ）ＨＰＶ１８の検出： 前述の実施例と同様の方法に従う；２種の異なる希釈液が試験される：　１１５ ０及び１／２００゜０、　２μｇ／ｍｌのＤＡＰ　Ｉを含む５ｍＭトリス−塩酸 緩衝液、ｐＨ７，６，８ｍＭ　ＮａＣ１中にて蛍光測定を行う（励起３７２ｎｍ 、発光４５４　ｎｍ）。

キャリブレーション系列： １．５μｇ　０．７５μｇｏｊ８μｇ０．１９μｇ　ｏ、１μｇＯμｇ１００％ 　５０％　２４％　１２％　６％　０％ｂ）ＨＩＶＩの検出： 前実施例と同様の方法で行う。

キャリブレーション系列： ２μｇ　１μｇ０．５μｇｏ、２５μｇ０．１２μｇ　ｏμｇ％１００　４８　 ２０　１０　６　０μｇＨＩＶｉ： ＩＩ＋−希釈段階（ｂ）の役割。

予備実験によると、１／１０に希釈すると、ハイブリッドを親和性鋳型（ａｆｆ ｉｎｉｔｙ　ｔｅｍｐｌａ＋ｅ）に捕獲した後には低いシグナルの高いバックグ ラウンドが多く発生すること、及びこれが第２シリーズの増幅のサイクル数には 関係がないことが判明した。このことは、通常ＰＣＲが大過剰のプライマーの存 在下で行われるという事実、及び１／１ｏ希釈後の溶液中に増幅プライマーがま だ多く存在していると；　いう事実に基づくものかもしれない。第２シリーズの 増幅時においては、増幅プライマーと検出プライマーとの間で競合が起こるので 、ＰＣＨの効率低下につながる。高濃度のプライマーは二量体プライマーの生成 をも引き起こし得る。

Ｏ細胞破片が存在すると、ＰＣＲが粗ＤＮＡ試料について行なわれており、且つ 、１／１０希釈によってそれらが充分に排除されていない場合、反応が部分的に 阻害されることもあり得る。バックグラウンドの値は、非特異的配列の増幅を測 定することによりめる。特異的なシグナルは、特異的な増幅からバックグラウン ドの値を差し引いた後のカウント数と定義される。この方法の感度は、特異的シ グナルの固定率（ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｐｅｒｃｅ＋ｒ＋ａｇｅ）の測定により評 価される。結果を図３に示す。検出感度はサイクル数の関数で表わされる。

サイクル数をＸ軸、固定率をｙ軸で表わす図３は、ＨＰＶ１８＋細胞（Ｈｅ１ａ △１口、○）及びＨＰＶ１８−細胞（ＢＪＡＢ　１■、ム、・）で実施したＰＣ Ｒを示している。第１回目の増幅は容量１００μｍ中の細胞（２×１０４）につ いて行われる。１／１０希釈（○、・）、１／２００希釈（△、ム）及び１／２ ０００希釈（口、■）の後、ヨウ素１２５−標識プライマー及びビオチン化した １　プライマーの存在下で試料を第２回の増幅に供する。ハイブリッドを回収し 、放射能を測定する。全活性は７１、　０００　ｃｐｍ／１ｕｂｅであり、値は 保持サレル放射能ノ百分率で表わされる。

希釈度がそれぞれ１／２００　（△、ム）と１／２００００　（口、■）に増大 すると、第２回目の増幅時に存在する標的配列のコピー数は最初は低く、ＰＣＲ のより良い効率につながる。その時、指数段階（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｐｈ ａｓｅ）はさらに顕著になり、それぞれ２０と２５サイクル後にプラトー　（ｐ ｌａｔｅａｕ）に達する。それに対して、バックグラウンドでは１６と２０サイ クル後に指数的に増加し始める。

ト述より明らかなように、本発明はここでより明快に記載した実施例、実施態様 及び適用に決して限定されるものではない。むしろ、本発明の構成または範囲を 逸脱しない限りにおいて当業者が考えつく全ての類似技術を包含するものである 。

１）集積段階 ｄ）固定　及び 巳旦凪Ｌ１ 国際調査報告 １１−−一一一一＃＆　ＰＣＴ７ＦＲ９０１００４１０国際調査報告 ＦＲ９０００４１０ Ｓ＾　３７９５６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１種の酵素的増幅を含む、生物学的試料中に存在する特定の核酸 配列（単一の配列及び／又は核酸配列の混合物）を検出するための方法であって 、核酸又は核酸類（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ）を抽出するために溶液中に生物 学的試料を適当に置いた後に、以下の段階を使用して核酸配列又は配列混合物の 検出をすることを特徴とする方法： （１）（ａ）標的核酸配列又は核酸配列類（ｔａｒｇｅｔｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃ ｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の少なくとも１種のフラ グメントを増幅するために、溶液中にある生物学的試料を、少なくとも１対の適 当なプライマーと接触させ、該プライマーと該標的配列又は配列類とをハイブリ ダイズさせ、集積（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）のための増幅溶液を得ることができ るようにし、 （ｂ）上記（ａ）で得られる集積のための増幅溶液を少なくとも１度適当に希釈 すること により標的配列又は配列類を集積する段階；（２）（ｃ）上記（ｂ）で得られる 集積のための溶液のフラクションを、少なくとも１対のプライマー（その一つの 配列が少なくとも上記（ａ）で増幅された標的配列中に含まれている）と接触さ せ、 （ｄ）任意の適当な手段によって、上記（ｃ）で得られる２本鎖の標的核酸のコ ピーを検出することによって得られる増幅された標的配列を検出する段階。 ２．段階（ａ）及び（ｂ）を少なくとも一度繰り返すことを特徴とする請求項１ に記載の方法。 ３．段階（ｂ）における希釈度が、１／５０〜１／１００，０００であることを 特徴とする請求項１又は２に記載の方法。 ４．段階（ｂ）における希釈度が、１／５０〜１／５０，０００であることを特 徴とする請求項３に記載の方法。 ５．段階（ｂ）における希釈度が、１／５０〜１／１０，０００、好ましくは、 １／２００〜１／５，０００であることを特徴とする請求項３又は４に記載の方 法。 ６．段階（ａ）におけるプライマーが、標的配列とハイブリダイズする一本鎖の ヌクレオチド配列（一本鎖プライマー（Ｐｓ））であることを特徴とする請求項 １〜５のいずれかに記載の方法。 ７．段階（ｃ）におけるプライマーが、捕獲システム（ｃａｐｔｕｒｉｎｇｓｙ ｓｔｅｍ）によって修飾されたプライマー−検出システム（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）によって修飾されたプライマー（Ｐｃ−Ｐｄ）のペア、一本鎖プ ライマー−一本鎖プライマー（Ｐｓ１−Ｐｓ２）のペア、一本鎖プライマー−捕 獲システムによって修飾されたプライマー（Ｐｓ１−Ｐｃ）のペア及び一本鎖プ ライマー−検出システムによって修飾されたプライマー（Ｐｓ１−Ｐｄ）のベア からなる群から選ばれるペアであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに 記載の方法。 ８．段階（ｃ）（第２シリーズの増幅）で使用されるプライマーの量が、段階（ ａ）で使用されるプライマーの量より実質的に少ないことを特徴とする請求項１ 〜７のいずれかに記載の方法。 ９．段階（Ｃ）で使用されるプライマーの量が、少なくとも段階（ａ）で使用さ れるプライマーの量よりも５倍少ないことを特徴とする請求項８に記載の方法。 １０．段階（ｃ）における一対のプライマーが捕獲プライマーを含むときに、検 出段階（２）が： （ｄ）検出のための増幅溶液を、挿入された捕獲プライマー（Ｐｃ）を保有する 核酸フラグメントを捕獲する適当な支持体に接触させること、及び （ｅ）任意の適当な手段によって、該支持体上に保持された２本鎖の標的核酸の コピーを検出することからなることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載 の方法。 １１．検出プライマー（Ｐｄ）が、段階（ｃ）において標的核酸鎖に挿入された 時、段階（ｅ）における検出が、該検出プライマー（Ｐｄ）によって行われるこ とを特徴とする請求項１０に記載の方法。 １２．一本鎖プライマー（Ｐｓ）が、段階（ｃ）において鎖（ｓｔｒａｎｄ）に 挿入された時は、段階（ｅ）における検出が、適当な検出プローブと、支持体上 に保持される２本鎖の標的核酸のコピーとのハイブリダイゼーションにより行わ れるか、或いは２本鎖の標的核酸と相互作用する化合物、特にスペクトルの修飾 （ｓｐｅｃｔｒａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を作り出せる色素物質又はイン ターカレーティング剤と接触させ、次いで、２本鎖の核酸と相互作用する化合物 の該スペクトルの修飾を、任意の適当な方法によって、検出することによって行 われることを特徴とする請求項１０に記載の方法。 １３．段階（ｃ）における一対のプライマーが捕獲プライマーを含まない時に、 検出段階（２）が、（ｄ）上述で定義した段階（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の後に 得られる二本鎖の核酸を、適当な検出プローブに接触させるか、又は二本鎖の核 酸と相互作用する化合物、特にスペクトルの修飾を作り出せる色素物質又はイン タ一方レーティング剤に接触させ、次いで、２本鎖の核酸と相互作用する化合物 の該スペクトルの修飾を任意の適当な方法によって検出することによる、該増幅 された標的配列を均質液相中で直接的に検出する工程を包含することからなるこ とを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 １４．該化合物が二本鎖のＤＮＡに結合した後に物理化学的修飾を示す物質から 選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。 １５．スペクトルの修飾を作り出せる化合物が、ビス−ベンズイミド又はエチジ ウムブロマイドのような蛍光インターカレーティング剤であるであることを特徴 とする請求項１３又は１４に記載の方法。 １６．テストＤＮＡおよび特にテストウィルスＤＮＡの連続した希釈が、少量（ ０．０１％Ｗ／Ｗのオーダー）のゼラチンを含むｐＨ８．３の適当な緩衝液中に 、鋳型として使用できる少なくとも２種の標的配列、４種のデオキシリボヌクレ オシドトリフォスフェート及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する適当な容量 中で第１シリーズの増幅に供され、その後、該第１シリーズの増幅からの生産物 が、第２希釈段階に供され、次いで好ましくは前記第１シリーズの増幅において 使用された媒体と類似し、且つ、鋳型として使用できる少なくとも２種の標的配 列を含有する増幅媒体中で、第２シリーズの増幅に供し、その後、該第２シリー ズの増幅後に得られる増幅溶液に、スペクトルの修飾を作り出せる化合物が、該 溶液中に存在する可能性のある２本鎖のウィルスＤＮＡを検出するために、加え られることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。 １７．当該検出を実行するために必要な量の適当なバッファーおよび試薬に加え て、少なくとも、 −該方法の段階（ａ）を実行するための少なくとも一つの適当なプライマーの適 当な量（ｄｏｓｅｓ）の第１の対（ｐａｉｒ） −該方法の段階（Ｃ）を実行するための少なくとも一つの適当なプライマーの適 当な量（ｄｏｓｅｓ）の第２の対（Ｐａｉｒ） 及び、必要に応じて、 −該方法の段階（ｅ）を実行するための少なくとも一つの適当な量（ｄｏｓｅｓ ）の適当なプローブ及び／又は−それが核酸に結合される時又は核酸に結合され ない時に、スペクトルの修飾を作り出せる色素物質又はインターカレーティング 剤のような２重鎖の核酸に非共有結合的に結合する適当な量の少なくとも１種の 化合物を含有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実行するための、 使用の準備ができたボックス、キット、又は調整されたセット。 １８．ヒト、動物及び植物の遺伝子疾患の検出における請求項１〜１６のいずれ かに記載の方法の応用。 １９．ヒト、動物及び植物の感染疾患の検出における請求項１〜１６のいずれか に記載の方法の応用。 ２０．ヒト、動物及び植物の腫瘍疾患の検出における請求項１〜１６のいずれか に記載の方法の応用。 ２１．生物学的試料のチェックにおける請求項１〜１６のいずれかに記載の方法 の応用。 ２２．細胞の型別（ｃｅｌｌｔｙｐｉｎｇ）における請求項１〜１６のいずれか に記載の方法の応用。