JPH04504720A

JPH04504720A - タンパク質精製のための方法

Info

Publication number: JPH04504720A
Application number: JP2506788A
Authority: JP
Inventors: ステープルズ，マーク　エー．; パージリス，クリストファー　エー．
Original assignee: バイオジェン，インコーポレイテッド
Priority date: 1989-04-14
Filing date: 1990-04-12
Publication date: 1992-08-20
Also published as: WO1990012803A1; EP0467992A4; EP0467992A1; CA2050277A1; US5169936A; AU5545790A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質精製のための方法本発明の技術分野本発明はタンパク質を精製する方法に関する。特に、本発明は、ヒスチジンおよびンステインのような金属結合性アミノ酸残基を表面に有するタンパク質を精製する方法に関する。

背景タンパク質精製のための種々のクロマトグラフィーの技術が当該分野で知られている。分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および電気泳動のような方法がタンパク質精製に一般的に用いられている。しかし、非常に類似する分子量および類似する総電荷を有するタンパク質の分離は、既存の分離方法に用いられる特性（すなわち、分子量および総電荷）に有意な差がないため、別の精製法の使用が必要である。特に免疫不全あるいは免疫障害の患者のような過敏な個体の処置に精製タンパク質が使用される場合、治療に使用されるタンパク質の完全で効率的な分離は重大である。

限定された条件でのタンパク質精製の他の技術は「固定化金属アフィニティークロマトグラフィーＪ　（ＩＭＡｃ）と呼ばれる。この方法が発達したのは、ある種のタンパク質は重金属イオンに対する親和性を有することが認識された結果であり、それはタンパク質精製のために使用される、他の区別となる特性となり得るであろう。この特性は、特にヒスチジンあるいはシスティン残基を有するタンパク質に応用される。これらのアミノ酸残基はキレート化された亜鉛あるいは銅イオンと複合体を作り、キレート樹脂に吸着されることが知られている［Ｊ、　Ｐｏｒａｔｈら、　−Ｍｅｔａｌ　Ｃｈｅｌａｔｅ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ａ　Ｎｅｗ　Ａｐｐｒｏｃｈ　Ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ”、　Ｎａｔｕｒｅ、　２−ｓａ、ｐｐ、　５９８−９９（１９７５）］。

しかし、樹脂からタンパク質を選択的に脱着させる技術には困難が生じる。一般的に脱着に用いられる技術は、ｐＨを約３あるいは４に下げることである［Ａ、Ｊ、　Ｆａｔｉａｄｌ　−Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａｎｄ　Ｍｅｔａｌ　Ｃｈｅｌａｔｅ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”、ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ａｎａｌ　ｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　１８゜１）り、　１−４４（１９８７）］。

他の方法は、キレート化された金属に結合する親和性が、タンパク質よりも強い溶質を溶出液に加えることによる。これはヒスチジンあるいはＥＤＴＡのような、金属に堅く結合する強い複合剤を使用することを含む［Ａ、　Ｆ　ｉｇｕｅｒＯａら、−Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ−Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｏｎ　ｌｍ１ｎｏｄｉａｃａ？ｉｃ　Ａｃ１ｄ　５ｉｌｉｃａ−Ｂａｓｅｄ　Ｂｏｎｄｅｄ　Ｐｈａｓｅｓ＋、　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏ　ｒａ　ｈ　、３７ｔ、　ｐｐ、　３３５−５２（１９８６）］。

後者の技術では、金属がしばしばカラムから剥げ落ちる；そのような金属イオンの「漏出」は、明かに精製方法には望ましくない効果である。Ｆｉｇｕｅｒｏａらは、緩やかに結合したタンパク質をＩＭＡＣカラムから脱着する溶出液として、弱競合性リガンドであるアンモニアの使用を報告した。しかし、彼らの方法は、）ＩＰＬＣの使用および余分なカラムの洗浄、および溶出用のアンモニアに切り替えることを必要とする複雑な結合用緩衝液系の使用を含む。これらの両者の要素は精製に要する時間を延長し、精製方法の効率および収量を減する。

さらに、カラムからタンパク質を脱着するために一般に使用されるｐＨを下げる方法は、概して、強（結合したタンパク質の脱着にのみ効果的である。なぜならば、低ｐＨによる脱着゛はしばしば、全てのタンパク質の非選択的脱着を促すからである。

遺伝子工学技術は、それまで入手不可能であった、組み換えタンパク質の大量生産を可能にした。しかし、薬学的に許容できる形態にタンパク質を精製することに重大な障害を与えてきた夾雑物が、これらのタンパク質にしばしば含まれる。

類似の分子量および総電荷を有する夾雑タンパク質とともに見いだされるタンパク質の現在の精製方法は、部分的にのみ効果がある。その結果、新しい治療薬の入手可能性を増すようなタンパク質の精製法の必要性が引き続き存在する。

良豆立斐亘本発明は、表面に金属結合性アミノ酸残基を含むタンパク質を、高い収量で精製する方法を提供することにより、上述の問題を解決する。特に好適な実施態様では、結合用および基質からの溶出用に同じ緩衝液を用いて、Ｃｕ２“−ＩＤＡ基質から選択的に可溶性Ｔ４タンパク質を脱着することを本発明の方法は可能にする。

本発明は、それらを構成するアミノ酸の性質および分布に基いてタンパク質を分離する方法を提供する。

さらに詳細には、本発明は、それらを構成するアミノ酸残基の特異的金属陽イオンに対する親和性によって、タンパク質を分離する方法を提供する。

本発明はさらに、実質的に類似する分子量および総電荷を有する夾雑物からタンパク質を分離する方法を提供する。

従って、本発明は下記の工程によって、表面に金属結合性アミノ酸残基を有するタンパク質を精製する方法を包含する（ａ）結合した２価の金属イオン（Ｍｅ” ）を有する二側歯状のキレータ−（ｂｉｄｅｎｔａｔｅ　ｃｈｅｌａｔｏｒ）に結合したマトリックス樹脂を含む、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂の調製。それは、トリス、アンモニアなどのヨウな、該金属イオンに対する弱いリガンドを含む結合用緩衝液中で行われる；（ｂ）タンパク質を含有する溶液（それはまた、類似の総電荷および分子量の夾雑タンパク質あるいはタンパク質断片を含み得る）を前記樹脂に接触させる工程；および（ｃ）平衡化緩衝液より、より高濃度の前記弱いりガントを含む緩衝液を用いてのタンパク質の選択的溶出。

上述で僅かに言及したように、本発明は、後天性免疫不全ｆｌｉｔ　（ＡＩＤＳ）で特に関心を増しているタンパク質、すなわち可溶性Ｔ４（ＣＤ４）の精製に有利に適用され得る。

Ｔ４タンパク質は、Ｔ４”リンパ球の表面にあるレセプターとして働く。免疫正常な個体では、Ｔａ２）ンバ球は免疫系の他の特定の細胞型と相互作用して感染に対する免疫あるいは防御を与える［Ｅ、Ｌ、　Ｒｅ１ｎｈｅｒｚおよびＳ、Ｆ、　Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ、　−Ｔｈｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ−、Ｃｅ旦。

１９、ｐｐ、　８２１−２７（１９８０）］。さらに特異的には、機能的免疫系にとって重要な成長因子の生産を１４９７８球は刺激する。例えば、造血系幹細胞から分化した細胞であるＢ細胞を刺激するように作用し、それは防御性抗体の産生を促進する。それらはまた、マクロファージ（「キラー細胞」）を活性化して、感染細胞あるいは、そうでなければ異常宿主細胞を攻撃させ、単球（「スカベンジャー細胞」）を誘導して侵入微生物を包囲、破壊させる。

ある種の感染因子に対する主要な標的のレセプターは表面タンパク質Ｔ４である。これらの因子には、例えば、ウィルスおよびレトロウィルスが含まれる。そのような因子に１４９７８球が曝されると、機能できなくなる。その結果、宿主の複雑な免疫防御系は破壊され、宿主は広範な日和見感染に対して感受性となる。

そのような免疫抑制は後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）をわづらっている患者に見られる。ＡＩＤＳの全ての臨床的症状発現は、普通、ＡＩＤＳ関連症候群（ｒＡＲｃＪ　）に続く。ヒト免疫不全ウィルス（ｒＨＩＶＪ　）はＡＩＤＳ感染およびその前駆症状のＡＲＣの原因テアル病原体と考えられている［Ｍ、　Ｇ、　Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎら、”ａｎｔｔｂｏｄｉｅｓ　Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｗｉｔｈ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ）　Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ｏｆ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ”、５ｃｉｅｎｃも、■ま、ｐｐ、５０６−０８（１９８４）１゜ＨＩＶの宿主範囲は、表面域タンパク質Ｔ４を有する細胞に関連している。旧■のＴ４＋細胞に対する指向性は膜に固定しているウィルスレセプターとしての細胞表面域タンパク質Ｔ４の役割に起因する。Ｔ４は旧Ｖのレセプターとして働くので、その細胞外配列は、たぶん旧Ｖとの結合に直接的役割を果していると考えられる。クローン化されたヒトＴ４のｃＤＮＡ型は、マウスおよび線維芽細胞を含むＴ細胞以外の細胞をトランスフェクトしてその細胞表面に発現されると、それらの細胞に旧Ｖに結合する能力を与える［１’、Ｊ、　Ｍａｄｄｏｎら、”Ｔｈｅ　Ｔ４　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏｄｅｓ　Ｔｈｅ　ＡＩＤＳ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｎｄ　Ｉｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ａｎｄ　Ｔｈｅ　Ｂｒａｉｎ−、Ｃｅ１ｌ、　４７．　ｐｐ、　３３３−４８（１９８６）］。

ＨＩＶに関連する感染症であるＡＩＤＳおよびＡＲＣの予防および処置のために、可溶性Ｔ４タンパク質に基づく治療薬が提案されている。ヒトＴ４タンパク質の全配列をコードすると言われるＤＮＡのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列が報告されている［Ｐ、Ｊ、　Ｍａｄｄｏｎら、”Ｔｈｅ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｏｆ　Ａ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　Ｔｈｅ　Ｔ　Ｃｅ１ｌ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔ４：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｍｂｅｒ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　１ｍＩＩｌｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｆａｍｉｌｙ”、江且、■、　ｐｐ、　９３−１０４（１９８５）］。アミノ酸配列を本明細書の図１に示す。その推定される１次構造に基づいて、Ｔ４タンパク質は次の領域に分割される：（以下余白）構造／提案される位置　アミノ酸番号疎水性／分泌シグナル　−２３かラー１■部位と相同性／細胞外　＋１から＋９４Ｊ部位と相同性／細胞外　＋９５から＋１０９グリコジル化された部位／細胞外　＋１１０から＋３７４疎水性／トランスメンブラン配列　＋３７５から＋３９５非常に親水性／細胞質内　＋３９６から＋４３５可溶性Ｔ４タンパク質は、全長のＴ４タンパク質を３７５位で切断してトランスメンブランドメインおよび細胞質膜ドメインを取り除いて構築された。そのようなタンパク質は組み換え技術により作製された［Ｒ，Ａ、　Ｆｉｓｈｅｒら、”旧Ｖ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｉｓ　Ｂｌ。

ｃｋｅｄ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｂｙ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　５ｏｌｕｂｌｅ　ＣＤ４−、　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｊ３１、　ｐｐ、　７６−７８（１９８８）］。可溶性Ｔ４タンパク質は、１４表面タンパク質を発現している細胞のＨ１■感染を抑制する阻害あるいは競合的結合により、Ｔ４／ＨＩＶ相互作用を有利に妨害する。可溶性Ｔ４タンパク質は、１４２９７８球と抗原提示細胞との相互作用を抑制して、１４０９２８球介在性破壊の標的を抑制する。可溶性ウィルスレセプターとして作用することにより、Ｈ１’／のＴ４＋細胞への結合およびウィルス誘導性合胞形成を抑制する抗ウイルス治療薬として、可溶性Ｔ４タンパク質は有用である。

従って、組み換え可溶性Ｔ４タンパク質（ｒｓＴ４）は、その旧Ｖレセプターとしての作用により、ＡＩＤＳ、　ＡＲＣ，１（ＩＶ感染および１４９２３球の欠乏あるいは異常による他の免疫不全の処置に効果を有し得る。そこで、臨床および治療用に、純粋な可溶性Ｔ４を大量に生産することが望ましい。特に、タンパク質が免疫抑制された個体の血流に注射される場合には、毒性のある不純物が入っていてはならない。この要求を満たすためには、不安定化させる因子、あるいは毒性因子の夾雑のない、ｒｓＴ４の効率的な調製を可能にする精製法が必要性である。

しかし、現在の技術によって調製された可溶性Ｔ４は、類似の分子量および総電荷を有する夾雑物（補体因子ＢのフラグメントＢｂ）を含む。従って、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および電気泳動のような従来の方法は、完全な精製には適していない。

本発明の方法により精製される好ましいタンパク質は、Ｔ４＋Ｕ７パ球の表面レセプターである、組み換え可溶性Ｔ４である。

本発明により生産される精製された安定なｒｓＴ４は、Ｔ４＋ソンノ−球がその主要標的であるところの病原体が原因である疾病を患っている、免疫不全の患者の処置に有用である。さらに詳細には、本発明の方法により精製される可溶性Ｔ４タン／ｆり質は、後天性免疫不全症、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、および旧Ｖ感染の予防、処置あるいは検出に有用である。

本発明の特定の目的は、安定した構造の、精製された均質な組み換え可溶性Ｔ４タンパク質を提供することであり、その結果、それはＡＩＤＳ、　ＡＲＣ，および旧Ｖ感染の処置あるいは予防に使用され得る。

従って、好適な実施例では本発明は次の工程を包含する。

（ａ）好ましくはその細胞源および細胞砕屑の混じっていない、ｒｓＴ４タンパク質を含有する溶液を、固定化金属アフィニティーカラム（ＩＭＡＣ）に接触させる工程。ここで、ＩＭＡＣは、ＮａＣ１あるいはＫＣＩのような（好ましくはＮａＣ１）塩、および２価の金属イオンに対する弱いリガンドを含む結合用緩衝液中で、該金属イオンに結合した二側歯状のキレータ−に連結されるマトリックス樹脂を含む。（ｂ）塩および結合用緩衝液より、より高い濃度の弱いリガンドを含む緩衝液を用いてｒｓＴ４タンパク質を選択的に溶出する工程。好ましくは、溶出用緩衝液の塩濃度は結合用緩衝液のそれとほぼ同じであり、また、望ましくは、溶出用緩衝液中の弱いリガンドの濃度は結合用緩衝液のそれの約１０−５０倍である。望ましいマトリックス樹脂はアガロースゲルである。

従来の方法で精製され得る溶液中の組成物が、本発明によるＩＭＡＣ樹脂にかける前に試料中から取り除かれていることもまた、望ましい。従って、他の望ましい実施態様では、本発明の方法は次の工程を包含する：　（１）　ｒｓＴ４タンパク質を含有する培養上清、これは濾過されて、ｒｓＴ４を生産する細胞は取り除かれているのだが、それをタンパク質を吸着する陽イオン交換樹脂に接触させる工程；（２）吸着したタンパク質を、その総電荷に基づいて、樹脂から溶出する工程：（３）陽イオン交換樹脂からの溶出物（これはｒｓＴ４タンパク質を含有する）を、ｒｓＴ４およびそれのｐＩに類似のｐＩを有する他のタンパク質を樹脂に結合させずに洗い流しながら不純物を吸着する陰イオン交換樹脂にかける工程；　（４）　ｒｔＴ４を含有する「洗浄」フラクシヨンを固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂（ＩＭＡＣ）にかける工程。ＩＭＡＣはアガロースおよび二鋸歯状手レータ−５すなわちイミノニ酢酸を含むゲルを、塩（すなわちＮａＣ１あるいはＫＣＩ）および金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂の金属イオンに対する弱いリガンドを低濃度（すなわち０．０１から０．０５Ｍ）で含む結合用緩衝液を用いて、金属塩溶液中に懸濁させて調製する；および（５）同濃度の同じ塩および、高濃度（すなわち０．１がら０．５Ｍ）の同じ弱いリガンドを含む緩衝液を溶出液として用いてｒｓＴ４を溶出する工程。

前述の計画では、好ましくは金属アフィニティー樹脂の調製に使用される金属塩はＣＬＩＣ１２・２Ｈ２０である；好ましくは結合用緩衝液は、弱いリガンドとしてＴｒｉｓ−Ｈｃｌを約０．０１から０．１Ｍの濃度で、最も好ましくは０．０２Ｍの濃度で含む；好ましくは結合用緩衝液および溶出用緩衝液中の塩は、約０．１から１．０Ｍ（両方の緩衝液とも）の濃度のＮａＣ１あるいはＫＣＩである；および、好ましくは溶出用緩衝液は約０．１から０．５Ｍの濃度のＴｒｉｓ・Ｈｃｌを、最も好ましくは約０．３Ｍの濃度で含む。Ｔｒｉｓ緩衝液の濃度勾配もまた、溶出に用いられ得る。さらに、本明細書において用いられる用語「弱いリガンド」とは、精製されるべきタンパク質（すなわちｒｓＴ４）および使用される特定の金属アフィニティー樹脂に関係して定義される。弱いリガンドは、結合樹脂に対して、分離されるべきタンパク質より弱い、親和性を有する。一般的には一最も好ましい弱いリガンドは、アンモニアあるいは有機アミンである。

上記の結果得られる精製ｒｓＴ４は、後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）および旧Ｖ感染を予防、処置、あるいは検出するのに、治療的に使用され得る。

この調製法および精製法は、またＩＭＡＣカラムに結合するに十分な金属結合性アミノ酸残基を表面に有する、他のタンパク質の精製にも有用であ・す、それはＴｒｉｓ・ＨＣＩのような弱い競図１は、天然型のＴ４（ＣＤ４）タンパク質（トランスメンブランタンパク質）のアミノ酸配列を示す。これは、Ｍａｄｄｏｎらの”Ｔｈｅ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｏｆ　Ａ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｔ　Ｃｅ１ｌ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔ４：Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｍｂｅｒ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｇｅｎｅ　Ｆａｍｉｌｙ−、Ｃｅ１１．４２．　ｐｐ、　９３−１０４（１９８５）に報告されている。

図２は、本明細書に記載されている方法により有利に精製され得る、ｒｓＴ４タンパク質のアミノ酸配列を示す。

図３は、補体因子ＢのフラグメントＢｂのアミノ酸配列を示す。

図４は、本発明の方法に有用な固定化金属アフィニティー樹脂の図説である。

本発明による方法を、組み換え可溶性Ｔ４タンパク質の精製を特定の実施例として用いて、以下にさらに詳細に記載する。

以下の記載が、本発明により有利に精製される特定のタンパク質に関する一方で、上述のように、この方法は表面に金属結合性アミノ酸を有する広範な種類のタンパク質、これは当業者によってすぐに認識されるが、そのようなタンパク質の分離に使用されることは理解される。以下の記載はいかなる場合にも本発明の範囲を限定することを意図しない。

良豆ユ毘１呈笠ユ本発明は、組み換え可溶性Ｔ４および表面に金属結合性アミノ酸残基を有する他のタンパク質の精製法を提供する。本発明の方法は、ヒトに投与するのに適当な、安定で構造が変性していないタンパク質を提供する。

以下の議論では、ｒ　ｓＴ４タンパク質の分離について述べるが、開示される原則は、金属結合性アミノ酸残基を含む他のタンパク質を、類似の分子量および電荷を有する他のタンパク質あるいはタンパク質断片から分離、すなわち精製するのに容易に応用され得る。

例えば、ｒｓＴ４タンパク質をコードする遺伝子を有する細胞を、コラーゲンビーズを含む培養液中に懸濁し、インキュベートして、そして原料の細胞を除くために濾過することにより、ｒｓＴ４タンパク質を含有する粗製試料を得る。本発明の方法は、ｒｓＴ４を含有する試料を陽イオン交換樹脂に接触させる最初の工程を含み得る。約２０ｍｅｑ／ｍｌゲルあるいはそれ以上の容量で大量精製に適当な速い流速で使用できる陰イオンゲルを用いることが好まれる。最も好ましくは、使用されるゲルはＳ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ”（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ）である。これは結合している陰イオン硫酸塩リガンドおよび最大直線流速４００　ａｍ／時間を使用する。開始ｐＨを約５．５にすることにより、ｒｓＴ４タンパク質を含む試料中の多くのタンパク質は正に荷電し、樹脂に吸着される。通過画分は吸着しない夾雑物を含み、それは廃棄され得る。

次に、樹脂は高いｐｉ（および塩濃度の緩衝液で洗浄され得る。ｐＨ範囲が約２ −１０のｐＫａを有する全ての緩衝液が使用され得る。好ましくは、溶出用緩衝液はｐＨ［８，５のＴｒｉｓ−ＨＣＩであり、０．０５から０．１Ｍ、　好ましくは０．ＩＭの濃度の塩を含む。この塩は好ましくはＮａＣ１である。樹脂をこの緩衝液ですすぐと、最初の粗製試料に含まれるほとんどのタンパク質の脱着および溶出が起こる。

陽イオン交換樹脂を緩衝液で洗浄した後、ｒｓＴ４タンパク質を含有する溶出画分は陰イオン交換樹脂に接触させ得る。好ましくは、そのような樹脂は２０ｍｅｑ／ｍｌゲルあるいはそれ以上で、大量精製に適する流速で流せる容量を有する。最も好ましくは、使用されるゲルはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ”（Ｐｈａｒ＋ａａｃｉａ　ＬＫＢ）であり、これはジエチル（２−ヒドロキシ−プロピル）アミノエチル基の陽イオンおよび最大直線流速４００ｃｎ＋／時間を使用する。陽イオン交換工程からの溶出物のｐＨは約８．５であるため、塩基性のｐｉ（すなわち８．５より高いｐＩ）を有するタンパク質以外の全てのタンパク質は負に荷電し、樹脂に吸着される。通過画分はｒｓＴ４を含む、８．５より高いｐｉを有するタンパク質を含有する。この工程の結果、純度９０％のｒｓＴ４が約７０％の収量で得られる。

この工程は、リジン、アルギニンおよびヒスタミンのような塩基性アミノ酸残基を多数有するｒｓＴ４のようなタンパク質に特に適している。例えば、図２に示されるｒｓＴ４の配列は、３８個のりジン残基を含み、これは、この分子のｐｌを非常に希な塩基性にしている。この理由から、陰イオン交換工程での高いｐＨの使用は、ｒ　ｓＴ４と類似のタンパク質とを、低リジン含有であって、その結果的７．５の標準に非常に近いｐＨ値を有する多数の夾雑タンパク質から、うまく分離する。陰イオン交換工程の通過画分を採取した後、残っている主要夾雑物は同様に多数の塩基性残基を有していて、その結果塩基性のｐｉを有するタンパク質（あるいは蛋白質断片）である。ｒ　ｓＴ４の場合、溶液中に残っている主要な夾雑物は、補体因子ＢのフラグメントＢｂである（図３参照）。

精製の次の工程のために、陰イオン交換工程からの溶出画分に酸を加えて、ｐＨ８，５から約７．５に調整する。Ｉ）Ｈを下げるためにはどのような酸も用いられ得るが、この方法で用いられる酸は、好ましくはＨＣＩである。塩（ＮａＣ１）’ｔａ度もまた上げられ、好ましくは０．１５Ｍにする。次に、調製物を金属陽イオンが結合している金属キレート樹脂と直接接触させる。キレート剤と結合させることの可能な全ての樹脂は、金属陽イオンを含むマトリックスを形成するのに使用され得る。好ましい「マトリックス樹脂」はＣｈｅｌａｔｉｎｇ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ”　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。これはイミノニ酢酸（ＩＤＡ）に結合されたアガロースを基本とする樹脂で、二側歯状キレー゛ターとして作用するジカルボキン酸基を有する。イミノニ酢酸のように、接触する溶液に不活性で二側歯状キレーター分子の基質として作用する能力のある、他の樹脂もまた適当である。例には、デキストラン、架橋アクリルアミド、球状セルロースなどが含まれる。図４の図説のように、２価の金属イオンをキレート化あるいは固定するために、樹脂を該イオンと接触させる。

２価の金属イオン（図４のＭｅ”）はアルカリ土類金属、および原子番号の範囲が３０までの遷移金属の１列目から選択される。しかし、それらに限定されるわけではない。好ましくは、２価の金属イオンはニッケル（１１）、亜鉛（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）および銅（ＩＩ）を含む群から選択される。本実施態様のアガロース−ＩＤＡ樹脂に用いられる好ましい金属は、ＴＤＡおよびｒｓＴ４との強い結合定数を有することがらＣｕ２°である。陰イオン交換工程の通過画分がこのＩＭＡＣ樹脂に接触すると、タンパク質上に露呈しているヒスチジン残基は、固定されている金属に結合する。ｒｓＴ４およびフラグメントＢｂは、両者ともヒスチジン残基を有していて、それで樹′脂に結合する。しかし、ｒｓＴ４タンパク質は４個のヒスチジン残基しか有していない、一方、その主要夾雑物である補体因子ＢのフラグメントＢｂは１３個のヒスチジン残基（図２と図３を比較）を有している。

前述よりわかるように、タンパク質のヒスチジン残基の数は、タンパク質と樹脂との間の結合の強さの主要な指標である。しかし、タンパク質−樹脂間の結合の強さは、樹脂にヒスチジン残基が接触可能であること、および複数のヒスチジン残基が近接していることに依る。従って、タンパク質の３次構造が知られていない場合は、タンパク質−樹脂間の結合の強さ、およびタンパク質調製物の純度を上げるのに本発明が適しているかを評価するためのい（らかの実験作業が必要である。

樹脂からｒｓＴ４を選択的に溶出するために、銅に対するタンパク質の親和性の強さに基づいて、金属との結合においてタンパク質と競合する緩衝液を選ばねばならない。金属への親和性かタンパク質のそれより強い緩衝液は、緩衝液が全てのヒスチジン−Ｃｕ２＋間の結合を壊して結合している全てのタンパク質を同時に脱着すると考えられるため、選択的脱着には有効でないと考えられる。トリス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアンモニウム勺のような弱いリガンドは脱着を起こさないと考えられる。なぜならば、タンパク質のヒスチジン残基の金属に対する親和性は、トリス分子の親和性より非常に強いからである。それはたぶん、一部には、トリスの窒素の単独電子対に較べて非常に効果的にヒスチジンのイミダゾール環か電子を供与すること、およびタンパク質が複数箇所で樹脂に結合することに依る。

しかし、驚くことに、Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩを高濃度で、すなわち０３Ｍで使用し続けると、適当な飽和が起こり、ｒｓＴ４のヒスチジン−Ｃｕ２＋間の結合と競合してｒｓＴ４の樹脂からの脱着を起こす。しかし、夾雑物は樹脂に吸着されたまま残る。アンモニアのような池の弱いリガンドもまた、この工程で脱着を起こすのに有効である。異なる弱いリガンドを溶出液として使用するとそのために緩衝液系をアンモニアに交換しなくてはならないため工程の効率が低下する。

この精製工程は、最後の主要夾雑物をｒｓＴ４から除き、そしてその結果、純度９４％を越えるｒｓＴ４が６０％を越える収量で回収固定化Ｃｕ２“樹脂からのｒｓＴ４を含有する溶出物は、硫安沈澱により濃縮され得る；そして、さらに好ましい精製工程として、ｒｓＴ４含有沈澱物を好ましくはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、その溶液を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５１００　ＨＲ”（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにかけて、分子量のサイズに基づいて分離する。５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５１００ＨＲＴＶ＋樹脂が好ましい、分子量が４００００の範囲（この場合ではｒｓＴＡ用）の分子を分離する全てのサイズ排除樹脂がこの工程で使用され得る。他の溶液あるいは物質もまた、沈澱を再溶解するのに、あるいはこのサイズ排除クロマトグラフィーの溶出用緩衝液として用いられ得る；そしてそのような別の溶液あるいは物質は通常、望ましい最終調合、およびタンパク質がどのように調製されるのか、すなわち貯蔵されるのか、あるいはそのまま患者に投与されるのか、または他のことに最終的に使用されるのかに注目して選択され得る。そのような他の物質の１つは、グリシン（例えば約０．５％Ｖ／Ｖ）である。

他の様式では、精製されたタンパク質はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）のみに、あるいは、例えば５．０％Ｗ／Ｖのマンニトールを含有するリン酸緩衝液に再溶解され得る。

純粋で安定な上述のようにして得られるｒｓＴ４調製物は、適当な投与用の強さに希釈され、免疫不全および免疫障害の患者の処置に直接使用され得る。

本発明の方法は、固定化金属イオンキレート樹脂に結合させるのに十分なヒスチジンあるいはンスティンのような金属結合性残基を有する全てのタンパク質の精製に使用され得る。

そのようなタンパク質は、表面のヒスチジンおよびシスティン残基の組成あるいは分布が、分離すべきタンパク質と異なる類似する電荷およびサイズを有する夾雑タンパク質あるいはタンパク質断片から分離するために、トリスのような弱い競合的リガンドを用いて選択的に樹脂から脱着され得る。

ｒｓＴ４タンパク質精製の以下の実施例を、本発明の方法を例示することにより述べるが、いがなる点でも、出願人の発明教示の範囲を限定しない。

支宣五支五Ａ−上イオン　クロマトグラフィーによる組み　え可溶性Ｔ４の部　製我々は先ず、ｒｓＴ４をフードする遺伝子を有する細胞（ＣＨＯクローン６、Ｂｉｏｇｅｎ　Ｉｎｃ、、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡにより提供された）をバイオリアクター中で、コラーゲンピーズの上で懸濁、インキュベートすることにより、４００Ｌの試料を得た。ｒｓＴ４は可溶性タンパク質として細胞外の液中に分泌される。次に我々はバイオリアクターから培養液を除き、原料の細胞を取り除くために０．２ミクロンの限外濾過にかけた。次に、我々はこの試料を同量の水で希釈し、１％の酢酸を加えてｐＨ５，５に調整した。そして、この溶液を、陽イオン交換樹脂Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅを含む６．５ｃｉＩ長の４．ＯＬのカラムに、１４０ｍｇタンパク質／ｍｌゲルの割合でがけた。７．５カラム容量ノｐＨ８，５の０．０１５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液で洗浄した。次に１．７カラム容量のＯ，ＬＭ　ＮａＣ１を含有するｐＨ８，５の０．０１５Ｍ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ緩衝液で、カラムを洗浄して吸着しているタンパク質を溶出した。この工程は約６０％の純度のｒｓＴ４タンパク質を生産した。

我々は次に、１．Ｌ容量のＴｒｉｓ−ＨＣＩで希釈し、ｐＨを８，５に調整した陽イオン交換カラムからのｒｓＴ４を含有する溶出画分を、陰イオン交換樹脂のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　ＦＩＯＷ”を含む２．５Ｌのカラムに、ｌｏｍｇタンパク質／ｍｌゲルの割合で直接かけた。我々はカラムを通過した画分を集めた後、次の使用のために、樹脂を再生した。通過画分は９０％の純度レベルで約７０％の収量のｒｓＴ４を供給した。

固　金　イオンカラムの−１最初に我々は１カラム容量のＣｈｅｌａｔｉｎｇ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ” ゲルを数倍のカラム容量の水で洗浄した。次に洗浄したゲルを４容量の０．０５Ｍ　ＣＬＩＣＩ２・２Ｈ２０に最低３０分間懸濁した。次に再度ゲルを数容量の水で洗浄して、作用しなかったＣｕ２＋を取り除いた。

最後に、数容量のＯ，１５Ｍ　ＮａＣｌを含有する０、０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ緩衝１ｆｆｌ（ｐＨ７，５）で洗浄することにより、ゲルを平衡化した。

固＝イ金属アフィニティークロマトグラフィーによるｒｓＴ４のさらなる精製陰イオン交換クロマトグラフィ一工程の通過画分をプールした後、ＨＣＩ　（１，０Ｍ）を加えて試料のｐＨを７．５に調整し、ＮａＣ１を加えて塩濃度を０．１５Ｍに上げた。次に、通過画分のプールを胴固定化樹脂を含む２．５Ｌのカラムにかけた。試料は４℃で、１０ｍｇタンパク質／ｍｌゲルの割合でかけられた。流速は６力ラム容Ｉｔ／時間であった。

次に試料をかけたカラムにタンパク質を結合させ、結合しない夾雑物を通過させるために、数容量のＯ，１５ＭのＮａＣ１を含有する０、０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　− ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄した。カラムからの流出液をＵＶ分光光度計に通し、２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに下がるまで、０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含有する０、２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５＞で洗浄することにより、ｒｓＴ４をカラムから溶出した。

ヒスチジン残基が多く、そのため固定化銅に対する親和性がより強いｒｓＴ４の夾雑物Ｂｂは吸着したまま残る。

この方法は、純度約９５％の安定したｒｓＴ４を供給した。

サイズ１７、クロマトグラフィーによるｒ　ｓＴ４の　終　１１ＭＡＣカラムのｒｓＴ４を含有する画分のプールに硫安（４７２ｇ／Ｌ）を加えた。得られたｒｓＴ４を含有する沈澱物を遠心（１１００００ｒｐ。

４°Ｃ１１時間）で集め、沈澱物をｐＨ７，０の０．５％（ｖ／ｖ）のグリシンにｌｏｎｇ／ｍｌとなるように耳溶解した。そうして得た溶液を２ＳＬの５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５１００　ＨＲ”ゲルカラムに、４℃、流速８３１１／分でかけた。２８０ｎｍにおける吸光度測定により検出されたｒｓＴ４のピークの中央部を集めてプールし、純度９８％のタンパク質を得た。

前分離工程の溶出用緩衝液もまた、この最終工程で調合に用いる緩衝液に交換した。

プールした画分をＹＭ　１００”限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ。

ＭＡ）で濾過することにより滅菌し、次に濾過物をＰＭ−１０”フィルター（Ａｍ　１ｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ）上で限外濾過することにより５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。この調製物を５％（Ｗ／Ｖ）マンニトールと調製して注射可能な組成物にした後、バイアル中で凍結乾燥した。

前述の濃縮およびサイズ排除工程では、グリシンを使用すると、見かけ上の分子量がやや小さくなり、カラムからの溶出を遅らせることを見い出した。ｒｓＴ４の再溶解および溶出用溶液をＰＢＳに換え、この現象を排除した。この理由のため、この実施態様によるｒｓＴ４精製の最終過程ではＰＢＳが好まれる。しかし、他のタンパク質の精製においてもグリシンの使用が同じ効果を有するとは考えていない。

Ｌ１匠−１次の点を除く概括的に実施例１の方法で、ｒｓＴ４試料を精製した。すなわち、ＩＭＡＣカラムに使用された緩衝液は（０，１５Ｍ　ＮａＣ１よりもむしろ）　０．３Ｍ　ＮａＣ１を含有し、溶出用緩衝液は０．３ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩであり、ざらに次ぎの工程として、カラムをＯ４４ＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ緩衝液で洗浄した。

この方法の結果、純度約９５％の安定したｒｓＴＡＸＩｉ製物を得た。

最後の濃縮およびサイズ排除工程のために沈澱させたｒｓＴ４をｐＨ７．　４のリン酸緩衝液（グリシンを含まない）にｌｏｎｇ／ｍｌとなるように溶解し、Ｓ１００ゲル力ラムにかけた。ゲル力ラムから集めたタンパク質は９８％の純度を有することがわかった。続いてタンパク質を滅菌し、実施例１のように注射可能な組成物に調合した。特に所望のタンパク質であるｒｓＴ４の分離を参照しながら本発明の方法を述べてきたが、この方法はヒスチジンおよび／あるいはシステインのような金属結合性アミノ酸を表面に有する多くの他のタンパク質にも適している。そのようなタンパク質には、例えば他の可溶性Ｔ４タンパク質、ヒト血１’ｌｆ　９　７　ハクｉｆ　（　例，ｔ　ハ、ＩｇＧ，ハブトグ口ビン、ヘモペキシン、Ｇｃ−グロブリン、ＣｌｑＳＣ３、Ｃ４）、ヒトセル口プラスミン、匣１ｉｃｈｏｓ　ｂｉｆｌｏｒｕｓ　（フジマメ）レクチン、亜鉛抑制性チロシン（Ｐ）ホスファターゼ、フェノラーゼ、カルポキンベブチダーゼイソエンザイム、ヒト銅一亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ、ヌクレオンドジホスファターゼ、白血球インターフェロン、線維芽細胞インターフェロン、免疫インターフェロン、ラクトフェリン、ヒト血漿α２−ＳＨ糖タンパク質、α２−マクログロブリン、α１一抗トリブシン、プラスミノーゲン活性化因子、消化管ポリベブチド、ペプシン、ヒトおよびウシ血清アルブミン、顆粒球およびライソザイムの顆粒タンパク質、非ヒストンタンパク質、ヒトフイブリノーゲン、ヒト血清トランスフェリン、ヒトリンホトキシン、カルモジュリン、プロテインＡ１　アビジン、ミオグロビン、ソマトメジン、ヒト成長ホルモン、トランスフォーミング成長因子、血小板由来成長因子、α−ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、カーディオディレティン（ｃａｒｄｉｏｄｉｌａｔｉｎ）、およびその他が含まれる。

さらに、この開示の特定の実施例では、カラムクマトグラフィーが記載されているが、バッチ法もまた使用され得た。本明細書に記載された方法はまた、膜結合タンパク質由来の他の可溶性タンパク質、すなわちタンパク質の細胞外部位をコードする遺伝子のクローニングあるいは他の技術により得られるタンパク質の精製に使用され得る。すべてのそのような精製は、添付の請求項に定められる本発明の意図する範囲内である。

ＦＩＧ．　ｆＭｅｔＡｓｎＡｒｇＧｌｙＶａｌＰｒｏＰｈｅＡｒｇＨｘｓＬｅｕＬａｕＬａｕＶａｌＬａｕＧｌｎＬｅｕＡｌａＬａｕＬｅｕＰｒｏ　２０ｘｌａＡ１ａＴｈｒＧｌｎＧｌｙＡｓｎＬｙｓＶａｌＶａｌＩａｕＧｌｙＬｙｓＬｙｓＧｌｙＡｓｐＴｈｒＶａｌＧｌｕＬａｕＴｈｒ　４０ＣｙｓＴｈｒＡｌａ！９ａｒＧｌｎＬｙｓＬｙｓＳａｒ工１ｅＧ１ｎＰｈｅＨｉｓＴｒｐＬｙｓＡｓｎ５ａｒＡｓｎＧｌｎ工１ｅＬｙｓ　６O 工１ａＬｅｕＧｌｙＡｓｎＧｌｎＧｌｙＳａｒＰｈ＠ＬａｕＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏ５ａｒＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｒｇＡｌａ　ｇｏ入５ｐＳ　ｅｒＡｒｑＡｒｑＳ＠ｒＬａｕＴｒｐＡＳｐＧｌｎＧｌ’ｆＡＳｎＰｈ＠ＰｒロＬａｕ工１ａｌｌａＬｙｓＡｓｎＬｅｕＬｙｓ　P００工ｌｅＧｌｕＡｓｐＳｅｒＡｓｐＴｈｒＴｙｒ工１ａＣｙｓＧｌｕＶａｌＧｌｕＡｓｐＧｌｎＬｙｓＧｌｕＧ１ｕＶａｌＧｌｎＬａｕ’　１Q０ＬｅｕＶａｌＰｈｅＧｌｙＬｅｕＴｈｒ入１ａＡｓｎ５ａｒＡｓｐＴｈｒＨｉｓ！，ｅｕＬａｕＧｌｎＧｌｙＧｌｎＳａｒＬｅｕＴｈｒ　ｘSｏＬｅｕＴｈｒＬｅｕＧｌｕＳｅｒＰｒｏＰｒｏＧｌｙＳｅｒＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌＧｌｎＣｙｓＡｒｇＳｅｒＰｒｏＡｒｇＧｌｙ　１６O ＬｙｓＡｓｎ工１ｅＧｌｎＧｌｙＧｌｙＬｙｓＴｈｒＬａｕ５ｅｒＶａｌＳａｒＧｌｎＬａｕＧｌｕＬａｕＧｌｎＡｓｐＳｅｒＧｌｙ　１８O ＴｈｒＴｒｐＴｈｒＣｙｓＴｈｒＶａｌＬａｕＧｌｎＡｓｎＧｌｎＬｙｓＬｙｓＶａｌＧｌｕＰｈｅＬｙｓｌｌｅＡｓｐｘｌｅＶａｌ　２０O ＶａｌＬｅｕＡｌａＰｈａＧｌｎＬｙｓＡｌａＳａｒＳｅｒ工１ａＶａｌＴｙｒＬｙｓＬｙｓＧｌｕＧｌｙＧ１ｕ（；ｌｎＶａｌｃｌｕ　２Q０Ｐｈ＊ＳａｒＰｈａＰｒｏＬ４ｕＡｌａＰｈａＴｈｒＶａ１Ｇｌｕｌ，ｙｓＬａｕＴｈｒＧｌｙＳｓｒＧｌｙＧｌｕＬｅｕＴｒｐＴｒｐ　２S０（；ｌｎＡｌａＧｌｕＡｒｇＡｌａ５ｅｒ５ａｒＳａｒＬｙｓＳｅｒＴｒｐ工１ｅＴｈｒＰ１″ｑＡｓｐＬａｕＬｙｓＡｓｎＬｙｓＧｌｕ　Q６ＯＶ　ａ　ｌ　Ｓ　ｔｒＶａ　ｌ　Ｌｙ　ｓＡ　ｒｑ　Ｖａ　ｌＴｈ　ｒＧ　ｌ　ｎＡｓｐｐｒＯ　ＬｙＳ　Ｌａｕ（；　ｌ　ｎＭａセＧｌｙkｙｓＬｙｓＬａｕＰｒｏＬｅｕ　２８０ＨｉｓＬａｕＴｈｒ　ＬｅｕＰｒｏＧｌｎＡｌａＬａｕＰｒｏＧｌｎＴｙｒＡｌａＧ１ｙＳｓｒＧｌｙＡｓｎＬｅｕＴｈ！：ＬｅｕＡｌａ　RＯｏＬａｕＧｌｕＡｌａＬｙｓＴｈｒＧｌｙＬｙｓＬａｕＨｉｓＧｌｎＧｌｕＶａｌ入ｓｎＬａｕＶａｌＶａｌＭｅｔＡｒｇＡｌａＴｈｒ　コ２■ ＧｌｎＬｅｕＧｌｎＬｙｓＡｓｎＬａｕＴｈｒＣｙｓＧｌｕＶａｌＴｒｐＧｌｙＰｒｏＴｈｒＳｅｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＭａｔＬａｕ　コ４O ＳｅｒＬａｕＬｙｓＬａｕＧｌｕＡｓｎＬｙｓＧｌｕＡｌａＬｙｓＶａｌＳｅｒＬｙｓＡｒｇＧｌｕＬｙｓＡｌａＶａｌＴｒｐＶａ１　コ６O ＬｅｕＡｇｎＰｒｏＧｌｕＡｌａＧｌｙＭｅｔＴｒｐＧｌｎｃｙＳＬｅｕＬｅｕＳａｒＡｓｐＳｅｒＧ１ｙＧｌｎＶａｌＬａｕＬｅｕ　コ８O ＣｌｕＳｅｒＡｓｎ工１ｅＬｙｓｖａｌＬｅｕＰ１：ロＴｈｒＴｒｐｓｅ　ｒＴｈｒＰｒｏＶａ　１ｃｉｎＰｒｏＭｅｔ入１ａＬｅｕ工１ｅ@４００ＶａｌＬａｕＧｌｙＧｌｙＶａｌλｌａＧｌｙＬＡｕＬａｕＬｅｕＰｈａ工１ｅＣｌｙＬａｕＧｌｙ工１ｅＰｈｅＰｈｅｃｙｓＶａｌ　４２O ＡｒｇＣｙｓＡｒｑＨｉｓＡｒｇＡｒｇＡｒｇＧ１ｎＡｌａ（：ｌｕＡｒｇＭａｔｓａｒＧｌｎＩｌｅｌ，ｙｓＡｒｇＬａｕＬｅｕＳｅｒ　S４０ＧｌｕＬｙｓ　ＬｙｓＴｈｒＣｙｓＧ　１ｎＣｙｓ　ＰｒｏＨ　ｉｓＡｒｇＰｈｅＧｌ　ｎＬｙｓＴｈｒｃｙｓｓ　ｅ　ｒＰｒｏ工ｌａ　４T８ＦＩＧ．２ＡｓｎＬｙｓＶａｌＶａｌＬｅｕＧｌｙＬｙｓＬｙｓ（；ｌｙＡｇｐＴｈｒＶａｌ（；ｌｕＬｅｕＴｈｒＣｙｓＴｈｒＡｌａＳａｒＧｌｎ　Q０ＬｙｓＬｙｓｓｅｒ工１ｅＧＬｎＰｈ＠ＨｉｓＴｒｐＬｙｓ入ｓｎ５ａｒＭｎＧｌｎ工１＠Ｌｙｓ工１ａＩａｕＧｌｙＡｓｎＧｌｎ　４０ＧｌｙＳａｒＰｈａＬａｕＴｈｒＬｙｓ（；ｌｙＰｒｏｓｅｒＬｙｓＬａｕＡｓ＋ｚ入ｓｐ＾ｒｇＡｌａ入ｓｐｓａｒ人ｒｇＡｒｇｓｅｒ　U０ＬａｕＴ　ｒｐＡＳｐＧｌｎＧ１ｙＡＳｎＰｈ＠ＰｒＯ　ＬＣｕ工ｌｍ工１＠Ｌｙｓ入ｓｎＬａｕＬｙｓ工１＊ＧｌｕＡｓｐ５＊ｒＡｓｐ　I１０ＴｈｒＴｙｒ工１ａＣｙｓＣｌｕＶａｌＧｌｕＡｓｐＧｌｎＬｙｓＧｌｕＧｌｕＶａｌＧｌｎＬａｕＬａｕＶａｌＰｈａＧｌｙＬａｕ　１ｏ■ ＴｈｒＡｌａＡｓｎＳａｒＡｓｐＴｈｒｌ｛ｉｓＬａｕＬａｕＧｌｎＧ１ｙＧｌｎ５ｅｒＬａｕＴｈｒＬａｕＴｈｒＬａｕＧｌｕ５ｅｒ　１Q０ＰｒｏＰｒｏＧｌｙ５ｅｒＳａｒＰｒｏ５ａｒＶａｌＧｌｎＣｙｓＡｒｇＳａｒＰｒロＡｒｇＧｌｙＬｙｓ入ｓｎ工ｌａＧｌｎＧｌｙ　１４O （：ｌ　ｙＬｙｓ？ｈｒＬａｕＳａｒＶａｌＳａｒＧｌ　ｎＬａｕＧ　１ｕＬａｕＧｌｎＡｓｐＳａｒＣ１ｙＴｈｒＴｒｐＴｈ　ｒＣｙｓτ■秩@１６０ＶａｌＬａｕＧｌｎＡｓｎＧｌｎＬｙｓＬｙｓＶａｌ（；ｌｕＰｈ＊Ｌｙｓ工１ａＡｓｐＺｌｅＶａｌＶａｌＬａｕＡｌａＰｈａＧｌｎ　１W０ＬｙｓＡｌａＳｅｒＳａｒ工１ｅＶａｌＴｙｒＬｙｓＬｙｓＧｌｕＧｌｙＧｌｕＧｌｎＶａｌＧｌｕＰｈｅＳａｒＰｈｅＰｒｏＬｅｕ　２０O Ａ工ａＰｈａＴｈｒＶａｌＧｌｎｔ，ｙｓＬａｕＴｈｒＧｌｙＳａｒＧｌｙＧｌｕＬａｕＴｒｐＴｒｐＧＬｎＡｌａＧｌｕＡｒｇＡｌａ　２Q０ＳａｒＳ＠ｒＳａｒＬｙｓＳａ？Ｉ’ｒｐ工１ｅＴｈｒＰｈａＡｓｐＬａｕＬｙｓ入ｓｎＬｙｓＧｌｕＶａｌＳａｒＶａｌＬｙｉＡｒｇ　２S０ＶａｌＴｈｒＧｌｎＡｓｐＰｒｏＬｙｓＬａｕＧｌｎＭａｔ（：ｌｙＬｙｓＬｙｓＬａｕＰｒｏｒ．ａｕＨｉｓＬｅｕ’ｒｈｒＬａｕＰｒｏ@２６０Ｇｉｎ入１ａＬａｕＰｒｏＧｌｎＴｙｒ入１ａＧｌｙｓａｒＧｌｙＡｓｎＬａｕ τｈｒＬａｕＡｌａＬ＊ｕＧｌｕＡｌａＬｙｓＴｈｒ　２８O ＧｌｙＬｙｓＬｅｕＨｉｓＧｌｎＧｌｕＶａｌ入ｓｎＬａｕＶａｌＶａｌＭｅｔ．入ｒｇＡｌａＴｈｒＧｌｎＬａｕＧｌｎＬｙｓＡｓｎ　３O０ＬｅｕＴｈｒＣｙｓＧｌｕＶａｌＴｒｐＧｌｙＰｒｏＴｈｒｓｅｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＭｅセＬｅｕＳｅｒＬａｕＬｙｓＬａｕＧｌｕ　コ２■ ＡｓｎＬｙｓＧｌｕＡｌａＬｙｓＶａＬＳａｒＬｙｓＡｒｇＧｌｕＬｙｓＡｌａＶａｌＴｒｐＶａｌＬａｕＡｓｎＰｒｏＧｌｕ入１ａ　コ４O Ｇｌ　ｙＭａｔＴ！：ｐＧｌｎＣ　ｙＳＬａｕＬａｕＳ＠ｒＡＳｐｓ４ａｒＧｌ ’／ＧｌｎＶａｌＬａｕＬｅｕＧｌｕＳｅ！：＾ｓｎ工ｌｅkｙｓ　コ６ｏＶａｌＬｅｕＰｒｏＴｈｒＴｒｐｓｅｒＴｈｒＰｒｏＶａＩＧｌｎＰｒｏＭａｔＡｌａＬｅｕ工１ｅ　コ７５ＦＩＧ．　３Ｌｙｓ工１ｅＶａｌＸＡｕＡｓｐＰｒｏＳａｒＧｌｙＳａｒＭｅｔＡｓｎ工１ａＴｙｒＬｅｕＶａｌＬａｕＡｓｐＧｌｙＳａｒＡｓｐ　２０Ｓａｒ工１ａＧｌｙＡｌａＳａｒＡｇｎＰｈａＴｈｒＧｌｙＡｌａＬｙｓＬｙｓＣｙｓＬｅｕＶａｌ入ｓｎＬｅｕＴｈｒＧｌｕＬｙｓ　４０ＶａＩＡ１ａｓｓｒＴｙｒＧｌｙＶａｌＬｙｓＰｒｏＡｒｇＴｙｒＧｌｙＬａｕＶａｌＴｈｒＴｙｒ入１ａＴｈｒＴｙｒＰｒｏＬｙｓ　６０工１ａＴｒｐＶａｌＬｙｓＶａｌ！５ｇｒＧ１ｕＡｌａＡｓｐＳｅｒ５ｅｒＡｓｎＡＬａ入ｓｐＴｒｐＶａｌＴｈｒＬｙｓＧｌｎＬａｕ　８ O 人ｓｎＧＬｕＸ／Ｌ＊八ｓｎＴｙｒｃＬｕ入ｓｐＨｉｓＬｙｓＬａｕＬｙｓＳｅｒＧｌｙτｈｒ入ｓｎτｈｒＬｙｓＬｙｓ入１ａＬａｕ　１O０ＧｌｎＡｌａＶａｌ’！’ｙｒＳｅｒＭａｔＭａｔＳａｒＴｒｐＰｒｏＡｓｐＡｓｐｖａｌＰｒｏＰｒｏ（；１ｕＧｌｙＴｒｐＡｓｎＡｒｇ@１２０ τｈｒ入ｒｑＨｉｓＶａｌ工１ｅＩＬ＠ＬａｕＭａセＴｈｒＡｓｐＧｌｙＬａｕＨｉｓＡｓｎＭｅｔ（；ｌｙＧｌｙＡｓｐＰｒｏＺｌ＠　１S０ＴｈｒＶａ１　工１＠ＡｓｐＧｌｕＸｌａＡｒｑ　ＡｓｐＬａｕＬａｕ？’ｙｒ工１ｅＧｌｙＬｙｓＡｓｐＡｒｇＬｙｓＡｓｎＰｒｏＡｒｇ@１６０ｃｌｕＡｓｐＴｙｒＩ４ｕＡｓｐＶａｌＴｙｒＶａＩＰｈｅＧｌｙＶａｌＧｌｙＰｒｏＬａｕＶａｌ入ｓｎＧｌｎＶａｌ入ｓｎ工ｌｅ　１８O 人ｓｎ入１ａＬａｕＡｌａＳｅｒＬｙｓＬｙｓＡｓｐＡｓｎＧｌｕＧｌｎＨｉｓＶａｌＰｈｅＬｙｓＶａｌＬｙｓＡｓｐＭａｔＧｌｕ　２０O ＡｓｎＬａｕＧｌｕＡｓｐＶａｌＰｈａＴｙｒＧｌｎＭａｔ工１ｅＡｓｐＧ１ｕＳａｒＣｌｎＳａｒＬａｕＳａｒＬａｕＣｙｓＧ１ｙ　２２O ＭｅｔＶａｌＴｒｐＧｌｕＨｉｓＡｒｇＬｙｓＧｌｙＴｈｒＡｓｐＴｙｒＨｉｓＬｙｓＧｌｎＰｒｏＴｒｐＧｌｎＡｌａＬｙｓｒｌｅ　２４O ＳｓｒＶａｌ工１ａＡｒｇＰｒｏＳａｒＬｙｓＧｌｙＨｉｓＧｌｕ５ａｒＣｙｓＭａセＧｌｙＡｌａＶａｌＶａｌＳａｒＧｌｕＴｙｒ　２６O ＰｈｅＶａｌＬａｕＴｈｒＡｌａ入１ａＨｉｓＣｙｓＰｈａＴｈｒＶａｌＡｓｐＡｓｐＬｙｓＧｌｕＨｉｓ５＠ｒ工Ｌ＊ＬｙｓＶａｌ　２８O ＳｅｒＶａＩＧｌｙＧｌｙＧｌｕＬｙｓＡｒｇＡｓｐＬａｕＣｌｕ工１ａｃｌｕｖａｌＶａｌＬｅｕＰｈａＨｉｓＰｒｏ＾ｓｎ’ｆ’ｙｒ　R００人ｓｎ工１ａＡｓｎＧｌｙＬｙｓＬｙｓＧｌｕ＾ＬａＣｌｙＩｌａＰｒｏＧｌｕＰｈｅＴｙｒＡｓｐＴｙｒＡｓｐＶａｌＡｌａＴＡｕ　コ２O 工１＠ＬＩＹＳ　ＬｅｕＬｙＳＡｇｎＬｙＳ　ｘＡｕＬ　ＹＳＴＹｒＧ１ｙＧｌｎＴｈｒ　工１ａＡｒｑＰｒＯ　工１ｅＣ　ｙＳＬａｕＰｒpＣＹＳ　コ４０ＴｈｒＧ１ｕＧｌｙＴｈｒＴｈｒ入ｒｑ入ＬａＬａｕＡｒｑＬｅｕＰｒｏＰｒｏＴｈｒＴｈｒＴｈｒＣｙｓＣｌｎＧ１ｎＧｌｎＬｙｓ　３６O ＧｌｕＧｌｕＬｅｕＬａｕＰｒｏＡｌａｃｓｌｎｋｓｐ工１ａＬｙｓＡｌａＬ４ｕＰｈｅＶａｌＳａｒＧｌｕＧ１ｕＧｌｕＬｙｓ　ＬＹＳ　R８０ＬｅｕＴｈｒＡｒｇＬｙｓＧｌｕＶａｌＴｙｒ工１ａＬｙｓＡｓｎＧｌｙＡｓｐＬｙｓＬｙｓＧ１ｙＳｅｒＣｙｓＣｌｕＡｒｇｘｓｐ　４０O ＡｌａＧｌｎＴｙｒＡｌａＰｒｏＧｌｙＴｙｒＡｓｐＬｙｓＶａｌＬｙｓＡｓｐ工１ａＳａｒＧ１ｕＶａｌＶａｌＴｈｒＰｒｏＡｒｇ　４２O ＰｈｅＬａｕＣｙｓＴｈｒＧｌｙＧＩ　ＹＶａｌＳｅｒＰｒｏＴｙｒＡｌａＡｓｐＰｒｏ＾ｓｎＴｈｒＣｙｓＡｒｇＧ１ｙＡｓｐ５ａｒ　４S０ＧｌｙＧｌｙＰｒｏＬｅｕ工１ｅＶａｌＨｉｓＬｙｓＡｒｇＳａｒＡｒｑＰｈｅ工１ｅＧｌｎＶａｌＧｌｙＶａｌｍｌａＳｅｒＴｒｐ　４６O ＧｌｙＶａｌＶａｌＡｓｐＶａｌＣｙｓＬｙｓＡｓｎＧｌｎＬｙｓＡｒｇＧｌｎＬｙｓＧｌｎＶａｌＰｒｏＡｌａＨｉｓＡｌａＡｒｑ　４８O 八ｓｐＰｈｅＨｉｓ工１＠ｋ！！ｎＬＡｕＰｈ＠ＧｌｎＶａｌＬｅｕＰ１：ｏＴｒｐＬＪｕＬＹＳＧｌｕＬｙ！！ＬａｕＧｌｎ入ＳｐＧ１ｕ@５００人ｓｐＬａｕＧｌｙＰｈａＬａｕ　５０５国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．表面に金属結合性アミノ酸残基を有するタンパク質を精製する方法であって、（ａ）固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂に、タンパク質を含有する溶液を接触させる工程であり、該樹脂が、塩および２価の金属イオンに対する弱いリガンドを含有する結合用緩衝液中で、該金属イオンに結合した二鋸歯状キレーターに連結するマトリックス樹脂を含有する、工程；および、（ｂ）塩および該結合用緩衝液中での濃度より、より高い濃度の該弱いリガンドを含有する緩衝液を用いて、選択的に該タンパク質を溶出する工程；を包含する方法。
２．工程（ａ）の前に、前記タンパク質を含有する溶液が、透析、密度勾配遠心、分子篩クロマトグラフィー、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、硫安沈澱法、あるいはそれらの組み合わせにより部分的に精製される、請求項１に記載の方法。
３．前記弱いリガンドがＴｒｉｓである、請求項１に記載の方法。
４．前記結合用緩衝液が０．０１−０．１ＭＴｒｉｓ・ＨＣＩ緩衝液である、請求項３に記載の方法。
５．前記溶出用緩衝液が０．１−０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ緩衝液である、請求項３に記載の方法。
６．前記結合用緩衝液が約０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩであり、そして前記溶出用緩衝液が約０．３Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ緩衝液である、請求項３に記載の方法。
７．前記結合用緩衝液が約０．１５Ｍ　ＮａＣＩを含有し、そして前記溶出用緩衝液もまた０．１５Ｍ　ＮａＣＩを含有する、請求項６に記載の方法。
８．前記タンパク質が、図２に示されるアミノ酸配列で規定される一次構造を有する組み換え可溶性Ｔ４である、請求項１に記載の方法。
９．前記２価の金属イオンがＣｕ２＋である、請求項１に記載の方法。
１０．二鋸歯状キレーターがイミノ二酢酸（ＩＤＡ）である、請求項９に記載の方法。
１１．Ｃｕ２＋イオンがＩＤＡでキレート化され、そして約ｐＨ５あるいはそれ以上でアガロース樹脂に固定化される、請求項１０に記載の方法。
１２．１ＭＡＣ樹脂を、０．１５Ｍ　ＮａＣＩ含有のｐＨ７．５の０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ緩衝液で洗浄後、前記タンパク質を含有する試料を該樹脂に接触させる、請求項１に記載の方法。
１３．ＩＭＡＣカラムに吸着した前記タンパク質を約０．３Ｍの濃度のＴｒｉｓ・ＨＣＩ緩衝液で選択的に溶出する、請求項１に記載の方法。
１４．金属結合性残基が数少ないタンパク質を先にカラムから溶出し、その結果単離する、請求項１３に記載の方法。
１５．表面に金属結合性アミノ酸を有する前記タンパク質が、可溶性Ｔ４、ＩｇＧ、ハプトグロビン、ヘモベキシン、Ｇｃ−グロブリン、Ｃｌｑ、Ｃ３、Ｃ４、ヒトセルロプラスミン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｕｓ（フジマメ）レクチン、亜鉛抑制性チロシン（Ｐ）ホスファターゼ、フェノラーゼ、カルボキシペプチダーゼイソエンザイム、ヒト銅−亜鉛スーバーオキシドジスムターゼ、ヌクレオシドジホスファターゼ、白血球インターフェロン、線維芽細胞インターフェロン、免疫インターフェロン、ラクトフェリン、ヒト血漿α２−ＳＨ糖タンパク質、 α２−マクログロブリン、α１−抗トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、消化管ポリペプチド、ペプシン、ヒトおよびウシ血清アルブミン、顆粒球およびライソザイムの顆粒タンパク質、非ヒストンタンパク質、ヒトフィブリノーゲン、ヒト血清トランスフェリン、ヒトリンホトキシン、カルモジュリン、プロテインＡ、アビジン、ミオグロビン、ソマトメジン、ヒト成長ホルモン、トランスフォーミング成長因子、血小板由来成長因子、α−ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、およびカーディオディレティン（ｃａｒｄｉｏｄｉｌａｔｉｎ）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
１６．組み換え可溶性Ｔ４タンパク質（ｒｓＴ４）を精製する方法であって、（１）ｒｓＴ４を産生する原料の細胞を濾適して取り除いた、ｒｓＴ４を含む培養液を陽イオン交換樹脂に接触させる工程；（２）吸着したタンパク質をその総電荷に基づいて樹脂から溶出する工程；（３）該陽イオン交換樹脂からｒｓＴ４を含む溶出画分を陰イオン交換樹脂にかける工程；（４）工程（３）からのｒｓＴ４を含有する洗浄画分を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂の金属イオンに対する弱いリガンドを低濃度に含有する結合用緩衝液を用いて、該固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにかける工程；および（５）より高濃度の前記弱いリガンドを含有する緩衝液を溶出剤として用いて、該ｒｓＴ４を溶出する工程；を包含する方法。
１７．（６）工程（５）のｒｓＴ４を含有する溶出物を硫安沈澱法により濃縮する工程；および（７）工程（６）の該沈澱物を溶解し、そして該溶液をサイズ排除クロマトグラフィー樹脂にかける工程；をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
１８．最終工程（７）において、ｒｓＴ４含有沈澱物を処方用緩衝液で溶解し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーにかける、請求項１７に記載の方法。
１９．前記弱いリガンドがＴｒｉｓである、請求項１８に記載の方法。
２０．前記結合用緩衝液が０．０１−０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ緩衝液である、請求項１９に記載の方法。
２１．前記溶出用緩衝液が０．１−０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ緩衝液である、請求項２０に記載の方法。
２２．前記結合用緩衝液が約０．０２ＭのＴｒｉｓ・ＨＣＩであり、そして前記溶出用緩衝液が約０．３ＭのＴｒｉｓ・ＨＣＩ緩衝液である、請求項１９に記載の方法。
２３．前記結合用緩衝液が約０．１５Ｍ　ＮａＣＩを含有し、そして前記溶出用緩衝液もまた０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含有する、請求項２１に記載の方法。
２４．前記組み換え可溶性Ｔ４が図２に示されるアミノ酸配列で規定される一次構造を有する、請求項１８に記載の方法。
２５．前記２価の金属イオンがＣｕ２＋である、請求項１８に記載の方法。
２６．前記二鋸歯状キレーターがイミノ二酢酸（ＩＤＡ）である、請求項２５に記載の方法。
２７．前記Ｃｕ２＋イオンがＩＤＡにキレート化されてアガロース樹脂に固定化される、請求項２６に記載の方法。
２８．前記ＩＭＡＣ樹脂を、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ含有のｐＨ７．５の０．０２ＭのＴｒｉｓ・ＨＣＩで洗浄後、前記ｒｓＴ４を含有する試料をＩＭＡＣ樹脂に接触させる、請求項１８に記載の方法。
２９．ＩＭＡＣ樹脂に吸着している前記タンパク質を、約０．３Ｍの濃度のＴｒｉｓ・ＨＣＩで選択的に溶出する、請求項１８に記載の方法。
３０．請求項１９に記載の方法によって生産された、未変性の組換え可溶性Ｔ４タンパク質の安定で均一な調製物。
３１．９８％を選える純度の組み換え可溶性Ｔ４タンパク質を含有する、請求項３０に記載の方法によるｒｓＴ４の調製物。