JPH04505579A - 溶液からのウイルスの分離のための膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 溶液からのウィルスの分離のための膜 皮盃旦■ この発明は、水性蛋白質溶液等の溶液からウィルス粒子等の粒子を、効果的、選 択的且つ再現的に除去するための膜、方法及びシステムに関係する。一層特に、 この発明は、ウィルスを約３〜８のログ保持値（ｌｏｇｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｖ ａｌｕｅ　）で除去する（即ち、約９９．９〜９９．９９９９９９％の粒子を溶 液から除去する）ための方法又はシステムにおいて有用な特殊なミクロ構造を有 する複合不整膜に関係する。

１１ユＩ ウィルスは、全生物又は嗜乳類の細胞培養源から由来する蛋白質を含む非経口薬 品及びその他の溶液における潜在的夾雑物を代表する。現在、ウィルスを不活性 化するための幾つかの化学的及び物理的方法が存在する。これらの方法は、すべ てのウィルスに等しく一般的に用い得るものではな（、幾つかは蛋白質を消費し て実施される。例えば、熱低温殺菌を安定剤の添加により蛋白質の変性を最小化 することの出来る溶液において用いる。バイオテクノロジー産業において、下流 処理において幾つかの不活性化又は除去のステップを結合してウィルス除去能力 及び蛋白質回収を最大化するという戦略が採用されて来た。用いる操作は、一般 に、非経口薬品生成物を精製するために最適化された操作であり、それらのウィ ルス除去能力を確実にする。従って、ウィルス除去は正常の操作の副産物である 。最終的に、この方法の目的において、クロマトグラフィー、蒸留又は加熱等の ステップを加えて全ウィルスの除去を増大させることが出来る。この戦略は、ｌ ）これらの操作のウィルス除去はアッセイすることの出来ない推定上のウィルス には適用出来ない；及び２）この方法のウィルス除去は継続的に監視することが 必要であるという２つの欠点を有する。

限外濾過膜が、溶液中の蛋白質からウィルスを分離するために提供された。理想 的な膜は、ウィルスをその大きさに基づいて保持し且つより小さい蛋白質を通過 させる。実際、限外濾過膜は、バイオテクノロジー産業において、この目的のた めに用いられている。しかしながら、現在の非対称性限外濾過膜は、最適なウィ ルス−蛋白質分離を行なうための分解能及び再現性を欠く、典型的には、経済的 に有用なパーセンテージの蛋白質を透過させるのに十分に多孔性である非対称性 限外濾過膜が継続的監視及び再存効化を必要としない最適性能を得るためのコン シスチンシー及び高レベルのウィルス保持を欠く。

米国特許第４，８０８．３１５号は、ウィルスの蛋白質溶液からの除去に有効な 独自の細孔構造を有する中空繊維膜を記載している。その膜は、表面保持機構を 有する非対称に覆われた限外濾過膜ではない、むしろ、それは、ウィルス粒子を その構造内に保持する。それは、内側及び外側膜表面が０．０１〜１０ミクロン の面内平均細孔直径を有し、且つその多孔性膜壁が、中空繊維膜の環状断面の放 射方向に垂直な各面において測定される１０％より少なくない面内多孔性を有し 、その面内多孔性が内側及び外側膜表面の間で少なくとも１つの最小値を示すよ うな独自の多孔性構造によって特徴づけられる新規な多孔性中空繊維膜として記 載されている。

米国特許第４，８２４，５６８号は、多孔性支持体上の非対称に覆われた膜を形 成するための方法を開示している。その特許は、その膜がウィルスの蛋白質含有 溶液からの選択的除去に有用か否かは開示しておらず、又蛋白質含有溶液からウ ィルスを再現的且つ選択的に除去するために有用なミクロ構造を得るためには如 何なる改変が必要であるかも開示していない。

商業的に有用な蛋白質の９５％より多くを回収することが出来且つ大きさに基づ いてウィルス粒子の少なくとも約３　ｌｏｇのログ減少値（ｌｏｇ　ｒｅｄｕｃ ｔｉｏｎ　ｖａｌｕｅ　）を有することを確実にすることの出来る（保持がウィ ルス粒子の大きさの関数として単調に増加する）非対称性限外濾過膜システムは 、これらの今日市販されているものに重要な改良を与えるであろう０次いで、こ の膜及びその膜を利用するシステムを、確信を持って、高価な監視及び再有効化 を必要としない再現的且つ便利な任意の太きさの推定上のウィルスの除去に用い ることが出来るであろう。

更に、そのような膜は、電子産業等において溶液から小さい粒子を除去すること が望ましい他の応用に用いることが出来る。

１且立ヱ匠 本発明は、スキンを有する限外濾過分離特性、多孔性支持体及び多孔性中間域を 有する特定の非対称性複合膜構造がウィルスを蛋白質含有溶液から選択的に分離 するのに特に有用であるという発見に基づいている。中間域の厚みは、中間域が つぶれるか又は一様でなくなる部分の厚みより大きく、且つ典型的な限外濾過膜 のボイドが形成される部分のそれより小さい、この膜は約１０〜２１％ポリマー を含むポリマー溶液を微小孔膜上にて流延することにより形成する。この流延ポ リマー溶液を、次いで、被覆した膜を、ポリマー溶液の溶剤成分とは混和的であ るがポリマー溶液のポリマー成分の溶剤ではない液体に浸すことにより、多孔性 の限外濾過スキン及び多孔性中間域に変換する。この浸漬液及び温度の適当な選 択は、高いウィルス保持と高い蛋白質透過の組合せを得るために重要である。限 外濾過スキン及び中間域は、約５Ｘ１０”〜５Ｘ１０’ダルトンの分子量カット オフを与える小さい細孔により特徴づけられる。“カットオフ”という用語は、 ここでは、記述したカットオフ分子量以上の分子量を有する分子種の少なくとも ９０％の除去を意味する。中間域はスキンにおける切断を形成し液体を直接多孔 性物に伝達するするボイドを含まない。ポリマー溶液被覆における被覆濃度及び 被覆の厚みは、最終的乾燥中間域の厚い部分が多孔性であり且つスキンから膜支 持体に伸びるボイドを含まないように制御する。

この方法により製造され、通常限外濾過膜中に見出されるボイドを含まない中間 域を有する複合膜は、従来の膜流延技術により得られるものより高い選択性と再 現性を持って蛋白質含有溶液から濾過によってウィルスを選択的に分離する独自 の能力を有するということが見出された。

の　ｔｌ 図１は、本発明において用いる被覆ステップの説明である。

図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ及び２ｅは、この発明の適宜的分離システムの図解で ある。

図３は、中間多孔性域の厚みの関数としてのファイＸ１７４のログ減少値及びヒ ト血清アルブミンのシービング係数（ｓｉｅｖｉｎｇ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ 　）のグラフである。

図４は、この発明の膜Ａ及び市販の限外濾過膜についてのストークス半径の関数 としての様々な大きさの蛋白質の排除係数のグラフである。

図５は、粒子直径の２乗の関数としての粒子のログ減少値のグラフである。

図６は、実施例３において製造した膜の容積フラックス（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ 　ｆｌｕｘ　）の関数としてのファイｘ１７４のログ減少値を示す。

図７は、実施例３において製造した膜の濾過流速に対する再循環流速の比の関数 としてのファイＸ１７４のログ減少値を示す。

図８は、チャンネル縦横比の関数としてのファイＸ１７４のログ減少値を示す。

図９は、実施例ＩＩＩにおいて利用する限外濾過ユニットの分解組み立て図であ る。

図１０は、図７の限外濾過ユニット及び第１のスペーサーの上面図である。

図１１は、図７及び８の装置の長方形チャンネルの断面図である。

図１２は１本発明において利用する限外濾過中空繊維の断面図である。

図１３は、米国特許第４，８２４，５６８号の方法により製造した典型的な膜の 断面図の光学顕微鏡写真である。

図１４は、この発明の方法により製造した膜の断面図の光学顕微鏡写真である。

図１５は、この発明の適宜的な複合膜の光学顕微鏡写真である。

この　日の　の この発明の複合膜は、独自のミクロ構造を有する限外濾過膜として機能する非対 称性の覆われた膜を含む。この発明の膜は、米国特許第４，８２４，５６８号に 開示されたもの（本明細書中に参考として援用するが、付加的要件を伴う）と類 似の方法により作られる。最も重要なことは、多孔性支持体をポリマー溶液で被 覆するステップを、注意深く制御された条件下で、微小孔支持体上に実施してス キン及び露出したスキンと支持体との間の中間域（多孔性であり且つスキンから 支持体に伸びるボイドを含まない）を形成することである。第２に、ポリマー溶 剤の除去及びポリマーの凝固を制御する浸漬液組成物は、ポリマーの凝固時間を 延長させるためにデザインされた有機浴（ｏｒｇａｎｉｃ　ｂａｔｈ）である、 更に、ポリマー溶液を多孔性支持体上に被覆する方法は、所望のポリマー溶液を 、一様の厚みを保つように支持体を損なわず且つ被覆をつぶすことなく一様の厚 みに塗布するように注意深（制御しなくてはならない、中間域の厚みと浸漬浴組 成物の適当な組合せは、所望のミクロ構造及び性能（蛋白質溶液がウィルスを含 む場合における、ウィルス粒子保持と蛋白質透過の組合せ）へと導く。

この複合膜の支持体成分は、約０．０５〜１０ＬＬｍの平均細孔サイズの細孔及 びチャンネルを含む実質的に連続なマトリックス構造を有する合成膜により形成 する。

支持体は微小孔膜、不織支持体、織物支持体、又は多孔性セラミックであって良 い、広く多様なポリマー材料を膜、織物支持体又は不織支持体として利用するこ とが出来る。これらのポリマーの例は、ポリオレフィン（低密度ポリエチレン、 高密度ポリエチレン、及びポリプロピレン等）、ビニルポリマー（ポリビニルク ロリド及びポリスチレン等ｌ、アクリル酸ポリマー（ポリメチルメタクリレート 等）、オキシドポリマー（ポリフェニレンオキシド等）、フルオロポリマー（ポ リテトラフルオロエチレン及びポリビニリデンジフルオリド等）、及び縮合ポリ マー（ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリカーボネート及びポリスル ホネート等）を含む。

この複合膜のスキン及び中間域は、ここに記載するポリマー溶液から作られる。

典型的なポリマー溶液は、上述のような多孔性支持体を形成するのに遇したすべ てのポリマーから製造することが出来、ポリビニリデンジフルオリド、セルロー スエステル（セルロースアセテート等）、ポリイミド（ポリエーテルイミド等） 、ポリスルホン（ポリエーテルスルホン及びポリスルホン等）、ポリアクリロニ トリル等の溶液を含んで良い。

１つの実施態様において、多孔性支持体の細孔表面は、次の被覆ステップで用い るポリマー溶剤がこれらの表面を攻撃すること及び膜に浸透することを最小化又 は防御する液体防御剤で処理する。ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）か ら形成する微小孔膜（ＭＨｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｂｅｄｆｏ ｒｄ、　？ザチューセッッから販売されているＤｕｒａｐｏｒｅ膜等）の場合に おいて、グリセリン処理が適当であることが見出された。その膜は、グリセリン の溶液中に浸漬した下部を有する回転する被覆ロール上のウェブとして走り得る か又はグリセリン溶液中に完全に浸漬して良い。

エチレングリコール、プロピレングリコール、トリエチレングリコール等のグリ コールを含むグリセリン以外の液体防御剤を用いることが出来る０通常、支持体 の成形加工において支持体溶剤及び他の支持体の形成において用いた材料を抽出 するためにしばしば用いる水浴中での薬剤の除去を容易にするので、水と和合性 の薬剤を選択するのが好ましい、当業者は、日常的な実験により、更なる液体防 御剤を知り、又は確認することが出来るであろう。液体薬剤は、アルコール溶液 等の溶液中に溶解させることが出来る。これはこの薬剤の適用を容易にし且つア ルコールは続（乾燥により除去し得る。

一般に、所定の支持体に、限外濾過分離特性を有する複合膜の形成において用い るポリマー溶剤からの攻撃に対する十分な防御を与え且つそのような溶剤による 支持体浸透に対する十分な防御を与えるのに十分な量の薬剤を用いる。より高濃 度の薬剤を実地での考慮により決定する。例えば、過剰のグリセリンは続いて形 成する限外濾過膜のより低い粘着力をもたらし得るということが観察された。薬 剤の費用は別の実際問題である。　Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜のグリセリン処理におい て、好ましい処理溶液はプロパツール中の約１５〜４０重量％のグリセリンを含 むということが決定された。液体でない処理薬剤も又用い得る。例えば、水溶性 ワックス（ポリエチレンオキシド等）は溶かし且つ微小孔膜に塗布し、そして所 望であれば、続いて温水浴中で処理して除去することが出来る。

処理した支持体を乾燥して任意の防御剤のキャリアー（例えば、イソプロパツー ル）を除去する。乾燥は、処理した膜を加熱したロール上を運搬すること、加熱 した熱対流炉を通すこと、又はその他の技術により達成し得る。

限外濾過分離特性を有する複合膜を、次いで、処理した支持体構造上に形成する 。これは、ポリマー溶液を処理した支持体上に被覆し、その被覆した支持体を溶 剤とは和合性であるがポリマーの溶剤ではない液体中に急速に浸漬することによ り実施する。限外濾過膜に特に好ましいポリマーはＰＶＤＦである（特に、微小 孔支持体をＰＶＤＦで形成する場合）、一般に好ましいが、限外濾過膜を支持体 を形成するのと同じポリマーで形成する必要はない、しかしながら、好ましい複 合膜の形成において、限外濾過膜を形成するポリマーは、微小孔支持体を形成す るポリマーと同一である。

約ｌＯ〜２１％、好マシ（は約１９〜２１　％（７）ＰＶＤＦを溶剤中に含むポ リマー溶液を、適当なカットオフの限外濾過膜スキンを得るために用いる。より 低いＰＶＤＦ濃度は僅かに高い蛋白質透過と僅かに低いウィルス保持を有するよ り開いた構造へと導（、最も選択的且つ保持的な構造は、１９〜２１％の好まし いＰＶＤＦ濃度を用いて達成される。

ＰＶＤＦの場合、被覆工程は、特に、このポリマー溶液の層を一様に付着させる ように設計し、それで、被覆の最終的な乾燥した厚みが約５〜２０ミクロン、好 ましくは約５〜１０ミクロンになるようにする。一般的に、限外濾過膜（ＵＦ） 流延溶液を支持体上に被覆するために用いるような典型的なロール式ナイフ塗布 法は、そのような正確な厚み制御を必要とする薄い被覆には量適ではない。ナイ フェツジは、この狭い範囲内に被覆を得るために動く支持体に近接してセットさ れなくてはならない、そのようなナイフセツティング及び調節を得ることは、摩 擦抵抗及びナイフ設計の標準公差のために困難である。ナイフ下に運ばれた支持 体の厚みのばらつきは、維持されるべき間隙（即ち、固定されたナイフの位置と 支持体との間の空間）のオーダーである。このばらつきは実際の間隙を変化させ 、それにより、被覆の厚みが変化する。微小孔膜の場合にも、支持体の厚みのば らつきは、微小孔膜支持体がナイフに当るか又は摩擦抵抗が大きくなり過ぎた場 合に破損を引き起こし得る。この問題は、エツジカール又はスカラッピング；　 “だれたエツジ”のために一層悪い、破損が起きた場合は、ナイフを除去し、き れいにし、そして再セットしてから続けなければならない。通常の不織支持体に 比べて相対的に弱い微小孔膜支持体の破損が普通なので、効率が減少する。

制御された再現性の限外濾過膜スキンを提供するために、新規な被覆方法をこの 発明によって提供する。図１に示すように、被覆の厚みは、回転ドラム７６と非 回転ゴム被覆したシリンダー７２との間のニップを形成することにより制御する 。微小孔支持体７４を、回転することの出来る裏付ドラム又はロール７６に接す る支持ウェブ７８上に位置させる。ゴム被覆したシリンダー７２とポリマー溶液 ８４との間にはさまれたプラスチックフィルム８２は、シリンダー７２に巻きつ くように固定したにのフィルム８２は、ポリエチレンテレフタレート又はポリマ ー流延溶剤によって不利な影響を受けず且つ加えられる剪断力に耐えるのに十分 に強い他の任意のフィルムであって良い。プラスチックフィルム８２は、ウェブ 運搬の方向において、ニップポイント８０を数インチ過ぎて伸長し得て、平滑化 フィルムとして機能する。即ち、表面に露出した流延ポリマー溶液８３の露出表 面を平滑化するフィルム８２の機能がこの発明の最終的複合膜におけるスキンを 形成する。シリンダー７２とフィルム８２の使用が流延フィルム８３の厚みの正 確な制御を可能にし、それが複合膜の中間域における望ましくないボイドを排除 するということが見出された。

運転において、流延溶液８４を、ゴム被覆したシリンダー７２とドラム７６との ニップポイント８０のウェブ導入側において貯蔵器に供給する。動く微小細孔支 持体７４は、ジャーナル軸受は潤滑と類似したニップ８０の下で溶液を引っ張る 。単純化した分析は、被覆の厚みがウェブ速度の平方根、流延溶液粘性及びニッ プ８ｏ下の長さく即ち、ゴム被覆ロールの“足跡”）に比例し、且つニップ下の 圧力の平方根に反比例するということを示している。この足跡は、ゴムの硬度及 びシリンダー７２をドラムに対して押しつける圧力により制御する。

実際には、溶液の粘性及び流延速度は、膜特性の要求により設定する。ゴム被覆 ８５の硬度は、所望の範囲の被覆厚みを与えるように経験的に選択する０次いで 、シリンダー７２上の圧力を用いて観察される正確な厚みを設定及び制御する。

圧力は、シリンダー７２の金属コア８７上で作動する空気シリンダー８６により 設定する。

空気シリンダー８６への圧力を制御することにより、コア８７における力を制御 する。被覆の厚みは、次いで、空気シリンダー８６への入口圧を調節することに より変え得る。

ポリマー溶液を正確に微小孔支持体上に被覆した後、限外濾過Ｍｌｌ構造を、被 覆した微小孔支持体をポリマー溶剤には和合性であるが溶解したポリマーの溶剤 ではない液体に浸漬することにより形成する。水に溶かした２５重量％のグリセ リンを含む溶液は１例＾ば好ましい１９〜２５％の固体濃度においてＰＶＤＦか ら作られた複合膜に対して好ましい液体である。１価アルコール、水、又はそれ らの混合物等の他の液体を用いることは出来るが、最適膜特性は、有機含有水浴 を用い且つ好ましくは２５重量％グリセリン水溶液を用いた場合に得られる。

付着工程が、０．５分を越え、好ましくは約０．６５〜１分等で、ゆっくりと起 こり、薄い被覆において２５重量％グリセリン水溶液で達成される場合、独自の 非対称性形態が、複合膜において得られる。この複合膜は、限外濾過分離特性を 持つスキン、微小孔支持体及び、ＰＶＤＦの場合、スキンと約５〜２０ミクロン の厚みを有する支持体との間の中間域を含む。中間域の形態は、通常非対称性微 小孔膜と結合した連続マトリックス構造（但し、実質的に小さく堰体濾過の範囲 に入る平均細孔サイズを有する）として特徴づけられる。

従来の限外濾過膜並びに米国特許第４，８２４，５６８号に記載されたものと異 なり、この発明の微小孔支持体上の被覆の構造は、スキンの露出した表面から中 間域の下の微小孔支持体に至る中間域に広がる延長されたボイドが存在しないこ とにより特徴づけられる。この属性は、ここで記載する膜がウィルス粒子の保持 に有用であり、同時に、従来の限外濾過膜の蛋白質透過特性の特徴を維持するこ とを可能にする。稀な小さいボイドを含む構造も又ここに記載の方法により、特 に低い固体含有率において生じ得る。しかしながら、これらの構造は、小さいボ イドが稀であり且つスキンの露出表面に達しないで下に現れるならば満足すべき ものである。しかしながら、好ましい構造は、ボイドの存在しない連続的マトリ ックスであるものである。この型の構造は、ここに記載する好ましい条件におい て見出され、図１４に示しである。この構造は、米国特許第４，８２４，５６８ 号に開示された膜の構造（図１３に示す）と対照的である０図１５に示すように 、中間域は稀な大きいボイドを含んで良い。しかしながら、図１３に示す限外濾 過膜について本当であるようにこれらの大きいボイドはスキンから支持体へ広が らない。

膜構造を形成した後、複合ウェブを、被覆し且つ付着させたウェブを水浴中を運 搬することにより予備洗浄する。２５℃の水中においての約１分間の接触時間で 十分である。乾燥は予備洗浄したウェブを単一シートとして乾燥するために室温 に置くことにより達成し得る。別法として、ウェブを多孔性ロール上を運搬する ことにより連続的に乾燥することが出来る。ロールの内部を減圧し且つ加熱空気 流（例えば、１４０°Ｆ）をウェブの表面に当てる。そのようなロール上での典 型的なウェブの速度は４〜６フィート／分である。

ＰＶＤＦポリマー及び２５重量％グリセリン−水漫漬浴を用いた場合、５ミクロ ンより薄い厚みの限外濾過膜は、微小孔支持体の不十分な表面被覆を生じ且つウ ィルス保持特性が悪化するので、より満足でないということが見出された。幾つ かの場合において、５ミクロンより薄い被覆は、開いた多孔性構造より、非多孔 性のつぶれたフィルムをも形成する。中間域の厚みが約２０ミクロンより大きい 場合は、望ましくないボイドが中間域に現れ得て、それはウィルス粒子の透過を 促進する。流延ポリマー溶液を用いた場合、中間域の最小及び最大許容厚みは、 ＰＶＤＦについては５〜２０ミクロンの範囲で僅かに変化する。何れにしても、 中間域は、一様に多孔性であり且つ、従来の限外濾過膜において見出されるボイ ドと異なり、スキンから支持体に伸びる大きいボイドな含まない。

この発明の複合膜が疎水性のスキン表面を有する場合、水性蛋白質溶液等の水性 溶液を処理してそれらから選択的にウィルス粒子を除去するときに有用であるた めに親水性にすることが必要である。膜を親水性にするための及び低蛋白質結合 の好ましい方法は、米国特許第４．６１８，５３３号に開示されており、本明細 書中で参考として援用する。親水性化は、疎水性膜を親水性（水に濡れ得る）膜 に変換させる連続多段階工程としての米国特許第４，６１８，５３３号の方法に より行ない得る。その工程において、疎水性膜のロールをほどいて、下記の一連 の工程ステップに供給することが出来る： １、アルコール浸潤　−腹ウェブをアルコール（典型的にはイソプロパツール） に沈めるかさもなければ含浸して完全に濡らして多孔性構造に満たす。

２、水交換：その膜を水浴中に沈めてアルコールを水で置き換える。

３、反応溶液での含浸：水で濡れた膜を所望の組成に作ったモノマー及び他の反 応物の水浴中に沈める。この洛中で交換が起こり、ウェブは反応物を含む水溶液 で満たされる。米国特許第４，６１８，５３３号の教示するように、ヒドロキシ プロピルアクリレート、架橋剤及び適当な開始剤を含む組成物を用いることが出 来る。

４、重合：ウェブを、ウェブを浸している反応物の重合がその場で起こる反応チ ャンバー内を通して運搬する。

酸素は、重合反応の間排除する。これは反応チャンバーを不活性ガス（例えば、 窒素）で飽和させることにより；或はウェブをポリプロピレン等の透明なシート の間にはさむことにより行ない得る。

５、洗浄：反応後、ウェブな、浸水、スプレー等の適当な水洗ステップを通して 運ぶ。

６、乾燥：膜を上述のように乾燥した後、巻いて包装する。好ましい乾燥温度は ３００’Ｆである。

米国特許第４．６１８，５３３号に記載された親水性化法を、ここで改変して、 この発明の複合膜に用いる。

任意の過剰の親水性化溶液を複合膜のスキン表面から除去して複合細孔表面が細 孔を橋渡しする親水性被覆の層で覆われないようにする。これは、不動の軟質ゴ ムワイパー、過剰の表面液体を複合膜表面から除去するためのニップロール等を 用いて達成され得る。

この発明の膜は、ウィルス粒子及び他の粒子の直径（１０〜１１００ｎの直径の ウィルスに関係する大きさの範囲）と共に規則的且つ単調に増加する粒子につい てのログ保持値（ＬＲＶ；シービング係数の負の対数）により独自に特徴づけら れる。経験的に、ＬＲＶは、粒子投影面積（粒子直径の平方）の大きさと共に連 続的に増加する。絶対しＲＶは、被覆溶液固体含有率又は浸漬浴組成及び温度を 操作することにより創造される対応する膜蛋白質シービング特性の調節により調 節し得る。より高い多孔度の中間域を有するこの発明の複合膜は、より低い多孔 度の中間域を有するこの発明の膜より低分子量のカットオフを有する。小さい大 きさのウィルス粒子を蛋白質溶液から除去することに関して、少なくとも約３の 満足すべきＬＲＶが、より低い多孔度の中間域を有する膜を用いて得られる。し かしながら、分子量カットオフが減少し、それにより、蛋白質回収が減少する。

それ故、ユーザーは、満足すべきＬＲＶ及び蛋白質回収を与える複合膜を選択す るであろう、何れにしても、この発明の膜は、ウィルスに対する３のＬＲＶを生 じ得て、ウィルス粒子の大きさが直径１０〜１１００ｎの場合、約８又はそれ以 上に伸ばし得る。更に、この発明の複合膜は、約５Ｘ１０”〜５Ｘ１０’ダルト ンの蛋白質分子量カットオフにより特徴づけられる。すべての場合に、粒子投影 面積との経験的関係は保持される。ウィルス粒子に対するログ減少値（単一溶質 の溶液；蛋白質は存在しない）はウィルス粒子の大きさに依存する。下記の実施 例において説明する関係に基づいて、肝炎等の小さい大きさのウィルスでは、約 ３より大きいＬＲＶが得られ、ＡＩＤＳウィルス等の大きいウィルスでは、６よ り大きいＬＲＶが得られ得る。

蛋白質シービング特性は、典型的な従来の限外濾過膜の性能を達成するように調 節し得る。これらの特性は、流延溶液固体含有率及び限外濾過膜の形成において 慣例的な浸漬浴の組成及び温度を適当に操作することにより調節し得る。より高 い温度は大きい細孔の形成を促進する。より高い固体含有率は小さい細孔の形成 を促進する。この発明の膜は、５Ｘ１０”〜５Ｘ１０’ダルトンの分子量カット オフ値（低分極条件下において、膜により９０％が排除される溶質の分子量）を 有して形成し得る。

この発明の複合膜は、フラットシート又は中空繊維の形態であって良い、フラッ トシートの場合、支持体の１つの表面はスキン及び中間域で被覆する。中空繊維 の場合、内面又は外面をスキン及び中間域で被覆する。

この発明の１つの面において、チャンネル又は複数の中空繊維により与えられる 装置においてウィルス粒子を選択的に分離するための方法を提供する（そこに８ いて、供給流はスキンを横切って接線方向に流れる）、血漿を高分子量の血漿画 分と低分子量の画分とに分離するための類似の装置が米国特許第４，７８９，４ ８２号において開示されているが、それを本明細書中に参考として援用する。こ の発明により、複数のチャンネル又は中空繊維を有し、再循環流の濾過流に対す る制御された流量比で運転する装置を提供する。

図２８に関して、ウィルスを含んでも含まなくても良い容器１６内に容れた蛋白 質溶液を導管１０を通してポンプ１２により導き、導管１４を通して濾過ステッ プ２０へ向ける（そこで、蛋白質溶液を、この発明の膜２２によりウィルスから 分離する）、蛋白質をも含むウィルスに富む画分を容器１６へ導管２４により再 循環させる。ウィルスを含まない蛋白質に冨む画分を導管２６を通してポンプ２ ８により回収し、導管３ｏを通して貯蔵所又は使用点へ向ける。

他の工程の構成は、定容連続濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　）流の取り込 みを含んで可能である０図２ｂに関して、定容連続濾過は、貯蔵器６に貯えた緩 衝液を導管２を通して、ポンプ２８と同じ容積流量で運転するポンプ４によって 図２８に記された工程に加えることが出来る。

第２の工程の構成において、この発明の膜４２を含むモジュール４０を含む第２ の膜段階は、上述のものと直列にして運転し、より高い全ウィルス除去を達成す ることが出来る。図２０に関して、図２８に示した工程から造られる流れ３０の 蛋白質に富む画分をこの第２の段階に加える。再循環流３６を、この発明の膜４ ２を含む膜モジユール４０ヘボンブ３４及び導管３２によって導入する。ウィル スに冨む流れを導管３６を通してポンプ３４へ再循環させる。第１段階からの蛋 白質に冨む流れを導管３０を通して、導管３２及び３６及びポンプ３４により造 られる再循環ループへ導入する。第２段階からのウィルスを含まない蛋白質に富 む画分を導管３８を通してポンプ４４により回収し、導管４６を通して貯蔵器又 は使用点へ向ける。ポンプ４４を通る容積流量は、ポンプ２８及びポンプ１２を 通るそれと等しい、所望であれば、ポンプ２８及び４４は、ポンプ１２と互いに 同じ流量を達成するように調節したしぼり弁と置き換えることが出来る。

他の実施態様において、ここに記載する多段階カスケードを用いることが出来る （図２ｄを参照）、ウィルスを含んでも含まなくても良い容器１６内に容れた蛋 白質溶液を導管１０を通してポンプ１２により導き、導管１４を通して濾過ステ ップ２０へ向ける（そこで、蛋白質溶液を、この発明の膜２２によりウィルスか ら分離する）。蛋白質をも含むウィルスに富む画分を導管２４によりポンプ１２ へ再循環させる。ウィルスを含まない蛋白質に富む画分を導管２６を通してポン プ２８により回収し、第２の濾過段階４０へ向ける。ウィルスに冨むブリード流 れ３１を、導管１４及び２４及びポンプ１２を含む再循環ループから供給し、導 管３１及びポンプ３３を通して回収する。第２の再循環流れ３６を、ポンプ３４ 及び導管３２によりこの発明の膜４２を含む膜モジュール４０へ導入する。モジ ュール４０からのウィルスに富む溶液をポンプ３４へ導管３６を通して再循環さ せる。濾過モジュール２０からの蛋白質に富む流れを導管３０を通して、導管３ ２及び３６及びポンプ３４により造られる再循環ループへ導入する。濾過モジュ ール４０からのウィルスを含まない蛋白質に富む画分を導管３８を通してポンプ ４４により回収し、導管４６を通して貯蔵器又は使用点へ向ける。適宜、緩衝液 を導管３６へ導管５０を通して導入し、カスケードにおける一定の容積を維持す ることが出来る。更に、蛋白質回収を改善するために、第２の再循環ループに含 まれる液体の一部を、導管５２を通してポンプ５４により第１の再循環ループ及 び導管１４へ再循環することが出来る。この構成において、流れ３１．５０及び ５２における容積流量は同じであり、且つ流れ１Ｏ１２６及び４６のそれも又同 じである。回収される蛋白質及び除去されるウィルスの量は、流れ３１の流量の 流れ４６のそれに対する比を制御することにより最適化し得る。適当な供給及び 生成物導管を有する複数の濾過ステップ２０を、直列に、示したように用いるこ とが出来、それにより、ウィルスに富む流れ２４及び３１を追加の濾過ステップ ２０において接触させてウィルスを含まない更なる蛋白質に冨む画分を生じるこ とが出来る。これらの濾過ステップは、再循環流があってもな（でも運転するこ とが出来る。他の実施態様において、ここに示す、行き止まりの工程の構成を用 いることが出来（図２ｅを参照）、供給を濾過ステップ２０へ導入し、濾液を導 管２６を通して除去する。

図９及び１０に関して、長方形の中空チャンネル（図１１）を利用する典型的な 構造を示すが、それは、この発明における分離モジュールとして利用し得る。こ の一般的構造は、米国特許第４，５４０，４９２号に開示されており、本明細書 中に参考として援用する。

濾過ユニット３２は、第１の膜３４、第２の膜３６、第１のスペーサー３８及び 第２のスペーサー４０を含む（それらは、結合したときに、複数の長方形チャン ネル４８を形成する）、ウィルス分離に利用する装置は、互いに連続する複数の 濾過ユニット３２を含んで良く、且つ濾過ユニット３２のスタックを形成して良 い、第１の膜３４及び第２のＩｆＩ３６は共に同じ組立であり、上述したこの発 明の複合膜から形成する。各膜３４及び３６は、２つの縦方向チャンネル４２及 び４４及び横方向のチャンネル４６を与える。横方向チャンネル４６は、チャン ネル４２又は４４のいずれとも流体連絡にない。第１のスペーサー３８は、端５ ０から端５２まで伸びる複数のチャンネル４８及び出口チャンネル５４を含む、 膜３４及び３６がスペーサー３８に隣接するときは、端５０及び５２は膜３６の 端５６及び５８にそれぞれ一致する。第２のスペーサー４０は、蛋白質溶液入口 チャンネル６０及びウィルスに富む流れの出口６２及び６４を与えられる。第２ のスペーサー４０は又、内部チャンネル６８（チャンネル６６との流体連絡を与 え、それは更にウィルスに富む流れの出口６４と流体連絡にある）を与えられる 。スペーサー４０を膜３６と並置した場合、端６３及び６５はスペーサー３６の 端５６及び５８とそれぞれ一致する。チャンネル４８の間のスペーサーストリッ プ６９及びチャンネル６６の間のスペーサーストリップ７１は、次の隣接する膜 （示してない）に結合され、且つチャンネルに隣接する膜に必要な支持を与えて 膜の柔軟性を制御し、所望のチャンネルの高さを維持する。

図９及び１０に示すモジュール構造は本発明において有用であるが、この発明の 膜を利用する任意のモジュールが、運転条件を下記のように制御するならば、本 発明において用い得るということは理解されるべきである。

図１０に関して、第１のスペーサー３８のチャンネル４８は、膜３６のチャンネ ル４２及び４４と重ねて示しである。この重なりが、ウィルスを含む蛋白質溶液 をチャンネル４２へ導入すること、この溶液を膜３６と接触しながらチャンネル ４８に沿って長さ方向に通過させること、及びウィルスに富む溶液をチャンネル ４８から横方向のチャンネル４４を通して除去することを可能にする。

上述のモジュール（薄いチャンネル及び中空繊維の両方）は、低い容積変換にお いて接線方向流れモードにて運転し得る。最適なモジエールの縦横比及び対応す る最適な運転条件は、ウィルス粒子の蛋白質溶液からの分離にある。最適な縦横 比及び運転条件は、米国特許第４゜７８９．４８２号に記載されたものと一致し 、本明細書中に参考として援用する。高い溶質回収を達成するための縦横比（Ｌ ／ｈ）は、下記式ｌにより定められる：ｒ、／ｈ　−［Ｋ／１２　Ｐ　ｐ−ｈ／ ｐ、ｓｓ式Ｉ Ｋはトランスチャンネル圧力低下のチャンネル内圧力に対する比の関数である。

には下記の手順により実験的に得ることが出来る。ｈはチャンネルの高さ又は中 空繊維の半径であり、ρは再循環流の流量Ｑ、の透過流の流量Ｑ、に対する比で あり、Ｕは分離される流入蛋白質流の粘性であり、Ｌはチャンネル又は繊維の長 さであり、モしてり、は、膜が限外濾過されるべき液体で濡れた後の膜の水圧透 過性である。

少な（とも１つの多孔性膜で形成された壁を有する長方形状のチャンネルについ て、ｈは、膜９０と９２との間の距離である（図１１に示すチャンネルの高さを 定める）。一般に、長方形のチャンネルのｈは、約０．０１１０〜０．０３０ｃ ｍである０本発明において、モジュールの縦横比（Ｌ／ｈ）は、約５０〜５００ ０、好ましくは２００〜３００に及ぶ。

モジエールの縦横比及び剪断速度は、最大可能フラックス（ｌａｒｇｅｓｔ　ｐ ｏｓｓｉｂｌｅ　ｆｌｕｘ　）において所望の選択性を達成するために同時に最 適化される。従来のシステムと異なり、このシステムは、過度に大きい剪断速度 又は過度に低い容積フラックスにおいては作動せず、所望の選択性（ウィルス除 去の場合は、ウィルスの蛋白質に対する選択性）を最大化する条件において作動 する。最適な分離性能を与えるモジュール縦横比とモジュール作動剪断速度との 間の厳密な関係が見出された。

装置において利用される最大剪断速度は下記式２により定められる： 式２ （式中、γは、最適選択性能を得るための最大剪断速度である）。

比例定数Ｄ０は下記の手順により経験的に得られる：原型モジュールは、最終的 装置において利用される型の限外濾過膜の複数の薄いチャンネル又は中空繊維を 含んで提供される。原型におけるチャンネル又は繊維は任意の寸法であって良い 。約２００のＬ／ｈのチャンネルを有する原型は有用であることが見出された。

ポンプ及び導管は、低分子量成分を回収するフラックス流を形成し、透過物の流 量Ｑ、を制御するために与えられる。この透過流は供給貯蔵器において、限外濾 過チャンネル又は繊維から得られた高分子量成分を含む再循環流と合同する。再 循環流の流量（Ｑ、）は、制御される。変動するＱ、と一定に保たれるＱｌｌ又 は変動するＱ、ｌと一定に保たれるＱ、の何れかを有する装置を用いて複数の運 転を行なう。各運転の後、関係する分子種の間で行われた分離（選択性）を測定 する。各運転の後、システムを更に塩類溶液又は水等でフラッシュしてすべての 処理した液体をシステムから除去する。標準水圧透過性（例えば、水又は塩類溶 液）ＬＰを、次いで、標準的方法により測定する０次いで、その値に、処理した 液体のμの標準流体のμに対する比を掛ける（ここに、μはセンチポアズでの粘 性であり、Ｌｐは式１において用いている）。

得られた選択性値から、最適選択性に対応するＱＰ及びＱ＊値を決定することが 出来る０選択した最適値は、フラックス及び選択性の両方が同時に最大となると き、Ｑ、及びＱ９値を指して言う、定数には、式１を用いて、Ｑ、／Ｑ、の最適 値を用いて計算することが出来る。

次いで、最適Ｑ、に対応する剪断速度を用いて、定数Ｄ０を式２から計算するこ とが出来る。Ｄ＠は限外濾過される溶液の特性であり、蛋白質については、約１ ×１０−’　〜２５　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’ｃｍ”　／秒である。ρにおける制限は、 比Ｑい／　Ｑ　ｐにおける制限を反映する。その上限は再循環ポンプの大きさに より決まるが、下限は乃イルス保持により決められ、それは、低いＱ、／Ｑ、値 、即ち、高い変換において減少する（保持された分子種は、透過物が除去される につれて一層濃縮される）、小さいウィルスについては、２０−１より大きいＱ 、／Ｑ、鎖式１及び２によって限外濾過装置を設計し、運転する場合は、最適分 離効率を与える装置における全膜面積は、下記式３により与えられる： Ａ　−０，２５０，Ｌ（１＋　Ｋ）２／Ｄ”Ｋ　（ＰＬｐ／ｆｉ）’式３ （式中、Ａは全膜表面積である）。

更に、直接測定可能な最大トランスチャンネル圧力低下も又最適分離条件につい ての下記式４により与えられ式４ （式中、ΔＰｃはトランスチャンネル圧力低下である）。

接線方向流モジュールにおける濃縮分極の制御は、モジュール縦横比と運転剪断 速度の両者の結合に依存している。それ故、モジュール設計及び運転剪断速度の 制限範囲のみが実行可能である。これはファクターＬ／ｈ及びρの上限及び下限 を生じる。再循環流の流量ＱＩＩの透過物流の流量Ｑ２に対する比ρは、約５〜 １００、好ましくは約１０〜５０、最も好ましくは３０である。

最終的に、最適な設計Ｌ／ｈ及び運転条件γにおいて、チャンネル出口における トランスメンブレン圧力低下のチャンネル入口におけるトランスメンブレン圧力 低は１．０から有意に異なる。この発明から引き出されたｂの値は、０．０〜０ ，８５、最も典型的には０．７５にある。

実施例において示すように、最適のウィルス分離及び蛋白質回収は、米国特許第 ４，７８９，４８２号において示された条件下で達成される（しかし、好ましい 縦横比の値及び運転条件は、その特許の特許請求の範囲におけるものと同一のも のとは異なる）、実施例に示すように、蛋白質の存在下においては、ウィルス除 去（ＬＲＶ）は、縦横比及び再循環の流量Ｑ、ｌの透過物の流量Ｑ、に対する比 の両方の関数である。ウィルス保持に適した範囲は、１００〜１０００の縦横比 及び２０〜２００のρの値であることが示されている。これらの範囲は米国特許 第４，７８９．４８２号に記載されたものに含まれる。しかしながら、蛋白質の 存在しない場合は、好ましい縦横比は、約３００であり、ρの好ましい値は２０ 〜１００である。１００未満及び１０００を越える縦横比は共により低いウィル ス保持を生じる。２０未満のρの値（即ち、０．０５を上回る変換）は、用い得 るが、ウィルス保持において同様の劇的な損失を生じる。

ヒト血清アルブミン等の蛋白質の存在下において、ウィルス保持は、膜表面にお ける蛋白質分極により促進される。この場合、ウィルス保持は、まして縦横比に 影響されることはなく、ρの値が１０を越えている場合（即ち、変換がＯｌｌを 下回っている限り）、殆どそれとは無関係である。それ故、蛋白質の存在下にお いては、１００〜５００の縦横比が好ましく、１０〜５０のρの値が最も好まし い。

一般的利用のためにこれら２つの場合を結合すると、縦横比及びρの値は、米国 特許第４，７８９，４８２号に記載されたもの（約３００の好ましい縦横比及び 約２０〜３０の好ましいρの値を有する）である。

倒二上 マサチューセッツ、ベトフォード在ミリボアコーポレイションが市販する平均細 孔寸法０．２２マイクロメーターを有するＤｕｒａｐｏｒｅ　（登録商標）微孔 質膜を予備成形微孔質膜として使用した。膜を、イソプロパツールに溶解したグ リセリン３０％溶液で処理して乾燥しＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中にポリ 二弗化ビニリゾ７　（ＰＶＤＦ、Ｋｙｎａｒ７４１、ペンシルバニア、フィラデ ルフィア在ペンウオルト）２０．５％及び塩化リチウム４．９％を含有するポリ マー溶液を、図１に例示する装置を利用してグリセリンで処理したＤｕｒａｐｏ ｒｅ微孔質膜に速度１５フィート／分（４，６ｍ／分）でキャストした。被覆し た膜を、次いで温度７℃に保つ水浴で２５重量％のグリセリン中に浸漬した。図 １に関連して記載するコーティングプロセスのポリエステル平滑化フィルムの長 さはおよそ２〜３インチ（５〜８ｃｍ）である。コーティングポリエステルフィ ルムと浸漬浴との間の空気暴露は２インチ（５ｃｍ）であった。キャストした後 に、複合膜を２５℃に保つ水浴中に１分間浸漬し、次いで予備洗浄したウェブな 減圧を有する穿孔乾燥用ロールの上に運びかつ加熱した空気流（１４０°Ｆ　（ ６０℃））を６フィート／分（１，８ｍ／分）で移動しているウェブの表面に当 てて乾燥した。

膜を親水性にするのに用いられる一般的な手順は米国特許４，６１８，５３３号 に記載されている手順であり、これについては前に記載している０本例で用いる 膜・１、　ｉ：　ｊ　ＬＡ　Ｔ　４″、　Ｅｚｉｆｋ−＊ｆ＠ｍ°“ｂ　Ｆ　Ｃ ＋　＋　！／　２　ｏ　ｅ　ｔｌ、＝　７　’）　ＩＪシレー−（ＨＰＡ）４％ 、架橋剤及び遊離基開始剤を含有するものであった。疎水性膜を逐次にかつ連続 してアルコール、水及び反応体の中に共に２５フィート／分（７，６ｍ／分）で 通して移動させた。過剰の反応溶液を軟質ゴムワイパーブレードで取り除いた。

波長２５４ナノメートルを有する紫外線をウェブの両側にかけて架橋コポリマー の重合を開始させた０反応体を飽和させたウェブは紫外線における滞留時間およ そ５〜１０秒を有した。疎水化されたウェブな水中で洗浄して過剰の反応体を除 きかつ内部を減圧に保つ穿孔ドラム上で、３００’Ｆ　（１４９℃）に加熱した 空気を表面に当てながら乾燥させた。

コーティング作業の間、ＳＥＭにより測定する通りの中間多孔質域厚さ５〜２０ マイクロメーターを生じるために、これらの膜において、空気圧シリンダーによ ってかける通りのゴムロールニップ圧力及び微孔質基体なニップに通して引っ張 る速度を変えた。ニップ圧力を８５〜１７５ｐｓ　ｆ　（６，０−１２，３Ｘｇ ／ｃ＋＊”）でかつ速度を６．５〜１５フィート／分（２、０〜４　、６　ｍ　 ／分）で変えた。

生成した膜Ｂを２種の異なる溶液、すなわち一方は食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ ）中にＰｈｉ　Ｘ　１７４バクテリオフアージだけを含有する溶液であり、第２ 溶液はＰｈｉ　Ｘ　１７４バクテリオフアージを加えたＰＢＳ中にヒト血清アル ブミン０．２５％を含有する、で試験を行った。

図３に示す通りに、乾燥した疎水性中間域の厚さ５マイクロメーターにおいて、 中間多孔質域は相当につぶされて溶質透過度は小さくなり、Ｐｈｉ　Ｘ　１７４ ＬＲＶは極めて大きくて約５０グであり、アルブミンシービングは４８％で極め て小さい、中間域の厚さを８マイクロメーターに増大するにつれて、域及び表面 スキンは一層透過性になり、たんばく質通過が相当に増大しかつＰｈｉ　Ｘ　Ｌ ＲＶが損失するに至る。中間域の厚さを更に２０マイクロメーターに増大するに つれて、Ｐｈｉ　Ｘ　ＬＲＶはずワと小さい割合で減少し、アルブミン通過は変 化しない。

九１ 本例は、本発明の複合膜がたんばく質の不存在において、同等のたんばく質シー ビング特性を保有する従来技術の膜に比べて相当に良好なログ減少値でウィルス 粒子を保持することができることを例示する。加えて、本発明の膜の粒子ログ減 少値は粒子直径の関数として単調に増大し、これは従来技術の膜に関して見られ ない性質である。

メンプレインＡと識別する本発明の第１膜は下記、の通りにして造った： マサチューセッツ、ベトフォード在ミリポアコーポレイションが市販する平均細 孔寸法０．２２マイクロメーターを有するＤｕｒａｐｏｒｅ微孔質膜を予備成形 微孔質膜として使用した。膜を、イソプロパツールに溶解したグリセリン３０％ 溶液で処理して乾燥した。

メチルピロリドン中にポリ二弗化ビニリデン（ＰＶＤＦ、Ｋｙｎａｒ７４１、ペ ンシルバニア、フィラデルフィア在ベンウォルト）１９．８％及び塩化リチウム ５％を含有するポリマー溶液を、図１に例示する装置を利用してグリセリンで処 理したＤｕｒａｐｏｒｅ微孔質膜に速度１５フィート／分（４，６ｍ／分）でキ ャストした。被覆した膜を、次いで温度７℃に保つ水浴で２５重量％のグリセリ ン中に浸漬した。図１に関連して記載するコーティングプロセスのポリエステル 平滑化フィルムの長さはおよそ２〜３インチ（５〜８　ｃｍ）であり、空気圧シ リンダーの圧力は１５０ｐｓ　ｉ　（１１ｋｇ／ｃ−１）である。コーティング ポリエステルフィルムと浸漬浴との間の空気暴露は２インチ（５ｃｍ）であった 。

キャストした後に、複合膜を、２５℃に保つ水浴中に１分間浸漬し、次いで予備 洗浄したウェブを減圧を有する穿孔乾燥用ロールの上に運びかつ加熱した空気流 （１４０°Ｆ　（６０℃））を６フィート／分（１，８ｍ／分）で移動している ウェブの表面に当てて乾燥した。

メンプレインＡを例■に記載する通りにして親水化した。

乾燥した疎水性複合膜は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によってめる通りの中間多孔 質域厚さ７．２〜９．６ミクロンを有していた。

メンプレインＣと識別する本発明の第２膜は下記の通りにして造った： マサチューセッツ、ベトフォード在ミリポアコーポレイションが市販する平均細 孔寸法０．２２マイクロメーターを有するＤｕｒａｐｏｒｅ微孔質膜を予備成形 微孔質膜として使用した。膜を、イソプロパツールに溶解したグリセリン３０％ 溶液で処理して乾燥した。

メチルピロリドン中にポリ二弗化ビニリデン（ＰＶＤＦ、Ｋｙｎａｒ７４１．ペ ンシルバニア、フィラデルフィア在ベンウォルト）１９．８％及び塩化リチウム ５％を含有するポリマー溶液を、図１に例示する装置を利用してグリセリンで処 理したＤｕｒａｐｏｒｅ微孔質膜に速度１５フィート／分（４，６ｍ／分）でキ ャストした。被覆した膜を、次いで温度７℃に保つ水浴で２５重量％のグリセリ ン中に浸漬した０図１に関連して記載するコーティングプロセスのポリエステル 平滑化フィルムの長さは約２インチ（５ｃｍ）であり、空気圧シリンダーに供給 した圧力は１５０ｐｓｉ（Ｉ１ｋｇ／Ｃｆｆ１″）である。コーティングポリエ ステルフィルムと浸漬浴との間の空気暴露は２インチであった。キャストした後 に、複合膜を２５℃に保つ水浴中に１分間浸漬し、次いで予備洗浄℃たウェブを 減圧を有する穿孔乾燥用ロールの上に運びかつ加熱した空気流（１４０°Ｆ　（ ６０℃））を６フィート／分（１，８ｍ／分）で移動しているウェブの表面に当 てて乾燥した。

複合膜を下記の手順によって親水性にした：メンプレインＣをメンプレインＡと 同様にして親水化した。当たる乾燥空気温度は２７５°Ｆ（１３５℃）であった 、水性反応体コンセントレーシゴンはヒドロキシプロピルアクリレート５．１％ 、架橋剤及び遊離基開始剤を含有するものであった。

乾燥した疎水性複合膜は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によってめる通りの中間多孔 質域厚さ８．５ミクロンを有していた。

メンプレインＤと識別する本発明の第３膜は下記の通りにして造った： マサチューセッツ、ベトフォード在ミリボアコーポレイションが市販する平均細 孔寸法０．２２マイクロメーターを有するＤｕｒａｐｏｒｅ微孔質膜を予備成形 微孔質膜として使用した。膜を、イソプロパツールに溶解したグリセリン３０％ 溶液で処理して乾燥した。

メチルピロリドン中にポリ二弗化ビニリデン（ＰＶＤＦ、Ｋｙｎａｒ７４１．ペ ンシルバニア、フィラデルフィア在ベンウオルト）１９．９％及び塩化リチウム ４．９％を含有するポリマー溶液を、図１に例示する装置を利用してグリセリン で処理したＤｕｒａ−ｐｏｒｅ微孔質膜に速度１５フィート／分（４，６ｍ／分 ）でキャストした。被覆した膜を、次いで温度８℃に保つ水浴で２５重量％のグ リセリン中に浸漬した０図１に関連して記載するコーティングプロセスのポリエ ステル平滑化フィルムの長さは約２インチ（５ｃｍ）であり、空気圧シリンダー に供給した圧力は１５０ｐｓｉ（１１ｋｇ／　ｃｍ”　）である、コーティング ポリエステルフィルムと浸漬浴との間の空気暴露は２インチであった。

キャストした後に、複合膜を２５℃に保つ水浴中に１分間浸漬し、次いで予備洗 浄したウェブな減圧を有する穿孔乾燥用ロールの上に運びかつ加熱した空気流（ １４０′″Ｆ　（６０℃））を４〜６フィート／分（１，２〜１．８ｍ／分）で 移動しているウェブの表面に当てて乾燥した。

メンプレインＤをメンプレインＡと共に連続して親水化した。

乾燥した疎水性複合膜は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によってめる通りの中間多孔 質域厚さ８．１〜９．３ミクロンを有していた。

メンプレインＡを、市販されている限外ろ過膜であるＰＴＨＫ膜及びＰＬＭＫ膜 （共にベトフォードのミリボアコーポレイションから入手し得る）、及びマサチ ューセッツ、ダンバーズ在アミコンコーポレイションから入手し得るＹＭ−１０ ０膜と比較して、たんばく質シービング特性をたんば（質寸法及び剪断応力１１ ００　１／秒を達成するための一定循環流量における作業フラックスの関数とし てめた。

ウィルスメンプレインＡのたんばく質シービング特性は、０．６リツトル／メー トル２／時間（ＬＭＨ）及び６、ＯＬＭＨの両方において、代表的な１００，０ ００ダルトンカツトオフの市販されている限外ろ過膜のものと本質的に同等であ る。ウィルスメンプレインＡは、図４に示す通りに、両方の場合において、５０ ０，０００ダルトンカツトオフのミリボアＰＬＭＫ膜に比べて相当に密（ｔｉｇ ｈｔ）である。

上述した本例の３つの膜のログ減少値を、マサチューセッツ、ダンバーズのアミ コンコーポレイションから入手し得る市販されているＹＭ−１００膜；マサチュ ーセッツ、ベトフォードのミリボアコーポレイションから入手し得るＰＴＨＫ膜 （両者はほぼ同等のたんばく質シービング性を有することは前に示した）と比べ た。また、米国特許４，８２４，５６８号の例２に従って造りかつ上記した通り にして疎水化したＰＺＨＫ＃ｌ及びＰＺＨＫ＃２と識別する２つの膜並びにニュ ーヨーク、イーストヒルズのボールコーポレイションから入手し得る市販されて いるＵｌｔｉｐｏｒＯ，０４マイクロメーター膜も載せている。

ログ減少値は下記の手順によってめた。各々の膜に、食塩加リン酸緩衝液中にチ ャレンジ粒子を含有する溶液を用いて、接線フローセルにおいて剪断応力１１０ ０秒１及びフラックス３リットル／平方メートル／時間の条件下で試験を行った 。ろ液及びチャレンジ溶液のサンプルの粒子濃度を分析し、ＬＲＶをチャレンジ 濃度対ろ液濃度の比の対数として計算した。２つのチャレンジ粒子はバクテリオ ファージ、Ｐｈｉ　Ｘ　１７４及びＰｈｉ　６であり、それらのホストバクテリ アを用いてプラークアッセイによって検定する。稀釈シリーズを発生させて濃度 をめた０粒子はインディアナ、インディアナポリス在セラゲンダイアグノスチッ クスインコーポレイティドから入手し得るラテックス粒子である。

これらのラテックス粒子を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００界面活性剤で安定化 して凝集するのを防いだ、ラテックス粒子は、初め、デッドエンディド真空ろ過 によりカリフォルニア、プレザントン在ニュークレオボアから入手し得る０、０ ３ミクロン或は０．０５ミクロンのＮｕｃ　１　ｅ０ｐ０ｒ８フィルターの２５ ミリメートルディスクにろ液１０〜５０ｍ１を捕集して検定した。

Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅフィルターディスクの代表的な部分をＳＥＭステージに装 着し、２０を越えるフィールドの顕微鏡写真を記録する。これらの顕微鏡写真に おいて観察される粒子を数えて各々のサンプルにおけるラテックスの濃度をめる 。

これらの膜のログ減少値の比較を図５及び表１に示す。

図５及び表１に示す通りに、本発明の膜だけが溶液からウィルスの大きさの粒子 を、直径９３ｎｍの粒子についてログ保持価がＬＲＶ８．１の値まで粒子直径の 関数として単調に増大しながら、取り除くことができる。同様なたんばく質シー ビング性の市販されている限外ろ過膜は、ＬＲＶ値が粒子直径とほとんど関係な く測定した寸法範囲にわたり１７２〜ｌログだけ増大することを示す０本発明の 膜は、これらの市販されている限外ろ過膜に比べて、直径７０ｎｍを越える粒子 について粒子除去率少なくとも３〜４オーダーの大きさの向上をもたらす。加え て、表１に示す通りに、本発明の膜の性能は極めで再現性がある。

本明細書中に記載するキャスチング技法が米国特許４．８２４，５６８号の技法 より勝れて向上することにより、ＰＺＨＫ＃１及びＰＺＨＫ＃２の比べた場合、 測定した全粒子寸法範囲にわたり３〜５０グの性能向上に至った。

最後に、ＰＴＨＫ及びＵｌｔｉｐｏｒｅ膜は、図５に示す通りに、Ｈ３Ａたんば く賀の存在においてＰｈ１Ｘ　１７４の保持を損失することを立証した。このこ とは、Ｐｈｉ　Ｘ　１７４吸収がこれらの２つの膜に関して測定された粒子除去 に相当に寄与していることを示唆するものである。Ｈ５Ａの存在において、Ｐｈ ｉ　Ｘ１７４のＬＲＶは、本発明のメンプレインＡ及びメンプレインＣウィルス 膜でたんばく質濃度が極性化することによって３．０ログから３．７０グに増大 される。従って、測定された粒子の除去は主に大きさを基礎にして達成されてい る。

ｎｎ＋　Ｐｈ１Ｘ　６７ｎ＋ｓ　Ｐｈ１６　９３膿　２８　ｎｍ　ラテックス　 ７Ｊｌｎ■　ラテックスＡ　２．９　６．５　＞７．５　８．２Ｃ３，０６，７ ８，０ Ｄ　３．１　＞７．５ ＰＴ）ＩＫ　２．２　＜３．０６　３．５　＜３．５ＹＭ−１００３，１＜３． ４　３．３　３．９ポール　、０４ミクロン　０．７　＜３．３　４．２　４． ２ＰＺＨに１１　０．０ｇ　１．９２ ＰＺＨＫ＃２　０．０２５　−　０．１４例二匹 上記の通りにして造ったメンプレインＡと識別する本発明の膜を試験して接線フ ロ一作業条件がＰｈｉ　Ｘ１７４バクテリアウイルスを保持する能力に対して与 える効果をめた。

複合膜を、１モジユール３２を有する図９及び工０に示す装置と同様の、長さ２ ．４インチ（６，１ｃｍ）及び高さ０．００７８〜０．００６３インチ（０，２ ０〜０．１６ｍｍ）のチャンネルを有する装置に組み入れた。

ｐＨ７，４で直径２８ｎｍを有するｐｈｉ　ｘ１７４バクテリオファージを含む ０．２５重量％ヒト血清アルブミンたんばく質溶液（ＡｌｐｈａＴｈｅｒａｐｅ ｕｔｉｃ）を調製した。ＬＲＶを膜を通るフラックスの関数として及び循環流量 対ろ液流量の比の関数としてめるために、溶液を分離装置の中に通した。結果を 図６及び７に示す。

図６に示す通りに、ファージの保持は膜内外（トランスメンプレイン）フラック スの関数としてわずかに増大するが、フラックスを小さい値に戻す際に性能は可 逆的であり、性能はたんばく質濃度極性化と一致する。

本発明のＰＶＤＦ複合膜を試験して循環流量対ろ液流量の比がＬＲＶに対して与 える効果をめた０図７に示す通りに、Ｐｈｉ　Ｘ　１７４保持は、この流量比を 増大するにつれて、デッドエンドろ過装置のものを越えて増大する。従って、循 環流量を増大させるか或は転化率（この流量比の逆数）を減少させるにつれての いずれかで、Ｐｈｉ　Ｘ　１７４保持は、循環流量がゼロでありかつ転化率が１ ００％であるデッドエンドイドろ過において測定される保持より勝って向上され る。図７から分かる通りに、ファージＬＲＶは循環流量対ろ液流量の比が２５： ｌの値を越えると関係しない。

乳１ 本例の膜メンプレインＥを、チャンネルアスペクト比がウィルスログ減少に対し て与える効果をめることができるように、ｌモジエール３２を有する図９及び１ ０に示す装置と同様の、長さ２．４〜１１．０インチ（６、１〜２７　、９　ｃ 　ｍ　）及び高さ０．００４〜０．０３０インチ（０，１０〜０．７６ｍｍ）の チャンネルを有する装置で試験した。

メンプレインＥは下記の通りにして造った：マサチューセッツ、ベトフォード在 ミリポアコーポレイションが市販する平均細孔寸法０．２２マイクロメーターを 有するＤｕｒａｐｏｒｅ微孔質膜を予備成形微孔質膜として使用した。膜を、イ ソプロパツールに溶解したグリセリン３０％溶液で処理して乾燥した。

メチルピロリドン中にポリ二弗化ビニリデン（ＰＶＤＦ、Ｋｙｎａｒ７４１．ペ ンシルバニア、フィラデルフィア在ペンウオルト）２０％及び塩化リチウム５％ を含有するポリマー溶液を、図１に例示する装置を利用してグリセリンで処理し たＤｕｒａｐｏｒｅ微孔質膜に速度１５フィート／分（４，６ｍ／分）でキャス トした。被覆した膜を、次いで温度７℃に保つ水浴で２５重量％のグリセリン中 に浸漬した０図１に関連して記載するコーティングプロセスのポリエステル平滑 化フィルムの長さはおよそ２〜３インチ（５〜８ｃｍ）であり、空気圧シリンダ ーに供給した圧力は１５０ｐ、ｓｌ（１１ｋｇ／　ｃｍ″）である。コーティン グポリエステルフィルムと浸漬浴との間の空気暴露は２インチであった。キャス トした後に、複合膜を２５℃に保つ水浴中に１分間浸漬し、次いで予備洗浄した ウェブな減圧を有する穿孔乾燥用ロールの上に運びかつ加熱した空気流（１４０ ″Ｆ（６０℃））を４〜６フィート／分（ｌ、２〜１．８ｍ／分）で移動してい るウェブの表面に当てて乾燥した。

乾燥した疎水性複合膜は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によってめる通りの中間多孔 質域厚さ６〜１０ミクロンを有していた。

Ｈ５Ａの存在及び不存在の両方において、ｐｈｔ　ｘ１７４を含有するＰＢＳ溶 液を用いて試験を行った際の結果を図８に示す、試験はすべてチャンネル剪断速 度１１００秒〜１及び３リットル／平方メートル／時間のフラックスで行った。

チャンネルアスペクト比は、約１００の値を越えてウィルスの保持に対してほと んど効果を持たない。

４工 上記の通りにして造ったメンプレインＡと識別する本発明の膜を図２ｄの２段系 において使用して実施において採用することができる通りに系における性能を立 証した。２段系を接線フロー条件下で両方の段において循環剪断応力１１００秒 −１及び容積フラックス６リツトル／平方メートル／時間にして運転した。加工 した流体容積は２００ｍ１でありかつ各々の場合における加工時間は約５時間で あった。

食塩加リン酸緩衝液中Ｈ３Ａ０．２５％からなる供給溶液にファージ、１つの場 合Ｐｈｉ　Ｘ　１７４を及び第２の場合Ｐｈｉ　６を各々約５ｘｌＯ’ｐｆｕ／ ｍｌで加えた。各々の流れにおいてサンプルを抜き取って結果を表■及び■に報 告し、表■及び■で呼ぶ流れ番号を図２ｄに示す、測定したＨ３Ａ濃度対出発原 料のＨＳＡ濃度の比及び５時間後の各々の流れにおけるウィルスＬＲＶ値を報告 する。Ｈ３Ａ濃度比を図４に提示する排除係数に基いて計算した値と比較する。

各々の流れにおける濃度は、膜の性質に従ってＨ３Ａ回収率を示す理論値の近く に合う、Ｐｈｉ　Ｘ　１７４の場合、段ｌ及び２の流出物において４．２０グ及 び４．８０グの除去がそれぞれ測定され、最終の加工された流体において合計５ ．６０グの総括除去率が測定される。Ｐｈｉ　６の場合、どちらの段の流出物中 にもＰｈｉ　６は測定されなかった０両方の実験で、第１段循環流から抜き出し た流れ３１においてウィルスが回収される。

轟−一旦 理論的　測定した　Ｘ１７４ え出　」五ム」ユ　」ｎ１ｉｔユＬ− ２６，９２，８９４，２ ３８、９０、９０４，８ ４６ｓ、ｓ ３１　１．８　２．０　０．６ ５２　２．０　１．４　０．７ ストークス半径（入） ストークス半径（ハ） 〇− （権）”（ｎｍ２） ）−０−１。

４ｔｌ　４ｎ　ｏ　ご ＊　＊　■　ゝ …　ＳＪ 。　。　バ 碕　々 、へ　八　〇−、（ｈ Ｃ） ウィルス性粒子のような粒子をたんばく質溶液のような溶液から選択的に取り去 ることができる複合膜及びその膜を利用した方法を提供する。膜は多孔質膜支持 体。

限外ろ過分離特性を有する表面スキン及び支持体とスキンとの間の中間多孔質域 を含み、中間域は支持体に比べて小さい平均細孔寸法を有する。中間域はスキン を貫いて支持体と直接流体連絡するボイドが存在しない。複合材料は溶液から選 択的に粒子を僅少なくとも３（除去率９９．９％）でログ減少させることができ る。

手続補正書 平成４年４月１０日

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．平均寸法約０．０５〜１０ミクロンの細孔を有する支持体、表面スキン及び 支持体とスキンとの間に位置された中間多孔質域を含み、該中間域は多孔質であ りかつスキンから膜支持体に及ぶボイドが存在しないウイルス粒子の大きさの特 性を示す寸法範囲内の寸法を有する粒子を含有する溶液から該粒子を選択的に分 離する複合不整膜であって、たんぼく質分子量カットオフ約５×１０２〜５×１ ０аダルトンを特徴としかつログ減少値なくとも約３を生じることができ、該ロ グ減少値は直径約１０〜１００ナノメートルの粒子寸法範囲において粒子直径の 単調に増加する関数である前記複合膜。
2. ２．前記中間多孔質域が厚さ約５〜２０ミクロンを有する請求項１の複合膜。
3. ３．支持体が微孔質腹である請求項１の複合膜。
4. ４．中間多孔質域が厚さ約５〜２０ミクロンを有する請求項３の複合膜。
5. ５．膜支持体がポリニ弗化ビニリデンから形成される請求項３の複合膜。
6. ６．膜支持体がポリニ弗化ビニリデンから形成される請求項４の複合腹。
7. ７．前記スキン、前記中間多孔質域及び前記膜がポリニ弗化ビニリデンから形成 される請求項３の複合腹。
8. ８．中間域厚さ約５〜１０ミクロンを有する請求項５、６又は７のいずれか一の 複合腹。
9. ９．フラットシートの形状の請求項１、２、３又は４のいずれか一の複合膜。
10. １０．中空繊維の形状でありかつ前記スキンが該繊維の外面を構成する請求項１ 、２、３又は４のいずれか一の複合腹。
11. １１．親水性表面を有する細孔を有する請求項１、２、３又は４のいずれか一の 複合膜。
12. １２．溶液から寸法約１０〜１００ナノメートルの粒子をログ減少値なくヒも約 ３で選択的に取り除く方法であって、第１ろ過工程で、該溶液を請求項１の複合 膜のスキンに直接接触させて通してスキンによる粒子の保持を行わせて粒子冨化 溶液を形成し、同時に実質的に粒子の存在しない溶液中の溶質を複合腹の中に通 させることを含み、粒子除去のログ減少値は粒子の直径の単調に増加する関数で ある前記方法。
13. １３．粒子がウイルス粒子であり、前記溶液がたんぼく質溶液である請求項１２ の方法。
14. １４．前記腹の中間多孔質域が厚さ約５〜２０ミクロンを有する請求項１２の方 法。
15. １５．スキン、中間多孔質域及び前記膜支持体をポリニ弗化ビニリデンから形成 する請求項１２の方法。
16. １６．前記複合膜がフラットシートの形状である請求項１２、１３又は１４のい ずれか一の方法。
17. １７．前記粒子冨化溶液の少なくとも一部を循環させて前記複合膜の前記スキン に直接接触させる請求項１２、１３又は１４のいずれか一の方法。
18. １８．前記複合腹がフラットシートの形状であり、前記粒子冨化溶液の少なくと も一部を循環させて前記複合膜の前記スキンに直接接触させる請求項１２、１３ 又は１４のいずれか一の方法。
19. １９．前記粒子冨化流を第２ろ過工程で請求項１の第２複合膜のスキンに直接接 触させて通して第２粒子冨化溶液及び実質的に粒子の存在しない第２溶液を生成 する請求項１２、１３又は１４のいずれか一の方法。
20. ２０．前記粒子冨化流を第２ろ過工程で請求項１の第２複合膜のスキンに直接接 触させて通して第２粒子冨化溶液及び実質的に粒子の存在しない第２たんぱく質 溶液を生成しかつ第１或は第２粒子冨化溶液の少なくとも一方をろ過工程の一方 に循環させる請求項１２、１３又は１４のいずれか一の方法。
21. ２１．ウイルス粒子の大きさの特性を示す寸法範囲内の寸法範囲を有する粒子を 含有する溶液から該粒子を分離する複合不整膜の製造方法であって、回転ドラム と固定ローラーとの間にニップを形成し、平均寸法約０．１０５〜１０ミクロン の細孔を有する支持体を回転ドラムの上に位置させ、平滑フィルムを固定ローラ ーの上にニップを通しかつそれを通り越して位置させ、ポリマー溶液をニップに 導入して膜支持体上にコーティングを形成し、塗布されたポリマー溶液を膜支持 体上で凝固させ、塗布されたポリマー及び膜支持体を乾燥させることを含む方法 。
22. ２２．前記支持体がポリニ弗化ビニリデンであり、前記ポリマー溶液がポリニ弗 化ビニリデン約１０〜２１重量％を含有する請求項１８の方法。
23. ２３．前記支持体を保護剤で処理した後に支持体に前記ポリマー溶液を接触させ てポリマー溶液中の溶媒が膜支持体に与える悪影響を最小限にする請求項２１又 は２２のいずれか一の方法。
24. ２４．前記支持体がポリニ弗化ビニリデンであり、前記ポリマー溶液がポリニ弗 化ビニリデン約１９〜２１重量％を含有する請求項２１の方法。