JPH04507195A - 腫瘍壊死因子結合リガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍壊死因子結合リガンド 本発明の分野 この発明は、ヒト腫瘍壊死因子アルフｙ　（ｔｕｍｏｕｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　 ｆａｃｔｏｒ　ａｌｐｈａ：　ＴＮＦ）に結合するリガンドに関するのもので、 この結合によってＴＮＦの生物学的活性が修飾される。ここでいう修飾は、すで に明らかにされているような、ＴＮＦアルファに結合してＴＮＦアルファの活性 すべてを阻害する抗体によるものとは異なるものである。新規の発見は、ＴＮＦ アルファの翼なる活性を阻害したり、促進したりするものである。また、本発明 は、ＴＮＦに結合する分子を含む組成物と、ＴＮＦに対して活性を示す分子およ びＴＮＦを用いた治療方法とに関するものである。

本発明の背景 膿瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）は、活性マクロファージによって産生されるズ され、エントド牛シン（Ｌ　Ｐ　Ｓ）によってチャレンジされた実験動物の血清 中において最初に発見された。ＴＮＦの計画的な投与によって、ヘモルハジフク （ｈａｅ閣ｏｒｒｈａｇｉｃ）な壊死が、マウスの移植可能な腫瘍に見出される 。一方、インビトロ系ではＴＮＦは腫瘍細胞系に対して細胞溶解性（ｃｙｔｏｌ ｙｔｌｃ）または細胞不活性（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ）効果を示す＠宿主保護効 果に加えて、ＴＮＦは敗血症（ｓｅｐｔｉｅｓｍｉａ）　、悪液質（ｃｈｉｃｈ ａｘｌａ）、そして脳マラリア（ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｍａｔ訂１ａ）の原因とな る因子とみなされてきた。

ＴＮＦに対する多クローン性ウサギ血清によるマウスの受動免疫は、感染に先立 つてされた場合、中毒ン１ツクのイニシェート剤であるＬＰＳエンドトキンンの 致死効果からマウスを守ることが示されている。

ＴＮＦをコードする遺伝子はクローン化されており、評価されるべき強力なガン 治療剤としてこのモノカイン（ｓｏｎｏｋｌｎｅ）の有用性が示されている。

一方、ステージｌ臨床トライアルにおける癌患者へのＴＮＦ点滴によって膿瘍が 退行するが、一方で血小板減少症、リンパ球減少症、肝毒性、腎臓障害、そして 高血圧症などのような副作用が報告されている。ＴＮＦの臨床での使用に伴うこ れらの顕著な副作用は、数多くの知られているＴＮＦの効果から予測されるもの であり、そのいくつかは第１表に挙げられている。

（以下、余白） ＴＮＦの生物学的活性 抗腫瘍活性 抗ウィルス活性 抗寄生物活性 機能 腫瘍細胞に対する細胞毒性昨月 発熱原活性 ９ボタンバク質リパーゼ阻害 好中球活性化 破骨細胞活性 内皮細胞、単球、そして腫瘍細胞プロコアゲラント活性内皮細胞上の表面抗原誘 導 ＩＬ−５誘導 ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｆｏｓの誘導 夏Ｌ−１の誘導 ＴＮＦ合成の誘導 ＧＭ−Ｃ８Ｆ合成の誘導 プロスタグランジンおよびコラゲナーゼ合成増加急性相タンパク質ｃ３の窮導 とくに重要な点は、内皮および抹消血単球の一連のＴＮＦ活性として起こる凝固 活性にある。播種住血管内凝固は中毒シ璽ツク（ｔｏｘｉｃ　５ｈｏｃｋ）に関 連しており、また胃腸癌、肺臓癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、子宮癌、メラ／−マ 、急性白血病、骨髄層、骨髄増殖性症候群、そして骨髄芽性白血症などの多くの 癌に関連している。腫瘍退行活性に影響のなく凝固のような好ましくない効果が 除去またはマスクされるようなＴＮＦ活性の修飾は、より一層癌治療に有益なも のとなるが、一方でＴＮＦ活性の完全な廃止が中毒シ賢ブクの完全治癒にめられ る。

部位特異性抗体（多クローンおよびモノクローン）の利用によるホルモン活性の 分離によってホルモン活性を強めることができる（Ａｓｔｏｎ　１９８９．　Ｍ ａｔ、Ｌｓｍｕｎｏｌ、　２６．４３５）。今日、３次元構造が既知のＴＮＦ分 子の特定領域に対する機能または抗原性を同定する試みがわずかながらなされて いる。そのような領域に対する機能の同定は、治療目的に合ったモノクローン抗 体および他のリガンドの開発を可能とする。アミノ酸１から１５に対する多クロ ーン性抗体によるヒーラＲ１９細胞受容体結合を阻害することが報告されている （Ｓｏｃｈｅｒ　ａｔ　１．、１９８？、　ＰＮＡＳ８４、　＋１８２９）。一 方で、ＴＮＦ上の未決定の構造的エピトープを認識するモノクローン抗体がイン ビトロ系でＴＮＦの細胞毒性活性を阻害することが報告されていが他のＴＮＦ活 性に対してどのような効果を示すかは明らかではない。

本発明の記載 本発明者は、ヒトＴＮＦに対して活性を示すモノクローン抗体ライブラリーを作 った。そして、ＴＮＦの抗腫瘍効果（インビトロおよびインビボ系）と、ＴＮＦ 受容体結合と、凝固の活性化（インビトロおよびインビボ系）と、そして限定さ れたそれらのトポグラフィツクな特異性とに対するそれらの抗体の効果について 調べた。このようなアプローチによって、本発明者はＴＮＦアルファの異なるト ポグラフィ、りな領域が、異なる活性に関係していることを発見した。したがっ て、本発明者は、ＴＮＦアルファ活性を選択的に高めるか阻害するりガツトまた は抗体の同定を可能とし、それによってＴＮＦアルファを含む改善された治療薬 や治療方法を提供する。

本発明の第一の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるもので、この リガンドがＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの下記生物学的活性が阻害される。

１、Ｗ瘍退行（ｔｕｍｏｕｒ　ｒｅｇｕｒｅｓｓｉｏｎ）２、内皮プロファギュ ラント（ｅｎｄｏｔｂｅｌｉａｌ　ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）の誘導３、Ｗ瘍 フィブリン沈着（ｔｕｍｏｕｒ　ｆｉｂｒｉｎ　ｄｅｐｏ８ｉｔｉｏｎ）の誘導 ４、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｅｌｔｙ）５、受容体結合（ｒｅｃｅｐｔｏｒ 　ｂｌｎｃｌｌｎｇ）本発明の好ましい実施態様では、リガンドは抗体、Ｆ（ａ ｔ＋）断片、再構成抗体（ＣＤＲ移植ヒト化抗体（ｇｒａｒｔｅｄｈｕｍａｎｊ ｓｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）　）単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）　、単一鎖 抗体、血清結合タンパク質、受容体、そして天然の阻害剤から選択される。また 、リガンドは合成されたタンパク質またはペプチドであって前記断片のひとつと 類似している。しかし、好ましくは、リガンドはモノクローン抗体またはそのＦ （ａｂ）断片である。

本発明の第二の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なりガントからなるものであって 、ＴＮＦへのリガンドの結合によって、残基１−１８．５８−６５．１１５−１ ２５、そして１３８−１４’９からなるトポグラフィツク領域、または残基１− １８．１０８−１２８からなるトポグラフィツク領域、または残基５８−７９． １１０−１２７、そして１３５−１５５からなるトポグラフィツク領域が実質的 に、自然発生的な生物学的活性リガンドに対する結合から遮るようにしてのリガ ンドがＴＮＦに結合することによって、ＴＮＦによる内皮ブロコアギュラント誘 導、腫瘍退行、腫瘍フィブリン沈着誘導、細胞毒性、そして受容体結合を阻害す る。

本発明の第三の発明は、主として残基１−２０からなるトポグラフィツク領域と 、残基５６−７７からなるトポグラフィツク領域と、残基１０８−１２７からな るトポグラフィツク領域と、モして残基１３８−１４９からなるトポグラフィツ ク領域からなる群から選択される少なくとも２つの領域によって、ヒトＴＮＦに 結合可能なりガツトからなるものである。

本発明の第三の発明にもとづく好適な実施態様では、リガンドはトポグラフィツ ク領域１−１８．５８−６５．１１５−１２５、そして１３ｇ−１４９において ヒトＴＮＦと結合する。このような配列からなる領域をトポグラフィツクにして 第２３図に示した。

本発明の第三の発明にもとづくより好適な実施態様では、リガンドはトポグラフ ィツク領域１−１８および１０８−１２８においてヒトＴＮＦと結合する。この ような配列からなる領域をトポグラフィツクにして第２４図に示した。

本発明の第二の発明にもとづくより好適な実施態様では、リガンドはトポグラフ ィツク領域５６−７９．１１０−１２７．モして１３６−１５５においてヒトＴ ＮＦと結合する。このような配列からなる領域をトポグラフィツクにして箪２５ 図に示した。

本発明の第一、第二および第三の発明にもとづく特に好適な実施蝮様では、リガ ンドは、ＭＡＩ）１、ＭＡｔ＋４７、そしてＭＡｂ５４と指定されたモノクロー ン抗体からなる群から選択される一種類のモノクローン抗体である。ＭＡｂｌ、 ＭＡｂ４７、そしてＭＡｂ５４を産生するハイブリドーマからなる細胞系統の試 料は、英国（Ｐｏｒｔａｎ　Ｄｏｗｎ、　５ａｌｌｓｂａｒｙ、　Ｗｌｌｔｂｓ ｈｌｒｅ　ＳＦ３０ＪＧ、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）■ あるヨーロピアンコレクシ菖ンオブアニマルセルカルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａ ｎ　Ｃｏ１１ｃｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍ＠ｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ ；　ＥＣＡＣＣ）　、ワクチン開発製造研究所（ＶａｃｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃ ｈ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、公衆衛生ラボ ラトリ−サービス（Ｐｕｂｉｅ　Ｈｅａｌｔｈ　ＬａｂｏｒａｔＯｒｙ　５ｅｒ ｖｉｃｅ）　％応用微生物学研究センター（、Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌ ［ｅｄ　Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　ヘ寄託され た。ＭＡＩ）１は、１９８９年８月３日に寄託され、その登録番号は８９０８０ ３０１である。ＭＡｂ５４は、１９８９年８月３１日に寄託され、その登録番号 は８９０８３１０３である。ＭＡｂ本発明の第四の発明は、本発明の第一、第二 または第三の発明にもとづくリガンドと組み合わさってＴＮＦを含む組成物から なるものである。この組成物は、そのＴＮＦに対してリガンドが結合することを 特徴とする。

本発明の第五の発明は、本発明の第一、第二または第三の発明にもとづくリガン ドもしくは本発明の第四の発明にもとづく組成物のどちらか一方を投与すること からなる中毒ノ曹１り治療方法からなるものである。

本発明の第六の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるものであって 、このリガンドはＴＮＦに結合することによって、ＴＮＦの内皮プロコアギ１ラ ント活性誘導を阻害し、内皮細胞上の受容体へのＴＮＦ結合を阻害し、そしてＴ ＮＦによる腫瘍フィブリン沈着誘導および腫瘍退行活性を促進させるが、一方で 細胞毒性は影響されず、またＴＮＦの腫瘍受容体結合活性については影響を受け ないかあるいは促進される。

本発明の第七の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドに関するものであって 、このリガンドはＴＮＦに結合することによって、ＴＮＦの内皮プロコアギ二ラ ント活性誘導を阻害し、内皮細胞上の受容体へのＴＮＦ結合を阻害し、そしてＴ ＮＦによる腫瘍フィブリン沈着誘導および腫瘍退行活性を促進させる。ＴＮＦへ のこのリガンドの結合は、残基１−３０，１１７−１２８、モして１４１−１５ ３からなるトポグラフィツク領域によって限定されるＴＮＦのエピトープが自然 発生的な生物学的活性リガンドへの結合を遮られることによって起こる。

本発明の第への発明は、残基１−３０．１１７−１２８、モして１４１−１５３ からなるトポグラフィツク領域においてヒトＴＮＦに結合するリガンドからなる 。

この第への発明の好適な実施態様では、リガンドは残基１−２６、ｌｔ７−ｔ２ ｇ、％して１４１−１５１のトポグラフィツク領域においてヒトＴＮＦへ結合す る。そのような配列からなる領域は、トポグラフィツクに第２６図に示した。

本発明の第六、第七および第への発明にもとづく好適な実施態様では、リガンド は、ＭＡｂ３２と指定されたモノクローン抗体である。ＭＡｂ３２を産生するハ イフリトーマからなる細胞系統の試料は、英国（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　５ ａｌｉｓｂｕｒｙ、　ｆｌｌｔｈｓｈｉｒｅ　ＳＦ３０ＪＧ、　Ｕｎｉｔｅｄに ｉｎｇｄｏｗ＋）にあるヨーロピアンフレクシ冒ンオブアニマルセルカルチャー ズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔ４ｏｎ　ｏｆ　Ａｎ＋＋＊ｉｌ　Ｃｅ１ ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ；　ＥＣＡＣＣ）、ワクチン開発製造研究所（Ｖ＠ｃｅｊ ｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ）、公衆衛生ラボラトリ−サービス（Ｐｕｂｊｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ）　、応用微生物学研究センター（Ｃｅｎｔｒｅ　 ｆｏｒ＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）　ヘ１９８９年８月３日に寄託され、その登録番号は８９０８０３０２である 。

本発明の第九の発明は、本発明の第六、第七または箪への発明にもとづくリガン ドと組み合わさってＴＮＦを含む組成物からなるものである。この組成物は、そ のＴＮＦに対してリガンドが結合することを特徴とする。投与されたサイトカイ ンの活性を修飾するためにモノクローン抗体（−＾ｂ）とともにＴＮＦを投与す ることを開示した文献はいままでのところない。

本発明の箪十の発明は、本発明の第六、第七または第への発明にもとづくリガン ドもしくは本発明の第九の発明にもとづく組成物のどちらか一方を投与すること を含むもので、ＴＮＦによって腫瘍の増殖を阻害する腫瘍処置方法に関するもの である。

本発明の第十−の発明は、ヒトＴＮＦの残基１−１８へ結合するりガント（ペプ チド３０１）からなるものである。

本発明の第十三の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるものであっ て、このリガンドはＴＮＦへ結合することによって、ＴＮＦの内皮ブロコアギュ ラント活性誘導を阻害し、腫瘍フィブリン沈着誘導および腫瘍ボ行を促進させる が、ＴＮＦの細胞毒性は影響されず、またＴＮＦの腫瘍受容体結合活性は影響さ れないかあるいは促進される。リガンドのＴＮＦへの結合は、残基１−１８から なるトポグラフィツク領域によって限定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自 然発生的な生物学的活性リガンドへの結合を遮られることによってなされる。

本発明の第十三の発明は、本発明の第１１または第１２の発明にもとづくリガン ドと組み合わさってＴＮＦを含む組成物からなるものである。この組成物は、そ のＴＮＦに対してリガンドが結合することを特徴とする。

本発明の第十四の発明は、・本発明の第十−または第十三の発明にもとづくリガ ンドもしくは本発明の第十三の発明にもとづく組成物のどちらか一方を投与する ことを含むもので、ＴＮＦによって腫瘍の増殖を阻害する膿瘍処置方法に関する ものである。

本発明の第十三の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるものであっ て、このリガンドはＴＮＦへ結合することによって、ＴＮＦの内皮ブロコアギュ ラント活性誘導を阻害し、腫瘍フィブリン沈着活性を促進させるが、ＴＮＦの細 胞毒性および腫瘍退行は影響されず、またＴＮＦの腫瘍受容体結合活性も影響さ れない。

本発明の第十六の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるものであっ て、このリガンドがＴＮＦへ結合することによっては、ＴＮＦの細胞毒性および 腫瘍退行は影響されないが、内皮プロコアギ１ラント活性銹導およびＴＮＦの腫 瘍フィブリン沈着活性は阻害され、さらにＴＮＦの腫瘍受容体結合活性は影響さ れない。リガンドのＴＮＦへの結合は、残基２２−４０．４９−９７，１１０− １２７、そして１３６−１５３からなるトポグラフィツク領域によって限定され るＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学的活性リガンドによって遮 られるものである。

本発明の策士七の発明は、残基２２−４０．４９−９７．１１０−１２７、モし て１３６−１５３からなるトポグラフィツク領域においてヒトＴＮＦへ結合する リガンドからなるものである。そのような配列からなる領域は、トポグラフィツ クに第２７図に示した。

本発明の第十七の発明の好適な実施態様では、残基２２−４ｏ、４９−９６．１ １０−１２７、そして１３６−１５３からなるトポグラフィツク領域においてヒ トＴＮＦへ結合するリガンドからなるものである。この領域はＴＮＦアルファの ３Ｄ構造におおよそある。

本発明の第十三、第十六および第十七の発明の好適な実施態様では、リガンドは ＭＡｂ４２と指定されたモノクローン抗体である。このＭＡｔ）４２を産生する ハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　Ｓ ｓ目５ｂｕｒｙ、　ＩＦｉＨｈｓｈｉｒｅ　ＳＦ３０ＪＧ、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋ ｉｎｇｄｏｍ）にあるヨーロピアンフレクシ豐ンオブアニマルセルカルチャーズ （Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ！ｌ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ：　ＥＣＡＣＣ）、ワクチン開発製造研究所（Ｖａｃｃｉｎｅ 　ＲｅＳｅｍｒｅｂ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） 　％公衆衛生ラボラトリーサービス０ｕｂｉｅ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　５ｅｒＶ１ｃｅ＞　％応用微生物学研究センター（Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏ ｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） 　６１９８９年８月３日に寄託され、その登録番号は８９０８０３０４である。

本発明の策士への発明は、本発明の第十三、第十六または策士七の発明にもとづ （リガンドと組み合わさってＴＮＦを含む組成物からなるものである。この組成 物は、そのＴＮＦに対してリガンドが結合することを特徴とする。

本発明の第十九の発明は、本発明の第十三、第十六または茶十七の発明にもとづ くリガンドもしくは本発明の箪十への発明にもとづく組成物のどちらか一方を投 与することを含むもので、ＴＮＦによって腫瘍の増殖を阻害する腫瘍処置方法に 関するものである。

本発明の第二十の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドに関するものであっ て、このリガンドはＴＮＦに結合することによって、ＴＮＦの腫瘍フィブリン沈 着活性を促進させ、一方で、ＴＮＦの内皮ブロファギエラント活性誘導には影響 を与えないが、細胞毒性、腫瘍退行、そしてＴＮＦの受容体結合活性を阻害する 。

本発明の第二十−の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドに関するものであ って、このリガンドはＴＮＦに結合することによって、ＴＮＦの腫瘍フィブリン 沈着活性を促進させ、一方で、ＴＮＦの内皮ブロコアギニラント活性誘導には影 響を与えないが、細胞毒性、腫瘍退行、そしてＴＮＦの受容体結合活性を阻害す る。そして、このリガンドのＴＮＦへの結合は、残基残基１２−２２．３８−４ ５．９６−１０５、そして１３２−１５７からなるトポグラフィツク領域によっ て限定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学的リガンドによ って遮ぎられものである。

本発明の第二十三の発明は、残基１２−２２．３６−４５．９６−１．０５．そ して１３２−１５’７からなるトポグラフィツク領域においてヒトＴＮＦへ結合 するりガントからなるものである。この領域はＴＮＦアルファの３Ｄ構造におお よそある。そしてトポグラフィツクに第２８図に示した。

本発明の第二十、第二十−および第二十三の発明の好適な実施態様では、リガン ドはＭＡｂ２５と指定しれたモノクローン抗体である。このＭＡｂ２５を産生す るハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　 ５ａｌｊｓｂｕｒｙ、　Ｗｉｌｔｈｓｈｉｒｅ　ＳＦ３０ＪＧ、Ｕｎｉｔｅｄ　 Ｋｉｎｇｄｃｙｍ）にあるヨーロピアン）Ｌ／クン璽ンオブアニマルセルカルチ ャーズ（ＩＩ：ｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ＾ｎｉｍａｌ　Ｃ ｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒａｓ：　ＥＣＡＣＣ）　、ワクチン開発製造研究所（Ｖａ ｃｃｉｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａ Ｌ。

ｒｙ）　、公衆衛生ラボラトリ−サービス（Ｐｕｂｉｅ　Ｈｅａｌｔｈ　ｔ、ａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｒＶ１ｃｅ’）　一応用微生物学研究上／ター（Ｃｅｎ ｃｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ）へ１９８９年１２月１４日に寄託され、その登録番号は８９１２４ ０１である。

本発明の第二十三の発明は、ヒトＴＮＦに結合するリガンドからなるものであっ て、このリガンドはＴＮＦに結合することによって、ＴＮＦの腫瘍フィブリン沈 着活性を促進させ、一方で、細胞毒性、腫瘍退行、ＴＮＦの内皮プロファギュラ ント活性誘導、そしてＴＮＦの受容体結合活性を阻害する。

本発明の第二十四の発明は、ヒ）ＴＮＦに結合可能なリガンドに関するものであ って、このリガンドはＴＮＦに結合することによって、ＴＮＦの腫瘍フィブリン 沈着活性を促進させ、一方で、細胞毒性、腫瘍退行、ＴＮＦの内皮プロコアギュ ラント活性誘導、そしてＴＮＦの受容体結合活性を阻害する。このＴＮＦへのリ ガンドの結合は、残基１−２０および７６−９０からなるトポグラフィツク領域 によって限定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学的リガン ドによって遮ぎられものである。

本発明の第二十三の発明は、残基１−２０および７６−９０からなるトポグラフ ィツク領域においてヒトＴＮＦに結合するりガントからなるものである。これら の領域は、ＴＮＦアルファの３Ｄ構造におおよそある。モしてトポグラフィツク に第２９図に示した。

本発明の第二十三の発明の好適な実施態様では、リガンドは残基１−２８および ７６−９０からなるトポグラフィツク領域においてヒトＴＮＦに結合する。

本発明の第二十三、第二十四および第二十三の発明の好適な実施態様では、リガ ンドはＭＡｂ２１と指定しれたモノクローン抗体である。このＭＡＩ）２１を産 生ずるハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ 、　５ａｌｌｔｂｕｒｙ、　ｆｉｌｔｂｓｈｉｒｅ　ＳＦ３０ＪＧ、Ｕｎｉｔｅ ｄ　Ｈｎｇｄｏｍ）にあるヨーロピアンコレクンＨンオブアニマルセルカルチャ ーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ −Ｉ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ：　ＥＣＡＣＣ）　、ワクチン開発製造研究所（Ｖａｃ ｃｉｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｃ＋ｒａ ｔ。

ｒｙ）　、公衆衛生ラボラトリ−サービス（Ｐｕｂｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｏ）、応用微生物学研究センター（Ｃｅｎｔｒｅ 　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｊｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ）へ１９９０年１月２５日に寄託され、その登録番号は９００１２４３２で ある。

本発明の第２６の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なりガントに関するものであっ て、このリガンドはＴＮＦに結合するものであるが、ＴＮＦの腫瘍フィブリン沈 着活性には影響が及ばず、しかし細胞毒性、腫瘍退行、ＴＮＦの内皮プロコアギ ュラント活性誘導、モしてＴＮＦの受容体結合活性が阻害される。

本発明の第２７の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なりガントに関するものであっ て、このリガンドはＴＮＦに結合するものであるが、ＴＮＦの膿瘍フィブリン法 曹活性には影響が及ばず、しかし細胞毒性、腫瘍退行、ＴＮＦの内皮ブロファギ ニラント活性誘導、そしてＴＮＦの受容体結合活性が阻害される。このＴＮＦへ のリガンドの結合は、残基２２−４０．６９−９７．１０５−１２８、そして１ ３−１５５からなるトポグラフィツク領域によって限定されるＴＮＦのエピトー プが実質的に自然発生的な生物学的リガンドによって遮ぎられものである。

本発明の第二中への発明は、残基２２−４０．６９−９７．１０５−１２８、モ して１３−１５５からなるトポグラフィツク領域においてヒ）ＴＮＦに結合する リガンドからなるものである。これらの領域は、ＴＮＦアルファの３Ｄ構造にお およそある。モしてトポグラフィツクにＪＰｒ３０図に示した。

本発明の第二十六、第二中上および第二中への発明の好適な実施態様では、リガ ンドはＭＡｔ＋５３と指定しれたモノクローン抗体である。このＭＡｂ５３を産 生するハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ 、　５ａｌｌｓｂｕｒｙ、　Ｗｌｌｔｈｓｂｌｒｅ　ＳＦ３０ＪＧ、　ｌ１ｎｌ ｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）にあるヨーロビアノコレクションオブアニ７　／Ｌｌ セルカルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃ目ｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａ ｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ：　ＥＣＡＣＣ）　、ワクチン開発製造研究所 （Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｊｏｎ　Ｌａｂ ｏｒａｔ。

ｒｙ）　、公衆衛生ラボラトリ−サービス（Ｐｕｂｉｅ　１ｌｅａｌｔｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ）、応用微生物学研究センター（Ｃｅｎｔｒ ｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ）へ１９９０年１月２５日に寄託され、その登録番号は９００１２４３３ である。

本発明の第二十九の発明は、ヒ）ＴＮＦに結合可能なリガンドに関するものであ って、このリガンドはＴＮＦに結合しても、ＴＮＦの腫瘍フィブリン沈着活性、 内皮プロコアギニラント活性誘導、細胞毒性、腫瘍退行、そしてＴＮＦの受容体 結合活性は影響されない。

本発明の第三中の発明は、ヒ）ＴＮＦに結合可能なりガツトに関するものであっ て、このリガンドはＴＮＦに結合しても、ＴＮＦの腫瘍フィブリ／沈着活性、内 皮プロコアギ二うント活性誘導、細胞毒性、腫瘍退行、そしてＴＮＦの受容体結 合活性は影響されない。このＴＮＦへのりがノドの結合は、残基２２−３１およ び１４６−１５７からなるトポグラフィツク領域によって限定されるＴＮＦのエ ピトープが実質的に自然発生的な生物学的リガンドによって遮ぎられものである 。

本発明の第三十−の発明は、残基２２−３１および１４６〜１５７からなるトポ グラフィツク領域においてヒトＴＮＦに結合するリガンドからなるものである。

これらの領域は、ＴＮＦアルファの３Ｄ構造におおよそある。モしてトポグラフ ィツクに第３１図に示した。

本発明の第二十九、第三中および第三十−の発明の好適な実施態様では、リガン ドはＭＡｂ３７と指定しれたモノクローン抗体である。このＭＡｂ５３を産生ず るハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　 ５ｉｌｉｓｂｕｒｙ。

Ｗｉｌｔｈｓｈｉｒｅ　ＳＦ３０ＪＧ、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）にあ るヨーロピアンコレクシ菖ンオブアニマルセルカルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ 　Ｃｏ１１ａｅｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｊｍ＋ａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ ；　ＢＣＡＣＣ）、ワクチン開発製造研究所（ＶａｃｃＩｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、公衆衛生ラボラ トリ−サービス（Ｐｕｂｌｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｒｖ ｉｃｅ）　、応用微生物学研究センター（Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｍｌ’ｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ａａｒｃｈ）へ１９８９年８ 月３日に寄託され、その登録番号は８９０８０３０３である。

本発明の第三十三の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なりガントに関するものであ って、このリガンドはＴＮＦに結合しても、ＴＮＦの内皮ブロコアギュラント活 性誘導を影響されず、一方、ＴＮＦの細胞毒性、腸瘍退行、腫瘍フィブリン沈着 活性、そしてＴＮＦの受容体結合活性は阻害される。

本発明の第三十三の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドに関するものであ って、このリガンドはＴＮＦに結合しても、ＴＮＦの内皮ブロコアギニラント活 性誘導を影響されず、一方、ＴＮＦの細胞毒性、膿瘍退行、腫瘍フィブリン沈着 活性、モしてＴＮＦの受容体結合活性は阻害される。このＴＮＦへのリガンドの 結合は、残基２２−４０および４９−９８からなるトポグラフィツク領域によっ て限定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学的リガンドによ って遮ぎられものである。

本発明の第三中口の発明は、残基２２−４０からなるトポグラフィツク領域、残 基４９−９８からなるトポグラフィツク領域、モして残基６９−９７からなるト ポグラフィツク領域からなる群から選択される少なくともひとつの領域において ヒトＴＮＦに結合する９ガントからなるものである。

本発明の第三中口の発明の好適な実施態様では、リガンドは残基４９−９８から なるトポグラフィツク領域においてヒトＴＮＦと結合する。この領域は、トポグ ラフィツクに第３２図に示した。

本発明の東三中口の発明のより好適な実施態様では、リガンドは残基２２−４０ および７０−８７からなるトポグラフィツク領域においてヒトＴＮＦと結合する 。この領域は、ＴＮＦの３Ｄ構造におおよそあり、トポグラフィツクに第３２図 に示されている。

本発明の第三十三、第三十三および第三中口の発明の好適な実施態様では、リガ ンドはＭＡｔ）１１またはＭＡｔ）１２と指定しれたモノクローン抗体である。

本発明の第三十三の発明は、ヒトＴＮＦに結合することが可能なリガンドからな るものである。このリガンドは、ＴＮＦに結合することによってＴＮＦの内皮ブ ロコアギエラント活性誘導を阻害する。

本発明の第三十六の発明は、ヒ）ＴＮＦに結合することが可能なリガンドからな るものである。このリガンドは、ＴＮＦに結合することによってＴＮＦの内皮ブ ロファギニラント活性誘導を阻害する。また、このＴＮＦへのリガンドの結合は 、残基１０８−１２８からなるトポグラフィツク領域によって限定されるＴＮＦ のエピトープが実質的に自然発生的な生物学的リガンドによって遮ぎられもので ある。

本発明の第三中上の発明は、残基１０８−１２８からなるトポグラフィツク領域 においてヒ）ＴＮＦへ結合するリガンドからなる。

本発明の第三十三、第三十六および第三中上の発明の好適な実施態様では、リガ ンドは、ＭＡｂｌ、ＭＡｂ３２、ＭＡｂ４７、ＭＡｂ５３そしてＭＡｂ５４から なる群から選択されるモノクローン抗体である。

ここで述べられているＴＮＦの生物学的活性は、「膿瘍退行」、「腫瘍フィブリ ン沈着誘導」、「細胞毒性」、そして「受容体結合」という用語の意味は下記の 方法によって決定される。

「単一ドメイン抗体」という用語は、ワールドらの文献（Ｎａｔｕｒｅ　３４± 、　５４４−５４１１９８９）に開示されたような抗体断片である。

本発明をより一層明らかにするために、好ましい態様を下記の実施例と添付され た図面をもとにして記載する。

第１図は、ＴＮＦに対するＭＡり１の滴定検定の結果を示すものである。

第２図は、ＴＮＦ　ＭＡｂｌスカッチャードプロットと、親和性の決定とを示す ものである。

第３図は、ＷＨＩ−１６４細胞におけるＴＮＦ毒性に対する抗ＴＮＦモノクロー ン抗体！および３２の効果を示すものである。

第４図は、ＴＮＦに誘導されたＭｅｔｈ　Ａ　ソリッド腸瘍の退行に対するＭＡ ｂｌの効果を示すものである。

第５図は、ＴＮＦに誘導されたＭｅｔｈ　Ａ　腹水腫瘍の退行に対するＭＡｂｌ および２５の効果を示すものである。

第６図は、ＴＮＦによる内皮プロコアギ１ランド活性の誘導に対する抗ＴＮＦモ ノクローン抗体の効果を示すものである。

第７図は、腫瘍を有するマウスの腫瘍部に標識されたフィブリノーゲンを取り込 ませて抗ＴＮＦモノクローン抗体の効果を示すものである。

第８図は、ＴＮＦのエピトープを説明するための図である。

第９図は、ＷＥＨＩ−１６４腫瘍のＴＮＦ誘導退行に対する抗ＴＮＦモノクロー ン抗体の効果を示すものである。

第１θ図は、２つの実験におけるＭＡｂ３２によるＴＮＦ退行活性の促進を示す ものである。

第１１図は、ＭＡｂ３２投与１日投与１グ目８目の投与量に対する応答によるＴ ＮＦ誘導腫瘍退行の促進を示すものである。

第１２図は、牛大動脈内皮細胞上の受容体に対する放射性標識ＴＮＦの結合を示 すものである。

第１３図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイを示すもので、このＴＮＦは、下記の ものとミエローマ細胞系統ＭＭ４１　Ｉｌｌ　Ｅ上で複合体を形成して用いられ た。

ＭＡｂ３２　（−φ−）　対照となる抗体　く−江と−）ＭＡ　ｂ　４７　（− 一一一） 第１４図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイを示すもので、このＴＮＦは、下記の ものとミエローマ細胞系統ＩＧＲａ上で複合体を形成して用いられた。

ＭＡｂ３２　（−◆−→　対照となる抗体　（−ロー　）Ｍ　Ａ　ｂ４７　（− １１−） 第１５図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイを示すもので、このＴＮＦは、下記の ものと膀胱カルシノーマ細胞（ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｒｃｌｎｏｍａ　ｃｅｌｌ ）系統５６３７上で複合体を形成して用いられた。

ＭＡｂ３２　（−今一−）　対照となる抗体　（１？　’ＩＭＡ　ｂ　４７　（ −■←−） 第１６図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイを示すもので、このＴＮＦは、下記の ものと胸部カルシノーマ細胞（ｂｒｅａｓｔ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ） 系統ＭＣＦＴ上て複合体を形成して用いられた。

ＭＡｂ３２（−一φ−）　対照となる抗体　く−ロー）ＭＡ　ｔ＋　４７　（− 中一） 第１７図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイを示すもので、このＴＮＦは、下記の ものと結腸力ルンノーマ細胞（ｃｏｌｏｎ　ｃａｒｃｉｎｏ閣鳳ｃｅ１１）系統 Ｂ１０上で複合体を形成して用いられた。

ＭＡｂ３２　（−→糾−）　対照となる抗体　く−」ヨー）ＭＡｂ４７　’　Ｃ −ＩＦ−） 第１８図は、下記の抗体によるインビボ系（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でのＴＮＦ媒介腫 瘍退行効果を示すものである。

ＭＡｂ３２　（■　）　対照となる抗体　（口　）ＭＡｂ４７　（★　） 第１９図は、対照モノクローン抗体、ＭＡｂ３２、そしてＭＡｂ３２の一価（ｕ ｎｉｖａｌｅｎｔ）　Ｆ　Ａ　ｂ’断片によるインビボ系（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で のＴＮＦ媒介膿瘍退行効果を示すものである。

第２０図は、下記抗体によるＴＮＦ誘導腫瘍退行の効果を示すものである。

対照モノクローン抗体　（−）　ペプチド３０１抗血清　（二　）ＭＡｂ３２　 （回　） 第２１図は、アミノ酸が１０−（［からなるペプチドによってオーバーラツプさ れたＭＡｂ３２の反応性を示すものである。

第２２図は、ＴＮＦ分子の三次元（３Ｄ）構造を模式的に示すものである。

第２３図は、残基１−２０．５６−７７．１０ｇ−１２７、そして１３ｇ−１４ ９からなる領域をトポグラフィツク（立体的）に示したものである。

第２４図は、残基１−１８および１０８−１２８からなる領域を立体的に示した ものである。

藁２５図は、残基５６−７９．１１０−１２７および１３６−１５５からなる領 域を立体的に示したものである。

第２６図は、残基１−２６．１１７−１２８および１４１−１５３からなる領域 を立体的に示したものである。

軍２７図は、残基２２−４０．４９−９７．１１０−４２７、そして１３６−１ ５３からなる領域を立体的に示したものである。

第２８図は、残基１２−２２．３６−４５．９６−１０５、そして１３２−１５ ７からなる領域を立体的に示したものである。

第２９図は、残基１−２０および７６−９０からなる領域を立体的に示したもの である。

第３０図は、残基２２−４０．６９−９７，１０５−１２８、そして１３５−１ ５５からなる領域を立体的に示したものである。

第３１図は、残基２２−３１および１４６−１５７からなる領域を立体的に示し たものである。

第３２図は、残基４９−９８からなる領域を立体的に示したものである。

第３３図は、残基２２−４０および７０−８７からなる領域を立体的に示したも のである。

動物および腫瘍細胞系統 すべての実験において用いられたマウスは、Ｃ３ｌＲＯ動物施設から入手した生 後１０−１２週間の雌でＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスである。

ＭｅｔｈＡソリッド騰瘍およびＭｅｔｈＡｆｉ水腫瘍は、オルト博士（Ｄｒ、　 Ｌｌｏｙｄ　Ｊ、　Ｏｌｄ、　５ｌｏａｎ　Ｋｓｔｔｅｒｉｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ 　ＣｅｎＬｒａ）に提供して頂いた。また、ＷＥＨｆ−１６４フイブロサルコー マ系統は、チャウドリ博士（Ｄｒ、　（ｉｅａｔａ　Ｃｈａｕｈｄｒｌ。

Ｊｏｂ＋＋　Ｃｕｒｔｌｎ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｌｃａｌ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ、ＡｕＬｒａｌ！ａｎ　Ｎａ目ａｎａｌ　［Ｉｎ１ｖ■窒唐奄狽凵j に提供して頂いた。

ハイブリドーマの融合と産生 完全７０インドアジユバントに懸濁された１０Ｍｇのヒト組換え体ＴＮＦをマウ スの腹腔内に注入してマウスを免疫した。その−ケガ後に、完全フロインドアジ ュバントに懸濁された１０ＭｇのＴＮＦを投与した。六週間後および融合四日前 に、ＰＢＳに懸濁されたｌＯμｇのＴＮＦをマウスにブースした。免疫されたマ ウスから得た肺臓細胞をラスジエンとアンダーウッドの方法（Ｒａｔｂｊｅｎ　 ＆　１ｌｎｄｅｒｖｏｏｄ、　Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２３．４４１．１ ９８６）にもとづいてミエローマｓ　ｐ　２　／　Ｏと融合させた。ラジオイム ノアアセイによってスクリーニングされた抗ＴＮＦ抗体を産生ずる細胞系統をマ ウス腹腔マクロファージからなる支持細胞層上で限界希釈によりサブクローン化 した。さらに、抗体のサブクラスは、Ｅ　Ｌ　！　Ｓ　Ａ　（Ｍｉｓｏｔａｓｔ 、Ｃｏ＋ｎ＋ｏｎｖｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によ って決定した０標準的な方法によってラクトペルオキシダーゼを用いてＴＮＦを ヨウ素化した。

ハイブリドーマの培地の上清（５０μｌ）をＩＱ’　Ｉ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ　（２０ ，０００ｃｐ閤／５ｏｕｌ）とともに−晩、４℃でインキ−ベートとした。そし て、１００μｌの９ａｃ−Ｃｅｌ（ロバ抗マウス／ラブド免疫グロブリン被覆セ ルロース、　Ｗｅｌｌｃｏ■ｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｌｃｓ）を添加し、さらに 室温（２０℃）で２０分間インキュベートした。このインキュベーン冒ンに続い て、１ｍｌのＰＢＳを添加し、そして試験管を２．５００ｒｐｍで５分間遠心し た。この遠心後、上清を揄てて、沈澱物の放射活性を測定した。

モノクローン抗体間の比較を行なうために、固定化抗原（ＬＡＣＴ）または抗体 （ＰＡＣＴ）のどちらか一方を用いて拮抗アッセイを行なった（Ａｓｔｏｎ　＆ 　Ｉｖｉｎ１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ　（ＢＳＡ／ＰＢＳ）によって非特 異的結合部位をブロックするのに先立って、フレツキシブルなマイクロタイター プレートに、モノクローン抗体（マウス腹水から得られた硫酸ナトリウム沈澱グ ロブリン１００μｇ／罵ｌを含む重炭酸塩ナトリウム緩衝液、０．０５Ｍ、　ｐ Ｈ９，６）をコートして、−晩、４℃で静置した。固定された抗体への１′’Ｉ −ＴＮＦの結合は、種々の濃度の二次抗ＴＮＦそツクローン抗体存在下で決定し た。抗体およびＴＮＦは同時に添加され、そしてＰＢＳ（４回）による洗浄に先 立って２４時間インキュベートされた。そして、各ウェルの放射活性を測定した 。１００％結合は、異質のモノクローン抗体の非存在下で決定され、一方１００ ％拮抗は、過剰な同質のモノクローン抗体存在下で決定された。すべての希釈は ＢＳＡ／ＰＢＳにって行なった。

精製プロティンＡ、放射能標職モノクローン抗体のＴＮＦ被覆マイクロタイター ウェルへの結合は、種々の濃度の二次モノクローン抗体存在下で決定した。マイ クロタイタープレートは前記のようにしてＴＮＦ　（５０Ｍｇ／ｍｌ）がコート されている　１１！＋　１−モノクローン抗体（３０，ＯＯＯｃｐｍ）を添加す る２４時間前に拮抗する抗体（５０ｍｌ）を事前にプレート上で４時間、４℃で ブレインキュベートした。ウェルに結合した放射能の測定は、ＰＢＳでウェルを ４回洗った後に行なった。１００％結合は、拮抗する抗体の非存在下で決定され 、一方１００％拮抗は、過剰の未標識モノクローン抗体存在下で決定された。

ＷＥＨｒ−１６４細胞毒性試験 組換えＴＮＦ活性のバイオアッセイをスベヴイックとマイヤーの方法（Ｅｓｐｅ ｖｌｋ　ｋ　ＮｌｉｓｅＮｌｌｓｅｎ−、Ｊ、　ｌｍ５ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　９５．９９．１９８６）にもとづいて実施した。

ＴＮＦ活性に対するモノクローン抗体の効果は、ＡＢＴ９０にある細胞培養へモ ノクローン抗体を添加することによって決定した。

腫瘍退行実験 モノクローン抗体によるＴＮＦ誘導騰瘍退行の変化を３種類の腫瘍モデルを用い て実施した。すなわち、ａｆｉ類の腫瘍モデルは、皮下腫瘍ＷＥＨＩ−１６４、 Ｍ　ｅ　ｔ　ｈ　Ａサルコーマ、そして腹水ＭｅｔｈＡ腫瘍である。皮下腫瘍は 、約５ｘ１０５細胞注射することによって誘導された。これによって約１５日後 に１０−１５ｍｍの腫瘍が形成された。マウスの腹腔に、ヒト組換えＴＮＦ　（ １０μｇ）と、モノクローン抗体（２Ｑ　Ｏｍ　１腹水グロブリン）とを４日間 つづけて注射した。対照群は、ＰＢＳのみ、あるいはＴＮＦと中成長ホルモンに 対するモノクローン抗体とを注射した。それぞれの実験の開始時に、カリパスを 用いて腹水マウスの場合において体重を測定したソリッド腫瘍（ｓｏｌｉｄ　ｔ ｕｍｏｕｒ）または腫瘍を有する動物の腫瘍のサイズを測定した。これらの測定 は実験中、日々実施された。

ラジオレセプターアッセイ 増殖したＷＥＩ−１６４細胞を培地から回収し、１％ＢＳＡ含有ハ／り平衡塩溶 Ｈ（Ｒａｎｋ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕＮｏｎ、　）ＩＢｓ ｓ、　Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄した。１００μｌの未標識Ｔ　Ｎ　Ｆ　（１−１ ０，０００ｎｇ／試験管）またはモノクローン抗体（１０倍希釈液ンリーズ、腹 水グロブリン１０に対してｌからｉｏｏ、　ｏｏｏに対して１）を５０μ夏の” Ｉ　−ＴＮ　Ｆ　（５０，０００ｅｐｓ）へ添加した。その後、ＷＥＩ−１６４ 細胞を添加した（ｚ　ｘ　１ｏ６Ｉ［ｌ胞を念む２００μｍ）。この混合物を振 とうウォーターバスで３７”Ｃ，３時間インキュベーンタンした。このインキュ ベーションの終了時に、１ｍｌのＨＢＳＳを添加し、そして細胞を１６、Ｏ（ｌ ｏｒｐｍ、３０秒の遠心処理した。

上清を捨てて、細胞からなる沈澱物に結合した”Ｊ−ＴＮＦを測定した。すべて の希釈は、１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで行なった。

内皮細胞でのＴＮＦによるプロコアギュラント誘導牛腹水内皮細胞（継代１０） を、３７℃、５％Ｃ０Ｉ２の条件下でｌＯ％牛脂児血清（Ｆｅ２）　、ペニシリ ン、ストレプトマイシン、そして２−メルカプトエタノールを含むＰＲＰＭ＋− １６４０中で増殖させた。ＴＮＦによる内皮ブロコアギュラント活性誘導のため に、細胞をトリプンン処理し、そして２４穴（ウェル）コスタ−トレイに播種し た（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ　ａｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　８３．４５３３．１９ ８６）　、　ＨＢ　Ｓ　Ｓによるコンフルエントな細胞単層の洗浄後に７　Ｎ　 Ｆ　（０−５００単位／培養）と、モノクローン抗体（希釈は、腹水グロブリン ２５０に対してｌ）とを添加した。４時間後、細胞を回収して凍結し、ソニケー シジン処理した。全体の細胞性プロコアギコラント活性を、３７℃で正常なドナ ー血小板・血漿欠乏（ｎｏｒｖａｌ　ｄｏｎｏｒ　ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｐＯｏｙ 　ｐｌａｓｍａ）のりカルシフイケーシ１ン（ｒｅｃａｌｃｔＨｃａｔｌｏｎ） 時間によって決定した。１００μ！のントレート化血小板・血漿欠乏を、１００ μｌの塩化カルシウム（３０ｍＭ）と１００μＩの細胞ライセードに添加し、ク ロット（血べい）形成時間を記録した。いくつかの実験では、腫瘍細胞培養の上 清をＴＮＦおよび（または）モノクローン抗体（最終濃度２に対してｌ）によっ て処理された内反細胞に添加した。

インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）系でのフィブリン形成に対するモノクローン抗体と ＴＮＦとの効果について試験するために、Ｂ＾しＢ／ｃマウスの皮下にＷＥＩ− １６４細胞（１Ｇ’細胞／動物）を注射した。７−１４日後、腫瘍の直径が約１ 　ｃａｌこ違した時点で、動物の腹腔内に、Ｔ　Ｎ　Ｆ　（１０ｕｇ／動物）お よび１１【−ヒトフィブリノーゲン（７，ＳＵＺ／動物、１２２ＪＩ　Ｃｉ／ｍ ｇ、　Ａｓｅｒｓｈａｍ）を、それぞれ単独で、あるいはヒトＴＮＦに対するモ ノクローン抗体（２００μｍ／動物腹水グロブリン）とともに注射した。

中成長ホルモンに対するモノクローン抗体は、対照用のモノクローン抗体として 用いられた。ＴＮＦの注入２時間後、マウスの組織への１８５１−フィブリノー ゲンの取り込みを、組織を除去して試料とし、その重量を測定し、モしてガンマ カウンターで試料の放射能を測定した。

ヒトＴＮＦと反応した１３種類のモノクローン抗体が単離された。これらのモノ クローン抗体は、それぞれＭＡｂｌ、ＭＡｔ＋１１、ＭＡｂｌ２、ＭＡｂ２１、 ＭＡｂ２５、ＭＡｔ）３１、ＭＡｔ）３２、ＭＡｂ３７、ＭＡｂ４２、ＭＡｂ４ ７、ＭＡｂ５３．そしてＭＡｔ）５４と定められた。ヒトＴＮＦ生物活性に対す るこれらのモノクローン抗体の効果を第２表に示した。

第２表から明らかなように、いくつかのモノクローン抗体が抗腫瘍活性およびヒ ）ＴＮＦによる凝固活性を阻害したが（ＭＡ　ｂ　１．４７および５４）、すべ ての抗腫瘍活性を阻害するすべての抗体が、インビボおよびインビトロで凝固活 性を阻害したわけではない（ＭＡｔ＋１１，１２．２５および５３）。実際、腫 瘍退行を阻害するＭＡ　ｂ　２１はインビボで凝固活性を促進させた。

（以下、余白） 第２表 生物活性に対するモノクローン抗体の効果モノクローン抗体 細胞毒性　・　−−Ｑ−−００００−−−腫瘍退行　−−−０−−０＋　０Ｏ− −−（腫瘍） 受容体結合　−−−０−−０＋１０☆　ｏｏ−−−表中、 ＋　促進 Ｏ効果なし −　阻害 ★　ＩＦＥ旧−１６４１１瘍細胞でのＭＡｂ濃度および腫瘍型Ｉこ依存（第３． １３−１７参照） ＴＮＦ上のエピトープを分かち合うための拮抗的結合についてのテストで示され たＭＡｔ＋１，４７および５４は、ＴＮＦの完全中和に必要とされる高いＴＮＦ レベルである中毒／１１フクおよび他の側Ｌウィルスおよび寄生虫感染の状態を 治癒する上で要求される特徴を備えている。ＭＡｂ３２のような他のモノクロー ン抗体は、癌治療の際にＴＮＦと一緒に投与されることが好ましい。なぜなら、 腫瘍退行を阻害しないが、凝固を阻害するからである。このような治療方法は、 ＴＮＦによる凝集活性を促すような癌治療に用いられる細胞毒性剤（ｅｙｔｏｔ ｏｘｉｅｄｒｕｇｓ）と組み合わせる場合に特に指摘される（例えば、ビンブラ スチン、アシクロビル（ｘｃｙｃｌｏｖｌｒ）　、ｒ　Ｆ　Ｎアルファ、Ｉ　１ −−２、アクチノマイシンＤ、ＡＺＴ、ラジオセラビイ、アドリブミシン、マイ トマイシンＣ１シトシンアラビノシド、ドウ／ルビシン（ｄｏｕｎｏｒｕｂｌｃ ｌｎ）　、シス・プラテン、ビンクリスチン、５えば免疫不全症候群）および癌 、例えばカポジサルコーマ、ノンホジキンズリンホーマおよびスク７ｖウスセル カルンノーマ（ｓｑｕａ＋１ｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）に関連し た免疫不全症候群を有する患者）。

モノクローン抗体ＭＡｂｌは、以下の特徴を有することがわかった。

１、ヒト組換え体ＴＮＦアルファと結合する。しかし、ヒトリンパ毒（ＴＮＦベ ータ）またはヒトインターフェロンではない。同様にＭＡｂｌは、組換え体マウ スＴＮＦ　（第１図）と交差反応しない。

２、ＭＡｂｌは免疫グロブリン型がＩｇＧ！、Ｋである。親和性は約４．４Ｘ１ ０−９モル／リットルである（第２図）。

３、ＭＡｂは、゛培地中においてＷＲ旧−１６４マウスフイブロサルコーマ細胞 上の組換え体ヒ）ＴＮＦの細胞毒性効果を中和する。インビトロ系で１８ｇのＭ Ａｂｌは、約１５６．２５単位のＴＮＦを中和する（第３図）。

４、ＭＡり１は、インビボ系で下記のマウス腫瘍モデル：　ＩＦＥＩ（＋−１６ ４皮下ソリツド腫瘍（ｓｕｂｃｕｔａｎａｏｕｓ　５ｏｌｉｄ　ｔｕｍｏｕｒ） 　、Ｍａｔｈ　Ａ皮下ソリッド腫瘍、モしてＭａｔｈ　Ａ腹水腫瘍（ａｓｃｉｔ ｅｓ　＋ｕｍｏｕｒ）においてＴＮＦの腫瘍退行活性を中和する（第４図、第５ 図および第９図）。

５、ＭＡｂｌは、マラリア病原虫に感染したマウスにおいて、ヒトＴＮＦによっ て引き起こされる大脳損傷を抑える。

６、ラジオリセブターアッセイにおいて、ＭＡｂｌは、ＩＩＩＥ旧−１０上にあ る受容体（レセプター）へのＴＮＦの結合を抑える（第３表）。

７、ＭＡｌ）１は、牛腹水内皮培養細胞上のプロコアギ１ラント活性誘導（組織 因子）を阻害する（第６図）。

８、ＭＡｂｌは、ＴＮＦ処理されたマウスの腫瘍への１″５■フィブリノーゲン 取り込みを減少させる（箪７図）。

９、ＭＡｌ）１は、”５Ｔ−ＴＮＦの結合に対して拮抗する。したがって下記の モノクローン抗体：２１，２５．３２．４７．５４、そして３７と、オーバラッ ピングしたエピトープを分かち合う。

１０、ＭＡｂｌは、下記のモノクローン抗体＝１１．１２．４２．５３．３１゜ そして２０と、′２’Ｉ−ＴＮＦの結合に対して拮抗しない（第８図）。

（以下、余白） 東３表 ラジオレセプターアッセイ：ＭＡｂｌによるＷＥＩＩＩ−１６４細胞へのＴＮＦ 結合の阻害処理　％特異的結合 ＭＡｂ３２は、ＩｎＧ２ｂ、に抗体で、ヒトＴＮＦアルファに対する親和性はス カツチャードブロフト（Ｓｃｈａｔｃｂａｒｄ　ａｎａｌｙｓｉｍ）よれば、８ ．７７ＸＩＯ−”■ｏｌａｇ／ｌである。しかし、このモノクローン抗体は、ヒ トＴＮＦベータ（リンパ毒（Ｉｙ■ｐｂｏｔｏｘｉｎ）　）やマウスＴＮＦアル ファとは反応しない。

箪３図に示したように、ＭＡｂ３２は、インビトロ系でのＷＦ、旧−１８４アツ セイの結果によれば、ＴＮＦ細胞毒性を阻害しない。

モノクローン抗体３２は、ＴＮＦ投与量が１０ｇｇ／日であるＢＡＬＢ／ｃマウ スに皮下経由で移植された腸瘍であるＷＲ［Ｉ＋−１６４フイブロサルコーマに 対スるＴＮＦ誘導膿瘍退行活性を抑制するが、その抑制程度は不安定である（第 １０図および第１１図を見よ）。このようなことは、ＴＮＦに対して生じたすべ ての抗体に当てはまるわけではない（第９図）。しかし、受容体を介した腫瘍細 胞へのＴＮＦ取込み増大を許すＭＡ　ｂ　３２に特異的な結合部位に当てはまる （第８図、箪４表）。

（以下、余白） 第４表 ＭＡｂ３２存在下でのｆｒｉｌ＋−１６４細胞上の受容体へのＴＮＦの結合ＭＡ ＋）　％結合ｔ″’Ｉ−ＴＮＦ Ｌ／Ｚｏｏ　、　０００　９７　９３ ＴＮＦ投与量が低いときのＭＡｂ３２によるＴＮＦ活性の増大とは、少なくとも １０倍以下のＴＮＦがある程度の腸瘍退行を達成するのに必要とされることであ る（第１１図および第１８図参照）。結果は、１日目（ｄａｙ　ｌ）では２．５ μｇおよび１μｇＴＮＦと、２８目（ｄａｙ　２）では２．５ＪＪｇであった。

２．５μｇと１μｇとの統計学的違いは、を検定でｐ＜０．０１であった。この ようなＴＮＦ活性増大の程度は、またレシピエンドの生存率を上げることになる 。なぜなら、低濃度のＴＮＦを使用するので毒性効果が生じることはない。第１ ９図は、ＭＡｆｉ３２の単一の価からなるＦｅｂ断片が、ＭＡＩ）３２全体と同 様にしてＴＮＦ誘導腫瘍退行を促進させることを示している（下記をみよ）。

ＭＡ　ｂ　３２は、ＴＮＦと培養細胞とをインキニベーン璽ンすることによって 正常に誘導された内皮細胞の凝固因子（ｃｌｏｔｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ）発 現を阻害する（第６図）。この応答は、事前に同定されていないＴＮＦ受容体に って媒介されるもので、この同定されていないＴＮＦ受容体は、他の細胞で発見 された受容体と異なるものである。

逆に言えば、ＭＡｔ）３２は、放射性同位元素で標識されたフィブリノーゲンの 取り込みによって示されるような腫瘍床内での凝固のインビボ系での活性化を促 進させる（第７図）。このことは、単球／マクロファージ・プロコアギニラント の活性にもとづくものであり、さらにＴＮＦによって誘導される腸瘍退行の機構 を明らかにするこ゛とを可能とするものであろう。

ＭＡｂ３２を用いた実験で得られた結果を、第２表において他のものと比較した 。

内皮細胞に対するＴＮＦの結合を阻害する能力について、ＭＡｂ３２とＭＡｂ４ ７ともアッセイした。

中太動脈内皮細胞（ｂｏｖｊｎｅ　ａｏｒＬｌｃ　ｅｎｄｏｔｈｅ＋４ａｌ　ｃ ｅｌｌｓ：　ＢＡＥ　ｃｅｌｌｇ）　（継代１１）を２４穴の培養皿（コーニン グ社製）に播種した。この培養皿の各ウェルには事前にゲラチン（０，２％）を コートしておいた。また、２０％牛脂児血清を含むマブコイ５Ａ（修飾）メジウ ム中でコンフルエンスさせるように増殖させた。このメジウムは、ラジオイムノ アッセイにおける希釈溶液（未標識ＴＮＦおよびＭＡｂ）としても用いられた。

ＢＡＥ細胞を未標ｗＬｒ　Ｎ　Ｆ　（０−＋ｏｏｎｇ）またはＭＡｂ（１７１０ ０−１／１００．　Ｇｏｏ）に希釈された腹水グロブリン）と、ヨウ素化Ｔ　Ｎ 　Ｆ　（５０，０Ｏｆｌｃｐｓ’）との存在下において１時間インキュベートし た。この時間が経過した後、メジウムを捨てて、細胞を洗った。その後、細胞を ＩＭの水酸化ナトリウムで破壊した。破壊された細胞（細胞ライセード）に結合 している放射性ＴＮＦを測定し、細胞に特異的に結合した標識ＴＮＦを決定した 。

ＭＡｔ）３２、ＭＡｂ４７、そして対照のＭＡｔ）に関するのアッセイで得られ た結果は、第１２図に示した。

ＴＮＦおよび抗ＴＮＦモノクローン抗体存在下で培養されたＢＡＥ細胞を用いた 凝固（血ぺい形成；クロ１テイング）アッセイにおいて得られた結果は、ＢＡＥ ラジオレセプターアッセイで得られた結果と関係している。すなわち、内皮細胞 の表面上への凝固因子誘導を阻害するモノクローン抗体は、またその受容体への ＴＮＦの結合も阻害する（ＴＮＦ単独の場合と比較して凝固時間が増加する）。

これは、ＭＡｂ３２および４７によって示される。

「Ｅ旧−１６４細胞へのＴＮＦ結合を阻害しないＭＡｂ３２は、内皮細胞へのＴ ＮＦ結合を阻害しない。このような結果は、ＴＮＦ分子上に具なる機能部位が存 在していること、またこのような部位が異なる細胞型の異なる受容体サブ集団と 相互作用するというよいうな仮説を支持するものとなる。したがって、ＴＮＦの 限定された領域に結合するリガンドは、特定の受容体サブタイプへ結合すること を限定することによってＴＮＦの生物学的活性を修飾する。

第１２図に示すように、ＭＡｂ４７は、内皮細胞に作用するＴＮＦの特に強力な 阻害剤であって、ｌ／１０ないし１／１０，０００希釈での特異的結合の率は、 事実上ゼロである。

ＭＡｂ３２は、ヒトＴＮＦの抗腫瘍活性を促進させることが示されている。この 促進効果に隠されているメカニズムには、特定の（！ｌ瘍）受容体サブタイプに 対するＴＮＦの結合を制限することが含まれるが、非腫瘍細胞に対するＴＮＦ毒 性が続いて減少させる他のもの（内皮）は含まれない。このメカニズムは、イン ビトロ系において、腫瘍細胞によるＴＮＦの取り込みを促進させることは必要で はない。また、ＭＡｔ）３２は、ある種のヒトカル７ノーマ細胞系上のＴＮＦ受 容体に対するヒトＴＮＦの直接的結合を可能とさせる。

下記のヒトカルシ／−マ細胞系統を用いて、ＭＡｂ３２存在下におけるＴＮＦに よる受容体媒介取り込み促進についてアッセイした。

ヒトカルシノーマ細胞系統：Ｂ１０、ＣａＣｏ、ＨＴ２９．５ＫＣＯＩ（これら は結腸カルシノーマ）　、５６３７　（膀胱カルシノーマ）、ＭＭ４１８Ｅ（メ ラノーマ）、ＩＧＲ３（メラノーマ）、モして　ＭＣＦ（胸部メラノーマ）。

細胞を、１０％牛脂児血清、ベニジンリン／ストレプトマイシン、そしてＬ−グ ルタミンを添加されたＲＰＭＩ−１６４０（ＭＭ４１８Ｅ）、ＤＭＥＭ（ＣａＣ ｏおよびＩＧＲ３）またはイスコブス修飾ＤＭＥＭ　（Ｂ１０、ＨＴ２９．５Ｋ ０１ＳＳ６３７．ＭＣＦ７）のどれかによって増殖さ゛せた。受容体アッセイは 、既に知られている内皮細胞に対する方法にもとづいて行なったが、以下の点を 変えた。すなわち、ヨウ素化ＴＮＦとのインキュベーン冨ン時間を３時間まで延 長した。例外として、ＢＩＯの場合はインキ１ベーン璽ン時間を１時間とした。

結果 メラノーマ細胞系統ＭＭ４１ｇＥおよびｒＧＲ３（第１３図および第１４図）、 膀胱力ルンノーマ５６３７（第１５図）、そして胸部カルシノーマＭＣＦ７　（ 第１６図）によって、ＭＡｂ３２存在下において、ＴＮＦ取り込み促進が観察さ れた。ＭＡｂ３２は、ＢＩＯ（第１７図）によりて示されるような他の細胞系統 においてＴＮＦ受容体相互作用に対してなんら杉響を与えなかった。ＭＡｂ４７ は、ＷＥＨｒ−１６４１１胞および内皮細胞へのＴＮＦ結合を阻害し、またＴＮ Ｆ媒介騰瘍退行を阻害した。ＴＮＦ媒介腫瘍退行は、試験したすべての細胞系統 において、顕著なＴＮＦ結合阻害が観察された（第１３図−策１７図）。

結論 受容体結合実験によれば、ＴＮＦの抗腫瘍活性を高めるような役割をＭＡｂ３２ が有するというような第二の機構が存在することが示唆される。ＴＮＦの働きを 高めるこの第二の反応経路は、ＭＡｂ３２の存在下での腫瘍全受容体にょるＴＮ Ｆの取り込み増加にもとづくものである。

ＭＡＩ）３２またはＭＡｔ）３２の一価ＦＡＢ’断片によるインビボ系でのＴＮ Ｆ媒介腫瘍退行の促進ＷＥＨＩ−１６４皮下腫瘍を有するマウス（Ｎ−５動物／ 群）を用いて、上記方法にもとづいて腫瘍退行を調べた。腫瘍の大きさは、実験 継続期間中、毎日測定した。ＭＡり３２を用いて得られた結果は、第２２図に示 した。その結果によれば、処理完了時点（２日目；　ｄａｙりで、腫瘍領域の平 均＋／−３Ｄ％の変化が認められた（■：ＭＡｂ３２、ロ：対照ＭＡｂ、★：Ｍ Ａｂ４７）。

対照ＭＡｂ−ＴＮＦ処理群と、ＭＡｂ３２−ＴＮＦ処理群との間に認められる違 いは、統計学的に顕著であった（を検定　ｐ＜０．０ルベル）。

ＭＡｂ３２の一価ＦＡｂ’断片を用いた結果は、第１９図に示されている。

腫瘍の大きさは、実験継続期間中、毎日測定した。処理完了時点（２日月；ｄａ ｙ２）で、腫瘍領域の平均＋／−ＳＤ％の変化が認められた。対照ＭＡｂ−１０ Ｆ処理群と、ＭＡｂ３２−ＴＮＦ処理群との間に認められる違いは、統計学的に 顕著であった（を検定　ｐ＜０．０ルベル）。

ＴＮＦ誘導腫瘍退行：抗ペプチド３０１血清の効果第２０図は、ＴＮＦ十対照Ｍ Ａｂ（中成長ホルモンに対する抗体）、ＴＮＦ＋ＭＡｂ３２、あるいはＴＮＦ十 抗ペプチド３０１血清（グロブリン分画）にょって３日間処理された腸瘍を有す るマウスにおける腫瘍領域の変化率を示すものである。対となっていないｔ−検 定において、対照群は、試験群（ＭＡｂ３２、抗血清３０１）の両方と顕著に異 なった。一方、ＭＡｔ）３２とペプチド抗血清３０１群とは、互いに顕著な違い が認められた。（対照群対ＭＡｂ３２、ｐ＜０．００２；　対照群対抗ペプチド ３０１．９＜０．０２５）。したがって、ＭＡｔ）３２の特異性を有する部分を 含むペプチドを用いて調製した抗血清は、ＴＮＦによる腫瘍退行促進も引き起こ させる。

第９図に示すように、拮抗（競合）結合実験によって３０種類のモノクローン抗 体が２つのメイングループに分類された。すなわち、ＭＡｂｌ、２１．４７．５ ４．３７．３２、そして２５のグループと、ＭＡｂｌｌ、１２．５３、そして４ ２のグループである。よって、つぎの実験は、これらのモノクローン抗体によっ て認識されたヒトＴＮＦ上の領域を同定することである。

ヒトＴＮＦにおけるモノクローン抗体認識領域の同定１．７ないし１０個のアミ ノ酸配列程度の長さからなる重なり合うたペプチドは、ゲイセンらの方法（Ｇｅ ｙｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　ＰＮＡＳ　８１．３９９８−４００２ ）にもとづいてポリプロピレン・ビン上で合成された。重なり合いはそれぞれ６ 残基および９残基のもので、ペプチドは正確に全ＴＮＦアミノ酸配列を覆ってい る。このペプチドは、ＥＬＩＳＡによってＭＡｔ）との反応性が調べられた。全 ＴＮＦと事前のインキニベーシ１ンによってモノクローン抗体から吸着されたＴ ＮＦ反応性を有するＭＡｂもペプチドとの反応性について調べられ、そして負の 対照群として作用した。

２．７ＮＦの長めのペプチドは、下記の通りに合成された。このペプチドは、下 記のプロトコールにもとづいてヒツジから抗血清を調製するのに用いられた。オ ボアルブミンにコンジュゲートされ、完全フロインドアジュバント中に乳濁化さ れたＴＮＦペプチドによって一次接種されたメリノヒトジ（Ｍｅｒｉｎｏ　５ｈ ｅｅｐ）に、４週間の間隔で、ラジオイムノアッセイによる抗ＴＮＦ抗体の存在 をアッセイするために、ペプチド・オボアルブミンと血清とを注射した。その結 果、ペプチド２７５．３０１，３０５．３０６、そして３０７のみが全ＴＮＦと 反応する血清から得られた。よって、陽性血清をＭＡｂとの拮抗結合アッセイ（ ＰＡＣＴアフセイ）に用いた。

下記のペプチドが合成された。これらのペプチドは、それぞれのアミノ酸を表わ すために従来の３文字フードを用いた。ＴＮＦ配列領域は括弧で示した。

（以下、余白） ペプチド２７５ Ｈ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙ ｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１１１−１２０）ペプチド３０１ Ｈ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ａｔｇ−Ｔｈｃ−Ｐｒｏ−５ ｅｒ　−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ　−Ｈｌｓ−Ｖａｌ・Ｖａｌ −Ａｌａ−０１！　（１−１８１ペプチド３０２ Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−ｖａｌ−Ｖａｌ　−Ｐ ｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−１１ｅ−ＯＨ（４ ３−５８） ペプチド　３０４ Ｈ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ　−Ｓ ｅｔ　−Ｔｈｒ−！（ｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈ−Ｌｅｕ−５ｅｒ　− Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ− Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ　−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（ １３２−１５０１ペプチド　３０６ Ｈ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ− Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ　−ＯＨ（０−２６１ プブチド３０７ Ｈ−Ａｌａ　−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ４ｒｐ　−Ｌｅｕ− Ａｓｎ−Ａｒｑ−ｘｒｑ−Ａｔａ−ｘｓｎ−Ａｌａ　・Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ −Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｏｔ＋　（２２−４０１ペプチド３０８ Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−’ｒｙｔ　−Ｌｅｕ　−１１ｅ　−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｉ ｎ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ@− ＧＩＹ−ＯＨ（５４−６８） ペプチド　３０９ Ｈ−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ　−［、ｅｕ・Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−）１ｉｓ−Ｔｈｒ　−Ｘ 　Ｌｅ−５ｅｒ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−５ｅｒ@− Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｔｔ＋ｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＯＯ Ｈ（７３−９４１ペプチド３２３ Ｈ４ｈｒ−１１ｅ−５ｅｒ・Ａｒｑ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−５ｅｒ４ｈｒ− Ｇｉｎ−Ｔｈｔ−ＯＨ（７９−８９１これらのペプチドは、下記の一般的なプロ トコールにしたがって合成された。

すべてのペプチドは、固相ペプチド合成からなるＦｍｏｃ−ポリアミノ法（＾ｔ ｈｅｒｔｏｎ　ａｔ　ｘｉ、　１９７ｇ、　Ｊ、　Ｃｈａｍ、　Ｓｏｃ、　Ｃｂ ｃ嘗、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　Ｈ，５３７−５３９）によって合成された。用いら れた固形樹脂は、ペプシン（ＰａｐＳｙｎ）　Ｋ　Ａであって、４−ヒドロキシ メチルフェノキン酢酸を機能化リンカ−として用いたキエセルグール支持体（Ｋ ｉａｓａｌｇｕｈｒ　５ｕｐｐｏｒｔ）上のポリジメチルアクリルアミドゲルで ある（＾ｔｈｅｒｔｏｎ　ａｔ　ａｌ、　１９７５．　Ｊ、＾ｍ、　Ｃｈｅｗ、 　Ｓｏｃ、　９７．６５８４−６０５）。

カルボキシル末端のアミノ酸は、ＤＣＣ／ＤＭＡＰメジェーテッド・シンメトリ カル−７７ヒドリド・エスエリフィケー７．ン（ＤＣＣ／ＤＭＡＰ−ｍｅｄｉａ ｔｅｄ　ｓｙｍｓｅｔｒｌｃａｌ−ａｎｈｙｄｒｉｄｅ　ｓｇｔｅｒ＋ｆｌｅａ ｔｉｏｎ）によって固体支持体に結合する。

すべてのＦｍｏ　ｃ基は、ピペリジノ／ＤＭＦ洗浄によって除去され、またペプ チド結合はペンタフルオロフェニル活性エステルを経由して、あるいは直接的に ＢＯＰ／ＮＭＭ／ＨＯＢ　ｔ　（カスドロ試薬）　（Ｐｏｕｒｎｉｅｒ　ａｔ　 ａｔ、、　１９８９．　Ｉｎｔ、　ＪＰｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ 、、　３３．１３３−１３９）によって、第５表に示したあるアミノ酸を除き形 成された。

アミノ酸に対して遺ばれる側鎖保護は、合成後に残されたシスティン上のＡｃｍ を除き、クリーピング（ｃｌｅａｖａｇａ）中に付随的に除去された。

（以下、余白） 東５表 アミノ酸　保護基　カップリング方法 Ａｒｇ　Ｍｔｒ　’ｊｒ４　Ｐｍｃ　Ｆ”ｂ’Ｆ）Ａｓｐ　０Ｂｕｔ クリーピングおよび精製 ペプチド３０１．３０２．３０５　は、９５％ＴＦＡおよび５％チオアニソール （１，５ｈ）によって樹脂からクリーピングされ、モして逆相Ｃ４カラム（緩衝 液Ａ　−０，１％　ＴＦＡ溶液、緩衝ＱＢ　−１１０％　ＡＣＮ　２０％　Ａ） 　ニよッテ精製された。

ペプチド３０３，３０４は、９５％ＴＦＡおよび５％フェノール（５−６ｈ）に よって樹脂からクリーピングされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ　−０，Ｈ ＴＦＡ溶液、緩衝液Ｂ−８０％＾ＣＮ　２０％Ａ）によって精製された。

ペプチド３０６．３０８は、９５％ＴＦＡおよび５％水（１，５ｈ）によって樹 脂からクリーピングされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ−０，１χＴＦ＾溶 液、緩衝液Ｂ−８０％ＡＣＮ　２０％Ａ）によって精製された。

ペプチド３０９は、９５％ＴＦＡおよび５％チオアニソールによって樹脂からク リーピングされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ−０，１％ＴＦＡ溶液、緩衝 液Ｂ−８０％ＡＣＮ　２０％Ａ）によって精製された。

ペプチド３０７は、９３％ＴＦＡ、３．１％アニソール、２．９７％エチルメチ ルスルフィド、そして０．９５％エタンジチオールからなる混合物（３ｈ）によ って樹脂からクリーピングされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ−０，１％丁 ＰＡ溶液、緩衝液Ｂ　−８０％　ＡＣＮ　２０％　Ａ）　ｔ：ヨッテ精製された 。

７およびｌＯ量体（ｉｅｒｓ）を用いたモノクローン抗体ＥＬ　Ｉ　ＳＡの典型 的な結果を第２１図に示す。ヒツジ抗ペプチド血清（第６表＃照）を用いたＰＡ ＣＴの結果とともに、ＴＮＦの下記領域は抗ＴＮＦモノクローン抗体の結合部位 を含む。

（以下、余白） ＭＡｂｌ　：　残基　１−１１１．５８−６５．１１５−１２５．１３１１−１ ４９ＭＡｂｌｌ　：　残基　４Ｇ−９８ ＭＡｂ１２　：　残基　２２−４０．７０−１１７ＭＡｂ２１　：　残基　１− １８．７６−８７ＭＡｂ２５　：　残基　１２−２２．３６−４５．９５−１０ ５．１３２−１５７ＭＡＩ）３２　：　残基　１−２６．１１７−１２８．１４ １−１５３ＭＡｂ３７　：　残基　２２−３１．１４６−１５７ＭＡｂ４２　： 　残基　２２−４０．４９−９６．１１０−１２７．１３６−１５３ＭＡｂ４７ 　：　残基　１−１８，１０８−１２８ＭＡ１５３　：　残基　２２−４０．５ ９−９７．１０５−１２８．　ＵＳ−１５５ＭＡｂ５４　：　残基　５６−７９ ．１１０−１２７．１３６−１５５（以下、余白） 第６表 抗ペプチド血清存在下における抗ＴＮＦモノクローン抗体の拮抗的結合性１：　 −拮抗なし ＋　高濃度の抗ペプチド血清（１／Ｓｏ）によるわずかの拮抗子＋十十　同質的 なＭＡｂの場合と等しい抗ペプチド血清による強い拮抗性２：　ＴＮＦ全体を認 識する血清を引き出すペプチドのみをこのア、セイに用いた。

結論 各モノクローン抗体によって認識される領域の７１ピングによって、グループ夏 （ＭＡｂｌ、２１，４７，５４，３７，３２．そして２５）のモノクローン抗体 は、ＭＡｂ３７と５４とを除き、残基１−１８の領域においてＴＮＦと結合する 。一方、グループＩＩ　（ＭＡｂｌｌ、１２，５３．そして４２）は、ＴＮＦ３ 次元構造のいわゆるパリンドローム・ループを取り囲む残基フｏ−９６の領域に おいてＴＮＦと結合する。内皮ブロコアギエラント活性誘導を阻害するモノクロ ーン抗体（ＭＡｂｌ、３２，４２，４７，５４．そして５３）は、ＴＮＦ３次元 構造のいわゆるパリンドローム・ループをふたたび取り囲む残基１０８−１２８ の領域においてＴＮＦと結合し、またこの領域は内皮細胞にはあるが、腫瘍細胞 にはないＴＮＦ受容体に作用する。インビボ系で腫瘍退行とＴＮＦの抗ウィルス 活性とを促進させるＭＡｂ３２は、残基１−２６，１１７−１２８．モして１４ １−１５３に関連したすべてのループ領域に結合する唯一の抗体である。したが って、これらの領域の結合は、正常細胞のために毒性の排除を完了させるような ＴＮＦ生物学的活性の促進にとって重要なものとなる。

第２表から明らかなように、ＭＡｂｌ、４７、そして５４はＴＮＦの生物学的活 性に対して同一の効果を示す。上記に示した結果から、これら３種類のモノクロ ーン抗体は、ＴＮＦ分子の類似領域へ結合する。したがって、主に残基１−２０ の領域、残基５６−７７の領域、残基１０８−１２８の領域、モして残基１３ｇ −１４９の領域からなる群から選択される少な（とも２つの領域においてＴＮＦ に結合するリガンドは、ＭＡｂｌ、４７および５４と同様にしてＴＮＦの生物学 的活性に対する効果を示す。同様に、主に残基１−２０および７６−９０からな る領域においてＴＮＦと結合するりガントは、モノクローン抗体２１と同様に、 ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示す。主に残基２２−４０および６９−９ ７からなる領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、モノクローン抗体１２と 同様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示す。主に残基１−３０．１１７ −１２８、そして１４１−１５３からなる領域においてＴＮＦと結合するりガン トは、モノクローン抗体３２と同様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示 す。主に残基２２−４０．４９−９７．１１ｏ−１２７、そして１３６−１５３ からなる領域においてＴＮＦと結合するりガントは、モノクローン抗体４２と同 様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示す。主に２２−３１および１４６ −１５７からなる領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、モノクローン抗体 ３７と同様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示す。主に２２−４０．６ ９−９７．１０５−１２８、そして１３５−１５５からなる領域においてＴＮＦ と結合するりガントは、モノクローン抗体５３と同様に、ＴＮＦの生物学的活性 に対して効果を示す。

本発明者は、以下のことをはっきりと示した。すなわち、ＴＮＦの生物学的活性 は、ＴＮＦへのリガンドの結合によって変更されてしまう。また、生物学的効果 はりガントの特異性を表わす関数である。例えば、ＭＡｂ３２のＴＮＦへの結合 は、残基１−２６，１１７−１２８．１４１−１５３からなる領域においてＴＮ ＦへのＭＡｂ３２の結合は、ＴＮＦの内皮プロコアギ１ラント活性の誘導を引き 起こし、また内皮細胞上の受容体に対するＴＮＦの結合は阻害された状態となり 、ＴＮＦによる腫瘍退行活性および腫瘍フィブリン沈着活性は促進された状態と なる。細胞毒性については同等影響されず、またＴＮＦの腫瘍受容体活性は影響 されないか、あるいは促進される。ＴＮＦの生物学的活性に対するこのような効 果は、ＭＡｂ３２によって認識されるＴＮＦのエピトープが自然発生的な生物学 的活性リガンドへの結合を妨害されることによって起こる。したがって、ＭＡｂ ３２によって作られた同様の効果もまた、ＴＮＦの領域に結合するリガンドによ って作られることから、ＭＡ１３２によって認識されたエピトープは、自然発生 的な生物学的に活性なりガントへの結合から阻害される。

この結合の妨害は、立体障害または他の機構によるものであろう。

したがって、本願に開示された種々のモノクローン抗体によって認識されるエピ トープの、自然発生的生物学的活性リガンドへの結合阻害は、本発明の範囲内に ある。

Ｆ／（３，４ ＣｏｎＬ　１　１１　１２２０２１２５３１３２３７４２４７５３５４抗体に浬 Ｆ／Ｇ−６ Ｆ工Ｇ−１０ ＰＥ３Ｓ　ＴＮＦ　Ｔ）、ＪＦす３２ 蛤で１ Ｆ工Ｇ、　１１ Ｎ（ｖ／さ戎駿看／味稲り民丁、ｖ７＝ＦＩＧ、　１４ ＦＩＧ、　１５ ＦＩＧ、　１６ ＦＩＧ、１７ ＴＮＦａ（μ９／詐財　） ＦＩＧ、１８ ＦＩＧ、１９ ＦＩＧ、　２０ （２（）Ｏｇｌ　７’Ｑゲリン中１０ｕｇＴＮＦ　基１Ｈ／日／′（シス　コＦ ＩＧ、２２ ＦＩＧ、　２３ ＦＴＧ、２６ ＦＴＧ、２８ 国際調査報告 ｍ’ｎつπ正り汀ロ廿込Ｔ工αａ交λに１でＰゴびＯＮ酎耐飴Ｗｊ地ＡｐＰ１． ＩＣＡＴＩｌ！−丁ＥＮＤ　ＯＦ　ＡＮＮＥＸ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは前記ＴＮＦに結合 すると、前記ＴＮＦの生物学的活性： １．腫瘍退行； ２．内皮プロコアギュラントの誘導； ３．腫瘍フイブリン沈着の誘導； ４．細胞毒性；そして ５．受容体結合 を阻害することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ２．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドが前記ＴＮＦへ結合 することによって、前記ＴＮＦによる内皮プロコアギュラント誘導、腫瘍退行、 腫瘍フイブリン沈着誘導、細胞毒性、そして受答体結合が阻害され、前記ＴＮＦ への前記リガンドの結合は、残基１−１８、５８−６５、１１５−１２５、そし て１３８−１４９からなるトポグラフイック領域、または残基１−１８、１０８ −１２８からなるトポダラフィック領域、または残基５８−７９、１１０−１２ ７、そして１３５−１５５からなるトポグラフイック領域によって限定される前 記ＴＮＦのエピトープが、実質的に、自然発生的な生物学的活性リガンドに結合 することを妨げられること特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ３．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リかンドは前記ＴＮＦの主と して残基１−２０からなるトポグラフィック領域と、残基５６−７７からなるト ポグラフイック領域と、残基１０８−１２７からなるトポグラフイック領域と、 そして残基１３８−１４９からなるトポグラフイック領域とからなる群から選択 される少なくとも２つの領域によって結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合 リガンド。 ４．請求の範囲第２項記載のリガンドであって、該リガンドはトポグラフイック 領域を限定する残基１−１８、５８−６５、１１５−１２５、そして１３８−１ ４９においてヒトＴＮＦと結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ５．請求の範囲第２項記載のリガンドであって、該リガンドは残基１−１８およ び１０８−１２８のトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦと結合することを 特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ６．請求の範囲第２項記載のリガンドであって、該リガンドは残基５６−７９、 １１０−１２７、そして１３６−１５５からなるトポグラフイック領域において ヒトＴＮＦと結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ７．請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか一項記載のリガンドであって、該 リガンドは、抗体、Ｆ（ａｂ）断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、単一鎖抗 体、そして血清結合タンパク質からなる群から選択されることを特徴とするヒト ＴＮＦ結合リガンド。 ８．請求の範囲第７項記載のリガンドであって、該リガンドはモノクローン抗体 またはそのＦ（ａｂ）断片であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ９．請求の範囲第１項、第２項、第３項、第６項または第７項記載のリガンドで あって、該リガンドは、ＭＡｂ１（ＥＣＡＣＣ８９０８０３０１）、ＭＡｂ５４ （ＥＣＡＣＣ８９０８３１０３）、そしてＭＡｂ４７（ＥＣＡＣＣ８９１２１４ ０２）からなる群から選択されるモノクローン抗体であることを特徴とするヒト ＴＮＦ結合リガンド。 １０．請求の範囲第４項記載のリガンドであって、該リガンドはＭＡｂ１（ＥＣ ＡＣＣ８９０８０３０１）であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 １１．請求の範囲第５項記載のリガンドであって、該リガンドはＭＡｂ５４（Ｅ ＣＡＣＣ８９０８３１０３）であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 １２．請求の範囲第６項記載のリガンドであって、該リガンドはＭＡｂ４７（Ｅ ＣＡＣＣ８９１２１４０２）であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 １３．リガンドと組み合わさってＴＮＦが含まれる組成物であって、該リガンド は請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれか一項記載のリガンドであり、かつ 前記リガンドは前田ＴＮＦと結合していることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガ ンド含有組成物。 １４．中毒ショックを処置するための方法であって、該方法は、請求の範囲第１ 項ないし第１２項のいずれか一項記載のリガンドまたは請求の範囲第１３項記載 の組成物のどちらか一方の投与を含むことを特徴とする中毒ショック処置方法。 １５．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦに 結合することによって、前記ＴＮＦによる内皮プロコアギュラント活性誘導が阻 害きれ、そして前記ＴＮＦによる腫瘍フイブリン沈着誘導および腫瘍退行活性が 促進されるが、一方で前記ＴＮＦの細胞毒性および受容体結合活性については影 響を受けないことを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 １６．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦに 結合することによって、前記ＴＮＦの内皮プロコアギュラント活性誘導を阻害し 、内皮細胞上の受容体への前記ＴＮＦ結合を阻害し、また前記ＴＮＦによる腫瘍 フイブリン沈着誘導および腫瘍退行活性を促進させ、一方で前記ＴＮＦの細胞毒 性および受容体結合活性については影響を受けないか、あるいは促進されるもの で、さらに前記リガンドは残基１−３０、１１７−１２８、そして１４１−１５ ３からなるトポグラフイック領域において前記ヒトＴＮＦに結合することを特徴 とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 １７．ヒトＴＮＦに結合するリガンドであって、該リガンドは、残基１−３０、 １１７−１２８、そして１４１−１５３からなるトポクラフイック領域において ヒトＴＮＦに結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 １８．請求の範囲第１７項記載のリガンドであって、該リガンドは、残基１−２ ６、１１７−１２８、そして１４１−１５３からなるトポグラフイック領域にお いてヒトＴＮＦに結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 １９．請求の範囲第１４項ないし第１６項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドは、抗体、Ｆ（ａｂ）断片、単一ドメイン抗体（ｄＡＢｓ）、単 一鎖抗体、そして血清結合タンパク質からなる群から選択されることを特徴とす るヒトＴＮＦ結合リガンド。 ２０．請求の範囲第１９項記載のリガンドであって、該リガンドはモノクローン 抗体またはそのＦ（ａｂ）断片であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド 。 ２１．請求の範囲第１５項ないし第２０項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドは、ＭＡｂ３２（ＥＣＡＣＣ８９０８０３０２）であることを特 徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ２２．リガンドと組み合わさってＴＮＦが含まれる組成物であって、該リガンド は請求の範囲第１５項ないし第２１項のいずれか一項記載のリガンドであり、か づ前記リガンドは前記ＴＮＦと結合していることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リ ガンド含有組成物。 ２３．ＴＮＦによって増殖が阻害される腫瘍を処置するための方法であって、該 方法は、請求の範囲第１５項ないし第２１項のいずれか一項記載のリガンドまた は請求の範囲第２２項記載の組成物のどちらか一方の投与を含むことを特徴とす る腫瘍処置方法。 ２４．請求の範囲第２３項記載の方法であって、前記腫瘍は、メラノーマ、胸部 カルシノーマ、そして膀胱カルシノーマからなる群から選択されることを特徴と する腫瘍処置方法。 ２５．請求の範囲第２３項または第２４項記載の方法であって、該方法は、癌治 療に用いられる細胞毒性剤の同時投与を含むことを特徴とする腫瘍処置方法。 ２６．請求の範囲第２４項記載の方法であって、前記細胞毒性剤は、ピンブラス チン、アシクロビル、インターフェロンアルファ、ＩＬ−２、アクチノマイシン Ｄ、ＡＺＴ、ラジオセラビイ、アドリアマイシン、マイトマイシンＣ、シトシン 、アラビノシド、ドウノルイシン、シス−ブラチン、ビンクリスチン、５−フル オロウラシル、そしてプレオマイシンからなる群から選択されることを特徴とす る腫瘍処置方法。 ２７．ヒトＴＮＦの残基１−１８へ結合するリガンド（ペプチド３０１）であっ て、該リガンドは、前記ＴＮＦへ結合することによって、前記ＴＮＦの内皮プロ コアギュラント活性誘導を阻害し、前記ＴＮＦの腫瘍退行を促進させることを特 徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ２８．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの内皮プロコアギュラント活性誘導を阻害し 、内皮細胞上の受容体への前記ＴＮＦ結合を阻害し、また前記ＴＮＦによる腫瘍 フィブリン沈着誘導および腫瘍退行活性を促進させ、一方で前記ＴＮＦの細胞毒 性については影響を受けず、前記ＴＮＦの受容体結合活性については影響を受け ないか、あるいは促進されるもので、 前記ＴＮＦへの前記リガンドの結合は、残基１−１８からなるトポダラフイック 領域によって限定される前記ＴＮＦのエピトープが、実質的に、自然発生的な生 物学的活性リガンドに結合することを妨げられることを特徴とするヒトＴＮＦ結 合リガンド。 ２９．リガンドと組み合わきってＴＮＦが含まれる組成物であって、該リガンド は請求の範囲第２７項または第２８項記載のリガンドであり、かつ前記リガンド は前記ＴＮＦと結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド含有組成物。 ３０．ＴＮＦによって増殖が阻害される腫瘍を処置するための方法であって、該 方法は、請求の範囲第２７項ないし第２８項記載のリガンドまたは請求の範囲第 ２９項記載の組成物のどちらか一方の投与を含むことを特徴とする腫瘍処置方法 。 ３１．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの細胞毒性および腫瘍退行は影響されず、前 記ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導、腫瘍フイブリン沈着誘導および受容体 結合活性は阻害されることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ３２．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの細胞毒性および腫瘍退行は影響されず、前 記ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導および腫瘍フイブリン沈着誘導は阻害さ れるが、前記ＴＮＦの受容体結合活性は阻害されず、前記ＴＮＦへの前記リガン ドの結合は、残基２２−４０、４９−９７、１１０−１２７、そして１３６−１ ５３からなるトポグラフイック領域によって限定される前記ＴＮＦのエピトープ が、実質的に、自然発生的な生物学的活性リガンドに結合することを妨げられる ことを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ３３．リガンドであって、該リガンドは、残基２２−４０、４９−９７、１１０ −１２７、そして１３６−１５３からなるトポグラフイック領域においてヒトＴ ＮＦと結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ３４．請求の範囲第２３項記載のリガンドであって、該リガンドは残基２２−４ ０、４９−９６、１１０−１２７、そして１３６−１５３からなるトポグラフィ ック領域においてヒトＴＮＦと結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガン ド。 ３５．請求の範囲第３１項ないし第３５項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドは、抗体、Ｆ（ａｂ）断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）再構 成抗体、単一鎖抗体、そして血清結合タンパク質からなる群から選択されること を特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ３６．請求の範囲第３５項記載のリガンドであって、該リガンドはモノクローン 抗体またはそのＦ（ａｂ）断片であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド 。 ３７．請求の範囲第３１項ないし第３６項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドはＭＡｂ４２（ＥＣＡＣＣ８９０８０３０４）であることを特徴 とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ３８．リガンドと組み合わさってＴＮＦが含まれる組成物であって、該リガンド は請求の範囲第３１項ないし第３７項のいずれか一項記載のリガンドであり、か っ前記リガンドは前記ＴＮＦと結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガン ド含有組成物。 ３９．ＴＮＦによって阻害される腫瘍を処置するための方法であって、該方法は 、請求の範囲第３１項ないし該３７項のいずれか一項記載のリガンドもしくは請 求の範囲第３８項記載の組成物のどちらか一方の投与を含むことを特徴とする腫 瘍処置方法。 ４０．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性が促進され、前記 ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行および受容体結合活性が阻害され、一方で前記ＴＮ Ｆの内皮プロコアギュラント活性誘導は影響されないことを特徴とするヒトＴＮ ド結合リガンド。 ４１．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性が促進され、前記 ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行および受容体結合活性が阻害され、一方で前記ＴＮ Ｆの内皮プロコアギュラント活性誘導は影響されず、前記ＴＮＦへの前記リガン ドの結合は、残基１２−２２、３６−４５、９６−１０５、そして１３２−１５ ７からなるトポグラフィック領域によって限定きれる前記ＴＮＦのエピトープが 、実質的に、自然発生的な生物学的活性リガンドに結合することを妨げられるこ とを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ４２．ヒトＴＮＦに結合するリガンドであって、該リガンドは、残基１２−２２ 、３６−４５、９６−１０５、そして１３２−１５７からなるトポグラフイック 領域においてヒトＴＮＦと結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ４３．請求の範囲第４０項ないし第４２項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドは、抗体、Ｆ（ａｂ）断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）再構 成抗体、単一鎖抗体、そして血清結合タンパク質からなる群から選択されること を特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ４４．請求の範囲第４３項記載のリガンドであって、該リガンドはモノクローン 抗体またはそのＦ（ａｈ）断片であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド 。 ４５．請求の範囲第４０項ないし第４４項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドはＭＡｂ２５（ＥＣＡＣＣ８９１２１４０１）であることを特徴 とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ４６．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性が促進され、前記 ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、受容体結合活性および内皮プロコアギュラント活 性誘導が阻害されることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ４７．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リかンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性が促進され、前記 ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、受容体結合活性および内皮プロコアギュラント活 性誘導は阻害され、 前記ＴＮＦへの前記リガンドの結合は、残基１−２０および７６−９０からなる トポグラフイック領域によって限定される前記ＴＮＦのエピトープが、実質的に 、自然発生的な生物学的活性リガンドに結合することを妨げられることを特徴と するヒトＴＮＦ結合リガンド。 ４８．ヒトＴＮＦに結合するリガンドであって、該リガンドは、残基１−２０お よび７６−９０からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦと結合するこ とを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ４９．ヒトＴＮＦに結合するリガンドであって、該リガンドは、残基１−１８お よび７６−９０からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦと結合するこ とを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ５０．請求の範囲第４６項ないし第４９項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドは、抗体、Ｆ（ａｂ）断片、単一ドメイン抗体（ｄＡＢｓ）再構 成抗体、単一鎖抗体、そして血清結合タンパク質からなる群から選択されること を特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ５１．請求の範囲第５０項記載のリガンドであって、該リガンドはモノクローン 抗体またはそのＦ（ａｂ）断片であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド 。 ５２．請求の範囲第４６項ないし第５１項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドはＭＡｂ２１（ＥＣＡＣＣ９００１２４３２）であることを特徴 とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ５３．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性を影響されず、前 記ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、受容体結合活性および内皮プロコアギュラント 活性誘導が阻害されることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ５４．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性は影響されず、前 記ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、受容体結合活性および内皮プロコアギュラント 活性誘導は阻害され、 前記ＴＮＦへの前記リガンドの結合は、残基２２−４０、６９−９７、１０５− １２８、そして１３５−１５５からなるトポグラフィック領域によって限定され る前記ＴＮＦのエピトープが、実質的に、自然発生的な生物学的活性リガンドに 結合することを妨げられることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ５５．ヒトＴＮＦに結合するリガンドであって、該リガンドは、残基２２−４０ 、６９−９７、１０５−１２８、そして１３５−１５５残基からなるトポグラフ イック領域においてヒトＴＮＦと結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガ ンド。 ５６．請求の範囲第５３項ないし第５５項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドは、抗体、Ｆ（ａｂ）断片、単一ドメイン抗体（ｄＡＢｓ）再構 成抗体、単一鎖抗体、そして血清結合タンパク質からなる群から選択されること を特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ５７．請求の範囲第５６項記載のリガンドであって、該リガンドはモノクローン 抗体またはそのＦ（ａｂ）断片であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド 。 ５８．請求の範囲第５３項ないし第５７項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドはＭＡｂ５３（ＥＣＡＣＣ９００１２４３３）であることを特徴 とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ５９．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性、細胞毒性、腫瘍 退行、受容体結合活性および内皮プロコアギュラント活性誘導は影響を受けない ことを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ６０．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性、細胞毒性、腫瘍 退行、受容体結合活性および内皮プロコアギュラント活性誘導は影響を受けず、 前記ＴＮＦへの前記リガンドの結合は、残基２２−３１および１４６−１５７か らなるトポグラフイック領域によって限定される前記ＴＮＦのエピトープが、実 質的に、自然発生的な生物学的活性リガンドに結合することを妨げられることを 特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ６１．ヒトＴＮＦに結合するリガンドであって、該リガンドは、残基２２−３１ および１４６−１５７からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦと結合 することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ６２．請求の範囲第５９項ないし第６１項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドは、抗体、Ｆ（ａｂ）断片、単一ドメイン抗体（ｄＡＢｓ）再構 成抗体、単一鎖抗体、そして血清結合タンパク質からなる群から選択されること を特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ６３．請求の範囲第６２項記載のリガンドであって、該リガンドはモノクローン 抗体またはそのＦ（ａｂ）断片であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド 。 ６４．請求の範囲第５９項ないし第６３項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドはＭＡｂ３７（ＥＣＡＣＣ８９０８０３０３）であることを特徴 とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ６５．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性、細胞毒性、腫瘍 退行および受容体結合活性が阻害され、一方で前記ＴＮＦの内皮プロコアギュラ ント活性誘導は影響を受けないことを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ６６．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性、細胞毒性、腫瘍 退行および受容体結合活性が阻害され、一方で内皮プロコアギュラント活性誘導 は影響を受けず、 前記ＴＮＦへの前記リガンドの結合は、残基２２−４０および４９−９８からな るトポグラフイック領域によって限定される前記ＴＮＦのエピトープが、実質的 に、自然発生的な生物学的活性リガンドに結合することを妨げられることを特徴 とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ６７．リガンドであって、該リガンドは、残基２２−４０からなるトポグラフイ ック領域においてヒトＴＮＦと結合することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガン ド。 ６８．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性、細胞毒性、腫瘍 退行および受容体結合活性が阻害され、一方で内皮プロコアギュラント活性誘導 は影響を受けず、 前記ＴＮＦへの前記リガンドの結合は、残基２２−４０および７０−８７からな るトポグラフイック領域によって限定される前記ＴＮＦのエピトープが、実質的 に、自然発生的な生物学的活性リガンドに結合することを妨げられることを特徴 とするヒトＴＮＰ結合リガンド。 ６９．請求の範囲第６７項記載のリガンドであって、該リガンドは、残基２２− ４０および７０−８７からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦと結合 することを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ７０．請求の範囲第６５項ないし第６９項のいず札か一項記載のリガンドであっ て、該リガンドは、抗体、Ｆ（ａｂ）断片、単一ドメイン抗体（ｄＡＢｓ）再構 成抗体、単一鎖抗体、そして血清結合タンパク質からなる群から選択されること を特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ７１．請求の範囲第７０項記載のリガンドであって、該リガンドはモノクローン 抗体またはそのＦ（ａｂ）断片であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド 。 ７２．請求の範囲第６５項、第６６項、第７０項、そして第７１項のいずれか一 項記載のリガンドであって、該リガンドは、ＭＡｂ１１またはＭＡｂ１２である ことを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ７３．請求の範囲第７２項記載のリガンドであって、該リガンドはＭＡｂ１１で あることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ７４．請求の範囲第６５項ないし第６９項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドはＭＡｂ１２であることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ７５．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの内皮プロコアギュラント活性誘導が阻害さ れることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ７６．ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦへ 結合することによって、前記ＴＮＦの内皮プロコアギュラント活性誘導が阻害さ れ、 前記ＴＮＦへの前記リガンドの結合は、残基１０８−１２８からなるトポグラフ イック領域によって限定される前記ＴＮＦのエピトープが、実質的に、自然発生 的な生物学的活性リガンドに結合することを妨げられることを特徴とするヒトＴ ＮＦ結合リガンド。 ７７．残基１０８−１２８からなる領域においてヒトＴＮＦに結合可能なリガン ドであって、該リガンドは、前記ＴＮＦの内皮プロコアギュラント活性誘導が阻 害されることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ７８．請求の範囲第７５項ないし第７７項のいずれか一項記載のリガンドであっ て、該リガンドは、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３２、ＭＡｂ４２、ＭＡｂ４７、ＭＡｂ５ ３、そしてＭＡｂ５４と命名されたモノクローン抗体からなる群から選択される ものであることを特徴とするヒトＴＮＦ結合リガンド。 ７９．リガンドであって、該リガンドは、第２３図ないし第３１図または第３３ 図のいずれかひとつによってトポグラシフィックに示された領域は、、自然発生 的な生物学的活性リガンドに結合することを妨げられることを特徴とするヒトＴ ＮＦ結合リガンド。 ８０．ペプチドであって、該ペプチド（ペプチド２７５）は、ＴＮＦの１１２− １２０残基に実質的に一致するアミノ酸配列を有すること特徴とするアミノ酸配 列。 ８１．ペプチドであって、該ペプチド（ペプチド３０１）は、ＴＮＦの１−１８ 残基に実質的に一致するアミノ酸配列を有すること特徴とするアミノ酸配列。 ８２．ペプチドであって、該ペプチド（ペプテド３０２）は、ＴＮＦの４３−５ ８残基に実質的に一致するアミノ酸配列を有すること特徴とするアミノ酸配列。 ８３．ペプチドであって、該ペプチド（ペプチド３０４）は、ＴＮＦの６３−８ ３残基に実質的に一致するアミノ酸配列を有すること特徴とするアミノ酸配列。 ８４．ペプチドであって、該ペプチド（ペプチド３０５）は、ＴＮＦの１２３− １５０残基に実質的に一致するアミノ酸配列を有すること特徴とするアミノ酸配 列。 ８５．ペプチドであって、該ペプチド（ペプチド３０６）は、ＴＮＦの１３−２ ６残基に実質的に一致するアミノ酸配列を有すること特徴とするアミノ酸配列。 ８６．ペプチドであって、該ペプチド（ペプチド３０７）は、ＴＮＦの２２−４ ４残基に実質的に一致するアミノ酸配列を有すること特徴とするアミノ酸配列。 ８７．ペプチドであって、該ペプチド（ペプチド３０８）は、ＴＮＦの５４−６ ８残基に実質的に一致するアミノ酸配列を有すること特徴とするアミノ酸配列。 ８８．ペプチドであって、該ペプチド（ペプチド３０８）は、ＴＮＦの７３−９ ３残基に実質的に一致するアミノ酸配列を有すること特徴とするアミノ酸配列。 ８９．ペプチドであって、該ペプチド（ペプチド３０８）は、ＴＮＦの７３−８ ９残基に実質的に一致するアミノ酸配列を有すること特徴とするアミノ酸配列。