JPH04507240A

JPH04507240A - インシュリン様成長因子及び類似体を用いる障害治療方法

Info

Publication number: JPH04507240A
Application number: JP2509846A
Authority: JP
Inventors: ルイス，マイケル・イー; カウアー，ジェームズ・シー; スミス，ケビー・アール; キャリソン，キャスリーン・ブイ; バルディノ，フランク，ジュニアー
Original assignee: セファロン・インコーポレーテッド
Priority date: 1989-06-05
Filing date: 1990-06-05
Publication date: 1992-12-17
Anticipated expiration: 2010-07-26
Also published as: ES2106735T3; US5093317A; EP0798000A2; JPH0768138B2; CA2058443C; CA2058443A1; HK1010989A1; ATE156018T1; EP0476044A4; EP0476044A1; DE69031168D1; EP0476044B1; WO1990014838A1; EP0798000A3; DK0476044T3; DE69031168T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】インシュリン様成長因子及び類似体を用いる障害治療方法［技術分野］本出願は、Ｌｅｗｉｓらの１９８９年６月６日出願の米国特許出願第３６１゜５９５号の部分継続出願である。

本発明は、神経学的及びその他の障害の治療などに用い得る治療用ポリペプチドに関する。

［背景技術］インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）は、各種組織において［Ｂａｘｔｅｒら、Ｃｏｍｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　９１Ｂ：２２９−２３５　（１９８８）：Ｄａｕｇｈａｄａｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ、１０：６８ −９１（１９８９）参照］、とりわけ発生段階において［Ｄ’　Ｅｒｃｏｌｅ、Ｊ、Ｄｅｖｅｌ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、９：４８１−４９５　（１９８７）参照］細胞の成長を刺激するポリペプチドとして多くの動物種で同定されている。ＩＧＦはそれぞれ約７，５００ダルトンの分子量を有し、ヒトプロインシュリンと化学的に類似する。即ち、ＩＧＦはＡ及びＢドメインを有し、これらのドメインは（１）プロインシュリンの対応するドメインによく類似しており、（２）より小さな、相関性を有しないドメインＣによって連結されている。ＩＧＦにはさらにカルボキシル末端伸長部であるＤドメインがあるが、これはプロインシュリンには見られない。

ＩＧＦのある種のポリペプチド断片は、それぞれのＩＧＦに特異的な抗体を高めるための抗原として有用であることが示されている［例えば、日本特許出願ｒｍ、Ｍｅｔａｂ、Ｒｅｓ、、２０：３４４−３４７　（１９８８）参照コ。ラベルしたＩＧＦに特異的な抗体をプローブとして、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−ＩＩ　＜それぞれソマトメジンＣ及びソマトメジンＡと呼ばれることもある）は、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）を含む多くの組織に見いだされている。ＣＮＳ中にこれらのポリペプチドをコードするｍＲＮＡが存在することは、ＣＮＳ中での局部的な合成を示唆している。［Ｂａ５ｋｊｎら、ＴｌＮ５．１１　：１０７−１１１　（１９８８）参照］。さらに、ＩＧＦ−Ｉの３つのＮ−末端アミノ酸残基を欠く、ＩＧＦ−Ｉの不完全形であるＩＧＦ−ｍ　（または脳ＩＧＦ）が胎児及び成人のヒトＩＧＦ受容体が成人ヒトＣＮＳ　（Ｂａｓｋｉｎら、１９８８）及び脳［５ａｒａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｌｅｔ、、３４：３９−４４　（１９８２）］に同定されている。さらに、ヨーロッパ特許出願第８６８５０４１７．６号は、ヒト胎児膜に分布する第３の型のＩＧＦ受容体の存在を記載する。この分野の複雑な研究としては、（１）脳膜のインシュリン受容体はインシュリンばかりでな（、ＩＧＦも認識するという証拠、（２）２つの型の成人ＩＧＦ受容体のうちの１つは、■ＣＦ−Ｉ及び■の両方のみならずインシュリンにもある程度の親和性を示すという知見、（３）ＩＧＦ−ＩＩが第２の型の成人ＩＧＦ受容体に結合する（Ｂａ、５ｋｉｎら、１９８８）ことの生理学的重要性についての不確定性、が挙げられる。

ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩは、広範な影響されやすい型の細胞の発生及び増殖を刺激する効果を有すると思われるＣＤａｕｇｈａｄａｙら、１９８９参照）。

ＩＧＦまたはそのポリペプチド断片を用いる治療が、骨の修復や取り替え治療として（ヨーロッパ特許出願第８８３０３８５５．６号）、制癌剤のある種の有害な副作用を中和する手段として（日本特許出願第６３１９６５２４号）、そしてまた牛やその他の家畜の乳の分泌と肉の生産性を増す方法として（Ｌａｒｓｅｎら、米国特許第４，７８３．５２４号）広く示唆されて来た。各ＩＧＦはまた、６８５０４１７．６号］及び末梢神経系から［Ｂｏｔｈｗｅｌ　１．Ｊ、Ｎｅｕｒる培養胚子様ニューロン（これは成熟ニューロンとは異なり、細胞分裂をする能力を未だ失っていない）の生存、増殖及び／または軸索の伸長を増加すると思われる。また、ＩＧＦは未分化の神経細胞の発生に影響を及ぼすことが示された。

即ち、ヒト神経芽細胞腫の細胞は、軸索を伸長することによって［Ｒｅｃｉｏ− Ｐｉｎｔｏ　ａｎｄ　ｌ５ｈｉｉ、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｒｅｓ、、１９：３１２−３２０　（１９８８）］、また有糸分裂を行うことによって１ｇＭａｔｔｓ。

ｎら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１０２＋１９４９−５４　（１９８６）］、添加ＩＧＦに反応することが示された。酵素オルニチンデカルボキシラーゼの誘導がこれらの細胞の有糸分裂活性の刺激と関連することが示されたので、この酵素の活性レベルを測定することに基づく細胞増殖アッセイが考案された（Ｍａｔｔｓｏｎら、１９８６）。

）を添加すると、伝達物質特異的酵素（アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ中隔ニューロンにおけるＣｈＡＴレベルを増加するが、甲状腺ホルモンとＮＧＦとの組み合わせは、これら２つめ物質を個々に加えた合計の効果よりもはるかに大きいＣｈＡＴ活性の刺激をもたらした［Ｈａｙａｓｈｉ　ａｎｄ　Ｐａｔｅｌ、Ｄｅｖ、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、、３６：１０９−１２０　（１９８７）　コ　。　■ＧＦ−１．ＩＧＦ−ｎ及びインシュリンも培養中隔ニューロンにおけるＣｈＡＴ活性を誘導する［Ｋｎｕｓｅｌら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、、１０：５５８−５７０　（１９９０）］。ＮＧＦとインシュリンの両方を培地に加えたときのＣｈＡＴ活性への効果は相加的であるが、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−ＩＩとインシュリンとの組み合わせは相加的ではない（Ｋｎｕｓｅｌら、１９９０）。

役割の生理学的性質はまだはっきりとはしない。いったんＣＮＳの神経細胞が成熟に達すると、もはや細胞分裂を行わない。

ＩＧＦ以外の神経栄養因子が、ニューロンの生存性を増す有力な手段として提案されている。例えば、筋萎縮性側索硬化症（見かけ分子量２０，０００−２２１０００ダルトン及び１６．０００−１８．０００ダルトンの骨格筋由来のタンパク質を用いる：　ＰＣＴ出願　ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１３９３）や、アルツハイマー病（フォスフォエタノールアミンを用いる：ＰＣＴ出願　ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１６９３）のような神経退行性疾病の治療に用いる。５ａｒａらは、アルツハイマー病に苦しむ患者の血清及び脳を髄液ソマトメジン（ＩＧＦ）レベルに、正常な対照群と比して”顕著な増加”を観察したが、次のように結論する：ソマトメジンがアルツハイマー型の痴呆症の病因にカジュアルな（原文のまま）役割を果たすか否かはまだわからない。しかしながら、ソマトメジンが脳組織中へのアミノ酸の取り込みを刺激するのであるから、その投与は有効な治療効果をもたらすかも知れない。結論としては、正常な老人患者におけるソマトメジンの低下は、細胞の老化におけるソマトメジンの役割への疑問を高める［５ａｒａら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、Ａｇｉｎｇ、３：１１７−１２０．１１９（１９８２）より略して引用］ＩＧＦ−Ｉが、成人ラット脳のスライスからアセチルコリンの即時（２０分以内）放出を刺激するという報告（コリン作動性酵素活性が増加したというよりも、アセチルコリンの神経伝達が一時的に増加したと考えられるプロセス）において、Ｎｉ１ｓｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｌｅｔ、、８８：２２１−２２６゜２２１．２２４　（１９８８）は、次のように指摘する・アルツハイマー病における主な欠損の一つは、脳のコリン作動性系に関し、脳ではアセチルコリンの合成及び放出の減少が観察される一一一アルツハイマー病のような神経退行性疾病におけるＩＧＦの役割をさらに追及することが重要である（引用略）損傷した末梢神経、特にシュワン細胞と呼ばれる非神経細胞におけるＩＧＦ−■ の増加を検出するためにＩＧＦ−Ｉに特異的な抗体を用いて、Ｈａｎｓｓｏｎら、Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、５ｃａｎｄ、、１３２：３５−４１．３８．４０　（１９８８）は次のように示唆する：かくして、あらゆる損傷後に再生する末梢神経において、ＩＧＦ−Ｉの免疫応答性の増加が見られ、これは特にシュワン細胞において顕著なように、一般的な反応パターンとなっているように思える。

我々の超構造研究により、シュワン細胞は振動障害後に肥大し、活性化の兆しを見せる、即ち顆粒小胞体とゴルジ複合体の大きさが増すことが明らかとなった。

従って、振動にさらした神経の研究で述べたように、修復過程の初期段階において有用な一時的な応答性の一部として、シュワン細胞におけるＩＧＦ−Ｉの免疫応答性が増加したものと我々は解釈する。ＩＧＦ−Ｉの免疫応答性の増加は、損傷した組織または器官の修復において生じる一連の反応の初期反応を意味すると考えられるが、この増加は、振動にさらした後に起こると報告されている微小管の減少に部分的には由来する、ＩＧＦ−１分子の軸素原形質輸送が阻害されたためと解釈する方がよいかも知れない（引用略）さらに、Ｓｊｏｂｅｒｇら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、、４８旦：１０２−１０８（１９８９）は、損傷した末梢神経にＩＧＦ−Ｉを局所投与すると、関連する非神経細胞の増殖と共に神経の再生も刺激することを見いだした。

ペプチダーゼによる分解に対するポリペプチドの感受性を減少させるために、例えば天然ポリペプチドのし一アミノ酸残基をＤ−異性体で置換するなどのいくつかの方法が用いられている［Ｃｏｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、７３　：　６３２−８　（１９７６）コ。ＣＮＳ障害の治療としてポリペプチドを用いるためには、さらにいわゆる”脳血液関門”と呼ばれる問題を解決しなければならない。即ち、これは脳の毛細壁構造が血液中に存在する分子の種類を効果的に識別して選択し、これらが脳に流入するのを妨げるものである。脳血液関門は脳にポリペプチドを直接注入することにより、効果的に迂回しつるが、例えば、ポリペプチドをより親油性にしたり、目的のポリペプチドを、関門を越えて自然に輸送される分子と結合させたり、あるいはポリペプチド鎖の全体の長さを小さくするなどによって、目的のポリペプチドを脳血液関門を通過して輸送させることを目的とする、より実際的な方法の研究が行われている［Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、７：３１４ −３３０　（１９８６）：米国特許第４．８０１，５７５号コ。

［発明の開示コ一般的に本発明は、好ましくは老化、損傷またはアルツハイマー病、卒中発作、癲瘤、筋萎縮性側索硬化症、あるいはパーキンソン病などの病気による影響に苦しむ神経組織を治療する情況において、有効量のＮＧＦまたはその機能的誘導体の投与を伴うか、あるいは伴わずに（ただし、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを投与する場合には、ＮＧＦまたはその機能的誘導体を投与するものとする）、有効量のＩＧＦ−４、ＩＣＦ−Ｉの機能的誘導体、ＩＧＦ−ＩｆまたはＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体のうちの少な（とも一つを哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における瀕死の神経細胞、好ましくは非分裂性神経細胞及び／またはコリン作動性神経細胞の生存性を増加する方法を特徴とする。

本発明はまた、好ましくは老化、損傷またはアルツハイマー病、卒中発作、癲痴、筋萎縮性側索硬化症、あるいはパーキンソン病などの病気による影響に苦しむ神経組織を治療する情況において、細胞生存を促進する量の成長因子、例えばＩＧＦ−Ｉ、またはＩＧＦ−ＩＩ、あるいは成長因子の機能的誘導体（例えば第１の成長因子の断片、類似体、または断片の類似体）を単独で、あるいは他の成長因子またはその機能的誘導体と生物的に活性に組み合わせて投与することを含む第１の処置を哺乳動物に施し、次いで神経伝達物質を増加する量の伝達物質促進剤、例えばＮＧＦまたは伝達物質促進剤の機能的誘導体（例えば伝達物質促進剤の断片、類似体、または断片の類似体）を投与することを含む第２の処置を該噛乳動物に施すことによって、哺乳動物における瀕死の神経細胞、好ましくは非分裂性神経細胞及び／またはコリン作動性神経細胞の生存性を増加する方法を特徴とする本発明はまた、好ましくは老化、損傷またはアルツハイマー病、卒中発作、癲廃、筋萎縮性側索硬化症、あるいはパーキンソン病などの病気による影響に苦しむ神経組織を治療する情況において、有効量のＮＧＦまたはその機能的誘導体の投与を伴うか、あるいは伴わずに（ただし、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−ＩＩを投与する場合には、ＮＧＦまたはその機能的誘導体も投与するものとする）、有効量のＩＧＦ−Ｉ、Ｉ　ＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉの機能的誘導体またはＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体（好ましくはＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの断片を投与、若しくはＩＣＦ−ＩまたはＩＧＦ−１１の類似体、あるいはＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ −ＩＩの断片の類似体を投与）のうちの少なくとも一つを哺乳動物に投与することによって、哺乳動物におけるコリン作動性神経細胞、好ましくは非分裂性神経細胞のコリン作動性活性（例えば、アセチルコリン合成容量）を増加する方法を特徴とする。

本発明はまた、好ましくは老化、損傷またはアルツハイマー病、卒中発作、癲痴、筋萎縮性側索硬化症、あるいはパーキンソン病などの病気による影響に苦しむ神経組織を治療する情況において、細胞生存を促進する量の成長因子、例えばＩＧＦ−Ｉ、またはＩＧＦ−ＩＩ、あるいは成長因子の機能的誘導体（例えば断片、類似体、または断片の類似体）を単独で、あるいは他の成長因子またはその機能的誘導体と生物的に活性に組み合わせて投与することを含む第１の処！を哺乳動物に施し、次いで神経伝達を増加する量の伝達物質促進剤、例えば細胞中の伝達物質特異的酵素のレベルを増加する因子、例えばＮＧＦまたは伝達物質促進剤の機能的誘導体（例えば断片、類似体、または断片の類似体）を投与することを含む第２の処置を該哺乳動物に施すことによって、哺乳動物におけるコリン作動性神経細胞、好ましくは非分裂性神経細胞のコリン作動性活性（例えば、アセチルコリン合成容量）を増加する方法を特徴とする。

本発明の他の方法は、（１）ＮＧＦまたはその機能的誘導体の投与を伴うが、あるいは伴わずに、有効量のＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ｒの機能的誘導体、ＩＣＦ−■ またはＩＧＦ−Ｉｆの機能的誘導体のうちの少なくとも一つを哺乳動物に投与するか、あるいは（２）細胞生存を促進する量の第１グループの物質、例えばＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉの機能的誘導体、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−Ｉ［の機能的誘導体のうちの少なくとも一つを投与することを含む第１の処置を哺乳動物に施し、次いで神経伝達を増加する量の伝達物質促進剤またはその機能的誘導体、例えばＮＧＦまたはその機能的誘導体を投与することを含む第２の処置を該哺乳動物に施すことによって、哺乳動物の頭またはを髄の損傷、あるいは哺乳動物の病気状態、例えば卒中発作、癲瘤、老化に関連する神経の欠損、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病またはパーキンソン病を治療することを特徴とする。

本発明はまた、まず最初にリガンドを受容体の調製物に結合させ、次いで修飾工程（好ましくは、カチオン化、グリコジル化またはポリペプチドの親油性増加）を行い、そして修飾リガンドを受容体から放出することによって、細胞表面上に位置する受容体と結合することのてきるリガンド、好ましくは神経活性なポリペプチドを修飾する方法を特徴とする。

本発明の方法で投与されるポリペプチドは、脳血液関門を通ってポリペプチドが輸送されやすくなるように、例えば親油性を増加、グリコジル化を変更、あるいは実効正電荷を増加するようなポリペプチドの修飾によって化学的に修飾されつる。

本発明の実施態様は一つ以上の神経活性なポリペプチドの投与を含む。好ましい実施態様では、ポリペプチド投与における所望の組み合わせ効果は相加的であり、より好ましい実施態様では、該効果は相乗的である。

ＩＧＦ−ＩＩの断片を投与する他の好ましい実施態様では、ＩＧＦ−Ｉ［（５４ −６７）が好ましいＩＧＦ−ｎ断片である。

本発明はまた、精製ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉの精製機能的誘導体、精製ＩＧＦ− ｎ及びＩＧＦ−ＩＩの精製機能的誘導体からなる群から選択される第１成分と、精製ＮＧＦ及びＮＧＦの精製機能的誘導体からなる群から選択される第２成分とを含む組成物を特徴とする。ここで精製とは、物質が９５％またはそれ以上（重量で）純粋であること、即ち物質が天然状態で関係するタンパク質、脂質及び炭水化物を本質的に含まないことを意味する。

本発明の方法は、病気、損傷または自然の老化過程のような要因によって瀕死の危険にある哺乳動物細胞の生存率及び／コリン作動性活性を増加するために、あるいはコリン作動性活性の刺激が哺乳動物の状態に良い効果をもたらしつる場合に、ＩＧＦ−ＩＳ　ＩＧＦ−Ｉｆ、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体、それらの組み合わせ、並びにＮＧＦまたはＮＧＦの機能的誘導体をも含むそれらの組み合わせを用いる。本発明の方法に用いる機能的誘導体のいくつかは公知であり、他のものは本明細書に記載の定法を用いて見いだしうる。

本発明の方法及び組成物、例えばＩＧＦ−ＩとＮＧＦの組み合わせ投与は、今までに知られていない巧妙な方法でコリン作動性ニューロンの生存性と神経伝達物質合成容量を増加する。

本発明の方法で処理した神経細胞の生存性は、未処理の対照細胞に比べてかなり大きな細胞生存性の維持を示す。成熟ＣＮＳの神経細胞のほとんどは一般に細胞分裂することができないと信じられているので、このような細胞の生存性を増加をするための薬剤能力は、本明細書に記載するオルニチンデカルボキシラーゼアッセイのような細胞栄養応答を示すアッセイによって測定することができる。

または生存細胞として着色するか、あるいは生存ニューロンの他の特徴を指標として生存細胞数を直接数えるとか、または適当なラベルした前駆体のｍＲＮＡへの取り込みをアッセイするなどの再現可能な相対的生存細胞数を示すアッセイならば何でも用いることができる。添加した成長因子、機能的誘導体、または成長因子および／または機能的誘導体がコリン作動性ニューロンの機能に及ぼす効果を特に知りたい場合には、その機能を測定する他のアッセイ、例えばここに記載するコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼアッセイを用いることができる。

筋萎縮性側索硬化症におけるを髄コリン作動性ニューロンのような、特定の退行性疾病における攻撃されやすいニューロンの特定のサブセットに対する成長因子、機能的誘導体、または成長因子および／または機能的誘導体による処理の効果を試験するためには、これらの手法のいずれでも用いることができる。ＩＧＦまたはＮＧＦ受容体に結合するポリペプチドの予備的スクリーニングをまず行い、細胞生存またはコリン作動性活性アッセイのような上記したアッセイのいずれを用いるかを決めればよいが、本明細書ではかかる目的のために考案されたＩＧＦ −Ｉ−受容体置換アッセイを記載する。ＮＧＦまたはその機能的誘導体の受容体に対する結合能力を測定する方法は当業者に公知である。上記アッセイのうちの一つまたはそれ以上を用いて細胞生存またはコリン作動性活性を増加すると考えられるこれらポリペプチドは、さらに適当なｉｎ　ｖｉｖｏ投与を用いて、動物の神経系または他の組織における老化、損傷または病気のもたらす退行性効果を妨げる能力を試験することができる。

いかなるポリペプチドもこれを治療剤として用いる場合には、標的組織の内外で各種のペプチダーゼの作用にさらされるので、投与後のポリペプチドの安定性の問題を生じる。このような安定性の欠如が問題となる場合には、本明細書に記載の安定性を増加する修飾をポリペプチドに施すことができる。本明細書に記載するように、脳血液関門を通過してポリペプチドが輸送され易くするためにポリペプチドに修飾することもできる。

本発明の方法は、神経細胞の病気または老化、あるいは損傷に由来する障害を含む、細胞、とりわけ神経細胞の死を特徴とするヒトまたは他の哺乳動物の障害を治療するのに有用である。ＩＣＦ及び／またはその機能的誘導体、及びＩＧＦ及び／またはその機能的誘導体とＮＧＦまたはその機能的誘導体との組み合わせを含む神経栄養性ペプチドは、アルツハイマー病、卒中発作、癲痴、筋萎縮性側索硬化症、及びパーキンソン病などの神経退行性疾病や、他の方法による治療では特に手に負えないことが明らかな状態である一般的老化関連性神経欠損の治療に有用である。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の好ましい実施態様及び請求の範囲から明らかであろう。

［図面の簡単な説明コ図１はラットを髄培養物における、コリン作動性ニューロンの生存に対するＩＧＦ−Ｉの効果を示すグラフである。

図２はラットを髄培養物における、コリン作動性ニューロンの生存に対する■ＧＦ−ＩＩ及びＩ　ＧＦ−ｎ［の効果を示すグラフである。

図３はラットを髄培養物における、コリン作動性ニューロンの生存に対する■ＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−Ｈのある種の合成ペプチド断片の効果を示すグラフである。

図４は未成熟ラットの脳に注入された各種投与量のＩＧＦ−Ｉが脳オルニチンデカルボキシラーゼ活性に及ぼす効果を示すグラフである。

図５は未成熟ラットの脳に注入されたＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦの合成ペプチド断片が脇オルニチンデカルボキシラーゼ活性に及ぼす効果を示すグラフである。

図６は成熟ラットの脳の各部分に注入されたＩＧＦ−Ｉが脳オルニチンデカルボキシラーゼ活性に及ぼす効果を示すグラフである。

図７はロイシン取り込みによって評価した、ＩＧＦ−ｎ誘導体及びＩ　ＧＦ−Ｉの皮質細胞の生存性に及ぼす効果を示すグラフである。

図８は形態的特徴によって評価した、ＩＧＦ−ＩＩｎ誘導体びＩＧＦ−Ｉの皮質ニューロンの生存性に及ぼす効果を示すグラフである。

図９は（飽和濃度の）ＮＧＦ及びＩＧＦ−Ｉが培養ラット中隔細胞におけるＣｈＡＴ活性に及ぼす付加的効果を示すグラフである。

図１０はＮＧＦ及び（飽和濃度の）ＩＧＦが培養ラット中隔細胞におけるｃｈＡＴ活性に及ぼす付加的効果を示すグラフである。

図１１はＮＧＦ及びＩＧＦ−Ｉの経時添加が培養ラット中隔細胞におけるｃｈＡＴ活性に及ぼす効果を示すグラフである。

図１２はＮＧＦ及びＩＧＦ−Ｉが中隔培養におけるＡＣｈＥポジティブな細胞数に及ぼす効果を示すグラフでおる。

［発明を実施するための最良の形態コペプチド本発明はとりわけ、ニューロンの生存可能性が少なくなったことを特徴とするある種の疾病または障害の治療として、ＮＧＦまたはＮＧＦの機能的誘導体の投与を伴うか、あるいは伴わずに用いる、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ及びその機能的誘導体のような神経活性ポリペプチドの修飾及びその使用を目的とする。ここで ”神経活性ポリペプチド“または”成長因子”とは、例えばＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ −■、神経成長因子（ＮＧＦ）上皮成長因子、繊維芽細胞成長因子及びインシュリンのような神経細胞に生存増強効果を示すポリペプチドと定義される。ポリペプチドの”機能的誘導体”とは、その分子の断片、類似体または断片の類似体である化合物であって、所望の生物活性、ここでは神経細胞の生存性及び／またはコリン作動性活性を増加する能力を有するものである。ポリペプチドの”断片” とは、該ポリペプチドのあらゆるポリペプチドサブセットを言う。ポリペプチドの”類似体”とは、該ポリペプチドの生物活性を有してはいるが、該ポリペプチドと何らかの構造的差異を有する分子、例えばアミノ酸配列の変化、通常はその分子の一部分ではない化学的部分を付加したものを言う。例えばアシル化、アルキル化、カチオン化またはグリコリル化反応によって導入されるこれらの部分は、分子の可溶性、吸収、輸送、生物的半減期などを改善する。この作用の代わりに、またはこれに加えて、ある種の部分は、分子の毒性を減じ、あるいは分子の好ましくない副作用を除去したり減じたりする。このような作用を有する部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ、Ｃｏ、、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８０）に記載されている。ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ及びＮＧＦの誘導体のうちのあるものは、単独でまたは組み合わせた場合に作用しないかも知れないが、以下に詳述するように当業者にはどれが作用し、どれが作用しないかを認識することができる。“伝達物質促進剤”とは、伝達レベルを増加させるポリペプチドを言う。ＮＧＦは伝達物質促進剤の一例である。”伝達”とは、例えばアセチルコリンのような神経伝達を言う。”伝達物質特異的酵素”とは、ニューロンに存在して伝達代謝に関与する酵素、例えばコリン作動性ニューロンの場合には、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）またはコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を言う。”神経細胞”とはニューロンを言う。

本発明に含まれる化合物のい（つかを表１に示すが、これはＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ −ＩＩ、及びＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの多くの機能的誘導体のアミノ酸配列（表２に定義する一文字の略号を用いて記載）を示す。これらの誘導体はＩＧＦ− ＩまたはＩＧＦ−Ｉ［受容体への結合能及び本発明の機能的誘導体の定義に用いうるか、を考慮した以下の基準に基づいて選択して研究した＝　（１）種におけるアミノ酸配列の保存：　（２）種における”保存性”アミノ酸置換の存在（即ち、似た形、電荷またはその他の顕著な特徴を有するアミノ酸）：　（３）ラジオアイオダイネーションからチロシン残基の受容体を保護すること（Ｍａｌｙ　ａｎｄ　Ｌｕｔｈｉ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６３ニア９６８−７０７２　（１９８８）；　（４）受容体との相互関係に必要とされる、ポリペプチド表面上の受容体結合ドメインの位置を示唆する親水性残基が優勢であること：及び（５）三次元モペプチドが脳血液関門を通過する能力はその親油性または実効イオン電荷が関連するので、その輸送性を増強する［Ｋａｓｔｉｎら、Ｐｈａｒｍａｃ、Ｂｉ。

７−３１３　（１９８７）；Ｒｉｅｋｋｉｎｅｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、８：２６１、−２６５　（１９８７）］ために、ペプチドに適当な修飾を施す（例えばフェニルアラニンをペンタフルオロフェニルアラニンで置換したり、カチオン化アルブミンと結合させるなど）ことが、脳血液関門外から投与した後の生物的適用性のためには重要であり、これらの修飾は本発明の範囲に含まれる。さらに、ペプチドの生物的適用性はプロテアーゼやペプチダーゼによる分解に対する感受性によって制限される［Ｌ　ｉ　ｔ　ｔ　ｌ　ｅｗｏｏｄら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、Ｉｎｔ、、１２　：　３８３−３８９　（１９８８）］ので、その代謝安定性（Ｃｏｙら、１９７６）を増すためのペプチド修飾（例えばＬ−アミノ酸をＤ −アミノ酸で置換）も治療効能のためには重要であり、これら修飾ペプチドも本発明の範囲に含まれる。

本発明の機能的誘導体はとりわけ、以下に述べる点の一つまたはそれ以上において、天然ＩＧＦまたはＮＧＦと異なるペプチドを含む：１、ペプチドの両端にあるアミノ基及びカルボキシル基の化学修飾、２、天然配列中のアミノ酸残基の一つまたはそれ以上を、生物的に矛盾のない他のアミノ酸残基で置換、３、天然配列中のアミノ酸残基の一つまたはそれ以上を、化学修飾された生物的に矛盾のない他のアミノ酸残基で置換、４、天然配列中のアミノ酸残基の一つまたはそれ以上を削除、５、配列中のアミノ酸の一つまたはそれ以上の化学修飾、置換または削除を伴うか、あるいは伴わない、天然配列中の一つまたは好ましくは数個のアミノ酸残基の繰り返し、６、環化、即ち、線状ペプチドのアミノ末端とカルボキシル末端との結合、７、ジスルフィド、ペプチド、エステルまたは他の共有結合を用いる、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＣＦ−ＩＩ、ＮＧＦ、あるいはＩＧＦ−４，ＩＧＦ−ＩＩまたはＮＧＦのいずれかの機能的誘導体と、ポリペプチド（例えばＩＧＦ−１，ＩＧＦ−ｎまたはＮＧＦの他の断片）または炭水化物のような他の分子との結合。

本発明はまた、上記したＩＧＦの機能的誘導体中の好ましいサブグループとして、以下の式を有する機能的誘導体を用いる：ＲＩ　ＡＡＩ　ＡＡ２　ＡＡ３　ＡＡ４−　、、ＡＡｎ　Ｒ２［式中、ＡＡ、、ＡＡ２．ＡＡ３．ＡＡ４．、、ＡＡ、はＩＧＦまたはＩＧＦペプチドサブセットのアミノ酸残基であるか、あるいは表２に定義するそれらの保存性置換物であり、ｎはＩＧＦ−■機能的誘導体の場合には５から７０まで、ＩＧＦ−１機能的誘導体の場合には５から６７までの任意の整数である〕。Ｒ１はアミノ基ＡＡ、に結合しており、水素、低級（Ｃ＋− ６）アルキル、低級アルキルカルボニル、低級アルケニル、低級アルキニル、フォルミル、低級（Ｃｒ−＋ｏ）アリール、アロイル、アリールオキシ−カルボニル、アラールキルオキシ−カルボニル、低級アルキルオキシカルボニル、ベンゾイル、１−または２−テノイル、ニコチノイル、ジヒドロニコチノイル、Ｎ−アルキルジヒドロニコチノイル、イソニコチノイル、及びＮ−アルキルジヒドロイソニコチノイルからなる群から選択される。ペプチドのカルボキシル末端置換基（Ｒ２）は、ＯＨ，ＮＨ２，ＯＲ１Ｅ式中、Ｒ３は低級アルキルまたは低級アリール］　、０Ｒ３０Ｈ［式中、Ｒ３は上に定義する通すコ、及びＮＨ−Ｒ３またはＮ　（ＣＨ３）Ｒ５［式中、Ｒ３は上に定義する通りコがら選択される。あるいは、カルボキシル末端アミノ酸のカルボキシル基は、−ＰＯ３Ｈ２，−Ｂ　（ＯＨ）　２＋　ＣＨ２０Ｈ，−３Ｏ３Ｈまたは５−テトラゾール基で置換されていてもよい。　本発明はまた、上記したＮＧＦの機能的誘導体中の好ましいサブグループとして、以下の式を有する機能的誘導体を用いる：Ｒ＋　ＡＡＩ　ＡＡ２−ＡＡ３　ＡＡ４．、、ＡＡ、Ｒ２［式中、ＡＡ、、ＡＡ２．ＡＡ３．ＡＡ４．、、ＡＡｆｉはＮＧＦまたはその機能的誘導体のアミノ酸残基であるか、あるいは表２に定義するそれらの保存性置換物であり、ｎはＮＧＦまたはその機能的誘導体中のアミノ酸残基数に対応する整数である］。Ｒ１はアミノ基ＡＡ１に結合しており、水素、低級（Ｃ＋−ｓ）アルキル、低級アルキルカルボニル、低級アルケニル、低級アルキニル、フォルミル、低級（Ｃｓ−＋。）アリール、アロイル、アリールオキシ−カルボニル、アラールキルオキシーカルポニル、低級アルキルオキシカルボニル、ベンゾイル、１−または２−テノイル、ニコチノイル、ジヒドロニコチノイル、Ｎ−アルキルンヒドロニコチノイル、イソニコチノイル、及びＮ−アルキルジヒドロイソニコチノイルからなる群から選択される。ペプチドのカルボキシル末端置換基（Ｒ２）は、ＯＨ，ＮＨ，、○Ｒｓ［式中、Ｒ３は低級アルキルまたは低級アリール］　、０Ｒ３０Ｈ［式中、Ｒ３は上に定義する通り］、及びＮＨ−Ｒ３またはＮ　（ＣＨ３）Ｒ５［式中、Ｒ３は上に定義する通り］がら選択される。あるいは、カルボキシル末端アミノ酸のカルボキシル基は、−ＰＯ３Ｈ２，Ｂ　（ＯＨ）２．　ＣＨ２０Ｈ，５ＯｓＨまたは５−テトラゾール基Ｔｆｆｉ換されていてもよい。

ペプチド中のアミノ末端アミノ基及び／またはリジン、セリンまたはスレオニン側鎖は、フォルミル、アセチル、プロピオニル及び類似の低級アルキルアシル基で、あるいはアリールまたは複素環アシル基（例えばベンゾイル、テノイル、ニコチノイル、イソニコチノイル、Ｎ−アルキルニコチノイル、及びそのジヒドロ及びテトラヒドロ誘導体）で任意にアシル化されていてもよい。かかる修飾は、治療剤の脳血液関門透過性を増加すると期待される［Ｃｒｅｖｅｌｉｎｇら、Ｅｘｐｅｒ　１ｅｎｔ　ｉａ、２５　：　２６−２７　（１９６９）；　Ｂｏｄｏｒら、５ｃｉｅｎｃｅ、２１４：１３７０−１３７２　（１９８１）］。

アミノ末端にプロリン、グルタミン酸またはアルパラギン酸を有するペプチド配列では、アミノ末端のアミノ酸は、Ｌ−プログルタミン酸で任意に置換してもよい。

ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉｔ及びＮＧＦの断片ポリペプチドは、天然分子よりも少ないアミノ酸残基を有する、それぞれＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ｎ及びＮＧＦ分子のサブセットである。好ましいＩＧＦｉＥ列は５−４ｏ残基であり、最も好ましいのは６−２５残基である。断片中のアミノ酸の一部は、生成するペプチドの化学的または生物的安定性を改善し、脳血液関門を通過する輸送を改善するような保存性置換または削除を行ってもよい。好ましくは３０％以上、より好ましくは２０％以上のアミノ酸残基を置換したり削除しないものとする。適当な保存性置換を表２に列挙し、併せてタンパク質に見られる通常の天然アミノ酸に対する一文字の略号を記載する。表２に使用する他の略号をここに定義する：Ｎ１ｅはノルロイシン、Ａｉｂはアミノイソブチル酸、ＡｄａＡはβ−アダマンチルアラニン、ＡｄａＧはａ−アダマンチルグリシン、ｈｏｍｏ−ＡｒｇはＬ−ホモアルギニン、Ｄ−ｈｏｍｏ−ＡｒｇはＤ−ホモアルギニン、Ａｃｐはε−アミノカプロン酸、ＣｈｇはＬ−α−シクロへキシルグリシン、そしてａｌｌｏ−ＴｈｒはＬ− アロスレオニンを意味する。さらに、Ｃｈａはβ−シクロヘキシル−アラニン、Ｍｅはメチル（ＣＨ３）　、Ｏｒｎはオルニチン、Ｉ）ＹｒＯ−Ｇｌｕはピログルタミル基、Ｍｅｔ（０）及びＤ−Ｍｅｔ　（０）はそれぞれＬ−及びＤ−メチオニンに由来するスルフオキシド、β−Ａｌａはβ−アラニン、Ａｃｍはアセトアミドメチル、Ｌ−Ｄｏｐａは３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−アラニン、そしてＢｐａは４−ベンゾイル−フェニルアラニンを意味する。

ここに使用するその他の記号及び略号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　ＪｏｉｎｔＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、”Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ　ｆｏｒ　Ａｍｊｎｏ　Ａｃ１ｄｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ　１９８３”　Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｅｍ、　、　２６０：１４−４２　（１９８５）に推奨されるものに従った。慣例に従い、ペプチド鎖に対応するアミノ酸残基を結合するときにも、これを定義するのに同じ記号を用いた。アミノ酸が異性体を有する場合、特に記載しない限り、アミノ酸のし一体を表す。慣例的表現に従い、各ペプチドのＮ−末端にあるアミン基を左に、Ｃ−末端にあるアミノ基を右に表す。

上記したアミノ酸置換以外にも、ポリペプチドの化学修飾のような、脳血液関門を通過する輸送を改善するための他の方法を用いることができる。いかなる化学修飾工程においても、化学修飾工程の間に受容体結合部位を保護し、維持するために、例えばカチオン化（例えばＰａｒｄｒｉｄｇｅら、１９８７の方法による）またはグリコジル化［Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓｌ、１８１　：　５４２−５４９　（１９７７）の方法による］によって、ポリペプチドをまず受容体に付着させる。

ペプチドの使用以下に詳述するように、本発明は細胞死、特に神経細胞死の虞れを特徴とする病気または障害の治療剤として、ＩＣＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉｆ、及びその機能的誘導体、並びにＮＧＦ及びその機能的誘導体との組み合わせにおけるＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉｆ、及びその機能的誘導体の新規使用法を提供する。本発明の各ポリペプチドまたはポリペプチドの組み合わせの生物活性は、以下に詳述する脳オルニチンデカルボキシラーゼアッセイ、を髄コリンアセチルトランスフェラーゼアッセイ、培養中隔細胞アッセイまたは培養皮質細胞アッセイによって都合よ（測定される。あるいは、ポリペプチドを以下に記載する受容体−ＩＣＦ−Ｉ置換アッセイ（これはホモジエナイズした脳組織中で、受容体と結合したラベルＩ　ＧＦ −Ｉと置換しうるポリペプチドの能力を測定する）のような、受容体−成長因子置換アッセイによってまずスクニーニングしてもよい。このアッセイは、二つの酵素アッセイで測定されたポリペプチドの生物活性と相関性を有することが示された。以下の実施例で記載するように、これらのアッセイは、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−■、Ｉ　ＧＦ−ＩＩ［及びその機能的誘導体が単独で、またはＮＧＦまたはその機能的誘導体との組み合わせにおいて、今までに知られていなかった生物活性を示す。

従って、本発明のペプチドは上記した神経細胞死の虞れを特徴とする神経学的病気または障害に悩むヒトまたは他の哺乳動物への投与に有用である。これらの神経学的病気または障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、卒中発作、及び脳またはを髄における農産性または浸透性の損傷を含むが、これに限定されるものではない。

本発明の製剤は例えば静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼、室内、頭蓋内、嚢内、を髄内、槽内、腹腔内、局所、鼻孔内、エアロゾル、乱切法などの非経口投与、経口投与、頬側投与、肛門投与または膣投与に用いうる。上記した神経学的病気の治療には、治療的有効量（例えば患者の病理状態を除去または軽減する量）で、ヒトまたは他の哺乳動物に非経口投与するように組成物を調剤することができる。　本発明の化合物は、薬学的に受容しうる非毒性賦形剤及び担体と混合して医薬組成物とすることもできる。上記したように、かかる組成物は非経口投与、特に溶液または懸濁液の形で、または経口投与、特に錠剤またはカプセルの形で、あるいは経鼻投与、特に粉末、点鼻剤またはエアロゾルの形で調製することができる。

組成物は便宜的には単位投与量形で投与され、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓに記載された、医薬当業者に公知の方法により調製される。非経口投与用製剤は通常の賦形剤として、滅菌水または食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物油、水素化ナフタレンなどを含む。特に、生物的に矛盾のないかつ生物分解可能なラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド　コポリマーまたはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン　コポリマーはペプチドの放出をコントロールする有用な賦形剤である。本ペプチドの非経口投与系に用いつるその他の可能性は、エチレン−ビニルアセテート　コポリマー粒剤、浸透ポンプ、移植可能な冷浸システム及びリポソームを含む。吸入投与用製剤は、賦系剤としてラクトースなどを含み、または例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレート及びデオキシコレートを含む水溶液であってもよく、点鼻剤として投与するための油溶液であってもよく、または経鼻的に用いるゲルでもよい。非経口投与製剤はまた、頬側投与のだめのグリココレート、肛門投与のためのメトキシサリチレートまたは膣投与のためのクエン酸を含みつる。本発明の物質は、医薬中の単独活性体として用いつるが、他の活性成分、例えば神経学的病気における神経の生存を容易にする他の成長因子あるいはペプチダーゼまたはプロテアーゼ阻害剤と組み合わせても用いうる。治療組成物中の本発明の化合物の濃度は、投与する医薬の投与量、用いる化合物の化学的特質（疎水性など）及び投与経路を含む多くの要因に依って変化する。一般的には、非経口投与には約０．１−１０ｗ／Ｖ％の化合物を含む水性生理的緩衝溶液で提供される。典型的投与量は１日当たり、体重１ｋｇにつき約１μｇ−１ｇであり、好ましい投与量は１日当たり、体重１ｋｇにつき約０．０１ｍｇ−１００ｍｇである。好ましい投与量は神経学的病気のタイプと程度、個々の患者の全体的健康状態、使用する化合物の相対的生物効能、化合物の製剤形及び投与経路などに依存する。

本発明を以下の実施例でさらに説明する。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、範囲は添付の請求の範囲のみによって決定される。

実施例　１組み換えヒトＩＧＦ−１，ＩＧＦ−ＩＩ及びＩＧＦ−Ｉ［［、並びにＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ｎの部分配列を含むい（つかの化学合成ペプチドを表１に示す供給源から得た。１２５Ｉ−ラベル［スレオニン”］　ＩＧＦ−ＩはＡｍｅ　ｒｓｈａｍ　（Ａｒ　＋ｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）から得た。ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＦの部分配列を含む他のペプチドは、Ｍｉｌｌｉｇａｎ　Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｍｏｄｅｌ　９６００　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上でＦｍｏ　ｃｋａｒｄ　Ｍｏｄｅｌｓ　１０５０及び１０９０Ｍ　ＨＰＬＣｓで精製した。Ｆｍｏｃ　アミノ酸、ＢＯＰ　（Ｃ’ａ　ｓ　ｔ　ｒｏｏ　ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ）及び樹脂はＢｉｏｓｅａｒｃｈ　（Ｓａｎ　Ｒａｐｈａｅｌ、ＣＡ　９４９０１）及びＢａｃｈｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ、（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ　１９１０４）から購入した。溶媒はＢｕｒｄｉｃｋ　ａｎｄ　Ｊａｃｋｓｏｎ　（Ｍｕｓｋｅｇｏｎ、ＭＩ　４９４４２）から購入した。その他の試薬はＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ６３１７８）から購入した。大脳皮質及び小脳を含む脳組織を成人Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌ　ｅｙクラットＨｉｌｌｔｏｐ　Ｌａｂ　Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｃ、５ｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＦＡ）から切り出し、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、０．５％　ＢＳＡ、０．０１２５％　ＮＥＭ、０．０２５％　バシトラシン及び１００ＫＩＵ／ｍ、ｌ　アブロチｎｋｍａｎｎ　Ｐｏ１ｙｔｒｏｎホモジエナイザー（Ｗｅ　ｓ　ｔ　ｂｕ　ｒｙ、　ＮＹ）中で５分間、低速でホモジエナイズした。ホモジエナイズ後、７８００ｘｇで２０分間遠心して組織を回収し、アッセイバッファー１０部に再懸濁した。組織（５０μｌ）、＋２５Ｉ−［スレオニン”］　ＩＧＦ−Ｉ　（２０部Ｍ）　１００μｌ、及びバッファーまたは各種濃度のペプチド５０μＩを９６ウエルのプレートに加えて、氷上、３時間インキュベーションした。インキュベーション後、組織を００１％ポリエチレンイミンにあらかじめ浸しておいたＷｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｃフィルターに回収しＢｒａｎｄｅ　１セルハーベスタ−（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて水冷アッセイバッファーで４回洗浄した。フィルターを除去し、固着＋２５１−［スレオニン５９］　ＩＧＦ−Ｉｔ−Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅ１５５００Ｂ　Ｇａｍｍａ　Ｃｏｕｎｔｅｒで測定した。

表３は天然ＩＧＦとＩＧＦ断片を用いた＋２！Ｓ［［スレオニン”］　ＩＧＦ− Ｉ置換アッセイの結果である。この結果は、ＩＧＦ”−ｒとＩＧＦ−ＩＩＩは１２５ｉ　［スレオニン５Ｑコ　ＩＧＦ−Ｉの有力な置換体であるが、ＩＧＦ−ＩＩは本質的に不活性であり、これはこのアッセイがＩＧＦ−Ｉ様分子の同定に選択的であることを示している。このアッセイでは、ＩＧＦ−ｒ　（２４−４１）は単独で、またはＩＧＦ−ｎ　（５４−６７）との組み合わせで１２５［［スレオニン”］　ＩＧＦ−Ｉ置換に活性であった。ＩＧＦ−ｎ　（５４−６７）単独、及び表３に記載するいくつかの他の断片は１２５（［スレオニン５９］　ＩＧＦ−”Ｉの有意に効果的な置換体ではなかった。

実施例　２成人Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから脳をそのまま摘出し、粉末ドライアイス上で凍結し、（小脳及び脳幹のレベルで）２０μｍのセクションに切断して、これをセラチンでコートした顕微鏡スライドガラスに解凍してのせた［Ｈｅｒｋｅｎｈａｍ　ａｎｄ　Ｐｅｒｔ、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、、２：１１２９” −１１４９（１９８２）］。Ｂｏｈａｎｎｏｎら（１９８６）の方法の変法を用いて、組織セクションを０．０１部Ｍ　”５Ｉ−［スレオニン５９コ　ＩＧＦ− Ｉだけか、あるいはラベルしていないＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩまたはその合成ペプチド断片との組み合わせを含むＨＥＰＥＳアッセイバッファー（実施例１参照）２５０μｍで覆った。セクションを４℃、２４時間インキュベーションし、氷冷ＨＥＰＥＳアッセイバッファーを１分ずつ３回（各２００ｍ１）取り替えてリンスした。次いで組織セクションをスライドガラスからフィルターベーパーでふき取り、組織結合放射能をＢｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　５５００Ｂ　ＧａｍｍａＣｏｕｎｔｅｒで測定した。

このアッセイでは、実施例１で記載したアッセイとは対照的に　１２５１　［スレオニン５９］　ＩＧＦ−Ｉ結合は、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの両方で強く置換されたが、これはこのアッセイをいずれの分子の強力な活性誘導体（表４）を検出するためにも用い得ることを示す。＋２５１　［スレオニン”］　ＩＧＦ− ■ｍ合はＩＧＦ−ＩＩ　（３３−４０）で置換されたが、ＩＧＦ−Ｉ［（５４− ６７）では置換されなかった。

実施例　３ＩＧＦ−Ｉ、ＩＣＦ−ｎまたはその合成ペプチド誘導体の活性を、１４日目の胚子機ラットを髄ニューロンの解離培養でアッセイした。トリプシン解離したを髄からを髄ニューロンを得て、プレートし、ペプチドと共にインキュベーションして、次いで（４８時間後）ＭｃＭａｎａｍａｎら、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、、１２性をアッセイした。このアッセイにおいて、ＩＧＦ−［はコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を本質的に用量依存的に増加させ（図１）、これはＩＧＦ−Ｉがを髄コリン作動性ニューロンのコリン作動性活性を顕著に増加することを示唆している。また、ＩＧＦ−Ｉｆ及びｒＧＦ−１［［もを髄アッセイで活性であることがわかった（図２）。さらに、ＩＧＦ−Ｉ　（２４−４１）及びＩＧＦ−ＩＦ　（３３−４０）もコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を用量依存的に増加することが観察され、各ペプチドが活性なＩＧＦ機能的誘導体であることを示唆している。

（図３）を、脳オルニチンデカルボキシラーゼの誘導である。ＣＮＳ神経活性のための生化学マーカーを用いて試験した。オルニチンデカルボキシラーゼの誘導（即ち活性増加）は、多（の栄養因子の作用を知るための一般的なマーカーであることが報告されている［Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｄｅｖ、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、、１：４０３−４１３　（１９８１）；Ｋａｎｊｅら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、、３８１：２４−２８　（１９８６）：Ｒｕ５ｓｅｌｌら、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、、１９：１２９７−１３０６　（１９７６）；ＭａｃＤｏｎｎｅｌ　１ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４　：４６８１−４６８４　（１９７７）：Ｒｉｎｅｈａｒｔら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ］、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　旦２　：　４３６５−４３６８　（１９８５）］。

４日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌ　ｅｙクラットＩＧＦ−ＩＳ　ＩＧＦ−ｎまたはその合成ペプチド誘導体（１，２５−２，５μｇ投与、各処置群にラット６匹使用）を含むＯ，１Ｍリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）５μｍを脳内（側脳室領域）注入した。６時間後に脳を摘出し、Ｉ、ｅｗｉｓ’ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５：１０２１−１０２３　（１９７８）に記載の方法に本質的に従って、オルニチンデカルボキシラーゼをアッセイした。

ＩＧＦ−Ｉ投与は脳オルニチンデカルボキシラーゼ活性を用量依存的に増加する（図４）。さらに、ＩＣ；Ｆ−１（２４−４１）及びＩＧＦ−ＩＩ　（５４−６７）はいずれも脳オルニチンデカルボキンラーゼ活性を増加した１図５；これらのペプチドは図５ではそれぞれＩＧＦ−１（２−４）及びＩＧＦ　−ＩＩ　（５ −６）と表示コ　。

実施例　５ＩＧＦ−Ｉの脳オルニチンデカルボキシラーセ誘導が発生途中の動物に限定されるのかどうかを見るために、ＩＧＦ−Ｉを成人５ｐｒａ、ｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの側脳室に室内注入した。６時間後に脳を摘出し、いくつかの領域（大脳皮質、内側隔壁及び海鳥）に分け、実施例４の方法でオルニチンデカルボキシラーゼ活性をアッセイした。図６に示すように、ＩＧＦ−Ｉはアッセイした全ての脳領域でオルニチンデカルボキシラーゼ活性を刺激した。この結果はＩＧＦ関連分子を脳の広範な領域で使用しうることを示唆している。

実施例　６ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの合成誘導体［ＩＧＦ−ＩＩ　（５４−６７）コの、［３）（］−ロイシン取り込み能及び軸索軸受細胞（ｎｅｕｒｉｔｅ　ｂｅａｒｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ）の生存性増強能を培養ラット皮質細胞を用いて調べた（ＴＧＦ−■における数字”５４−６７”は天然ＩＧＦ−Ｉｆのアミノ酸残基５４ −６７を有する断片であることを示す）。図７に示すように、ＩＧＦ−ｎ　（５４−６７）は、ＩＧＦ−Ｉと同様に低密度２４時間混合皮質培養において［３Ｈ］−ロイシンの取り込みを増加した。ＩＧＦ−ＩＩ　（５４−６７）はまた、図８に示すように、（軸索軸受細胞の存在下で測定して）皮質ニューロンの生存性を増加する点において、ＩＧＦ−Ｉ様の生存促進活性を示した。

当業者に公知の標準的手法を用いて、１８−１９日目の胚子様ラットから得た解離皮質細胞で測定を行った。ポリ−１−オルニチン−ラミニンでコートしたプラスティック組織培養ウェル上で、血清を含まないＮ２培地［Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６：５１４−５１７　（１９７８）］中に１．５ｘｌＯ’／ｃｍ２で細胞を植えた。取り込みアッセイのために、［３Ｈ］−ロイシンをプレート時に加えた。プレート後２４時間培養を続け、［３Ｈ］−ロイシンの取り込みまたは顕微鏡観察による軸索細胞数を測定した。

実施例　７ＣｈＡＴ活性に対するＩＧＦ−Ｉ及びＮＧＦの同時投与効果を培養中隔ニューロンでアッセイした。ＣｈＡＴは神経伝達物質、アセチルコリンの合成における初期酵素であり、コリン作動性ニューロンの特異的生化学マーカーである。この酵素のアッセイは、コリン作動性ニューロンの生存性及び／またはこの酵素の制御に対するＩＧＦ（及び他の因子）の及ぼす効果を知る指標となりうる。図９に示すように、飽和または準最高濃度のＩＧＦ−Ｉと組み合わせた飽和濃度のＮＧＦで、ＣｈＡＴ活性に付加的増加が見られた。図９では、口はＩＧＦ−Ｉを表し、 ◇はＩＧＦ−１＋２ｎＭ　ＮＧＦを表し、Ｏは２ｎＭ　ＮＧＦを表し、４０３ＤＰＭにおける水平線は非誘導細胞を示す。飽和濃度のＩＧＦ−Ｉを飽和または準最高濃度のＮＧＦと組み合わせた時も、図１０に示すように、同様の付加的効果が見られた。図１０では、口はＮＧＦを表し、◇はＮＧＦ＋２５ｎＭ　ＩＧＦ− Ｉを表し、Ｏは２５ｎＭ　ｊＧＦ−Ｉを表し、５５４ＤＰＭにおける水平線は非誘導細胞を示す。対照非誘導細胞に対するＣｈＡＴ活性の増加パーセントを表５にまとめた。培養ラット中隔細胞試験を基本的にはＨａｒｔｉｋｋａ　ａｎｄ。

１７日目の胚子様ラットの中隔領域の解離細胞培養を、組織の酵素（Ｄ　ｉ　ｓ　ｐａｓｅ、ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）解離を用いて当業者に公知の標準手法により調製し、ポリ−１−オルニチン−ラミニンでコートしたプラスティック組織培養ウェル上に６ｘｌＯ５／Ｃｍ”で細胞を植え（プレートする）、血清を含まないＮ２培地［Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎら、１９７８］中にで５日間栄養を加えずに培養した。対照（非誘導）培養には何も成長因子を加えず、誘導培養には、プレート時に図９及び１０に示す濃度のＩＧＦ−Ｉ及びＮＧＦ、Ｂｉｏｌ、１２５：３１１−３２０　（１９８８）　に記載の方法テアッセイシタ：　２９６７−２９８５　（１９８５）の方法でＡＣｈＥ染色を行った。

酵素アセチルコリンエステラーゼ（Ａ　Ｃｈ　Ｅ）に対するポジティブな細胞化学染色は、ラット中隔細胞培養におけるコリンアセチルトランスフェラーゼにポンチイブなニューロンのための信頼できるマーカーであることが示された。

実施例　８ＮＧＦ及びＩＧＦ−１を培地に加えた群では、図１１に示すように、培養ラット中隔細胞におけるＣ　ｈ　Ａ　Ｔ活性の増加に有意な効果を示す。図１１では１．へは２ｎＭ　ＩＧＦ、Ｂは２５ｎＭ　ＩＧＦ、Ｃはいずれもアッセイ５日前に加えたＩＧＦ−１十ＮＧＦ、Ｄは試験開始時に加えたＩＧＦ−Ｉ十試験３日日に加えたＮＧＦで試験５日目にアッセイしたものを表す。別々に加えた時、ＮＧＦまたはＩＧＦ−Ｉは５日間培養においてＣｈＡＴ活性を５０−６０％増加した。

ＮＧＦとＩＧＦ−Ｉとが共に全５日間存在した場合、ＮＧＦとＩＧＦ−１とのＣｈＡＴ活性に及ぼす効果は、図９．１０及び１１に示すように双加的（１００％増加）である。ＩＣＦ−Ｉが試験開始時から存在し、ＮＧＦを３日目に加えた場合は、５日目におけるＣｈＡＴ活性は図１１に示すように、非誘導培養に比べて３００％増加した。かくして、ＩＧＦ−Ｉ及びＮＧＦは今までに知られていなかった巧妙な方法でコリン作動性ニューロンの生存性と神経伝達物質合成容量とを増加することが示された。

培養ラット中隔細胞試験は上記した方法で行った。

実施例　９図１２に示すように、特定の培養条件（１０％ウシ血清を含む培地の存在下に４ｘｌＯ’細胞／ｃｍ２）下で、ＩＧＦ−１は対照群、即ち成長因子を含まない培養に比べてＡＣｈＥポジティブな細胞数を３−４倍増加した。図１２では、Ａは非誘導細胞、Ｂは２ｎＭ　ＮＧＦで処理した細胞、Ｃは１１００ｎ　ＩＧＦ−Ｉで処理した細胞、ＤはＩＧＦ−Ｉ＋ＮＧＦで処理した細胞を表す。（ＤＰＭは１分当たりの崩壊）同じ条件下のＮＧＦはＡＣｈＥポジティブな細胞数に影響しなかった。この結果は、ＩＧＦ−Ｉはコリン作動性細胞の生存に大きな効果を有すロンのＣｈＡＴ活性を制御（増加）することを示唆している。

実施例　１０カチオン化とは、ポリペプチドの実効正電荷を増加するために、ポリペプチド中の酸性アミノ酸残基（即ちアスパラギン酸及びグルタミン酸残基）の遊離のカルボキシル基を修飾する工程をいう。カチオン化工程は、アルブミンやホースラディッシュパーオキシダーゼのような大きな分子のマウス線維芽細胞への細胞吸収性を増加するために用いられて来た［Ｓ　ｈ　ｅ　ｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａ）は、脳血液関門を通過する輸送を測定するモデル系としてよく用いられるウシ脳の小室（ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｓ）を用いて、カチオン化アルブミンは天然アルブミンに比べてウシ脳小室へ吸収されやすいことを示した。

遊離のカルボキシル基のグローバル修飾には、ポリペプチド（例えばＮＧＦ。

ＩＧＦ−１またはその機能的誘導体）を過剰のへキサメチレンジアミン（ＨＭＤ）（１５，５ｇ／ｇ全タンパク質）と室温で３０分間反応させ、次いで１−エチル−３−［−３−ジメチル−アミノプロリル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＡＣ）（１，０ｇ／ｇ全タンパク質）とＨＭＤの共有カップリングを室温で３時間行った。未反応物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３ＭＰＳ−１分離機（Ａｍｉｃｏｎ、Ｄａｎｖｅｒ’ｓ、ＭＡ）またはイオン交換クロマトグラフィーで除去する。カチオン化の程度を測定するため、精製したポリペプチドを等電点電気泳動で分析する。

もしも細胞表面の受容体に結合するリガンドであるポリペプチドにグローバル修飾を行って、修飾工程が生物活性のない分子を生成する場合には、上記のカチオン化工程を繰り返す。ただし、ポリペプチド上の受容体結合部位を保護するために、カチオン化を行う前に適当な受容体にポリペプチドをあらかじめ結合しておく。保護工程は以下のようにして行う：興味のあるポリペプチド、例えばＩＧＦ −Ｉのための受容体を含む組織、例えば脳を実施例１に記載の方法で調製する。

受容体を結合させるため、ポリペプチドリガンドと４℃で２時間インキュベーションした後、反応混合物を室温に戻し、上記の方法でＨＮＤとＥＤＡＣを用いてカチオン化工程を行う。次いで反応混合物を５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ５Ｂ遠心機の５Ｓ−３４ｏ−夕−を用いて４℃、３０秒間、１６．００Ｏｒｐｍで遠心する。

上澄みを捨て、沈殿物をラン血清アルブミンを含むＰＢＳ　（１ｍｇ／ｍｌ）で３回洗浄する。沈殿物を１００ｍＭ酢酸に再懸濁し、受容体からカチオン化したポリペプチドを放出させるために４℃で１０分間インキュベーションする。再び１６．０００ｒｐｍで遠心ルだ後、カチオン化した放出ポリペプチドを含む上澄みをＮａＯＨでｐＨを中性とする。これを等電点電気泳動、実施例１に記載した受容体結合アッセイ、または生物活性をアッセイする他の適当な方法により分析する。

実施例　１１グローバル修飾法の別法は、実施例１０に記載した受容体保護を伴うか、あるいは伴わずに、ポリペプチド（例えばＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ｎまたはいずれかの機能的誘導体）中の少なくとも１個の遊離カルボキシル基とポリリシンをカップリングさせることである。工程は５ｈｅｎら、１９７８の方法に従う。例えば、ポリリシン、ＩＣＦ−ｒ及びカルボジイミドを、水またはバッファー中に１＝１：１の割合で室温で３時間加える。修飾タンパク質を分離し、実施例１０に記載した方法で分析する。

実施例　１２脳血液関門輸送を増強するためのタンパク質カルボキシル基を修飾する第３の方法は、ジアゾメタンまたはＮ、　Ｎ−ジメチルホルムアミドＲアセタール（ＤＭＦアセタール）（ここでＲはジメチル、ジエチル、ジブチル、ジベンジルなど）とエステルを形成することである。この型の修飾は負に荷電したカルボン酸基から速やかにエステルを形成するので、全体の正電荷を増加する。この修飾のもう実施例１０に記載した受容体保護を伴うか、あるいは伴わずに行うこの修飾の工程は、ジアゾメタンまたはＤＭＦアセタールを１＝１の割合で室温下、３０分間溶液中で反応させ、次いで実施例１０に記載した精製と分析を行う。

実施例　１３実施例１０に記載した受容体保護を伴うか、あるいは伴わずに行う、カチオン化の第４の方法は、ポリリシンカチオン化と開裂可能なエステル生成の利点を合わせて脳血液関門輸送を増強し、同時に輸送後の成長因子の生成も行うものである。ベンジルオキシアセチルクロリドと反応させ、次いで水素化と弱いエステルポリリシンと反応しうるＤＭＦアセタール誘導体を、エステル結合を用いるポリリシンと遊離カルボキシル基との結合に使用することができる。

実施例　１４ポリペプチド修飾のさらに他のタイプはグリコジル化である。還元的アミノ化、例えばグルコースとソジウムシアノボロヒドリド（ＮａＣＮＢＨｓ）とを用いてグルコースまたは同様の分子を導入する。タンパク質のグリコジル化はタンパク質の細胞吸収を増強し、脳血液関門輸送を改善するのに有用であることが認められている［Ｓｍ１ｔｈら、Ｐｈａｒｍ、Ｒｅｓ、印刷中］。実施例１０に記載した受容体保護を伴うか、あるいは伴わずに行うグリコジル化の工程は、Ｓｃｈｗａ　ｒ　ｔ　ｚら、１９７７に記載の方法に基づき、ＩＣＦ−１１ＩＧＦ−Ｉｒまたはそのいずれかの機能的誘導体のようなポリペプチドを、グルコース及びＮａＣＮＢＨ，と１　：　３００　：１６００のモル比で２００ｍＭリン酸緩衝液中、ｐＨ７，３７℃で少なくとも２４時間反応させる。実施例１０に記載の方法、またはレクチンアフィニティークロマトグラフィーで未反応物質を除去する。

グリコジル化アルブミンを用いる以前の研究において、修飾アルブミンは天然アルブミンに比べてはるかに高率にラット副畢丸小室（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ　ｍ１ｃｒｏｖｅｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、７８　：　２３９３−２３９７　（１９８１）］。

新鮮なラン脳の脳天白質から小室内皮細胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ）を単離した。脳は近くの屠殺場から得て抗生物質を含む水冷最少必須培地（ＭＥＭ）に入れて実験室に運んだ。滅菌条件下に表面の血管及び髄膜を除去する。吸引によって皮質灰白質を除去し、１ｍｍ以下の小片に切断する。次いで切断した灰白質を１５％ディスバーゼ（ＢＭＢ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と共に震盪水浴中、３７℃で３時間インキュベーションする。３時間の消化の後、混合物を遠心（１０００ｘｇで１０分）で濃縮し、１３％デキストランに再懸濁して５８００ｘｇで１０分遠心する。上澄みの脂肪、細胞カス、ミニリンを捨てて、粗小室沈殿物を１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ／ディスパー上に再懸濁し、震盪水浴中、３７℃で５時間インキュベーションする。５時間の消化の後、小室浮遊物をあらかじめ調製しておいた５０％Ｐｅｒｃｏｉｌグラジェントにかけ、１１００Ｏｘで１０分遠心する。精製内皮細胞を含むバンド（グラジェントの上から２番目のバンド）を取り、培地（５０％ＭＥＭ１５０％Ｆ−２栄養ミックス）で２回洗浄する。後の使用のために、細胞を２０％ＤＭＳＯ及び１０％ウマ血清を含む培地中で凍結（−８０℃）する。

分離後、約５ｘｌＯ’細胞／Ｃｍ２を培養皿、またはラットコラーゲン及びフィブロネクチンでコートした５　１２ｏｍの孔サイズのポリカーボネイトフィルターにプレートする。細胞植え付は後１０−１２日で顕微鏡で細胞単層の集密度を調べる。

これらの細胞の形態学的、組織化学的及び生化学的特質は、これらの細胞が脳血液関門の多くの特徴を備えていることを示した。この特徴とは、強い分子間結合、膜穿孔の欠如、低レベルの細胞吸水、及びガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ、アルカリンフォスファターゼ、ファクター■抗原活性の存在を含む。

この培養細胞は、極性結合または輸送のためのモデルを必要とする多くの実験に用い得る。細胞を多ウェルプレートにプレートすることにより、大小いずれの分子の受容体及び非受容体結合も実施することができる。経上皮細胞フラックス測定を実施するには、細胞を多孔性ポリカーボネイト膜フイルタ−（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）上で成長させる。フィルターが分子フラックスの速度限定障害になることを避けるために、大きな孔サイズのフィルター（５−１２μｍ）を用いる。この大きな孔サイズのフィルターを用いてもフィルター下で細胞は成長せず、細胞単層を肉眼観察できる。

細胞が集密になったら、細胞を並行拡散細胞装置（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｃｅｌｌ　ａｐｐａｒａｔｕｓ：Ｃｒｏｗｎ　Ｇｌａｓｓ、Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）にプレートする。フラックス測定を行うには、拡散細胞の供与チェンバーを試験物質でパルスし、パルス後経時的に少量を受け取りチェンバーから抜き取って分析する。放射性物質または蛍光ラベル物質を用いて分子フラックスの信頼できる定量化を行うことができる。ショ糖またはインシュリンのような非輸送性の試験物質を加えることにより、単層完全性も同時に測定することができる。統計的に有意なものとするには、少なくとも４つの試験群を測定する。

表　２保存性アミノ酸置換アミノ酸　記号　置　操体アルギニン　ＲＤ−Ａｒｇ、　ＬＴＬ　Ｄ−Ｃ５ｉ、　ｈｏｍａ−ｋｔ＠、　［１−ｈｏａｕ＋−＾ｒｇ、　Ｍｅｔ。

削除アスパラギン酸　Ｄ　Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−＾ｓｎ、　Ａｓｎ、　Ｇｌｕ、　［！− Ｇｌｎ、　Ｇｌｎ、　Ｄ−Ｇｌｎまたは削除システィン　ＣｒＪ−Ｃ７ｉ、　Ｓ−Ｍｅ−Ｃｙｓ、　Ｍｅｔ、　［１−Ｍｅｔ、　Ｔａｕ、　Ｄ−Ｔｈｒ、または削除グルタミン酸　Ｅ　Ｄ−Ｇｌｏ、Ｄ−Ａｓｐ、　＾ｓｐ、　Ａｓｎ、　Ｄ−Ａｓｎ、　Ｇｌｎ、　Ｄ−Ｇｌｎ、または削除Ｄ−ｉＪｅ　Ｉ、または削除ロイシンＬ　Ｄ−Ｌｅｕ、　Ｖ葛１．　Ｄ−Ｖｔ１．　＾ｄｘ＾、　ＡｄｘＧ、ＬｅＩＩ、Ｄ−ＬｅＩｌ、　Ｍｅｌ。

Ｄ−Ｍ！ｔ　または削除リシン　Ｋ　Ｄ−Ｃ７ｉ、　Ａｒｇ、　Ｄ−Ａｒｇ、　ｈｏｍｏ−Ａｒｇ、　Ｄ −ｈｏ＠ｏ−＾＋ｇ、　＆ｂｔ。

Ｄ−Ｍｅｔ、ｌｌｅ、Ｄ−ｌｌｅ、Ｏｔｎ、Ｄ−Ｏｒｎまたは削除メチオニン　Ｍ　Ｄ−Ｍｅｔ、　Ｓ−Ｍｅ−Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｄ−１１ｅ、　Ｌｅａ、　Ｄ− Ｌｅａ、　ｖ！ｌ。

Ｄ−Ｖａ　ｌまたは削除フェニル　Ｆ　Ｄ−Ｐｈｅ、　Ｔ７ｒ、　Ｄ−Ｔｈｒ、　Ｌ−Ｄｏｐｔ　旧ｓ、　Ｄ−Ｈｉｓ、　Ｔｒｐ。

７−ｙニン［）−Ｔｒｐ、　Ｔｉｎ５−３．４　ｏｒ　５−ｐｈｅｎ７１ｐｒｏｌｉｎｅ、Ａｄ！−＾。

Ａ＋ｌｘＧ、ｅｉｓ−３，４ｏｒ　５−ｐｈｅｎ２１ｐ＋ｏｌｉｎｅ、　Ｂ１１！、　Ｄ−Ｂｐａまたは削除プロリン　Ｐ　トＰｒｏ、Ｌ−ト１ｂｉ＊ｔｏ１ｉｄｉｎｅ−４−ｃｕｂｏｘｌｌｉｃ　ｘｃｉｄ、　ｆｌ−ｏｒＬ−１−ｏｎ−ｒｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃｕｂｏｔ７１ｉｃ　ａｃｉｄ　（Ｋｓａｅｒ。

Ｕ、　Ｓ、　Ｐｘｔｅｎｌ　４．ＳＬｌ、３９０１　または削除セリン　Ｓ　Ｄ −３ｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ｄ−Ｔｈｔ、１ｌｌｏ−Ｔｈｔ、　Ｍｅｎ、Ｄ４ｅｌ、　Ｍｅｔ（０１゜Ｄ−１１ｅｆ　（（１）または削除スレオニンＴ　Ｄ−Ｔｈｒ、　Ｓｅａ、　Ｄ−５ｅｒ、　ｇｌｌｏ−Ｔｈｔ、　Ｍｅｔ、　Ｄ−Ｍｅｔ、　Ｍｅｔ（０）。

Ｄ−Ｍｅｌ（０）、　Ｖｓｌ、　Ｄ−ＶｉｌｔタハＦｆｌｌ除チＯシンＹ　Ｄ− Ｔｙｔ、　Ｐｈｅ、　Ｄ−Ｐｂｅ、　Ｌ−［１ｏｐｔ、旧ｓ、　Ｄ−旧Ｓまたは削除バリンＶ　Ｄ−Ｖｓｌ、Ｌｅｌ、　Ｄ−Ｌｅｅ、ｌｌｅ、　Ｄ−１１ｅ、　Ｍｅｔ、　Ｄ−Ｍｅｔ、＾ｄｇ＾。

Ａ＋ｌｉＧまたは削除ＩＧＦ−１受容体競合アッセイまとめペプチ　ド（濃度）　最高結合パーセント（平均）ＩＧＦ−１（１０ｐＭ）　１００　（１，１）ＩＧＦ−Ｉ　（４０ｎＭ）　９．６　（０’、７）ＩＧＦ−ＩＩ　（４０ｎＭ）　９２．１　（０，７）ＴＧＦ−ｍ　（４０ｎＭ）　１７゜６（２，６）ＩＧＦ−１（２４−４１）（１００μＭ）４４（７）ＩＧＦ−１（２４１１）（５０μＭ）　９９　（６）ＩＧＦ−Ｉ　（２４−４１）（５０μＭ）＋夏ＧＦ−Ｉｆ　（５４−６７）　（５０μＭ）　４９　（１１）ＩＧＦ−１１（５４−６７）（１００μＭ）９４（６）ＩＧＦ−１（６２−７０）（１００μ Ｍ）　８３　（２０）ＩＧＦ−１（３０−４１）（１００μＭ）　９４　（１，４）ＩＧＦ−１１（６２−６７）（１００μＭ）　８３　（２１）ＩＧＦ−ＩＩ　（３３−４０）（、ｉｍＭ）　９２　（Ｌ　８）表　４ペプチ　ド　最高結合パーセントＩＧＦ−１（４ｐＭ）　９１１ＧＦ−１（４００ｐＭ）　３０１ＧＦ−ＩＩ　（２００ｎＭ）　５０ＩＧＦ−ＩＩ　（４００ｎＭ）　２３１ＧＦ−ｍ　（３３−４０）（１ｍＭ）　７６１ＧＦ−ＩＩ　（３３−４０）（，１０ｍＭ）　８２ＩＧＦ−Ｕ　（５４−６７）（，２５ｍＭ）　１６７１ＧＦ −Ｕ　（５４−６７）（，０２５ｍＭ）　１３２表　５培養ラット中隔細胞におけるＣＨＡＴ活性に対するＮＧＦおよびＩＧＦ−Ｉの付加的効果２ｎＭ　ＮＧＦ＋ｒＧＦＩ　１．３　５８ＮＧＦ　０．　０２　５６２５ｎＭ　ＩＧＦＩ＋ＮＧＦ　０．０２　７５０、　２　１００２・　Ｏ９４浄書（内容に変更なし）第１図第２図Ｏｔｏｏ　２００　３００ＩＧＦ（ｎＭ）第３図１ＧＦペプチド（μＭ）ＩＧＦ−１（μ９）第５図処置皮質　対角帯　海鳥脳領域第７図第９図第１０図第１ｆ図第１２図手続補正書（方式）％式％２、発明の名称インシュリン様成長因子及び類似体を用いる障害治療方法３、補正をする者事件との関係　特許出願人住所名称　セファロンｅインコーポレーテッド４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正命令の日付　平成　４年　８月１８日（発送日）６、補正の対象（１）出願人の代表書名を記載した国内書面（２）委任状及び翻訳文（３）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文（４）図面の翻訳文国際調査報告ＩＩＩＩ争ｍｗｋｓ＊＋＾−−ヘー用匈◆　Ｍ？／ＩＴ（Ｏ１’ｌ／ｆ’ｌ’ＨＡＡ―剛−−Ａｅ＃−ｋ　ＰＣτ／ＵＳ９０１０３１６６

Claims

【特許請求の範囲】

（１）哺乳動物に、有効量の以下に記載する物質のうちの少なくとも一つ：ＩＧＦ−Ｉ；ＩＧＦ−Ｉの機能的誘導体；ＩＧＦ−ＩＩ；またはＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体を投与する、ただしＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを投与する場合には、有効量のＮＧＦまたはＮＧＦの機能的誘導体も併せて投与する、ことからなる、細胞死の虞れのある哺乳動物の神経細胞の生存性を増加する方法。
（２）ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体を投与し、さらに有効量のＮＧＦまたはその機能的誘導体を投与することからなる請求の範囲第１項記載の方法。
（３）神経細胞が非分裂性神経細胞である請求の範囲第１項記載の方法。
（４）神経細胞がコリン作動性細胞である請求の範囲第１項記載の方法。
（５）神経細胞の疾病、損傷または老化のもたらす有害な影響の治療的処置に用いる請求の範囲第１項記載の方法。
（６）疾病がアルツハイマー病、卒中発作、■■、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病である請求の範囲第５項記載の方法。
（７）哺乳動物にＩＧＦ−Ｉ断片、ＩＧＦ−ＩＩ断片またはＮＧＦ断片のうちの少なくとも一つを投与する請求の範囲第１項記載の方法。
（８）ＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体がＩＧＦ−ＩＩ（５４−６７）である請求の範囲第１項記載の方法。
（９）哺乳動物にＩＧＦ−Ｉの類似体、ＩＧＦ−Ｉ断片の類似体、ＩＧＦ−ＩＩの類似体、ＩＧＦ−ＩＩ断片の類似体、ＮＧＦの類似体、またはＮＧＦ断片の類似体のうちの少なくとも一つを投与する請求の範囲第１項記載の方法。
（１０）哺乳動物に投与される上記類似体の一つまたはそれ以上が、脳血液関門を通過して輸送されやすいように化学修飾されたポリペプチドである請求の範囲第９項記載の方法。
（１１）修飾がポリペプチドの親油性を増加することからなる請求の範囲第１０項記載の方法。
（１２）修飾がグリコシル化である請求の範囲第１０項記載の方法。
（１３）修飾がポリペプチドの実効正電荷を増加することからなる請求の範囲第１０項記載の方法。
（１４）相加的に作用する上記物質の二つまたはそれ以上の組み合わせを哺乳動物に投与する請求の範囲第１項記載の方法。
（１５）相乗的に作用する上記物質の二つまたはそれ以上の組み合わせを哺乳動物に投与する請求の範囲第１項記載の方法。
（１６）細胞生存を促進する量の成長因子またはその機能的誘導体を投与することからなる第１の処置を哺乳動物に施し、次いで神経伝達物質を増加する量の伝達物質促進剤またはその機能的誘導体を投与するすることからなる第２の処置を哺乳動物に施す、ことからなる細胞死の虞れのある哺乳動物の神経細胞の生存性を増加する方法。
（１７）第２の処置が伝達物質特異的酵素のレベルを増加させる請求の範囲第１６項記載の方法。
（１８）成長因子がＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩである請求の範囲第１６項記載の方法。
（１９）成長因子の機能的誘導体が、ＩＧＦ−Ｉの機能的誘導体またはＩＧＦ− ＩＩの機能的誘導体である請求の範囲第１６項記載の方法。
（２０）成長因子の機能的誘導体が、成長因子の断片からなる請求の範囲第１６項記載の方法。
（２１）成長因子の機能的誘導体が、ＩＧＦ−ＩＩ（５４−６７）である請求の範囲第１６項記載の方法。
（２２）成長因子の機能的誘導体が、成長因子のいずれかの類似体または成長因子断片の類似体からなる請求の範囲第１６項記載の方法。
（２３）哺乳動物に投与される上記類似体の少なくとも一つが、脳血液関門を通過して輸送されやすいように化学修飾されたポリペプチドである請求の範囲第２２項記載の方法。
（２４）修飾がポリペプチドの親油性を増加することからなる請求の範囲第２３項記載の方法。
（２５）修飾かグリコシル化である請求の範囲第２３項記載の方法。
（２６）修飾がポリペプチドの実効正電荷を増加することからなる請求の範囲第２３項記載の方法。
（２７）伝達物質促進剤がＮＧＦである請求の範囲第１６項記載の方法。
（２８）伝達物質促進剤の機能的誘導体がＮＧＦの機能的誘導体である請求の範囲第１６項記載の方法。
（２９）伝達物質促進剤の機能的誘導体が伝達物質促進剤の断片からなる請求の範囲第１６項記載の方法。
（３０）伝達物質促進剤の機能的誘導体が、伝達物質促進剤のいずれかの類似体または伝達物質促進剤断片の類似体である請求の範囲第１６項記載の方法。
（３１）哺乳動物に投与される上記類似体の少なくとも一つが、脳血液関門を通過して輸送されやすいように化学修飾されたポリペプチドである請求の範囲第３０項記載の方法。
（３２）修飾がポリペプチドの親油性を増加することからなる請求の範囲第３１項記載の方法。
（３３）修飾がグリコシル化である請求の範囲第３１項記載の方法。
（３４）修飾がポリペプチドの実効正電荷を増加することからなる請求の範囲第３１項記載の方法。
（３５）神経細胞が非分裂性神経細胞である請求の範囲第１６項記載の方法。
（３６）神経細胞がコリン作動性細胞である請求の範囲第１６項記載の方法。
（３７）神経細胞の疾病、損傷または老化のもたらす有害な影響の治療的処置に用いる請求の範囲第１６項記載の方法。
（３８）疾病がアルツハイマー病、卒中発作、■■、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病である請求の範囲第３７項記載の方法。
（３９）第１の処置と第２の処置とが相加的に作用する請求の範囲第１６項記載の方法。
（４０）第１の処置と第２の処置とが相乗的に作用する請求の範囲第１６項記載の方法。
（４１）哺乳動物に、有効量の以下に記載する物質のうちの少なくとも一つ：ＩＧＦ−Ｉ；ＩＧＦ−Ｉの機能的誘導体；ＩＧＦ−ＩＩ；またはＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体を投与する、ただしＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを投与する場合には、ＮＧＦまたはその機能的誘導体も併せて投与する、ことからなる、哺乳動物におけるコリン作動性ニューロンのコリン作動性活性を増加する方法。
（４２）ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体を投与し、さらに有効量のＮＧＦまたはその機能的誘導体を投与することからなる請求の範囲第４１項記載の方法。
（４３）神経細胞の疾病、損傷または老化のもたらす有害な影響の治療的処置に用いる請求の範囲第４１項記載の方法。
（４４）疾病がアルツハイマー病、卒中発作、■■、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病である請求の範囲第４２項記載の方法。
（４５）哺乳動物にＩＧＦ−Ｉ断片、ＩＧＦ−ＩＩ断片またはＮＧＦ断片のうちの少なくとも一つを投与する請求の範囲第４１項記載の方法。
（４６）ＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体がＩＧＦ−ＩＩ（５４−６７）である請求の範囲第４１項記載の方法。
（４７）哺乳動物にＩＧＦ−Ｉの類似体、ＩＧＦ−ＩＩ断片の類似体、ＩＧＦ− ＩＩの類似体、ＩＧＦ−ＩＩ断片の類似体、ＮＧＦの類似体、またはＮＧＦ断片の類似体のうちの少なくとも一つを投与する請求の範囲第４１項記載の方法。
（４８）哺乳動物に投与される上記類似体の少なくとも一つが、脳血液関門を通過して輸送されやすいように化学修飾されたポリペプチドである請求の範囲第４７項記載の方法。
（４９）修飾がポリペプチドの親油性を増加することからなる請求の範囲第４８項記載の方法。
（５０）修飾がグリコシル化である請求の範囲第４８項記載の方法。
（５１）修飾がポリペプチドの実効正電荷を増加することからなる請求の範囲第４８項記載の方法。
（５２）相加的に作用する上記物質の二つまたはそれ以上の組み合わせを哺乳動物に投与する請求の範囲第４１項記載の方法。
（５３）相乗的に作用する上記物質の二つまたはそれ以上の組み合わせを哺乳動物に投与する請求の範囲第４１項記載の方法。
（５４）細胞生存を促進する量の成長因子またはその機能的誘導体を投与することからなる第１の処置を哺乳動物に施し、次いで神経伝達物質を増加する量の伝達物質促進剤またはその機能的誘導体を投与するすることからなる第２の処置を哺乳動物に施す、ことからなる哺乳動物におけるコリン作動性ニューロンのコリン作動性活性を増加する方法。
（５５）第２の処置が伝達物質特異的酵素のレベルを増加させる請求の範囲第５４項記載の方法。
（５６）成長因子がＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩである請求の範囲第５４項記載の方法。
（５７）成長因子の機能的誘導体が、ＩＧＦ−Ｉの機能的誘導体またはＩＧＦ− ＩＩの機能的誘導体である請求の範囲第５４項記載の方法。
（５８）成長因子の機能的誘導体が、成長因子の断片からなる請求の範囲第５４項記載の方法。
（５９）成長因子の機能的誘導体が、ＩＧＦ−ＩＩ（５４−６７）である請求の範囲第５８項記載の方法。
（６０）成長因子の機能的誘導体が、成長因子のいずれかの類似体または成長因子断片の類似体からなる請求の範囲第５４項記載の方法。
（６１）哺乳動物に投与される上記類似体の少なくとも一つが、脳血液関門を通過して輸送されやすいように化学修飾されたポリペプチドである請求の範囲第６０項記載の方法。
（６２）修飾がポリペプチドの親油性を増加することからなる請求の範囲第６１項記載の方法。
（６３）修飾がグリコシル化である請求の範囲第６１項記載の方法。
（６４）修飾がポリペプチドの実効正電荷を増加することからなる請求の範囲第６１項記載の方法。
（６５）伝達物質促進剤がＮＧＦである請求の範囲第５４項記載の方法。
（６６）伝達物質促進剤の機能的誘導体がＮＧＦの機能的誘導体である請求の範囲第５４項記載の方法。
（６７）伝達物質促進剤の機能的誘導体が伝達物質促進剤の断片からなる請求の範囲第５４項記載の方法。
（６８）伝達物質促進剤の機能的誘導体が、伝達物質促進剤のいずれかの類似体または伝達物質促進剤断片の類似体である請求の範囲第５４項記載の方法。
（６９）哺乳動物に投与される上記類似体の少なくとも一つが、脳血液関門を通過して輸送されやすいように化学修飾されたポリペプチドである請求の範囲第６８項記載の方法。
（７０）修飾がポリペプチドの親油性を増加することからなる請求の範囲第６９項記載の方法。
（７１）修飾がグリコシル化である請求の範囲第６９項記載の方法。
（７２）修飾がポリペプチドの実効正電荷を増加することからなる請求の範囲第６９項記載の方法。
（７３）神経細胞の疾病、損傷または老化のもたらす有害な影響の治療的処置に用いる請求の範囲第５４項記載の方法。
（７４）疾病がアルツハイマー病、卒中発作、■■、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病である請求の範囲第７３項記載の方法。
（７５）第１の処置と第２の処置とが相加的に作用する請求の範囲第５４項記載の方法。
（７６）第１の処置と第２の処置とが相乗的に作用する請求の範囲第５４項記載の方法。
（７７）哺乳動物に、有効量の以下に記載する物質のうちの少なくとも一つ：ＩＧＦ−Ｉ；ＩＧＦ−Ｉの機能的誘導体；ＩＧＦ−ＩＩ；またはＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体を投与することからなる、哺乳動物の頭部または脊髄の損傷、あるいは卒中発作、■■、老化関連神経欠損、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病からなる、哺乳動物の神経細胞に影響を及ぼす病状を治療する方法。
（７８）上記物質の二つまたはそれ以上の相加的組み合わせを哺乳動物に投与する請求の範囲第７７項記載の方法。
（７９）上記物質の二つまたはそれ以上の相乗的組み合わせを哺乳動物に投与する請求の範囲第７７項記載の方法。
（８０）ＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体が、ＩＧＦ−ＩＩ（５４−６７）である請求の範囲第７７項記載の方法。
（８１）有効量のＮＧＦまたはその機能的誘導体をさらに投与する請求の範囲第７７項記載の方法。
（８２）細胞生存を促進する量のＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体、ＩＧＦ−ＩＩ、及びＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体からなる物質群のうちの一つまたはそれ以上を投与することからなる第１の処置を哺乳動物に施し、次いで神経伝達物質を増加する量の伝達物質促進剤またはその機能的誘導体を投与するすることからなる第２の処置を哺乳動物に施す、ことからなる、哺乳動物の頭部または脊髄の損傷、あるいは卒中発作、■■、老化関連神経欠損、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病からなる、哺乳動物の神経細胞に影響を及ぼす病状を治療する方法。
（８３）伝達物質促進剤がＮＧＦまたはその機能的誘導体である請求の範囲第８２項記載の方法。
（８４）投与物質の効果が相加的である請求の範囲第８２項記載の方法。
（８５）投与物質の効果が相乗的である請求の範囲第８２項記載の方法。
（８６）ＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体が、ＩＧＦ−ＩＩ（５４−６７）である請求の範囲第８２項記載の方法。
（８７）リガンドを修飾工程に付す前に受容体調製物にリガンドを結合させ、次いで修飾工程を実施し、修飾工程に次いで受容体からリガンドを放出させることからなる、細胞表面上の受容体に結合することのできるリガンドの修飾方法。
（８８）リガンドが神経活性なポリペプチドである請求の範囲第１６項記載の方法。
（８９）修飾がカチオン化、グリコシル化またはリガンドの親油性増強である請求の範囲第８７項記載の方法。
（９０）請求の範囲第８７項記載の方法により製造した修飾ポリペプチド。
（９１）精製ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉの精製機能的誘導体、精製ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−ＩＩの精製機能的誘導体から選択される第１成分と、精製ＮＧＦ、ＮＧＦの精製機能的誘導体から選択される第２成分とからなる組成物。