JPH0453513B2

JPH0453513B2 -

Info

Publication number: JPH0453513B2
Application number: JP58146057A
Authority: JP
Inventors: Kazutomo Imahori; Ryoichi Tsuruya; Osamu Konishi; Keiichi Yamamoto; Hiroshi Nakajima
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 1983-08-10
Filing date: 1983-08-10
Publication date: 1992-08-26
Also published as: JPS6037994A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ペプチド又はペプチド誘導体の新規
な合成法に関するものである。

近年、ペプチドに種々の生理活性が存在するこ
とが相ついで知られ、治療、診断などの医薬品と
しての重要性並びに呈味物質としての重要性がま
すます増大しつつある。それに伴い、ペプチド合
成法の開発も活発である。現在までに知られてい
るペプチド合成法の主なものとしては、例えば、
フアルマシア、レビユー、３号、27−47頁（1980
年）にまとめられているように、化学合成法と酵
素法の二つの大別することができる。その化学合
成法としては、アジド法、混合酸無水物法、活性
エステル法、カルボジイミド法でアミノ酸を逐次
的に縮合する方法とフラグメントで縮合させる方
法などが代表的なものであるが、これらどの化学
合成法においても、ラセミ化及び副反応が起きや
すく反応時間が長く、末端アミノ基を保護基にて
反応前にあらかじめ保護しておく必要があるなど
種々の問題がある。フラグメント縮合法の場合、
特にラセミ化が起こりやすいという重大な欠点を
有するものである。

一方、ラセミ化の生起を極力避ける方法とし
て、プロテアーゼを用いる酵素法が提案されてい
るがこの方法においてもやはり、反応時間が長
く、末端アミノ基を保護基にて保護しておく必要
があるなど操作の煩雑さを改良するには至らなか
つた。さらに、このプロテアーゼを用いる酵素法
では、用いる酵素が本来ペプチド分解活性を有し
ているため、生じたペプチドが合成と併行して分
解され、しばしば目的のペプチドが得られないと
いう重大な欠点を示すものであつた。特に、オリ
ゴペプチドの合成を適用した場合には、一部のア
ミノ酸が欠落した目的外のペプチドが得られる重
大な欠点が指摘されている〔ジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリ−誌、256巻、1301
頁（1981年〕。また、酵素法によるペプチド合成
法としては、プロテア−ゼ法の他に、特定なアミ
ノ酸配列を有する単一ペプチドの合成のみを司る
特殊な酵素を用いる方法が知られている。この種
の酵素としては、例えば、グルタミン酸／システ
イン／グリシンの配列であるトリペプチドを合成
するグルタチオン合成酵素（特開昭54−122793号
公報）やデカペプチドであるグラミシジンＳを合
成するグラミシジンＳ合成酵素（現代化学1974年
12月号12頁）などが報告されている。しかし、こ
れらの酵素は特殊な酵素であつて、この酵素によ
つて合成しうるペプチドは、限定された一種のみ
のペプチドであり、目的とする任意なペプチドを
合成することができない。このため、この方法は
一般的なペプチド合成法とはなり得ないのが現状
である。

本発明者らは、ペプチドの有用性に鑑み、上記
のような欠点、特にラセミ化、副反応の生起、反
応の煩雑さなどの原因となり、同時に経済性を損
なう保護基の必要性を解決し、汎用性のある新規
なペプチド合成法を提供することを目的として鋭
意研究を重ねた結果、アミノ酸を核酸の一種であ
るtRNAに結合させる作用を有する酵素で、従来
全くペプチド結合を形成する作用が知られていな
かつたアミノアシル−tRNAシンテターゼに驚く
べきことに、ペプチド合成能があることを見い出
し、この酵素を縮合剤として用いると、前記の目
的がすべて達成されることを見い出し、先に特許
出願した（特願昭57−10336号）。しかし、この方
法は縮合剤として用いるアミノアシル−tRNAシ
ンテターゼを高純度に精製しており、このため操
作が煩雑で所望のアミノアシル−tRNAシンテタ
ーゼを得るに長時間を要し、アミノアシル−
tRNAシンテターゼ活性が精製中にたびたび失わ
れる例があり、このため、酵素の収率の低下をき
たし易い傾向があつた。これを改良するため、ア
ミノアシル−tRNAシンテターゼを、例えば微生
物など自然界に広く求めたとしても、取得したア
ミノアシル−tRNAシンテターゼの収率が低い傾
向にあり、上記の点を改善することはできなかつ
た。さらに、操作の煩雑性を改良すべく、例えば
微生物細胞などをホモジナイザーやダイノミルな
どで破砕したままの粗抽出液を用いることを検討
してみたが、この方法ではペプチド合成時に混在
する他の酵素などの影響のためか、たびたび副反
応が認められて目的ペプチドの収率を低下せしめ
る傾向にあり、かつ反応後の目的物の単離精製が
十分ではなかつた。

そこで、本発明者らは上記の点を改良するため
にさらに鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに
粗抽出液を染料を官能基として有する水不溶性の
担体で処理して得たアミノアシル−tRNAシンテ
ターゼを含む粗酵素液を用いると、上記の点をす
べて解決し、ペプチド又はペプチド誘導体を高収
量で合成できることを見い出し、本発明を完成し
た。

すなわち、本発明はアミノ酸からペプチド又は
ペプチド誘導体を合成するに際し、生物細胞を破
砕して得た粗抽出液を染料を官能基として有する
水不溶性の担体で処理してアミノアシル−tRNA
シンテターゼを含む粗酵素液を得、得られた粗酵
素液を反応系に加えて合成することを特徴とする
ペプチド又はペプチド誘導体の合成法である。

本発明に使用されるアミノアシル−tRNAシン
テターゼは、酵素分類6.1.1に属し、次式アミノ酸＋ATP＋tRNA→アミノアシル− tRNA＋AMP＋ピロリン酸の反応を触媒する酵素であり、例えば、ウサギ、
ウマ、ウシ、ラツト、ニワトリ、ヘビなどの動物
組織より得られるもの、イネ、イモ、トマトなど
の植物組織より得られるもの、カビ、酵母、キノ
コ、細菌、放射菌などの微生物及び藻類より得ら
れるものなどがあげられる。なかでも、酵素の取
得が容易であることから、微生物より得られるも
のが好ましく、さらに酵素の安定性からバチル
ス・ステアロサーモフイルス、サーマス・サーモ
フイルス、サーマス・フラバス、クロストリジウ
ム・サーモアセチカム、サーマス・アクアテイカ
スなどの耐熱性細菌より得られるアミノアシル−
tRNAシンテターゼが最適である。

これら各種のアミノアシル−tRNAシンテター
ゼは、種々のα−アミノ酸に特異性のあるものと
しては、チロシル−tRNAシンテターゼが、また
ロイシンに特異性のあるものとしては、ロイシル
−tRNAシンテターゼが、さらにバリンに特異性
のあるものとしては、バリル−tRNAシンテター
ゼ、その他イソロシル−tRNAシンテターゼ、フ
エニルアラニル−tRNAシンテターゼ、アラニル
−tRNAシンテターゼ、グルタミル−tRNAシン
テターゼ、アスパラギニル−tRNAシンテター
ゼ、メチオニル−tRNAシンテターゼ、ヒスチジ
ル−tRNAシンテターゼ、リジル−tRNAシンテ
ターゼ、トレオニル−tRNAシンテターゼ、セリ
ル−tRNAシンテターゼ、アスパラチル−tRNA
シンテターゼ、グルタミニル−tRNAシンテター
ゼ、システイニル−tRNAシンテターゼ、プロリ
ル−tRNAシンテターゼ、グリシル−tRNAシン
テターゼ、アルギニル−tRNAシンテターゼ、ト
リプトフアニル−tRNAシンテターゼなどが具体
例としてあげられる。

本発明においては、これらのアミノアシル−
tRNAシンテターゼを含む粗酸素液を得るには、
例えば、上記組織又は細胞をホモジナイザーやダ
イノミルなどで破砕した後、得られた粗抽出液を
染料を官能基としてて有する水不溶性の担体で処
理することが必要である。

この染料を官能基として有する水不溶性の担体
で処理するには、例えばPH３ないしPH13、好まし
くはPH６ないしPH10、最適にはPH７ないしPH９
で、濃度が1mMないし1M、好ましくは20mMな
いし100mMの緩衝液で平衝化した染料を官能基
として有する水不溶性の担体に、上記粗抽出液を
加える（バツチ法）か、上記樹脂をカラムにつ
め、そのカラムに粗抽出液を通液（カラム法）し
て行えばよい。その時の処理温度としては、アミ
ノアシル−tRNAシンテターゼの活性を維持する
温度で行えばよいが、一般には０℃から70℃が好
ましく、特に０℃から30％が最適である。また、
その時に用いる緩衝液としては、アミノアシル−
tRNAシンテターゼが溶解し、所望のPHが得られ
るものであればいかなるものでもよい。そのよう
なものとして、例えば、トリス塩酸緩衝液、ヘペ
ス緩衝液、トリエタノールアミノ緩衝液、イミダ
ゾール緩衝液、リン酸緩衝液などがあげられる。
さらに、酵素の失活を防ぐことを主目的として、
処理用緩衝液にメルカプトエタノール、ジチオス
レイトールなどのスルフヒドリル化剤、フエニル
メチルスルホニルフルオリドなどのタンパク質分
解酵素阻害剤、エチレンジアミン四酢酸ナトリウ
ムなどのキレート剤を添加してもよい。前記バツ
チ法で処理するには、例えば、粗抽出液を上記緩
衝液で平衝化した染料を官能基として有する水不
溶性の担体を加え、５分以上、好ましくは30分以
上撹拌し、さらにしばらく放置した後、同じ緩衝
液で溶出せしめるか、PHの異なる上記緩衝液、濃
度変化を持たせた、あるいは塩を含む緩衝液で吸
着した酵素を溶出せしめることにより、アミノア
シル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素液を得る
ことができる。また、カラム法で処理するには、
例えばカラム内で所望の酵素の吸着・脱着操作を
行えばよく、原理的にはバツチ法と同じである。
処理する時間としては、できるだけ迅速であるこ
とが好ましく、カラム内の線速度が１cm・h^-1以
上で行うのがよい。さらに、分離能を考慮してカ
ラム内の線速度としては、最大60cm・h^-1である
ことがより好ましい。

このように処理して得られたアミノアシル−
tRNAシンテターゼを含む粗酵素液を、そのまま
用いてもよいし、これをさらに凍結乾燥して得た
固形状のものも用いられる。

このように処理して得たアミノアシル−tRNA
シンテターゼを含む粗酵素液は、さらにDEAE樹
脂処理を施してペプチド合成に使用してもよい。

本発明における染料を官能基として有する水不
溶性の担体とは、染料と水不溶性の高分子とを反
応させた水に水不溶性の化合物をいい、この水不
溶性の高分子としては、例えば、セルロース、デ
キストラン、アガロース、デンプン等の多糖類の
誘導体、ポリ酢酸セルロース、ポリビニルアルコ
ールの誘導体、ポリスチレン、ポリプロピレン、
ポリエチレン、ポリビニルクロライド、ポリ（メ
チルメタクリル酸）エステル、ポリブデン、ポリ
ペンテン、ポリビニリデンクロライド、ポリアク
リロニトリル、ポリメタクリル酸、ポリアクリル
酸、ポリアミノスチレン、ポリブタジエン、ポリ
イソプレン、ポリマレイン酸モノエステル、架橋
ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポ
リビニルアミン、ポリ（ジアルキルアミノエチル
メタクリル酸エステル）、ポリ（ジアルキルアミ
ノメチルスチレン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポ
リ（ビニルピロリドン）、ポリアクリル酸無水物、
ポリメタクリル酸無水物物、ポリマレイン酸無水
物、ポリメタクリロニトリル、ポリ（トリフルオ
ロエチレン）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、
ポリ（ジビニルベンゼン）、ポリ（α−メチルス
チレン）、ポリ（Ｎ−ビニルアミン）、ポリ（テト
ラメチレングリコールジビニルエーテル）、ポリ
ビニルスルホン、ポリビニルスルホキシド、ポリ
アクロレイン、ポリメチルビニルケトンなどの不
飽和炭素を含む単量体からなる重合体、ポリフエ
ニレンオキシド、ポリメチレンオキシド、ポリエ
チレンオキシド、ポリテトラメチレンオキシドな
どのポリエーテル類、ポリアラニン、ポリフエニ
ルアラニンなどのポリペプチド類、ナイロン−
３、ナイロン−４、ナイロン−５、ナイロン−
６、ナイロン−７、ナイロン−11、ナイロン−
12、ナイロン−6.6、ナイロン−6.10、ポリ（ｍ
−フエニレン−イソフタラミド、ポリ（ｐ−フエ
ニレン−テレフタラミド）などのポリアミド、テ
レフタル酸、イソフタル酸、アジピン酸、マレイ
ン酸、フマル酸、トリメリツト酸等のポリカルボ
ン酸と、エチレングリコール、プロピレングリコ
ール、ブチレングリコール、ペンタエリスリトー
ル、ビスフエノールＡなどのポリオールとから誘
導されるポリエステル類、グリコール類、乳酸、
ヒドロキシピリバリン酸等から誘導されるポリエ
ステル、ジメチルポリシロキサン、メチルフエニ
ルポリシロキサン、メチルビニルポリシロキサ
ン、シアノアルキルメチルポリシロキサン、フル
オロアルキルメチルポリシロキサンなどのシリコ
ンゴム、トリエンジイソシアナート、キシレンジ
イソシアナート、フエニレンジイソシアナート、
エチレンジイソシアナートジフエニルメタンジイ
ソシアナート、トルエントリイソシアナートなど
のポリイソシアナートと、ポリエチレングリコー
ル、ポリプロピレングリコール、両末端にOH基
を有するポリエステルなどのポリオールとから誘
導されるポリウレタン類、フエノール−ホルムア
ルデヒド樹脂、キシレン−ホルムアルデヒド樹
脂、尿素−ホルムアルデヒド樹脂、メラミン−ホ
ルムアルデヒド樹脂などのホルムアルデヒド樹
脂、ポリイミド、ポリベンツイミダゾール、ポリ
チアゾールなどの４員環を含むポリマー、ポリカ
ーボナート、ポリスルホンなどの合成ポリマー類
及びガラス、アスベスト、クレイ、マイカ、ヒド
ロキシルアパタイト活性炭、シリカゲル、アルミ
ナなどの無機物の誘導体及びポリフオスフアゼン
のような合成無機ポリマーなどがあげられる。特
にこれらの中でも、セルロース、デキストラン、
アガロース、デンプンなどの多糖類の誘導体が好
ましい。

また、染料としては、例えばカラーインデツク
ス番号（以下C.I.No.という。）10305（Acid Dye）、
C.I.No.10415（C.I.Acid Brown103）、C.I.No.10440
（Acid Dye）などのニトロ系染料、C.I.No.11005
（C.I.Disperse Orange3）、C.I.No.11045（Basic
Dye）、C.I.No.20260（C.I.Acid Brown143）、C.I.No
.
35435（C.I.Direct Black22）などのアゾ系染料、
C.I.No.50245（Basic Dye）、C.I.No.50305（C.I.Basic
Blue14）などのアジン系染料、C.I.No.53170（C.I.
Sulphur Green21）、C.I.No.53218（C.I.Sulphur
Brown62）、C.I.No.53247（C.I.Solubilised Sulphur
Brown5）などのイオウ系染料、C.I.No.56011（C.I.
Vat Green23）、C.I.No.56050（C.I.Vat Red23）な
どのアミノケトン系染料、C.I.No.57000（Mord
ant Dye）、C.I.No.57005（Mordant Dye）、C.I.No.
57011（Mordant Dye）などのヒドロキシケトン
系染料、C.I.No.58010（（Mordant Dye）、C.I.No.
58080（Acid Dye）、C.I.No.58610（C.I.Mordant
Blue23）、C.I.No.60700（C.I.Disperse Orange11）
、
C.I.No.61205（C.I.Reactive Blue4）、C.I.No.61211
（C.I.Reactive、Blue2）、C.I.No.61505（Disperse
Blue3）、C.I.No.64500（C.I.Disperse Blue1）、C.I
.
No.67110（C.I.Vat Blue30）、C.I.No.71125（Vat
Dye）などのアントラキノン系染料、C.I.No.73025
（Vat Dye）、C.I.No.73080（Vat Dye）、C.I.No.
73835（Vat Dye）などのインジゴ系染料、C.I.No.
74100（C.I.Pigment Blue16）、C.I.No.74220（C.I.
Acid Blue249）、C.I.No.74255（C.I.Pigment、
Green37）などのフタロシアニン系染料、C.I.No.
75130（C.I.Natural Yellow26）、C.I.No.75160（C.I.
Natural Yellow38）、C.I.No.75310（C.I.Natural
Orange2）、C.I.No.75600（Fukugetin）などの天然
染料があげられ、これらの中でもアゾ系染料、ア
トラキノン系染料、フタロシアニン系染料が好ま
しい。

この染料を官能基として有する水不溶性の担体
の好ましい具体例として、例えば、市販のマート
レツクスゲルブルーＡ（アントラキノン系染料、
アミコン社製）、マートレツクスゲルレツドＡ（ア
ゾ系染料、アミコン社製）、マートレツクスゲル
ブルーＢ（フタロシアニン系染料、アミコン社
製）、アフイ・ゲルブルー（アントラキノン系染
料、バイオラツド社製）、ブルーセフアロースCL
−6B（アントラキノン系染料、フアルマシア社製
があげられ、これらを用いると、所望のアミノア
シル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素液が迅
速、かつ高収率で得られ、この粗酵素液を用いる
と高収量でペプチド又はペプチド誘導体を合成す
ることができて好ましい。

次に、染料を官能基として有する水不溶性の担
体で処理して得たアミノアシル−tRNAシンテタ
ーゼを含む粗酵素液を用いたペプチド又はペプチ
ド誘導体の合成方法を具体的に説明する。

本発明によれば、アミノ酸とアミノ酸から誘導
されるアミノ酸誘導体とをアミノアシル−tRNA
シンテターゼを含む粗酵素液の存在下で反応させ
ることによつてペプチド又はペプチド誘導体を合
成することができる。さらに本発明によれば、あ
らかじめアミノ酸とアミノアシル−tRNAシンテ
ターゼを含む粗酵素液とを混合させて混合物を
得、次いで得られた混合物とアミノ酸誘導体及び
親水性有機溶媒とを反応させることによつてペプ
チド又はペプチド誘導体を合成することができ
る。このアミノアシル−tRNAシンテターゼを含
む粗酵素液とあらかじめ混合させるのに好ましく
用いられるアミノ酸としては、例えばチロシン、
アラニン、ロイシン、イソロイシン、フエニルア
ラニン、メチオニン、リジン、セリン、バリンな
どのα−アミノ酸があげられ、Ｌ体、Ｄ体のいず
れでもよい。また、上記反応に好ましく用いられ
るアミノ酸誘導体としては、例えばグリシン、ア
ラニン、ロイシン、イソロイシン、フエニルアラ
ニン、グルタミン酸、グルタミン、イルロイシ
ン、システイン、チロシン、アルギニン、バリ
ン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アス
パラギン、メチオニン、トリプトフアン、トレオ
ニンなどのα−アミノ酸、β−アラニン、β−ア
ミノイソ酪酸などのβ−アミノ酸、クレアチンな
どの含窒素γ−アミノ酸、ピペリジン酸などのγ
−アミノ酸、ε−アミノカプロン酸などのε−ア
ミノ酸などの各種アミノ酸のエステル、チオエス
テル、アミド、ヒドロキサミドなどがあげられる
が、アミノ基が遊離の形であるアミノ酸誘導体で
あれば、上記例示化合物に限定されるものではな
い。そのエステルとしては、例えばメチル、エチ
ル、プロピル、シクロヘキシル、フエニル、ベン
ジルなどの単純な炭化水素系のエステルから、
tRNAの3′−OHで上記アミノ酸がエステル化し
たものまで、種々のエステルを用いることができ
る。また、アミドとしては、遊離のアミドの他、
例えば異種あるいは同種のアミノ酸がアミド結合
したオリゴペプチドやポリペプチドを用いること
もできる。このオリゴペプチドやポリペプチドが
さらにエステル、チオエステル、ヒドロキサミ
ド、エーテル化したものを用いることも可能であ
る。また、上記アミノ酸誘導体は水溶液の状態で
用いるか、あるいは固体のままで用いてもよい。

次に、混合物を得るには、例えばPH５ないしPH
11、好ましくはPH６ないしPH10、最適にはPH７な
いしPH10の緩衝液中、アデノシン三リン酸又はデ
オキシアデノシン三リン酸存在下に、アミノ酸と
アミノアシル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素
液と混合することによつて行えばよい。そのとき
の混合の温度としては、酵素活性を維持する観点
から一般に０℃から70℃が好ましく、最適には０
℃から30℃で行われる。また、そのときに用いら
れる緩衝液としては、アミノ酸、アデノシン三リ
ン酸、デオキシアデノシン三リン酸及びアミノア
シル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素液が溶解
し、所望のPHが得られるもので、あればいかなる
ものを使用してもよい。例えば、トリス塩酸緩衝
液、ヘペス緩衝液、トリエタノールアミン緩衝
液、マレート緩衝液、リン酸緩衝液などがあげら
れる。さらに、反応を円滑に進行させ、酵素の失
活を防ぐことを主目的として、反応系にマグネシ
ウム、マンガンなどの二価カチオン、メルカプト
エタノール、ジチオスレイトールなどのスルフヒ
ドリル化剤、ピロフオスフアターゼを単独又は混
合して添加してもよい。各添加剤の好適な濃度と
しては、二価カチオン0.01mM〜500mM、スル
フヒドリル化剤、0.001mM〜100mM、ピロホス
フアターゼ0.001ユニツト／ml〜100ユニツト／ml
であり、最適な濃度としては、それぞれ二価カチ
オン0.1mM〜10mM、スルフヒドリル化剤
0.01mM〜1mM、ピロホスフアターゼ１ユニツ
ト／ml〜10ユニツト／mlである。また、アミノ
酸、アミノアシル−tRNAシンテターゼを含む粗
酵素液及びアデノシン三リン酸又はデオキシアデ
ノシン三リン酸の使用量は特に制限されないが、
実用的な収量を得るためには、アミノ酸１重量部
に対し、アミノアシル−tRNAシンテターゼを含
む粗酵素液10³〜10⁶重量部（アミノアシル−
tRNAシンテターゼの濃度としては、10μM以上
のものが好ましい。）の範囲アミノ酸とアデノシ
ン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸との
モル比を１：10〜１：100の範囲内で行うのが好
ましい。前記の条件で反応を実施すると、反応は
円滑に進行し、数秒から30分以内に完結する。

次いで、上記のようにして得られた混合物とア
ミノ酸誘導体とを混合して反応させることにより
目的のペプチド又はペプチド誘導体を得ることが
できる（この段階は以後ペプチド化と称する。）。
このときに用いる反応混合物は、そのままペプチ
ド化反応に用いることもできるが、Ｇ−25（フア
ルマシア社製）、Ｇ−75（フアルマシア社製）など
のゲルクロマトグラフイーを行うことによつて、
反応後に混在するアデノシン三リン酸、アデノシ
ン一リン酸あるいはピロリン酸などを除去して用
いることもできる。また、ペプチド化反応の温度
としては、０℃から70℃が好ましく、酵素の失活
防止と適正な反応速度を得るという観点から、10
℃から50℃、特に20℃から40℃で行うことが好ま
しい。PHとしては、既出の各種緩衝などを用いて
５ないし11、好ましくは６ないし10、最適には７
ないし９で行えばよい。

反応混合物とアミノ酸誘導体との混合比とし
て、例えば容量で１：0.1〜１：100の範囲で行え
ばよい。また、この時用いるアミノ酸誘導体の濃
度としては10mMから10Mの範囲であるが、これ
をさらに低くして用いることもできる。

上記条件でペプチド化は、数秒から数日で完結
し、目的のペプチド又はペプチド誘導体を得るこ
とができる。

本発明によつて得られるペプチド誘導体は、例
えば血圧降下作用などのあるブラジキニンや内・
外分泌抑制作用などのあるソフトスタチンなどの
各種ホルモン及び抗生物質ペプチド、呈味ペプチ
ドのような他の生物学的活性物質として有用であ
る。

本発明によれば、上記有用ペプチド又はペプチ
ド誘導体を保護基を用いることなく、また、高純
度に酵素を精製することなく、安価に製造するこ
とができ、さらにより高取量で製造できるため、
工業的に極めて有用である。

以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。

実施例１、比較例１バチルス・ステアロサーモフイルスUK788（微
工研菌寄第5141号）の菌体６Kgを２倍量の
100mMトリス・塩酸緩衝液（PH7.5）に懸濁し、
ダイノミルを用いて細胞を破砕後、遠心分離によ
り不溶物を除去し、チロシンに特異的なチロシル
−tRNAシンテターゼを含む粗抽出液を得た。あ
らかじめ5mMメルカプトエタノール、2mMエチ
レンジアミノ四酢酸ナトリウム及び0.1mMホス
ホフエニルスルホニルフルオリドを含む50mMト
リス緩衝液（PH7.5）で平衡化したマートレツク
スゲルブル−Ａ（アミコン社製）を充填したカラ
ムに、上記の粗抽出液をとおし、塩化カリウムを
上記緩衝液に加えた溶液で、線速度60cm・h^-1で
溶出せしめると、チロシル−tRNAシンテターゼ
が溶出した。この区分を集め、濃縮、脱塩を行つ
た結果、約70％の収率でチロシンに特異的なチロ
シル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素液を得
た。上記操作をすべて４℃で行つた。

このように染料を官能基として有する水不溶性
の担体で処理して得たチロシル−tRNAシンテタ
ーゼを含む粗酵素液27ｇ（純度4.1％）、塩化マグ
ネシウム0.4ｇ、アデノシン三リン酸0.1ｇ、Ｌ−
チロシン１mg、ピロホスフアターゼ（ベーリンガ
ー・マンハイム社製）200ユニント及びジチオス
レイトール0.01mgを200mlの20mMヘペス緩衝液
PH8.0に溶解し、４℃で15分間混合させて混合物
を得た。得られた混合物にＬ−フエニルアラニン
メチルエステル４ｇを加え、よく混合し、反応温
度を30℃に保つて１日放置して反応させた。

次いで、得られた反応液にアセトン200mlを加
え、沈殿を濾別後、上漬をエバポレーターにて約
20mlに濃縮し、ボンダパツクC₁₈カラム（ウオー
ターズ社製）に供し、アセトニトリル／50mMリ
ン酸カリ水溶液、15/85、PH７を展開溶媒として
用いて分離し、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエニルアラ
ニンメチルエステルを0.7mg得た。

その元素分析（C₁₉H₂₂N₂O₄＝342.39）は計算値（％）Ｃ＝66.65 Ｈ＝6.48 Ｎ＝8.18 測定値（％）Ｃ＝66.81 Ｈ＝6.33 Ｎ＝8.11 であつた。

次に比較のため、バチルス・ステアロサーモフ
イルス６Kgから、上記と同様の方法で粗抽出液を
得、続いて陰イオン交換樹脂のDEAE−セルロー
スカラムクロマトグラフイー、ヒドロキシアパタ
イトカラムクロマトグラフイー、DEAE−セフア
デツクスカラムクロマトグラフイー、硫酸アンモ
ニウムによる分別沈殿法、ヒドロキシアパタイト
グラフイー、DEAE−セフアデツクスカラムクロ
マトグラフイー及びセフアデツクスＧ−150カラ
ムクロマトグラフイー法で単一に精製したチロシ
ル−tRNAシンテターゼを用い、上記と同様にし
てＬ−チロシル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエ
ステルを0.1mg得た。

実施例２、比較例２バチルス・ステアロサーモフイルスNCA1503
（微工研菌寄第4778号）の菌体10Kgを用い、実施
例１と同様にして得た粗抽出液を、あらかじめ
5mMメルカプトエタノール、2mMエチレンジア
ミン四酢酸ナトリウムを含む25mMトリス緩衝液
（PH7.0）で平衡化したマートレツクスゲルレツド
Ａ（アミコン社製）を充填したカラムに、上記の
粗抽出液を通し、塩化カリウムを上記緩衝液に加
えた溶液で、線速度40cm・h^-1で溶出せしめると、
アスパラチル−tRNAシンテターゼが溶出した。

上記操作をすべて30℃下で行つた。

この染料を官能基として有する水不溶性の担体
で処理して得たアスパラチル−tRNAシンテター
ゼを含む粗酵素45ｇ（純度3.8％）、塩化マグネシ
ウム50mg、アデノシン三リン酸300mg、Ｌ−アス
パラギン酸３mg、ピロホスフアターゼ（ベーリン
ガーマンハイム社製）200ユニツト及びジチオス
レイトール0.01mgを200mlの25mMリン酸緩衝液
PH8.0に溶解し、４℃で20分間反応させて混合物
を得た。得られた混合物にＬ−ロイシン−ｔ−ブ
チルエステル２ｇを加え、よく混合し、反応温度
を25℃に保つて８時間反応させた。実施例１と同
様に処理した後、ボンダバツクC₁₈カラム（ウオ
ーターズ社製）に供し、アセトニトリル／50mM
リン酸カリ水溶液、5/95、PH７を展開溶媒として
用いて分離し、Ｌ−アスパラチル−Ｌ−ロイシン
−ｔ−ブチルエステルを2.2mg得た。

その元素分析（C₁₄H₂₆N₂O₅＝302.42）は計算値（％）Ｃ＝55.60 Ｈ＝8.68 Ｎ＝9.27 測定値（％）Ｃ＝55.41 Ｈ＝8.63 Ｎ＝9.41 であつた。

次に比較のため、上記と同じ菌体量を用い、比
較例１と同様にして得たアスパラチル−tRNAシ
ンテターゼで反応を行つてＬ−アスパラチル−Ｌ
−ロイシン−ｔ−ブチルエステルを0.3mg得た。

実施例３、比較例３酵母TorulopsisR−14（微工研菌寄第3114号）
から実施例１と同様の操作で得た粗抽出液を、あ
らかじめ10mMメルカプトエタノール、20mMエ
チレンジアミン四酢酸ナトリウムを含む30mMヘ
ペス緩衝液（PH7.7）で平衡化したアフイ・ゲル
ブルー（バイオラツド社製）に加え、20分間撹拌
後、濾過により樹脂を濾別した。この樹脂に塩化
ナトリウムを含む上記を加え、ロイシン−tRNA
シンテターゼを含む粗酵素液を得た。これを凍結
乾燥して粉末状の粗酵素標品を得た。

この染料を官能基として有する水不溶性の担体
で処理して得たロイシン−tRNAシンテターゼを
含む粗酵素標品５ｇ（純度8.0％）、塩化マグネシ
ウム20mg、アデノシン三リン酸40mg、Ｄ−ロイシ
ン１mg、ピロホスフアターゼ（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）10ユニツト及びメルカプトエタノ
ール2.0μlを30mlの50mM2.5−ジメチルイミダゾ
ール緩衝液PH9.0に溶解し、４℃で10分間反応さ
せたのち、反応混合物をＧ−75（フアルマシア社
製）カラムに供し、ヘペス緩衝液にて溶出し、ボ
イド溶の画分40mlを集め反応混合物を単離した。
これにＬ−フエニルアラニンアミド２ｇを固体の
まま加えて40℃で45分間反応させた。得られた反
応物にアセトン20mlを加え、生じた沈殿を濾別
し、エバポレーターにて約10mlに濃縮後、実施例
１と同様に分離し、Ｄ−ロイシル−Ｌ−フエニル
アラニンアミドを1.6mg得た。

その元素分析（C₁₅H₂₃N₃O₂＝277.41）は計算値（％）Ｃ＝64.94 Ｈ＝8.37 Ｎ＝15.15 測定値（％）Ｃ＝64.92 Ｈ＝8.40 Ｎ＝15.18 であつた。

次に比較のため、上記で得た粗抽出液をアフ
イ・ゲルブルー（バイオラツド社製）で処理する
ことなくそのまま用い、上記と同様の方法で反応
を行つたところ、粗抽出液中に存在する他の酵素
などの影響による副反応のためか、Ｄ−ロイシル
−Ｌ−フエニルアラニンアミドの収率は非常に低
くHPLCでわずかに検出できる程度であつた。

実施例４、比較例４ウサギ（北山ラベス、KBL：JW日本白色種）
の肝臓からホモジナイザーを使つて、実施例１と
同様の操作でヒスチジル−tRNAシンテターゼを
含む粗抽出液を得た。あらかじめ、1mMジチオ
スレイトール、2mMエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム及び0.1mMホスホフエニルスルホニル
フルオリドを含む25mMトリス緩衝液（PH8.0）
で平衡化したブル‐セフアロースCL−6B（フア
ルマシア社製）に上記粗抽出液を加え、１時間撹
拌し、静置後、上清を除去した。これを塩化カリ
ウムを上記緩衝液に加えた溶液で溶出せしめる
と、ヒスチジル−tRNAシンテターゼが溶出し
た。

こうして得たヒスチジル−tRNAシンテターゼ
を含む粗酵素液３ｇ（純度18％）、塩化マグネシ
ウム50mg、デオキシアデノシン三リン酸50mg、Ｌ
−ヒスチジン１mg、ピロホスフアターゼ（ベーリ
ンガーマンハイム社製）200ユニツト及びジチオ
スレイトール0.01mgを用いて、実施例３と同様に
反応させ、Ｇ−25（フアルマシア社製）カラムを
用いて反応混合物を得た。次いで、これにＬ−プ
ロリンアミド２ｇを加え、混合し、０℃で30分間
反応させた。得られた反応液をボンダパツクC₁₈
カラムにより実施例１と同様に分離し、Ｌ−ヒス
チジル−Ｌ−プロリンアミド1.5mgを得た。

その元素分析（C₁₁H₁₇N₅O₂＝251.33）は計算値（％）Ｃ＝52.56 Ｈ＝6.83 Ｎ＝27.87 測定値（％）Ｃ＝52.55 Ｈ＝6.78 Ｎ＝27.90 であつた。

次に比較のため、上記で得た粗抽出液をブルー
セフアロースCL−6Bで処理することなくそのま
ま用いて、上記と同様の方法で反応を行つてＬ−
ヒスチジル−Ｌ−プロリンアミド0.1mgを得た。

実施例４に比べると、収率は低下する傾向にあ
つた。

Claims

【特許請求の範囲】

１アミノ酸からペプチド又はペプチド誘導体を
合成するに際し、生物細胞を破砕して得た粗抽出
液を染料を官能基として有する水不溶性の担体で
処理してアミノアシル−tRNAシンテターゼを含
む粗酵素液を得、得られた粗酵素液を反応系に加
えて合成することを特徴とするペプチド又はペプ
チド誘導体の合成法。