JPH0455670B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0455670B2 JPH0455670B2 JP61072456A JP7245686A JPH0455670B2 JP H0455670 B2 JPH0455670 B2 JP H0455670B2 JP 61072456 A JP61072456 A JP 61072456A JP 7245686 A JP7245686 A JP 7245686A JP H0455670 B2 JPH0455670 B2 JP H0455670B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacteria
- bacillus
- bacterial cells
- bacterial
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
［産業上の利用分野］
本発明はサイクロデキストリン合成酵素を菌体
に結合した状態で産生するバチルス属の新規好熱
性細菌に関するものである。 ［従来の技術］ 従来、サイクロデキストリン合成酵素（サイク
ロデキストリングルカノトランスフエラーゼ）の
産生菌としては、バチルス属のマセランス、サー
キユランス、メガテリウム、オーベンシス、ステ
アロサーモフイルスが知られているが、これらの
菌は該酵素を菌体外に産生し、酵素の回収、固定
化に不利であつた。さらに菌の培養の際に65℃以
上の高温を用いることができれば雑菌汚染も防止
でき有利である。この点ステアロサーモフイラス
は、50〜65℃で生育するので利用できるが、菌体
に結合した状態で該酵素を産生する菌株は知られ
ていない。 ［問題点を解決するための手段］ そこで本発明者らは、生育温度が65℃以上で、
菌体結合サイクロデキストリン合成酵素産生菌を
温泉の土から検索し、本目的に適合する菌株を十
数種見い出した。このうちで強い酵素活性をもつ
３菌株を選定し、菌学的諸性質を調べた結果を以
下に記す。 本３菌株は桿菌で胞子を形成し、グラム染色が
陽性、好気性であることからバチルス属である。 この他の性質については表に示した如くであ
る。
に結合した状態で産生するバチルス属の新規好熱
性細菌に関するものである。 ［従来の技術］ 従来、サイクロデキストリン合成酵素（サイク
ロデキストリングルカノトランスフエラーゼ）の
産生菌としては、バチルス属のマセランス、サー
キユランス、メガテリウム、オーベンシス、ステ
アロサーモフイルスが知られているが、これらの
菌は該酵素を菌体外に産生し、酵素の回収、固定
化に不利であつた。さらに菌の培養の際に65℃以
上の高温を用いることができれば雑菌汚染も防止
でき有利である。この点ステアロサーモフイラス
は、50〜65℃で生育するので利用できるが、菌体
に結合した状態で該酵素を産生する菌株は知られ
ていない。 ［問題点を解決するための手段］ そこで本発明者らは、生育温度が65℃以上で、
菌体結合サイクロデキストリン合成酵素産生菌を
温泉の土から検索し、本目的に適合する菌株を十
数種見い出した。このうちで強い酵素活性をもつ
３菌株を選定し、菌学的諸性質を調べた結果を以
下に記す。 本３菌株は桿菌で胞子を形成し、グラム染色が
陽性、好気性であることからバチルス属である。 この他の性質については表に示した如くであ
る。
【表】
バージエイズ マニユアル（Bergey′s
Manual of Determinative Bacteriology 8th
edition）およびCowan and Steelの分類によれ
ば（Manual for the ldentifcation of Medical
Bacteria、2nd edition、Cambridge Univ.
Press、1974）、以上の性質において生育温度から
ステアロサーモフイルスに近縁の菌であるが、菌
株KF5−１とKF9−10は生育PH、食塩耐性、硝酸
塩の還元性の点で異なり、KF53−10はアジ化ナ
トリウム耐性、食塩耐性の点でステアロサーモフ
イルスと異なつている。 また、これらの菌株は生育温度のみならず、ク
エン酸の利用、カゼインの加水分解、ゼラチンの
加水分解、アラビノースからの酸の生成において
もメガテリウム、マセランス、サーキユランスと
も異なつている。 さらにオーベンシス、メガテリウム、サーキユ
ランスはβ−サイクロデキストリン合成酵素を産
生するが、本発明の菌株はα−サイクロデキスト
リンを主として合成する酵素を産生するので、こ
の点においても上記公知菌と異なつている。 これらの結果から、本発明者らは３菌株をバチ
ルス・ステアロサーモフイルスvar.に属する新規
な菌と認め、おのおのKF5−１、KF9−10、
KF53−10と命名した。これら菌株は工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されており、その受
託番号はそれぞれFERM Ｐ−8716、同8718、同
8717、である。 本菌株をコーンスチープリカー、可溶性澱粉、
硫安、炭酸カルシウムの混合培地または馬鈴蓍、
オートミール、塩化カルシウム、食塩の混合培地
で培養すると良く生育し、65−75℃で12〜72時間
培養すると、サイクロデキストリン合成酵素が菌
体に結合した状態で産生される。培養温度を65℃
以下にした場合でも該酵素を産生するが、菌体外
酵素をより多く産生するようになり、例えばKF9
−10は50℃での培養で10THU（チルデン・ハド
ソン単位）の活性を菌体外に産生する。この傾向
はマセラス、ステアロサーモフイルスでも観察さ
れるが、菌体結合酵素活性は本発明の菌と比較す
ると10分の１以下と低く、また菌体外酵素につい
ても、本発明の菌より著しく低い。培地として
は、各種無機、有機、炭素源および窒素源、塩
類、ビタミン、アミノ酸などを組み合わせて最適
なものを用いればよいが、経済的にはコーンスチ
ーブリカー、廃糖蜜、フスマ、澱粉、硫安などが
有利である。 コーンスチープリカーを含む培地を用い、65〜
75℃で培養する際は特に密閉したジヤーフアーメ
ンターの使用を必要とせず、保温した器に空気を
吹き込めば菌が増殖し、しかも本菌は沈澱しやす
いので集菌は容易である。したがつて培地を添加
しながら増殖した連続的に取り出すこともでき本
発明の菌は連続培養にも有利である。 培養した菌体は水で洗浄した後、澱粉の懸濁液
に加え65℃以上で振とう反応すれば、澱粉粒は
徐々に溶解されると同時に酵素作用を受ける。 反応液の上澄を取り出して、澱粉を加えれば連
続反応ができるが、菌体から酵素が少量ずつ離脱
し、生菌体をバツチ式で用いた場合は３〜４回
（24時間／１回）の使用で結合酵素量は半減する。 そこでグルタルアルテヒドで結合を補強したと
ころ十数回の使用にも耐えた。酵素結合の補強に
はこの他の固定化酵素調整法の利用も可能であ
り、例えばアルギン酸ソーダ、ポリアクリルアミ
ド、ナイロン、硝酸セルロース、ポリエチレンイ
ミンを用い、これらの二種以上を混合するか、ま
たは単独で用いることができる。 さらに本固定化菌体酵素はバイオリアクターに
利用でき、例えば細胞培養用のリアクター、カラ
ーム型リアクター、模型リアクターなどに用いる
ことができる。 ［発明の効果］ このように本発明のサイクロデキストリン合成
酵素を細胞に結合させた好熱性細菌はサイクロデ
キストリンの生産に非常に有利なものであり、サ
イクロデキストリンの生産が連続化されるので、
その生産コストは著しく低減される。 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明するが、これに限定されるものではない。 実施例 １ コーンスチープリカー1.0％、可溶性澱粉1.0％
硫安0.5％、炭酸カルシウム0.5％を水道水に含む
培地を120℃、15分間オートクレーブした後、実
験室で100mlずつ500mlの三角フラスコに分注し、
スラントから１白金耳の菌体KF5−１（FERM
Ｐ−8716）をとり接種した後アルミホイルで蓋を
して65℃で２日間培養した。培養終了後１時間室
温放置して上澄を除去し、沈澱部分をガラスフイ
ルターに集めて水道水で洗浄した。菌体収量は湿
潤で２〜３ｇ／100ml培養液であり、活性は湿潤
菌体ｇ当り100〜300THUである。本菌体酵素は
65〜70℃で一夜放置しても失活せず、PH5.0以上
で安定である。 本湿潤菌１ｇを20ｇのコーンスターチを含む
100ml澱粉懸濁液に加えて24時間振とうすれば澱
粉粒は大部分液化反応し、α−サイクロデキスト
リンが20〜30％、β−サイクロデキストリンが10
〜15％、γ−サイクロデキストリンが５％程度含
まれるサイクロデキストリン水アメとなる。 この反応液を遠沈して除き、新たに100mlの澱
粉懸濁液を加えて同様に反応し、３回まで液化と
反応が十分に進行した。 実施例 ２ 菌体としてKF9−10（FERM Ｐ−8718）を使
用したこと以外は実施例１と同様に行ない湿潤菌
体１〜２ｇ／100ml培養液を得た。活性は湿潤菌
体ｇ当り100〜150THUである。本菌体酵素は65
〜75℃で一液放置しても失活せず、PH5.0以上で
安定である。 本湿潤菌体は1.5ｇを20ｇのコーンスターチを
含む100ml澱粉懸濁液に加え70℃で24時間振とう
して実施例１と同様の結果を得た。 実施例 ３ 菌体としてKF53−10（FERM Ｐ−8717）を使
用したこと以外は実施例１と同様に行ない湿潤菌
体１〜２ｇ／100ml培養液を得た。 活性は湿潤菌体ｇ当り200〜300THUである。
本菌体酵素は65〜70℃で一夜放置しても失活せ
ず、PH6.0以上で安定である。 本湿潤菌体1.0ｇを20ｇのコーンスターチを含
む100ml澱粉懸濁液に加えて70℃で24時間振とう
して実施例１と同様の結果を得た。
Manual of Determinative Bacteriology 8th
edition）およびCowan and Steelの分類によれ
ば（Manual for the ldentifcation of Medical
Bacteria、2nd edition、Cambridge Univ.
Press、1974）、以上の性質において生育温度から
ステアロサーモフイルスに近縁の菌であるが、菌
株KF5−１とKF9−10は生育PH、食塩耐性、硝酸
塩の還元性の点で異なり、KF53−10はアジ化ナ
トリウム耐性、食塩耐性の点でステアロサーモフ
イルスと異なつている。 また、これらの菌株は生育温度のみならず、ク
エン酸の利用、カゼインの加水分解、ゼラチンの
加水分解、アラビノースからの酸の生成において
もメガテリウム、マセランス、サーキユランスと
も異なつている。 さらにオーベンシス、メガテリウム、サーキユ
ランスはβ−サイクロデキストリン合成酵素を産
生するが、本発明の菌株はα−サイクロデキスト
リンを主として合成する酵素を産生するので、こ
の点においても上記公知菌と異なつている。 これらの結果から、本発明者らは３菌株をバチ
ルス・ステアロサーモフイルスvar.に属する新規
な菌と認め、おのおのKF5−１、KF9−10、
KF53−10と命名した。これら菌株は工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されており、その受
託番号はそれぞれFERM Ｐ−8716、同8718、同
8717、である。 本菌株をコーンスチープリカー、可溶性澱粉、
硫安、炭酸カルシウムの混合培地または馬鈴蓍、
オートミール、塩化カルシウム、食塩の混合培地
で培養すると良く生育し、65−75℃で12〜72時間
培養すると、サイクロデキストリン合成酵素が菌
体に結合した状態で産生される。培養温度を65℃
以下にした場合でも該酵素を産生するが、菌体外
酵素をより多く産生するようになり、例えばKF9
−10は50℃での培養で10THU（チルデン・ハド
ソン単位）の活性を菌体外に産生する。この傾向
はマセラス、ステアロサーモフイルスでも観察さ
れるが、菌体結合酵素活性は本発明の菌と比較す
ると10分の１以下と低く、また菌体外酵素につい
ても、本発明の菌より著しく低い。培地として
は、各種無機、有機、炭素源および窒素源、塩
類、ビタミン、アミノ酸などを組み合わせて最適
なものを用いればよいが、経済的にはコーンスチ
ーブリカー、廃糖蜜、フスマ、澱粉、硫安などが
有利である。 コーンスチープリカーを含む培地を用い、65〜
75℃で培養する際は特に密閉したジヤーフアーメ
ンターの使用を必要とせず、保温した器に空気を
吹き込めば菌が増殖し、しかも本菌は沈澱しやす
いので集菌は容易である。したがつて培地を添加
しながら増殖した連続的に取り出すこともでき本
発明の菌は連続培養にも有利である。 培養した菌体は水で洗浄した後、澱粉の懸濁液
に加え65℃以上で振とう反応すれば、澱粉粒は
徐々に溶解されると同時に酵素作用を受ける。 反応液の上澄を取り出して、澱粉を加えれば連
続反応ができるが、菌体から酵素が少量ずつ離脱
し、生菌体をバツチ式で用いた場合は３〜４回
（24時間／１回）の使用で結合酵素量は半減する。 そこでグルタルアルテヒドで結合を補強したと
ころ十数回の使用にも耐えた。酵素結合の補強に
はこの他の固定化酵素調整法の利用も可能であ
り、例えばアルギン酸ソーダ、ポリアクリルアミ
ド、ナイロン、硝酸セルロース、ポリエチレンイ
ミンを用い、これらの二種以上を混合するか、ま
たは単独で用いることができる。 さらに本固定化菌体酵素はバイオリアクターに
利用でき、例えば細胞培養用のリアクター、カラ
ーム型リアクター、模型リアクターなどに用いる
ことができる。 ［発明の効果］ このように本発明のサイクロデキストリン合成
酵素を細胞に結合させた好熱性細菌はサイクロデ
キストリンの生産に非常に有利なものであり、サ
イクロデキストリンの生産が連続化されるので、
その生産コストは著しく低減される。 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明するが、これに限定されるものではない。 実施例 １ コーンスチープリカー1.0％、可溶性澱粉1.0％
硫安0.5％、炭酸カルシウム0.5％を水道水に含む
培地を120℃、15分間オートクレーブした後、実
験室で100mlずつ500mlの三角フラスコに分注し、
スラントから１白金耳の菌体KF5−１（FERM
Ｐ−8716）をとり接種した後アルミホイルで蓋を
して65℃で２日間培養した。培養終了後１時間室
温放置して上澄を除去し、沈澱部分をガラスフイ
ルターに集めて水道水で洗浄した。菌体収量は湿
潤で２〜３ｇ／100ml培養液であり、活性は湿潤
菌体ｇ当り100〜300THUである。本菌体酵素は
65〜70℃で一夜放置しても失活せず、PH5.0以上
で安定である。 本湿潤菌１ｇを20ｇのコーンスターチを含む
100ml澱粉懸濁液に加えて24時間振とうすれば澱
粉粒は大部分液化反応し、α−サイクロデキスト
リンが20〜30％、β−サイクロデキストリンが10
〜15％、γ−サイクロデキストリンが５％程度含
まれるサイクロデキストリン水アメとなる。 この反応液を遠沈して除き、新たに100mlの澱
粉懸濁液を加えて同様に反応し、３回まで液化と
反応が十分に進行した。 実施例 ２ 菌体としてKF9−10（FERM Ｐ−8718）を使
用したこと以外は実施例１と同様に行ない湿潤菌
体１〜２ｇ／100ml培養液を得た。活性は湿潤菌
体ｇ当り100〜150THUである。本菌体酵素は65
〜75℃で一液放置しても失活せず、PH5.0以上で
安定である。 本湿潤菌体は1.5ｇを20ｇのコーンスターチを
含む100ml澱粉懸濁液に加え70℃で24時間振とう
して実施例１と同様の結果を得た。 実施例 ３ 菌体としてKF53−10（FERM Ｐ−8717）を使
用したこと以外は実施例１と同様に行ない湿潤菌
体１〜２ｇ／100ml培養液を得た。 活性は湿潤菌体ｇ当り200〜300THUである。
本菌体酵素は65〜70℃で一夜放置しても失活せ
ず、PH6.0以上で安定である。 本湿潤菌体1.0ｇを20ｇのコーンスターチを含
む100ml澱粉懸濁液に加えて70℃で24時間振とう
して実施例１と同様の結果を得た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ バチルス・ステアロサーモフイルスvar.に属
し、サイクロデキストリン合成酵素を菌体に結合
した状態で、かつ65℃以上の温度で産生する好熱
性細菌。 ２ バチルス・ステアロサーモフイルスvar.に属
し、サイクロデキストリン合成酵素を産生する好
熱性細菌がバチルスKF5−１（FERM Ｐ−
8716）、バチルスKF9−10（FERMP−8718）およ
びバチルスKF53−10（FERM Ｐ−8717）のいず
れかである特許請求の範囲第１項記載の細菌。 ３ 生育PH下限が５または６、および／または食
塩耐性上限が４〜６％、および／または0.02％ア
ジ化ナトリウム培地で生育する細菌である特許請
求の範囲第１項または第２項記載の細菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61072456A JPS62232381A (ja) | 1986-04-01 | 1986-04-01 | バチルス属に属する好熱性細菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61072456A JPS62232381A (ja) | 1986-04-01 | 1986-04-01 | バチルス属に属する好熱性細菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62232381A JPS62232381A (ja) | 1987-10-12 |
| JPH0455670B2 true JPH0455670B2 (ja) | 1992-09-04 |
Family
ID=13489820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61072456A Granted JPS62232381A (ja) | 1986-04-01 | 1986-04-01 | バチルス属に属する好熱性細菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62232381A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5501968A (en) * | 1987-10-15 | 1996-03-26 | Novo Nordisk A/S | Thermostable cyclodextrin glycosyl transferase and processes using it |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60120984A (ja) * | 1983-12-02 | 1985-06-28 | Ikeda Touka Kogyo Kk | 耐熱性サイクロデキストリン・グリコシルトランスフェラ−ゼ及びその製造方法 |
| JPS6172456A (ja) * | 1984-09-18 | 1986-04-14 | Fujitsu Ltd | システム構成管理方式 |
-
1986
- 1986-04-01 JP JP61072456A patent/JPS62232381A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62232381A (ja) | 1987-10-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |