JPH0459734A - 新規制ガン剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は制ガン剤に関し、更に詳細には生体内活性ポリ
ペプチドであるフィブロネクチン（以下、ＦＮと略称す
る）分子中の機能性ドメインの制ガン剤としての用途に
関する。

〔従来の技術〕

ガンの治療剤としては、アルキル化剤、制ガン性抗生物
質、代謝拮抗物質、そしてアルカロイド類等、種々の制
ガン剤があり、現在、臨床で使用が可能な制ガン剤は数
十種に及んでいる。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、一般には、これらの制ガン剤は毒性及び副作用
が強く、充分な治療効果を上げるには至っていない。

本発明は上記現状にかんがみ、生体内関連物質を利用し
た、より安全性の高い新たな制ガン剤を提供することを
目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は制ガン剤に関し、下記−
殺伐■： Ｙ　−（Ｍｅｔ）、−Ｚ　　　　−−ＣＩＩ（式中、Ｙ
はＨ−又はＦＮ分子中の縮緬接着ポリペプチド、ｎは０
又は１、Ｚは−ＯＨ又はＦＮ分子中のヘパリン結合ポリ
ペプチドを示すが、Ｙ及びＺの少なくとも一方は当該ポ
リペプチドである）で表される化合物を含有しているこ
とを特徴とする。

本発明者らは生体内物質であるＦＮの機能性ドメインに
関し鋭意研究を行った結果、−殺伐［１）で示されるポ
リペプチドが顕著な制ガン効果を有することを見出し、
本発明を完成した。

ＦＮは、分子量約２５万のポリペプチドがＣ末端付近で
Ｓ−５結合で２量体を形成している。

分子内アミノ酸配列は、繰返し構造を有し、■、■、■
型に分けられる。更に、種々の機能を有するドメイン構
造を有し、細胞接着、コラーゲン、ヘパリン及びフィブ
リン等に対する結合活性を示す。

本発明者らはＦＮの機能性ドメインの新たな用途につい
て研究を行った結果、細胞接着ポリペプチド、細胞接着
ポリペプチドとヘパリン結合ポリペプチドのキメラポリ
ペプチド、及びヘパリン結合ポリペプチドが顕著な制ガ
ン作用を有することを見出した。

本発明において細胞接着ポリペプチドとはＦＮの細胞接
着ドメインに含有され、かつ細胞接着活性を有するポリ
ペプチドであればよく特に限定はない。

上記ポリペプチドの例としては、本発明者らが創製した
特開平１−１８０９００号、同１２０６９９８号、同２
−９７３９７号各公報（２７４アミノ酸残基ポリペプチ
ド）、特願昭６３３０５８２０号明細書に開示されてい
る細胞接着ポリペプチドが挙げられる。これらの細胞接
着ポリペプチドは遺伝子工学的手法により効率よく製造
可能である。

以下に一例として２７４アミノ酸残基ポリペプチドに関
して詳述する。

２７４アミノ酸残基ポリペプチド（ｐ「０１２３９＾ｓ
　ｐ　＋　５１２　）は下記式■：Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　
　Ａｓｐ Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　５ｅｒ Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｔｙｒ Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ Ｍｅｔ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ ＩＩｅ　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　５ｅｒ Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ Ｔｈｒ　　八ｓｎ　　１ｉｅ Ｔｈｒ　　Ｔｒｐ　　Ａｌａ Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ Ｌｙｓ　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ ｌｉｅ　　Ｓａｒ　　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ ａｙ Ｐｒ。

Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓａｒ Ｌｅｕ Ｐｒ。

Ｓａｒ Ｌｅｕ Ｓａｒ Ｔｈｒ Ａｌａ １ｅ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒ。

Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ １ｅ Ｐｒ。

Ｌｙｓ Ｐｒ。

Ａｌａ １ｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｐｒ。

１ａ Ｐｒ。

Ａｒｇ Ｐｒ。

Ａｓｎ Ｇ＋ｙ Ｌｅｕ ＩＩｅ Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓａｒ １ｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇ］ｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ ｌｉｓ Ａｒｇ Ｓａｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ ｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｙｒ ｉｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ ａｙ Ｓａｒ ａ ｉｓ Ｇｌｕ １ｅ ｕ ｙ ｉｎ Ａｓｐ Ｓａｒ Ｖａｌ ｕｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｐ ｅ＋ｙ Ｔｙｒ ｌｎ ｉｎ １ｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｒ。

Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ ｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ ｉｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ １ｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓａｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ １ｅ Ｔｈｒ ｕｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ ＩＳ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ １ｅ Ａｒｇ ｔｙ Ｖａｌ Ｓａｒ １ｅ Ａｓｐ Ｓａｒ Ｓａｒ ｌｙ Ｓａｒ ｌｉｓ ｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒ。

Ａｓｎ Ｓａｒ Ｓａｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｓａｒ Ｔｙｒ １ｙ Ｐｒ。

ｌｙ Ｔｈｒ Ｓａｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ 八ｓｐ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｓａｒ ｉｓ Ｌｅｕ ｌ５ Ｐｒ。

Ｓａｒ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ １ｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒ。

Ｓａｒ Ｐｒ。

Ａｓｐ ＩＩｅ ＩＩｅ Ａｒｇ ｌｙ Ｓａｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｓａｒ Ｓａｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ １ａ Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　
Ｓｅｒ　　ｌｉｅ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　ＡｒｇＴｈ
ｒ　Ｇｌｕ　　ｌｉｅ　Ａｓｐ　　　　　　　　　　・
・・ＣＩＩ）で表されるアミノ酸配列で示されることを
特徴とする。その製造方法は特開平２−９３７９７号公
報に示されており、以下具体的に説明する。

なお、本明細書において、アミノ酸に付された頁数字は
、ＥＭＢＬデータバンク（εＭＢＬ　ＤＡＴＡ　ＢＡＮ
Ｋ）のＦＮのｃＤＮＡ配列を駐訳して得られるアミノ酸
に付与されたＮ末からのアミノ酸残基数を示す。

２７４アミノ酸残基ポリペプチド（Ｐｒｏ１２３ｇ＾５
ｐ１５１２　）は、既に特許出願している　２７９アミ
ノ酸残基ポリペプチド（ｐｒＯ＋２３９−１ｅｔｌＳ＋
’？　）（特開平１−２０６９９８号）のＣ末端５アミ
ノ酸残基を欠失させたものである。２７４アミノ酸残基
ポリペプチド（Ｐｒ０１２３９　ＡＳｐ＋５１２　）を
遺伝子工学的に調製する方法としては、上述した２７９
アミノ酸残基ポリペプチド（ｐｒｏ＋２３８Ｎ　ｅ　ｔ
　Ｉ　５１７　）をコードするプラスミドｐＴＦＤ　７
０７を用いるのが好都合である。２７９アミノ酸残基ポ
リペプチドのＣ末端より５残基目のＬｙｓ１５′３のコ
ドンＡＡＡを終止コドンＴＡＡに変換することにより２
７４アミノ酸残基ポリペプチド（ｐｒｏ＋２３９Ａ　Ｓ
　ｐ　ｌ　Ｓ　ｌ　２　）をコードするプラスミドを調
製することができる。この塩基の変換は、部位特異的変
異の導入により行うことができる。

２７４アミノ酸残基ポリペプチド（ｐｒ、＋２１９Ａ　
ｓｐ　ｌ　Ｓ　＋　２　）を発現するプラスミドを導入
した大腸菌Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ　
１０９／ｐＴＦ　７．２２１は微工研条寄第１９１５号
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９１５）として寄託されている。

組換え体からのこの細胞接着ポリペプチドの精製は、例
えば次のようにする。菌体ペレットをバッファーに懸濁
し、超音波処理により可溶性画分と不溶性画分に分ける
。後者は更に７Ｍ尿素を含むバッファーで可溶化する。

可溶性画分を集めて、ＦＮの細胞接着ドメインに特異的
な抗体を結合させたセファロース４Ｂのカラムにかけ、
アフィニティ精製を行う。溶出にはｐＨ２，３付近のバ
ッファーを用いる。イムノブロッティングで目的画分を
集めることにより、細胞接着ポリペプチドを得ることが
できる。必要とあれば、ＦＰＬＣ又はＨＰＬＣで更に精
製することができる。

また本発明においてヘパリン結合ポリペプチドとは、Ｆ
Ｎのヘパリン結合ドメインに含有され、かつヘパリン結
合活性を有するポリペプチドであればよく特に限定はな
い。

上記ポリペプチドの例としては、本発明者らが創製した
特願平１−１３１４５３号明細書中に開示されているヘ
パリン結合ポリペプチドが挙げられる。該明細書中記載
のポリペプチドは遺伝子工学的手法により効率よく製造
可能である。

以下にヘパリン結合ポリペプチドの一例として、２７１
アミノ酸残基ポリペプチドに関して詳述する。

２７１アミノ酸残基ポリペプチド（Ａ７ａ１８８０７　
ｈｒ　ｒ　９　＃　Ｄ　）は下記式ｍ：Ａｌａ　　ｌｉ
ｅ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ
　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　ＰｈｅＴｈｒ　　Ｇｌｎ　　
Ｖａｌ Ｇｌｎ　　Ｔｒｐ　　Ｔｈｒ Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ　　Ａｒｇ Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　ｌｉｅ　　５ｅｒ １１ｅ　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ １１ｅ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ １１ｅ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ Ａｒｇ　　Ｓｅｒ　　５ｅｒ Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　ｌ１ｅ Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｔｒｐ Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ Ｐｒｏ　　Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　５ｅｒ Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ａｌａ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｙ Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

Ａｓｐ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ Ｔｒｐ　　Ａｒｇ　Ｔｈｒ Ｐｈｅ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｔ Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒ。

Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ Ｇｌｎ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ Ａｓｐ　　Ａｌａ　　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒ。

Ｇｉｎ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　ＡｌａＶａｌ　　Ｇｉ
ｎ　　Ｌｅｕ　　ＴｈｒＴｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｎ Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｖ−ａｌ Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｇ１１ｌ Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ Ａｓｐ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ １１ｅ　　Ｇｉｎ　　Ａｒｇ Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　Ｔｙｒ Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ １１ｅ　　Ａｓｐ　　Ａｌａ Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ Ａｒｇ　Ａｌａ　　Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｒ。

Ｔｈｒ １ｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ １ｅ Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ｌ
ｙｓ　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

ＧＪｙ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　ＡｒｇＰｒｏ　
　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　
　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　１ｉｅＴｈｒ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　Ｔｈ
ｒ　　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒｌｌｅ　Ｔｙｒ　　Ｖａ
ｌ　　Ｉｌｅ　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　
Ａｓｎ　ＧｉｎＬｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ
　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ
　　ＬｙｓＴｈｒ　　　　　　　・　　　［Ｉ［［］で
表されるアミノ酸配列で示されることを特徴とする。

その製造方法は特願平１−１３１４５３号明細書に示さ
れており、以下具体的に説明する。

ヒトＦＮのヘパリン結合ドメインをコード・するｃＤＮ
＾断片を含むプラスミドｐＬＦ　２’４３５はバイオケ
ミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、第２５巻
、第４９３６〜４９４１頁（１９８６）に記載されてい
る、ｐＬＦ　２．４．３及び５のコード領域を連結させ
て再構築されたプラスミドである。

このプラスミドｐＬＦ　２４３５から必要なｃＯＮ＾断
片を制限酵素で切出し、５′側に開始コドンを含む合成
りＮＡを、また、３′側には、終止コドンを含む合成り
ＮＡをＤＮＡ　リガーゼで連結した後、適当な発現ベク
ターに接続することにより、ヘパリン結合ドメインの２
７１アミノ酸残基ポリペプチド（Ａｌａ１６９０４ｈｒ
１９６０）を発現するプラスミドｐＨ０１０１が構築さ
れる。

発現ベクターとしては、既存のものはすべて利用するこ
とができるが、例えばｐＬＩ［：　１１ＢＮ／ｐ［１ｃ
１１９１１　［フェブス　レターズ（ＦＢＢＳ　Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ）、第２２３巻、第１７４〜１８０頁（１９８
７）、及びその誘導体を用いることにより好結果を得る
ことができる。このプラスミドを大腸菌に導入すること
により、ヘパリン結合ポリペプチドを発現させ、その性
質を調べることができる。

２７１アミノ酸残基ポリペプチド（＾１　ａ　ｌ　６９
０Ｔｈｒ”６０）を発現するプラスミドを導入した大腸
菌Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１／
ｐ）１０１０１は微工研条寄第２２６４号（ＦＢＲＭ　
ＢＰ−２２６４）として寄託されている。

組換え体からこのヘパリン結合ポリペプチドの精製は、
例えば次のように行う。組換え大腸菌をＬ−グロス等の
培地に培養し、集菌した後、超音波処理により、菌体破
砕液を得、これを遠心分離して上清を得る。上清を透析
後、ＤＢＡＥイオン交換体のカラムを通過させ、次いで
ＣＭイオン交換体及び／又はヘパリン（ｉｉＯアガロー
ス等のアフィニティクロマトを行う。以上の操作により
、目的のポリペプチドを精製することができる。

また本発明における細胞接着ポリペプチドとヘパリン結
合ポリペプチドのキメラポリペプチドとは前記した本発
明の細胞接着ポリペプチドと直接又はメチオニンを介し
、前記した本発明のヘパリン結合ポリペプチドとが結合
したキメラポリペプチドである。

上記ポリペプチドの例としては、本発明者らが創製した
前述特願平１−１３１４５３号明細書に開示されたポリ
ペプチド（５４９アミノ酸残基ポリペプチド）があり、
遺伝子工学的手法により効率よく製造可能である。

以下に　５４９アミノ酸残基ポリペプチドに関し、詳述
する。

５４９アミノ酸残基ポリペプチド　（ｐｒｏ＋２３９Ｓ
ｅｒ　”　”−Ｍｅｔ−＾Ｉａ１６９０−ＴｈｒＩ９６
°）は下記式■：Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　５ｅｒ Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｔｙｒ Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ Ｓｅｒ　　Ｖａｔ　　Ｔｙｒ Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ ｌｉｅ　　Ａｒｇ　　Ｈｉｓ Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ Ａｒｇ　　Ａｓｎ　　５ｅｒ Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ Ｍｅｔ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ １１ｅ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　５ｅｒ Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ｖａｌ Ｇｌｕ　　Ｇｉｎ　　）ｌｉｓ Ａｒｇ　　Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｐ Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　ｌ１ｅ Ｈｉｓ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ａｒｇ Ｉｃｅ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ｖａｌ Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　１ｉｅ Ｔｈｒ、Ｔｒｐ　　Ａｌａ Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ しｙｓ　　Ａｓｎ　　（ｉｌｕ ｌｉｅ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ Ｖａｌ　　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ １（ｉｓ　　Ｐｈｅ　　５ｅｒ Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　！（ｉｓ Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　ｌ１ｅ Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

１ｙ Ｐｒ。

Ｌａｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌａｕ Ｓｅｒ Ｐｒ。

Ａｓｐ １ｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇａｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌａｕ しｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ １ｅ Ｐｒ。

Ｌｙｓ Ｐｒ。

八１ａ Ｓｅｒ １１ｅ　　Ｇｌｙ Ｐｒｏ　　Ａｒｇ Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ｐｒｏ　　Ａｌａ Ｔｈｒ　　Ｔｙｒ Ｖａｌ　　Ｇｌｎ ５ｅｒ　　Ｔｈｒ Ｇｌｙ　　Ｖａｌ Ｖａｌ　　Ｔｈｒ Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ ｒｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｐ １ｙ Ｐｒ。

Ｇｉｎ　　５ｅｒ Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ Ｔｈｒ　　Ｖａｌ Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　ｌ１ｅ Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ Ａｒｇ　　Ｇｌｙ Ｉｃｅ　　５ｅｒ Ｐｒｏ　　Ａｈａ Ｖａｌ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　Ｐｒ。

Ａｒｇ　　Ｖａｌ Ｇａｙ　　Ｐｒ。

Ａｓｐ　　Ｓｅｒ Ｍｅｔ　　Ｖａｌ Ｔｙｒ　　Ａｌａ Ｐｒｏ　　Ａｌａ Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ しｅｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｈｒ しｙｓ Ｇａｙ Ａｓｐ　　Ｌａｕ Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ｇｉｎ Ｔｈｒ　　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　　１ｉｅ Ｖａｌ　　Ｖａｌ Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ Ａｓｐ　　Ｔｈｒ Ｖａｌ　　Ｖａｌ Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　５ｅｒ Ｖａｌ　　Ｖａｔ　　Ａｌａ Ｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ｔｒｐ Ａｒｇ　　Ｔｙｒ　　Ｔｙｒ Ｇａｙ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｇａｙ Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ Ｉｃｅ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

１１ｅ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ 八ｒｇ Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ Ｓｅｒ　　Ａｌａ Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ ＬｙｓＧＩυ Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　５ｅｒ Ｇｌｕ　　Ｖａｌ しｅｕ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇａｙ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇａｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌａｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｒ。

Ｌａｕ Ｖａｌ Ａｒｇ ｌｕ ５ｎ Ｔｈｒ ｅｒ ｔｙ ｔｙ Ｐｒ。

ｅｕ ｅｕ ｅｒ １ｅ ｌａ ｒｐ ｙｒ Ｐｒ。

Ｐｒ。

ｅｕ ａｌ ａｌ ｓｐ ｒｐ ｈｅ ｉｎ ｓｐ ｉｎ ｙｒ Ｐｒ。

ｓｐ ｈｒ ｉｎ １ｅ Ｐｒ。

ｕｙ ｌｕ １ｅ ｅｒ ｌａ ｒｇ ｌｎ ｈｒ ａｌ Ｐｒ。

ｈｒ ａｌ ｌａ ｈｒ Ｐｒ。

ｉｅ ｒｇ ａｌ Ｐｒ。

＾１ａ Ｐｒ。

ｈｒ ｈｒ ａｌ Ｐｒ。

ｒｇ ｌｙ ｅｕ ａｌ Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｐｒ。

ｙｓ ｌｕ ｈｒ １ｙ ｅｕ Ｐｒ。

ｌｕ ｙｓ ｓｐ １ｅ ｅｒ ｈｒ Ａｓ口 １ｅ ｅｒ Ａｓ口 ｒｇ ｙｒ ａｌ ｌｕ ｈｒ ｙｓ ｒｇ ｈｒ ｈｒ ｌａ ｉｎ ｙｒ ｓｐ ＾ｓｐ ｓｐ Ａｓ口 ｅｒ ｌａ ｌｕ ａｌ ｌａ ｌｕ Ａｓ口 ｒｇ ｈｒ ｌｕ ａｌ ｒｇ ｈｒ ｙｒ Ａｓ口 ｌａ ｅｕ しｅｕ ｒｇ ｙｓ Ｐｒ。

ｈｒ ｙｒ Ａｓ口 ｌａ １ｅ ｈｒ Ｐｒ。

ｈｒ ｉｅ ｙｓ ＾１ａ ｅｒ ＾ｒｇ ｅｕ １ｅ Ｐｒ。

ｒｇ １ｅ ｈｒ ｉｎ ｒｇ ｈｒ ｉｅ ｌａ ｉｅ ｈｒ ｉｅ ＾ｒｇ ｈｒ ｈｅ ａｌ ｈｒ １ｙ Ｐｒ。

ｈｒ １ｅ ｙｓ ａｌ ｌｅ ｈｒ Ａｓ口 ｙｓ ｌｙ ｙｒ ｅｒ ｌａ ｅｕ ｅｒ ｌｙ ｅｒ ｒｇ ｌｙ ｙｒ ｅｒ 〔■〕 で表されるアミノ酸配列で示されることを特徴とする。

その製造方法は特願平１−１３１４５３号明細書に示さ
れており、以下具体的に説明する。

特開平１−２０６９９８号公報記載の２７９アミノ酸残
基ポリペプチド（ｐｒ０＋２３９−ＭｅｔｌＳｌｆｆ）
をコードするＤＮＡを発現ベクターに接続して得られた
プラスミドｐＴＦ　７０２１に　Ｎｃｏ　Ｉサイトを導
入して％　Ｐｒｏ””−３ｅｔ””−Ｍｅｔをコードす
るプラスミドｐＴＦ　７５２０を構築した。

前述ｐＨ０１０１からｃＤＮＡ断片を取出し、ｐＴＦ　
７５２０の翻訳領域の３′末端Ｎｃｏ　Ｉサイトに接続
することにより、ＦＮの細胞接着ドメインとヘパリン結
合ドメインとが連結した５４９アミノ酸残基ポリペプチ
ドを発現する組換え体プラスミドが得られる。

前記プラスミドにおける連結部には、Ｎｃｏ　Ｉサイト
に由来するメチオニン残基がリンカ−として含まれる。

リンカ−の有無は、本発明の効果を左右するものではな
いが、必要とあれば部位特異的変異の手法により、容易
に除去することができる。

５４９アミノ酸残基ポリペプチドを発現するプラスミド
を導入した大腸菌Ｅ！５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
ｆｌＢ　１０１／ｐＣＨ１０１は微工研条寄第２７９９
号（ＦＢＲＭＢＰ−２７９９）として寄託されている。

得られたプラスミドを大腸菌に導入し、適当な条件下に
培養することにより、目的ポリペプチドが大腸菌内に蓄
積される。

目的ポリペプチドの精製は、例えば次のように行う。組
換え大腸菌をＬ−グロス等の培地に培養し、集菌した後
、超音波処理により、菌体破砕液を得、これを遠心分離
して上清を得る。

上清を透析後、ＤＲＡＢイオン交換体のカラムを通過さ
せ、次いでＣＭイオン交換体及び／又はヘパリン−アガ
ロース等のアフィニティクロマトを行う。以上の操作に
より、目的のポリペプチドを精製することができる。

以上のようにして得られた本発明のポリペプチドを医薬
として使用する場合、必要に応じて医薬用担体と共に常
法により製剤化し、経口投与又は非経口投与すればよい
。賦形剤あるいは担体としては薬理学的に許容されるも
のが選ばれ、その種類及び組成は投与経路や投与方法に
よって異なる。例えば液状担体として水、アルコール類
若しくは大豆油、オリーブ油、ミネラル油等の動植物油
、又は合成油が用いられる。

固体担体としてマルトース、スクロースなどの糖類、ア
ミノ酸類、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロ
ース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩
などが使用される。

注射剤の場合は溶解液は生理食塩液、各種緩衝液、グル
コース、イノシトール、マンニトール、ラクトースなど
の糖類溶液、エチレングリコール、ポリエチレングリコ
ールなどのグリコール類が望ましい。またイノシトール
、マンニトール、ラクトース、スクロース等の糖類、フ
ェニルアラニン等のアミノ酸等の賦形剤と共に凍結乾燥
製剤とし、それを投与時に注射用の適当な溶剤、例えば
滅菌水、生理食塩液、ブドウ糖液、電解質溶液、アミノ
酸溶液等静脈投与用液体に溶解させて投与することもで
きる。製剤中における本発明のポリペプチドの含量は製
剤により異なるが、通常０．１〜１００重量％好ましく
は１〜９８重量％である。例えば注射液の場合には、通
常０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１０重量％の有
効成分を含むようにすることが望ましい。経口投与する
場合には前記固体担体若しくは液状担体と共に、錠剤、
カプセル剤、粉剤、顧粒剤、液剤、ドライシロップ剤等
の形態で用いられる。カプセル、顆粒、粉剤は一般に５
〜１００重量％、好ましくは２５〜９８重量％の有効成
分を含む。

投与量は、患者の年令、体重、症状、治療目的等により
決定されるが治療量は一般に、非経口投与で１〜１００
■／　ｋｇ　／日、経口投与で５〜５００■／　ｋｇ　
／日である。

〔作用〕

次に本発明のポリペプチドの生理活性を実験例により示
す。

実験例１　制ガン作用 ＣＯＰ、マウス（１群１０匹）に、Ｌ５１７８Ｙ−ＭＬ
２５白血病細胞４Ｘ１０’個、又は本発明のポリペプチ
ド２５０μｇとＬ５１７８Ｙ−ＭＬ２５細胞４Ｘ１０’
個の混合物の静脈内注射を行う。

本発明のポリペプチド投与群の延命率は、各群マウス及
び対照群マウスの白血病細胞静脈内移植後の平均生存日
数より、下記式で表される。

ガン細胞の移植後２６日目における各群マウスの生存日
数、生存比（２６日目での生存マウス数／群の使用マウ
ス数）、平均生存日数、及び延命率を第１表に示す。

以上のように、本発明のポリペプチドの投与で、制ガン
効果が発現している。

実験例２　急性毒性試験 ＣＤＦ　、マウスに本発明の各種ポリペプチドを静脈内
投与した。１００　ｍｇ／　ｋｇ投与において毒性は認
められなかった。

以上本発明ポリペプチドは、以上の実験例に示した通り
、安全性に優れ、良好な制ガン効果を示すもので、各種
ガン治療において有用なものである。

〔実施例〕

次に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明
の範囲は実施例に限定されるものではない。

なお、各側において、部は重量部を意味する。

製剤例１ ２７４アミノ酸残基ポリペプチド３０部に対しＰＢＳを
加え、全量を２０００部としてこれを溶解後、ミリポア
フィルタ−ＧＳタイプを用いて除菌ろ過する。このろ液
２ｇを１０−のバイアル瓶にとり凍結乾燥し、１バイア
ルに該ポリペプチド３０■を含む凍結乾燥注射剤を得た
。

製剤例２ ２７１アミノ酸残基ポリペプチド３０部に対しＰＢＳを
加え、全量を２０００部としてこれを溶解後、ミリポア
フィルタ−ＧＳタイプを用いて除菌ろ過する。このろ液
２ｇを１０ｒｄのバイアル瓶にとり凍結乾燥し、１バイ
アルに該ポリペプチド３０■を含む凍結乾燥注射剤を得
た。

製剤例３ ５４９アミノ酸残基ポリペプチド３０部に対しＰＢＳを
加え、全量を２０００部としてこれを溶解後、ミリポア
フィルタ−ＧＳタイプを用いて除菌ろ過する。このろ液
２ｇを１０ｍ１！のバイアル瓶により凍結乾燥し、１バ
イアルに該ポリペプチド３０ｍｇを含む凍結乾燥注射剤
を得た。

製剤例４ ２７４アミノ酸残基ポリペプチド５０部、乳糖６００部
、結晶セルロース３３０部及びヒドロキシプロピルセル
ロース２０部をよく混和し、ロール型圧縮機（ローラー
コンパクタ−）を用いて圧縮し、破砕して１６〜６０メ
ツシユの間に入るように篩過し、顆粒とした。

製剤例５ ２７１アミノ酸残基ポリペプチド５０部、乳糖６００部
、結晶セルロース３３０部及びヒドロキシプロピルセル
ロース２０部をよ＜混和し、ロール型圧縮機（ローラー
コンパクター）を用いて圧縮し、破砕して１６〜６０メ
ツシユの間に入るように篩過し、顆粒とした。

製剤例６ ５４９アミノ酸残基ポリペプチド５０部、乳糖６００部
、結晶セルロース３３０部及びヒドロキシプロピルセル
ロース２０部をよく混和し、ロール型圧縮機（ローラー
コンパクター）を用いて圧縮し、破砕して１６〜６０メ
ツシユの間に入るように篩過し、顆粒とした。

〔発明の効果〕。

本発明のポリペプチドは生体内関連物質であり安全性が
高く、制ガン剤として有用である。

また遺伝子工学的に大量に供給可能である点で顕著な効
果を有する。

手続補正書（自発） 平成２年８月２８　日 特許庁長官　　植　松　　　敏　殿

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記一般式 I ： Ｙ−（Ｍｅｔ）＿ｎ−Ｚ・・・〔 I 〕 （式中、ＹはＨ−又はフィブロネクチン分子中の細胞接
   着ポリペプチド、ｎは０又は１、Ｚは−ＯＨ又はフィブ
   ロネクチン分子中のヘパリン結合ポリペプチドを示すが
   、Ｙ及びＺの少なくとも一方は当該ポリペプチドである
   ）で表される化合物を含有していることを特徴とする制
   ガン剤。