JPH0462301B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0462301B2 JPH0462301B2 JP60079428A JP7942885A JPH0462301B2 JP H0462301 B2 JPH0462301 B2 JP H0462301B2 JP 60079428 A JP60079428 A JP 60079428A JP 7942885 A JP7942885 A JP 7942885A JP H0462301 B2 JPH0462301 B2 JP H0462301B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- urokinase
- precursor
- urokinase precursor
- albumin
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明はウロキナーゼ前駆体乾燥製剤に関す
る。 〔従来の技術〕 ヒト腎細胞から分泌されるウロキナーゼ前駆体
は、それ自身ではウロキナーゼ活性を発現しない
が、プラスミン等のプロテイナーゼの作用を受け
ると著しいウロキナーゼ活性を発現する。 ウロキナーゼ前駆体は、フイブリンに対する親
和性が高く、血漿中のフイブリンノーゲンに作用
（分解）することなく、血栓を構成するフイブリ
ンに到達し、血栓中の微量のプラスミンの作用に
よりウロキナーゼ活性を発現する。 即ち、ウロキナーゼ前駆体は血栓部位に限定し
た線溶を惹起させ、選択的かつ効率的に血栓を溶
解する特性を有するため、新規な血管栓塞疾患の
治療剤として有望視されている。 ところで、ウロキナーゼ前駆体は粗製段階及び
精製過程の高濃度中性溶媒中に保たれておれば比
較的安定であるが高度精製された状態あるいは
（凍結）乾燥した状態では不安定である。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的はウロキナーゼ前駆体の安定化を
はかることにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、本目的を解決すべく鋭意研究を
重ねた結果、無機塩及び有機酸塩から選ばれる少
なくとも一種とヒト・アルブミンとを併用してウ
ロキナーゼ前駆体に添加することによつて、ウロ
キナーゼ前駆体が相乗的に安定化しているという
新知見を得て本発明を完成した。 即ち、本発明は、ウロキナーゼ前駆体を主成分
とし、安定化剤として無機塩及び有機酸塩から選
ばれる少なくとも一種類の塩及びヒト・アルブミ
ンを添加することを特徴とするウロキナーゼ前駆
体乾燥製剤である。 （ウロキナーゼ前駆体） 本発明で用いられるウロキナーゼ前駆体とは、
尿及び人腎細胞及び遺伝子工学によつて得られる
ものが例示される（特願昭58−170354号参照）。 本発明で用いられるウロキナーゼ前駆体は高度
精製されたものにおいて特に効果が著しい。 たとえば、比活性100000IUmg蛋白の濃度が例
示される〔なお、IUはUKの国際単位の略であ
る。前駆体１mlをプラスミン処理した時ののUK
活性に相当する1IU／mlは前駆体溶液１mlをプラ
スミン処理した時に、UK1IUと同等の活性を有
することを意味する。以下同様〕。 （安定化剤） 本発明で使用される無機塩としては、たとえば
ハロゲンのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩、リン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩などが例示される。 好適には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リ
ン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシ
ウムがあげられる。 有機酸としては、水酸基を有していてもよい脂
肪族カルボン酸が好ましく、そのカルボキシル基
は１〜３個が、また水酸基は０〜３個が好まし
い。 かかる有機酸としては、たとえばクエン酸など
のオキシ酸、シユウ酸などの脂肪族ジカルボン
酸、酢酸、マンデル酸などの脂肪酸が好適に例示
される。 これら有機酸の塩としては、アルカリ金属塩ナ
トリウム、カリウムが例示される。 本発明に使用されるアルブミンは抗原性の問題
からヒト由来のアルブミンであることが好まし
く、それらは医療用に精製されたものであれば特
に制限はない。その純度は、電気泳動で分析して
80％以上がアルブミンであるものが好ましい。ヒ
ト由来アルブミンを得る方法としては、エタノー
ル分画法（特公昭47−2869、特公昭35−5297）、
有機酸の存在下で加熱する方法（特公昭43−
1604、特公昭51−40132）等が例示される。特に
好ましくはアルブミンを加熱処理（好ましくは、
60℃、10時間程度）して肝炎ウイルス等不活化処
理を行なつたものが使用される。 （安定化剤の添加量） 安定化剤は、ウロキナーゼ前駆体10000IU〜
250000IUに対してヒトアルブミンは、10〜50mg
に相当する割合で、また無機塩又は／及び有機酸
塩は５〜30mgに相当する割合で添加される。 〔発明の効果〕 本発明において、前記安定化剤は、ウロキナー
ゼ前駆体の精製時、製剤の保存時などウロキナー
ゼ前駆体が不活性化されうる条件下に置かれる任
意の時期に添加され効果を発揮する。 〔実施例〕 以下の実験例及び実施例において、本発明をよ
り明確に説明する。 なお、ウロキナーゼ前駆体の活性は、プラスミ
ンにより活性化後合成基質（Glt−Gly−Arg−
MCA）を用い測定した。 実験例 １ 0.10Mリン酸緩衝液を溶媒とした精製ウロキナ
ーゼ前駆体（比活性135000IU／mgは溶液に同緩
衝液を溶媒としたヒトアルブミンを加え、ヒトア
ルブミン20mg／mlを含むウロキナーゼ前駆体溶液
25000IU／mlを調製した。この溶液に各種添加物
（無機塩、有機酸塩）を総量８mg／ml加え、凍結
乾燥した。対照としては精製ウロキナーゼ前駆体
溶液に何も添加しないもの及びヒトアルブミンの
みを添加したものを同様に冷凍乾燥したものを用
いた。 これらを凍結乾燥直後と50℃で３箇月間保存し
た後、残存ウロキナーゼ前駆体力価（％）を測定
し、その結果を第１表に示した。
る。 〔従来の技術〕 ヒト腎細胞から分泌されるウロキナーゼ前駆体
は、それ自身ではウロキナーゼ活性を発現しない
が、プラスミン等のプロテイナーゼの作用を受け
ると著しいウロキナーゼ活性を発現する。 ウロキナーゼ前駆体は、フイブリンに対する親
和性が高く、血漿中のフイブリンノーゲンに作用
（分解）することなく、血栓を構成するフイブリ
ンに到達し、血栓中の微量のプラスミンの作用に
よりウロキナーゼ活性を発現する。 即ち、ウロキナーゼ前駆体は血栓部位に限定し
た線溶を惹起させ、選択的かつ効率的に血栓を溶
解する特性を有するため、新規な血管栓塞疾患の
治療剤として有望視されている。 ところで、ウロキナーゼ前駆体は粗製段階及び
精製過程の高濃度中性溶媒中に保たれておれば比
較的安定であるが高度精製された状態あるいは
（凍結）乾燥した状態では不安定である。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的はウロキナーゼ前駆体の安定化を
はかることにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、本目的を解決すべく鋭意研究を
重ねた結果、無機塩及び有機酸塩から選ばれる少
なくとも一種とヒト・アルブミンとを併用してウ
ロキナーゼ前駆体に添加することによつて、ウロ
キナーゼ前駆体が相乗的に安定化しているという
新知見を得て本発明を完成した。 即ち、本発明は、ウロキナーゼ前駆体を主成分
とし、安定化剤として無機塩及び有機酸塩から選
ばれる少なくとも一種類の塩及びヒト・アルブミ
ンを添加することを特徴とするウロキナーゼ前駆
体乾燥製剤である。 （ウロキナーゼ前駆体） 本発明で用いられるウロキナーゼ前駆体とは、
尿及び人腎細胞及び遺伝子工学によつて得られる
ものが例示される（特願昭58−170354号参照）。 本発明で用いられるウロキナーゼ前駆体は高度
精製されたものにおいて特に効果が著しい。 たとえば、比活性100000IUmg蛋白の濃度が例
示される〔なお、IUはUKの国際単位の略であ
る。前駆体１mlをプラスミン処理した時ののUK
活性に相当する1IU／mlは前駆体溶液１mlをプラ
スミン処理した時に、UK1IUと同等の活性を有
することを意味する。以下同様〕。 （安定化剤） 本発明で使用される無機塩としては、たとえば
ハロゲンのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩、リン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩などが例示される。 好適には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リ
ン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシ
ウムがあげられる。 有機酸としては、水酸基を有していてもよい脂
肪族カルボン酸が好ましく、そのカルボキシル基
は１〜３個が、また水酸基は０〜３個が好まし
い。 かかる有機酸としては、たとえばクエン酸など
のオキシ酸、シユウ酸などの脂肪族ジカルボン
酸、酢酸、マンデル酸などの脂肪酸が好適に例示
される。 これら有機酸の塩としては、アルカリ金属塩ナ
トリウム、カリウムが例示される。 本発明に使用されるアルブミンは抗原性の問題
からヒト由来のアルブミンであることが好まし
く、それらは医療用に精製されたものであれば特
に制限はない。その純度は、電気泳動で分析して
80％以上がアルブミンであるものが好ましい。ヒ
ト由来アルブミンを得る方法としては、エタノー
ル分画法（特公昭47−2869、特公昭35−5297）、
有機酸の存在下で加熱する方法（特公昭43−
1604、特公昭51−40132）等が例示される。特に
好ましくはアルブミンを加熱処理（好ましくは、
60℃、10時間程度）して肝炎ウイルス等不活化処
理を行なつたものが使用される。 （安定化剤の添加量） 安定化剤は、ウロキナーゼ前駆体10000IU〜
250000IUに対してヒトアルブミンは、10〜50mg
に相当する割合で、また無機塩又は／及び有機酸
塩は５〜30mgに相当する割合で添加される。 〔発明の効果〕 本発明において、前記安定化剤は、ウロキナー
ゼ前駆体の精製時、製剤の保存時などウロキナー
ゼ前駆体が不活性化されうる条件下に置かれる任
意の時期に添加され効果を発揮する。 〔実施例〕 以下の実験例及び実施例において、本発明をよ
り明確に説明する。 なお、ウロキナーゼ前駆体の活性は、プラスミ
ンにより活性化後合成基質（Glt−Gly−Arg−
MCA）を用い測定した。 実験例 １ 0.10Mリン酸緩衝液を溶媒とした精製ウロキナ
ーゼ前駆体（比活性135000IU／mgは溶液に同緩
衝液を溶媒としたヒトアルブミンを加え、ヒトア
ルブミン20mg／mlを含むウロキナーゼ前駆体溶液
25000IU／mlを調製した。この溶液に各種添加物
（無機塩、有機酸塩）を総量８mg／ml加え、凍結
乾燥した。対照としては精製ウロキナーゼ前駆体
溶液に何も添加しないもの及びヒトアルブミンの
みを添加したものを同様に冷凍乾燥したものを用
いた。 これらを凍結乾燥直後と50℃で３箇月間保存し
た後、残存ウロキナーゼ前駆体力価（％）を測定
し、その結果を第１表に示した。
【表】
実験例 ２
実験例１と同様にしてヒトアルブミンとクエン
酸ナトリウム及び食塩を種々の割合で混合し、凍
結乾燥品を作成した。 これらを凍結乾燥直後と50℃１箇月間保存した
後、残存ウロキナーゼ前駆体力価（％）を測定し
た。結果は第２表に示すとおりである。
酸ナトリウム及び食塩を種々の割合で混合し、凍
結乾燥品を作成した。 これらを凍結乾燥直後と50℃１箇月間保存した
後、残存ウロキナーゼ前駆体力価（％）を測定し
た。結果は第２表に示すとおりである。
【表】
第１表及び第２表中に示した力価は、前記処理
を行う前の力価を100とした場合に対する残存活
性である。 実施例 １ 精製ウロキナーゼ前駆体（比活性135000IU／
mg蛋白）25000IUヒトアルブミン20mg、クエン酸
ナトリウム6.4mgをPH7.0、0.1Mリン酸緩衝液１ml
に溶解し、無菌ろ過後、バイアル瓶に充填し、凍
結乾燥し、製剤中ヒトアルブミン20mg、クエン酸
ナトリウム6.4mg含有するウロキナーゼ前駆体
25000単位の注射剤を得た。 実施例 ２ 実施例１と同様に操作し、製剤中ヒトアルブミ
ン20mg、食塩6.4mgを含有するウロキナーゼ前駆
体25000IUの製剤を得た。 実施例 ３ 精製ウロキナーゼ前駆体（比活性135000IU／
mg蛋白）50000IU、ヒトアルブミン40mg、クエン
酸ナトリウム12.8mgを実施例１と同様に操作し、
製剤中ヒトアルブミン40mg、クエン酸ナトリウム
12.8mgを含有するウロキナーゼ前駆体50000IUの
製剤を得た。 ＜参考例：製造例＞ 培養人腎細胞を0.1％ヒト血清アルブミン添加
無血清培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離
し、その上清を凍結して保存した。プールした培
養上清をPH5.5に調整した後、CM−Sephadex Ｃ
−50に接触した。0.16Mリン酸緩衝液（PH5.5）
でカラムを洗浄した後、0.16Mリン酸緩衝液（PH
8.5）で吸着していた本ウロキナーゼ前駆体を溶
出させた。 一方、本ウロキナーゼ前駆体で予め免疫してお
いたマウスBALB／ｃの脾臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞をポリエチレングリコールにより融合
させたハイブリドーマのうち、本ウロキナーゼ前
駆体に対する抗体産生の高いクローンを選択し
た。この融合細胞の培養液から、抗ウロキナーゼ
モノクローナル抗体を回収した。このモノクロー
ナル抗体をBrCN活性化Sepharose4B
（Pharmacia社）に固定した。 このモノクローナル抗体カラムを0.4MNaCl含
有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化し、これ
に前記の本ウロキナーゼ前駆体を含有する溶出液
を接触した。0.4MNaCl含有0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）でカラムを洗浄した後、吸着していた本
ウロキナーゼ前駆体を0.5MNaCl含有0.2Mグリシ
ン−HCl水溶液（PH2.5）で溶出させた。溶出液
を中和後、抗マウスIgGウサギIgGを固定化した
担体を通過し漏出してくる極く微量のマウスIgG
を除去した。通過液を除菌過した後、凍結乾燥
し比活性が少なくとも80000IU／mgの高度精製本
ウロキナーゼ前駆体を得た。 なお、この精製品はSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により分子量５万の１本の帯を示
した。
を行う前の力価を100とした場合に対する残存活
性である。 実施例 １ 精製ウロキナーゼ前駆体（比活性135000IU／
mg蛋白）25000IUヒトアルブミン20mg、クエン酸
ナトリウム6.4mgをPH7.0、0.1Mリン酸緩衝液１ml
に溶解し、無菌ろ過後、バイアル瓶に充填し、凍
結乾燥し、製剤中ヒトアルブミン20mg、クエン酸
ナトリウム6.4mg含有するウロキナーゼ前駆体
25000単位の注射剤を得た。 実施例 ２ 実施例１と同様に操作し、製剤中ヒトアルブミ
ン20mg、食塩6.4mgを含有するウロキナーゼ前駆
体25000IUの製剤を得た。 実施例 ３ 精製ウロキナーゼ前駆体（比活性135000IU／
mg蛋白）50000IU、ヒトアルブミン40mg、クエン
酸ナトリウム12.8mgを実施例１と同様に操作し、
製剤中ヒトアルブミン40mg、クエン酸ナトリウム
12.8mgを含有するウロキナーゼ前駆体50000IUの
製剤を得た。 ＜参考例：製造例＞ 培養人腎細胞を0.1％ヒト血清アルブミン添加
無血清培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離
し、その上清を凍結して保存した。プールした培
養上清をPH5.5に調整した後、CM−Sephadex Ｃ
−50に接触した。0.16Mリン酸緩衝液（PH5.5）
でカラムを洗浄した後、0.16Mリン酸緩衝液（PH
8.5）で吸着していた本ウロキナーゼ前駆体を溶
出させた。 一方、本ウロキナーゼ前駆体で予め免疫してお
いたマウスBALB／ｃの脾臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞をポリエチレングリコールにより融合
させたハイブリドーマのうち、本ウロキナーゼ前
駆体に対する抗体産生の高いクローンを選択し
た。この融合細胞の培養液から、抗ウロキナーゼ
モノクローナル抗体を回収した。このモノクロー
ナル抗体をBrCN活性化Sepharose4B
（Pharmacia社）に固定した。 このモノクローナル抗体カラムを0.4MNaCl含
有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化し、これ
に前記の本ウロキナーゼ前駆体を含有する溶出液
を接触した。0.4MNaCl含有0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）でカラムを洗浄した後、吸着していた本
ウロキナーゼ前駆体を0.5MNaCl含有0.2Mグリシ
ン−HCl水溶液（PH2.5）で溶出させた。溶出液
を中和後、抗マウスIgGウサギIgGを固定化した
担体を通過し漏出してくる極く微量のマウスIgG
を除去した。通過液を除菌過した後、凍結乾燥
し比活性が少なくとも80000IU／mgの高度精製本
ウロキナーゼ前駆体を得た。 なお、この精製品はSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により分子量５万の１本の帯を示
した。
Claims (1)
- １ ウロキナーゼ前駆体を主成分とし、安定化剤
として無機塩及び有機酸塩から選ばれる少なくと
も一種類の塩及びヒト・アルブミンを添加するこ
とを特徴とするウロキナーゼ前駆体乾燥製剤。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60079428A JPS61238731A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ウロキナーゼ前駆体乾燥製剤 |
| KR1019860002879A KR940003056B1 (ko) | 1985-04-16 | 1986-04-15 | 우로키나제 전구체를 안정화시키는 방법 |
| CA000506647A CA1336585C (en) | 1985-04-16 | 1986-04-15 | Method of stabilizing urokinase precursor and dry preparation containing said precursor |
| EP86105235A EP0200966B1 (en) | 1985-04-16 | 1986-04-16 | Method of stabilizing urokinase precursor and dry preparation containing said precursor |
| ES554477A ES8706821A1 (es) | 1985-04-16 | 1986-04-16 | Metodo de estabilizar un precursor de uroquinasa |
| DE86105235T DE3688713T2 (de) | 1985-04-16 | 1986-04-16 | Verfahren zur Stabilisierung eines Urokinasevorläufers und diesen Vorläufer enthaltendes trockenes Präparat. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60079428A JPS61238731A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ウロキナーゼ前駆体乾燥製剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61238731A JPS61238731A (ja) | 1986-10-24 |
| JPH0462301B2 true JPH0462301B2 (ja) | 1992-10-05 |
Family
ID=13689601
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60079428A Granted JPS61238731A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ウロキナーゼ前駆体乾燥製剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61238731A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63174934A (ja) * | 1987-01-13 | 1988-07-19 | Green Cross Corp:The | ウロキナ−ゼ前駆体乾燥製剤 |
| JPS63208534A (ja) * | 1987-02-23 | 1988-08-30 | Green Cross Corp:The | 線維素溶解剤 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59139323A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-10 | Green Cross Corp:The | ウロキナ−ゼ乾燥製剤 |
-
1985
- 1985-04-16 JP JP60079428A patent/JPS61238731A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61238731A (ja) | 1986-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5854403A (en) | Method for isolation of highly pure von Willebrand Factor | |
| JP5025868B2 (ja) | 可逆的に不活性な酸性化プラスミン組成物の調製法 | |
| CA1329760C (en) | Plasma and recombinant protein formulations in high ionic strength media | |
| US5605884A (en) | Factor VIII formulations in high ionic strength media | |
| EP0217379A2 (en) | Thrombolytic composition and a process for production thereof | |
| JP3976351B2 (ja) | 免疫寛容プロトロンビン複合体の調製 | |
| JP2764264B2 (ja) | 線溶活性増強剤 | |
| FI119677B (fi) | Prokoagulantin ja sytokiinin käyttö | |
| KR940003056B1 (ko) | 우로키나제 전구체를 안정화시키는 방법 | |
| JPH02268681A (ja) | ウロキナーゼ前駆体の安定化方法及び乾燥製剤 | |
| US5075230A (en) | Stabilized plasminogen activator precursor and method of producing the same | |
| JPH0462302B2 (ja) | ||
| JPH0462301B2 (ja) | ||
| EP0139447B1 (en) | A process for preparing urokinase zymogen | |
| KR20140058721A (ko) | 고순도 히알루로니다아제의 정제방법 | |
| JPH0480010B2 (ja) | ||
| JPH0647555B2 (ja) | フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体含有血栓溶解剤 | |
| JPS6062981A (ja) | 線維素溶解酵素 | |
| JP2849922B2 (ja) | プラスミノーゲン活性化因子含有液状組成物 | |
| JPH0421647B2 (ja) | ||
| JPH0150209B2 (ja) | ||
| JPH03130231A (ja) | 医薬製剤 | |
| JPS62283932A (ja) | 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タの乾燥製剤 | |
| JPH0625011A (ja) | ヒト尿性トリプシンインヒビター含有液状製剤及びその製造方法 | |
| JPH0753403A (ja) | ウロキナーゼ前駆体の加熱処理方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |