JPH04639B2 - - Google Patents
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- JPH04639B2 JPH04639B2 JP14964583A JP14964583A JPH04639B2 JP H04639 B2 JPH04639 B2 JP H04639B2 JP 14964583 A JP14964583 A JP 14964583A JP 14964583 A JP14964583 A JP 14964583A JP H04639 B2 JPH04639 B2 JP H04639B2
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ又
はグルコアミラーゼの活性の測定方法に関するも
のである。 更に詳細には、本発明は、だ液、血液、植物等
の検体中に存在するα−アミラーゼなどのアミラ
ーゼ活性をそのまま直接措定する方法に関するも
のである。 従来、生体に由来するだ液、血液等の検体中に
存在するα−アミラーゼ等の活性を測定するには
まず検体中にすでに存在しているマルトース、グ
ルコースを透析処理や樹脂による吸着処理をして
除去するか、又はあらかじめ検体の盲検を行い検
体のα−アミラーゼ活性を測定していた。しかし
ながら検体の透析処理は煩雑な上に検体が希釈さ
れる欠点があり、樹脂による吸着処理も、グルコ
ースは吸着分離されるがα−アミラーゼ自体も、
吸着されることがあつていずれも好ましくない。
また検体を盲検する方法は二度手間がかかる上に
検体量が少ない場合は測定できないことになつて
好ましいものではなかつた。 本発明者らは、アミラーゼ含有検体から直接ア
ミラーゼ活性を測定する方法を求めて鋭意研究し
た結果、直接アミラーゼ活性を測定するのに障害
となるグルコースおよび／またはマルトースを検
体中でグルコノ−δ−ラクトンおよび／またはグ
ルコース−グルコノ−δ−ラクトンに変化させる
ことによつて解決することができた。 本発明は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ又
はグルコアミラーゼを含有する検体に、アルカリ
性域で、グルコース脱水素酵素および／またはマ
ルトース脱水素酵素とNAD+および／または
NADP+を添加し、検体中に存在するグルコース
および／またはマルトースをグルコノ−δ−ラク
トンおよび／またはグルコース−グルコノ−δ−
ラクトンに変化させ、次いで検体のPHを中性域に
戻し、過剰量のアミラーゼ反応基質を添加し、ア
ミラーゼ活性を測定することを特徴とするアミラ
ーゼ活性測定法である。 本発明の特色とするところは、検体中にすでに
存在するマルトースおよび／またはグルコースを
アルカリ性域で活性を発現し、中性付近ではほと
んど活性を発現しないアルカロフイリツクなグル
コース脱水素酵素および／またはマルトース脱水
素酵素によリグルコノ−δ−ラクトンおよび／ま
たはグルコース−グルコノ−δ−ラクトンに変化
せしめ、PHを中性に戻し、過剰量の澱粉、デキス
トリン、アミロース、アミロペクチン、オリゴ糖
又はそれらの誘導体から選ばれた一種又は二種以
上を基質として用いてアミラーゼ活性を測定する
方法である。 本発明のアミラーゼ活性測定法によれば検体中
にすでに存在するマルトース、グルコースを前も
つて消費させてしまつているので同一検体でその
まま添加したアミラーゼ用基質などからグルコー
スを生成させ、直接生成するグルコース含量をア
ミラーゼによつて分解されたグルコースとして測
定することができるので、アミラーゼ活性は正確
に測定することができることになるのである。 本発明のアミラーゼ活性の測定法はだ液、血
液、スイ液、尿などのα−アミラーゼ活性、血液
中のグルコアミラーゼ活性、植物組織中のβ−ア
ミラーゼ活性、その他α−アミラーゼ、β−アミ
ラーゼ又はグルコアミラーゼ含有検体の測定に用
いられる。 普通、これらの検体には、すでに微量のマルト
ース、グルコースがたえず存在しているため直接
グルコース生成反応によつて測定すると各アミラ
ーゼの活性が微量のマルトースおよび／またはグ
ルコースを付加して測定されてしまうので正確な
力価が得られなかつたものである。 本発明では、あらかじめ微量のグルコースおよ
び／またはマルトースをグルコノ−δ−ラクトン
および／またはグルコース−グルコノ−δ−ラク
トンに変化させているので、アミラーゼ活性測定
時に生成するグルコースの定量に関与することな
く、そこに生成するグルコースの量は正確にアミ
ラーゼの活性として測定されるものである。 本発明において使用するグルコース脱水素酵素
およびマルトース脱水素酵素はアルカリ域、例え
ばPH＝９〜11以上で活性を発現し、中性では活性
を示さない。従つてグルコース脱水素酵素およ
び／またはマルトース脱水素酵素を用いてアルカ
リ域でグルコースおよび／またはマルトースを消
費させた後、検体を中性に戻しておけば、両酵素
は生成するグルコースには何ら作用することはな
い。 本発明に用いるグルコース脱水素酵素および／
またはマルトース脱水素酵素としては、従来知ら
れたこれら酵素を広く使用することができる。好
ましいのは、アルカリ性菌のコリネバクテリウム
属菌の生産するグルコース脱水素酵素および／ま
たはマルトース脱水素酵素がよい。この酵素は単
一の酵素でありながら、グルコースとマルトース
に同時に作用して、グルコノ−δ−ラクトンとグ
ルコース−グルコノ−δ−ラクトンに変換するこ
とができる酵素である。 本発明においては、まず、検体にPH＝10程度の
緩衝液が加えられるが、この緩衝液にはグルコー
ス脱水素酵素および／またはマルトース脱水素酵
素とNAD+および／またはNADP+を添加してお
くのがよい。 NAD+および／またはNADP+はグルコース脱
水素酵素および／またはマルトース脱水素酵素の
補酵素として作用し、グルコースおよび／または
マルトースを酸化し、NADHおよび／または
NADPHに変化する。 検体中のグルコースおよび／またはマルトース
の消費は25℃程度に加温し、340mmの吸光度の変
化がある間は反応を続け、変化が終了したら停止
する。 検体中のグルコースおよび／またはマルトース
がすべてグルコノ−δ−ラクトンおよび／または
グルコース−グルコノ−δ−ラクトンに変化した
後は、検体のPHを中性域にもどし、α−アミラー
ゼ、β−アミラーゼ、又はグルコアミラーゼの活
性を測定することができる。 α−アミラーゼの活性を測定する場合の測定系
としては、グルコースおよび／またはマルトース
の消費後添加したグルカン又はその誘導体の基質
より生じたマルトースをグルコースに変換せしめ
た後グルコースを定量しうる測定系であればよ
い。たとえばそのような系としては、グルカン又
はそと誘導体とマルターゼ、ヘキソキナーゼ、グ
ルコース６燐酸脱水素酵素とATPおよびNAD+
又はNADP+を添加して、生成するNADH又は
NADPHの量によつてアミラーゼ活性を測定す
る方法がある。また、同様にグルコースおよびマ
ルトースを消費した後マルターゼ、ムタロター
ゼ、グルコースオキシターゼ、ペルオキシター
ゼ、４−アミノアンチピリン、およびフエノール
を添加し、キノン色素の発色の量によりアミラー
ゼ活性を測定する方法、および、その他に、アミ
ラーゼの作用により生成したマルトースをグルコ
ースへ変換し、そのグルコースを定量する系であ
ればいずれでもよい。 またβ−アミラーゼ活性の測定もα−アミラー
ゼ活性の測定と同様に行なうことができる。そし
てグルコアミラーゼの測定はマルターゼを必要と
しないほかはα−アミラーゼと全く同様に測定す
ることができるものである。 このように本発明は、アミラーゼ活性の測定に
おいて、前もつて検体中のマルトース、グルコー
スを消費せしめたために、引続き同一検体で直接
アミラーゼ活性の測定を可能としたもので、アミ
ラーゼ活性の自動分析にきわめて適した方法を提
供するものである。 次に、本発明の試験例及び実施例を示す。 試験例 37℃におけるだ液および膵液アミラーゼのPH10
での安定性だ液および膵液アミラーゼを約6u／
mlになるように10ｍＭグリシン緩衝液（PH10）で
希釈し37℃のウオーターバスでインキニベーシヨ
ンし各時間毎に活性を測定した。 その結果は次の表１に示されるが、この表から
明らかなように、α−アミラーゼが一時的にPH＝
10の条件下にあつても、ほとんど活性に変化のな
いことが分る。
はグルコアミラーゼの活性の測定方法に関するも
のである。 更に詳細には、本発明は、だ液、血液、植物等
の検体中に存在するα−アミラーゼなどのアミラ
ーゼ活性をそのまま直接措定する方法に関するも
のである。 従来、生体に由来するだ液、血液等の検体中に
存在するα−アミラーゼ等の活性を測定するには
まず検体中にすでに存在しているマルトース、グ
ルコースを透析処理や樹脂による吸着処理をして
除去するか、又はあらかじめ検体の盲検を行い検
体のα−アミラーゼ活性を測定していた。しかし
ながら検体の透析処理は煩雑な上に検体が希釈さ
れる欠点があり、樹脂による吸着処理も、グルコ
ースは吸着分離されるがα−アミラーゼ自体も、
吸着されることがあつていずれも好ましくない。
また検体を盲検する方法は二度手間がかかる上に
検体量が少ない場合は測定できないことになつて
好ましいものではなかつた。 本発明者らは、アミラーゼ含有検体から直接ア
ミラーゼ活性を測定する方法を求めて鋭意研究し
た結果、直接アミラーゼ活性を測定するのに障害
となるグルコースおよび／またはマルトースを検
体中でグルコノ−δ−ラクトンおよび／またはグ
ルコース−グルコノ−δ−ラクトンに変化させる
ことによつて解決することができた。 本発明は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ又
はグルコアミラーゼを含有する検体に、アルカリ
性域で、グルコース脱水素酵素および／またはマ
ルトース脱水素酵素とNAD+および／または
NADP+を添加し、検体中に存在するグルコース
および／またはマルトースをグルコノ−δ−ラク
トンおよび／またはグルコース−グルコノ−δ−
ラクトンに変化させ、次いで検体のPHを中性域に
戻し、過剰量のアミラーゼ反応基質を添加し、ア
ミラーゼ活性を測定することを特徴とするアミラ
ーゼ活性測定法である。 本発明の特色とするところは、検体中にすでに
存在するマルトースおよび／またはグルコースを
アルカリ性域で活性を発現し、中性付近ではほと
んど活性を発現しないアルカロフイリツクなグル
コース脱水素酵素および／またはマルトース脱水
素酵素によリグルコノ−δ−ラクトンおよび／ま
たはグルコース−グルコノ−δ−ラクトンに変化
せしめ、PHを中性に戻し、過剰量の澱粉、デキス
トリン、アミロース、アミロペクチン、オリゴ糖
又はそれらの誘導体から選ばれた一種又は二種以
上を基質として用いてアミラーゼ活性を測定する
方法である。 本発明のアミラーゼ活性測定法によれば検体中
にすでに存在するマルトース、グルコースを前も
つて消費させてしまつているので同一検体でその
まま添加したアミラーゼ用基質などからグルコー
スを生成させ、直接生成するグルコース含量をア
ミラーゼによつて分解されたグルコースとして測
定することができるので、アミラーゼ活性は正確
に測定することができることになるのである。 本発明のアミラーゼ活性の測定法はだ液、血
液、スイ液、尿などのα−アミラーゼ活性、血液
中のグルコアミラーゼ活性、植物組織中のβ−ア
ミラーゼ活性、その他α−アミラーゼ、β−アミ
ラーゼ又はグルコアミラーゼ含有検体の測定に用
いられる。 普通、これらの検体には、すでに微量のマルト
ース、グルコースがたえず存在しているため直接
グルコース生成反応によつて測定すると各アミラ
ーゼの活性が微量のマルトースおよび／またはグ
ルコースを付加して測定されてしまうので正確な
力価が得られなかつたものである。 本発明では、あらかじめ微量のグルコースおよ
び／またはマルトースをグルコノ−δ−ラクトン
および／またはグルコース−グルコノ−δ−ラク
トンに変化させているので、アミラーゼ活性測定
時に生成するグルコースの定量に関与することな
く、そこに生成するグルコースの量は正確にアミ
ラーゼの活性として測定されるものである。 本発明において使用するグルコース脱水素酵素
およびマルトース脱水素酵素はアルカリ域、例え
ばPH＝９〜11以上で活性を発現し、中性では活性
を示さない。従つてグルコース脱水素酵素およ
び／またはマルトース脱水素酵素を用いてアルカ
リ域でグルコースおよび／またはマルトースを消
費させた後、検体を中性に戻しておけば、両酵素
は生成するグルコースには何ら作用することはな
い。 本発明に用いるグルコース脱水素酵素および／
またはマルトース脱水素酵素としては、従来知ら
れたこれら酵素を広く使用することができる。好
ましいのは、アルカリ性菌のコリネバクテリウム
属菌の生産するグルコース脱水素酵素および／ま
たはマルトース脱水素酵素がよい。この酵素は単
一の酵素でありながら、グルコースとマルトース
に同時に作用して、グルコノ−δ−ラクトンとグ
ルコース−グルコノ−δ−ラクトンに変換するこ
とができる酵素である。 本発明においては、まず、検体にPH＝10程度の
緩衝液が加えられるが、この緩衝液にはグルコー
ス脱水素酵素および／またはマルトース脱水素酵
素とNAD+および／またはNADP+を添加してお
くのがよい。 NAD+および／またはNADP+はグルコース脱
水素酵素および／またはマルトース脱水素酵素の
補酵素として作用し、グルコースおよび／または
マルトースを酸化し、NADHおよび／または
NADPHに変化する。 検体中のグルコースおよび／またはマルトース
の消費は25℃程度に加温し、340mmの吸光度の変
化がある間は反応を続け、変化が終了したら停止
する。 検体中のグルコースおよび／またはマルトース
がすべてグルコノ−δ−ラクトンおよび／または
グルコース−グルコノ−δ−ラクトンに変化した
後は、検体のPHを中性域にもどし、α−アミラー
ゼ、β−アミラーゼ、又はグルコアミラーゼの活
性を測定することができる。 α−アミラーゼの活性を測定する場合の測定系
としては、グルコースおよび／またはマルトース
の消費後添加したグルカン又はその誘導体の基質
より生じたマルトースをグルコースに変換せしめ
た後グルコースを定量しうる測定系であればよ
い。たとえばそのような系としては、グルカン又
はそと誘導体とマルターゼ、ヘキソキナーゼ、グ
ルコース６燐酸脱水素酵素とATPおよびNAD+
又はNADP+を添加して、生成するNADH又は
NADPHの量によつてアミラーゼ活性を測定す
る方法がある。また、同様にグルコースおよびマ
ルトースを消費した後マルターゼ、ムタロター
ゼ、グルコースオキシターゼ、ペルオキシター
ゼ、４−アミノアンチピリン、およびフエノール
を添加し、キノン色素の発色の量によりアミラー
ゼ活性を測定する方法、および、その他に、アミ
ラーゼの作用により生成したマルトースをグルコ
ースへ変換し、そのグルコースを定量する系であ
ればいずれでもよい。 またβ−アミラーゼ活性の測定もα−アミラー
ゼ活性の測定と同様に行なうことができる。そし
てグルコアミラーゼの測定はマルターゼを必要と
しないほかはα−アミラーゼと全く同様に測定す
ることができるものである。 このように本発明は、アミラーゼ活性の測定に
おいて、前もつて検体中のマルトース、グルコー
スを消費せしめたために、引続き同一検体で直接
アミラーゼ活性の測定を可能としたもので、アミ
ラーゼ活性の自動分析にきわめて適した方法を提
供するものである。 次に、本発明の試験例及び実施例を示す。 試験例 37℃におけるだ液および膵液アミラーゼのPH10
での安定性だ液および膵液アミラーゼを約6u／
mlになるように10ｍＭグリシン緩衝液（PH10）で
希釈し37℃のウオーターバスでインキニベーシヨ
ンし各時間毎に活性を測定した。 その結果は次の表１に示されるが、この表から
明らかなように、α−アミラーゼが一時的にPH＝
10の条件下にあつても、ほとんど活性に変化のな
いことが分る。
【表】
実施例
NAD+ 3.0nM
グルコース脱水素酵素 4u／ml
以上を含有する0.01Mグリシン−KOH緩衝液
（PH10）／mlづつを４本のチユーブに入れ、各４
本に５ｍＭグルコースを含むヒトだ液を任意の各
別濃度になるように調整した検体7μあて４部
を作り、これらを添加し、それぞれ25℃で10分間
保温した後、340nｍの吸光度で測定し、吸光度
の変化が停止したところで、300ｍＭ NaCl、30
ｍＭ MgCl2を含む200ｍＭ PIPES緩衝液（PH
７）0.15ml、及び マルターゼ 1000u／ml20μ ヘキソキナーゼ 1000u／ml3μ グルコース−６−ホスホーデヒドロゲナーゼ
1000u／ml5μ ATP 72ｍM15μ マルトペンタオース 100mg／ml10μ を添加し340nｍの吸光度の増加を約２分間追跡
し、α−アミラーゼ活性を測定した。 ４種の検体の１分間の吸光度の増加は、 Ａ＝0.264 Ｂ＝0.228 Ｃ＝0.312 Ｄ＝0.240であつ
た。 これを次式によつてα−アミラーゼ活性を算出
すると、それぞれ Ａ＝7.36 Ｂ＝6.36 Ｃ＝8.70 Ｄ＝6.69であつた。 α−アミラーゼ活性（ｕ）＝△Ｅ／6.2×1.21／0.007 （国際単位） △Ｅ＝NADHの増加による吸光度の増加 6.2＝NADHの１ｍＭの吸光係数 1.21＝全反応液量 0.007＝唾液量 ここでα−アミラーゼ1u（国際単位）とは25℃
で１分に1μmoleのマルトースを生成する活性を
いう。
（PH10）／mlづつを４本のチユーブに入れ、各４
本に５ｍＭグルコースを含むヒトだ液を任意の各
別濃度になるように調整した検体7μあて４部
を作り、これらを添加し、それぞれ25℃で10分間
保温した後、340nｍの吸光度で測定し、吸光度
の変化が停止したところで、300ｍＭ NaCl、30
ｍＭ MgCl2を含む200ｍＭ PIPES緩衝液（PH
７）0.15ml、及び マルターゼ 1000u／ml20μ ヘキソキナーゼ 1000u／ml3μ グルコース−６−ホスホーデヒドロゲナーゼ
1000u／ml5μ ATP 72ｍM15μ マルトペンタオース 100mg／ml10μ を添加し340nｍの吸光度の増加を約２分間追跡
し、α−アミラーゼ活性を測定した。 ４種の検体の１分間の吸光度の増加は、 Ａ＝0.264 Ｂ＝0.228 Ｃ＝0.312 Ｄ＝0.240であつ
た。 これを次式によつてα−アミラーゼ活性を算出
すると、それぞれ Ａ＝7.36 Ｂ＝6.36 Ｃ＝8.70 Ｄ＝6.69であつた。 α−アミラーゼ活性（ｕ）＝△Ｅ／6.2×1.21／0.007 （国際単位） △Ｅ＝NADHの増加による吸光度の増加 6.2＝NADHの１ｍＭの吸光係数 1.21＝全反応液量 0.007＝唾液量 ここでα−アミラーゼ1u（国際単位）とは25℃
で１分に1μmoleのマルトースを生成する活性を
いう。
Claims (1)
- １ α−アミラーゼ、β−アミラーゼ又はグルコ
アミラーゼを含有する検体に、アルカリ性域で、
グルコース脱水素酵素および／またはマルトース
脱水素酵素とNAD+および／またはNADP+を添
加し、検体中に存在するグルコースおよび／また
はマルトースをグルコノ−δ−ラクトンおよび／
またはグルコース−グルコノ−δ−ラクトンに変
化させ、次いで検体のPHを中性域に戻し、過剰量
のアミラーゼ反応基質を添加し、アミラーゼ活性
を測定することを特徴とするアミラーゼ活性測定
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14964583A JPS6043399A (ja) | 1983-08-18 | 1983-08-18 | アミラ−ゼ活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14964583A JPS6043399A (ja) | 1983-08-18 | 1983-08-18 | アミラ−ゼ活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6043399A JPS6043399A (ja) | 1985-03-07 |
| JPH04639B2 true JPH04639B2 (ja) | 1992-01-08 |
Family
ID=15479748
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14964583A Granted JPS6043399A (ja) | 1983-08-18 | 1983-08-18 | アミラ−ゼ活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6043399A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02212597A (ja) * | 1989-02-14 | 1990-08-23 | Mitsubishi Kakoki Kaisha Ltd | 金属加工油剤の放射線殺菌方法 |
-
1983
- 1983-08-18 JP JP14964583A patent/JPS6043399A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6043399A (ja) | 1985-03-07 |
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