JPH0469398A - 新規ペプチド、その製造方法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野］ 本発明は、下記構造を有する新規なペプチドを提供する
ものてあり、アンギオテンシン変換酵素阻害剤等として
何用なペプチドに関する。

Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−ＧｌｙＩ従来の技術
〕 アンギオテンシン変換酵素は、主として肺や血管内皮細
胞、腎近位尿細管に存在し、アノギオテンノノ１（Ａｓ
ｐ−へｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ　−１１ｅ−１１ｉｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−１１ｉｓ−Ｌｅｕ）　　に作用して、ア
ンギオテノンノＩのＣ末端よりノペプチト（Ｈｉｓ９−
　Ｌｅｕｌｏ）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有す
るアンキオテノノノ■を生成させる酵素である。また、
この酵素は生体内降圧物質であるプラノキニンを破壊し
不活化する作用も併存し、昇圧系に強力に関与している
。

従来より、アンギオテノノノ変換酵素の活性を阻害すれ
ば、降圧に働き、臨床的には高血圧症の予防、治療に有
効であると考えられている。

最近ではブロリノ誘導体であるカプトプリルか合成され
、降圧活性が確認されて以来、種々のアンギオテンシン
変換酵素阻害物質の合成研究が盛んであり、又天然物か
らの取得も試みられているところである。

天然物由来のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は食品あ
るいは食品原料から得られるので低毒性で安全性の高い
降圧剤となることか期待されるからである。

「発明が解決しようとする課題］ しかしなから、天然物中に見出されるアンキオテンノン
変換酵素阻害物質は極めてまれで、僅かにブラジル産や
日本産蛇毒より得られたテブロタイド（ノナペプチド５
Ｑ２０８８１）等や、ストレプトミセス属に属する放線
菌の代謝産物ｌ５８３（特開昭５８−１７７９２０号公
報）が知られているに過ぎない。また、天然物を酵素処
理して得られたアンギオテンシン変換酵素阻害物質とし
ては、牛乳カゼインをトリプトノンにより分解して得た
ペプチド類等が知られているが（特開昭５８−１０９４
２５号、同５９−４４３２３号、同５９−４４３２４号
、同６１−３６２２６号、同６１−３６２２７号）新規
な阻害物質の開発が望まれているところである。

１課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる課題を解決すべく天然物質て副作
用の少ないアノギオテンノン変換酵素阻害物質を鋭意探
索した結果、蛋白質特にアクチン、魚肉、カツオブシを
特定の酵素で加水分解した組成物中にアンギオテンシン
変換酵素阻害活性を有する物質の存在をつきとめ、該物
質かＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを骨格と
するペプチドであることを知見し、更に該物質は動物や
微生物の組織中に含有されるアクチン由来であることを
見出し本発明を完成した。

本発明のＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを骨
格とするペプチドは文献未載の新規なペプチドであり、
カツオブシやアクチン等の蛋白質をサーモライノンによ
って加水分解することによって製造され、実用にあたっ
ては組成物をそのまま用いても良く、あるいは必要に応
じて精製して使用される。更にはペプチド合成の常套手
段を適用して合成することによって製造することもてき
る。

上記でいうＰｒｏはプロリン、Ａｒｇはアルギニン、Ｈ
ｉｓはヒスチジン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｙはグリ
シジを意味し、かかるアミノ酸はいずれもし一体である
。

本発明のペプチドは蛋白質をサーモライノンで加水分解
することによっても、ペプチド合成法でも取得てきる。

蛋白質をサーモライノンて加水分解するには、蛋白質の
性状により処決か異なるか、難溶性の場合には熱水に蛋
白質を混合し強力な撹拌でホモジナイズし、所定量のサ
モラインノを加え温度ｌθ〜８５℃程度で０１〜４８時
間反応を行う。

蛋白質としては、動物由来や微生物由来のもの等が任意
に用いられ、特に有用なものはアクチンであり、カッオ
ブシ、イワノ等の魚類か安価で有用である。

加水分解液中には本発明のペプチド以外に、Ｌｅｕ−Ｔ
ｙｒ、　Ｌ６ｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ、　ｌ１ｅ−Ｇｌｙ−
Ｖａｌ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、　Ｌｅｕ−
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、　Ｖａｌ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ｖａｌ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ、　
Ｌｅｕ−ＧＩｎ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｇｌｕ、　１ｌｅ−
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ等が少量存在してるか、これらは混合物
のままで各種の用途に用いられても良く、又、本発明の
ペプチドのみを単離して用いても差し支えない。

単離する場合は加水分解液を遠心分離等の公知の操作で
濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを適用した後、
あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤に対する吸着
親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるいは溶解度
の差、２種の混ざり合わない液相間における分配の差、
分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの析出性
あるいは析出速度の差なとを利用する手段を適用して目
的物を単離するのか好ましい。これらの方法は必要に応
して単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合せ、ま
た反覆して適用される。

本発明のペプチドはペプチド合成に通常用いられる方法
、即ち液相法ま几は固相法てペプチド結合の任意の位置
で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応
性カルホキノル基を有する原料と、他方のフラグメント
に相当する反応性アミノ基を有する原料とをカルボッイ
ミド法、活性エステル法等を用いて縮合させ、生成する
縮合物が保護基を育する場合、その保護基を除去させる
ことによってし製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきてない官能基は
、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては
、例えばヘンノルオキンカルボニル、ｔ−プチルオキノ
力ルホニル、ｐ−ヒフェニルイソブロビロオキノカルホ
ニル、９−フルオレニルメチルオキノ力ルホニル等が挙
げられる。カルホキノル基の保護基としては例えばアル
キルエステル、ヘンノルエステル等を形成し得る基が挙
げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルホキノル基
はクロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキ
シベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。

縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にある
いはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性
エステルを用いて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるか、固相法の場合
はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。

更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される
。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
が挙げられる。

本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口層
毎、非経口投与、直腸内投与のいずれてもよいが、経口
投与が好ましい。本発明のペプチドの投与量は、化合物
の種類、投与方法、生者の症状・年令等により異なるか
、通常１回０．００１〜Ｉ　０００ｍｇ、好まＬ　＜　
ハ０　、０１０１−１Ｏを１日当にり１〜３回である。

本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製し
た製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分
野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しな
い物質か用いられる。具体的には、例えば乳糖、ブドウ
糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、
デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、
合成ケイ酸アルミニウム、カルボキノメチルセルロース
ナトリウム、ヒドロキンプロピルデンプン、カルボキシ
メチルセルロースカルノウム、イオン交換樹脂、メチル
セルロース、ゼラチン、アラヒアゴム、ヒドロキンプロ
ピルセルロース、ヒドロキノプロピルメチルセルロース
、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質
無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラ
ガント、ベントナイト、ヒーガム、酸化チタン、ソルビ
タン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセ
リン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリ
セロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油
、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカー
ボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水
等が挙げられる。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロ
ップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼
付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は
常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用
時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であっ
てもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーチイン
クしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを
水に溶解させて調製されるが、必要に応して生理食塩水
あるいはブドウ糖溶液に溶解さけてもよく、まｆコ緩衝
剤や保存剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のペプチドを００１％以上、好
ましくは０．５〜７０％の割合で含有することができる
。これらの製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含有
していてもよい。

［作　　用コ 本発明のペプチドは、新規なペプチドであり優れたアン
ギオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作用、
ブラジキニン不活化抑制作用を示し、本態性高血圧、腎
性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防、治療剤
、これらの疾患の診断剤や各種の病態において用いられ
る血圧降下剤、狭心病発作の閾値上昇、心筋梗塞の減少
、うっ血性心不全における病態の改善剤として有用であ
る。

［実施例］ 次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

〔ペプチドの製造〕

（Ａ）カツオブシ５ｇに水４０ｍｌを加え充分ホモジナ
イズし、１００℃で１０分間煮沸後放置した。サーモラ
イノンを２０ｍ９加え３７℃、ｐＨ７で３時間加水分解
反応を行った。冷却後遠心分離して濃縮し、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＯＤＳ−、Ｐｈ−及びＣＮ−カラム
）により精製し、ペプチドを得た。

氷晶を気相ブロテイノノーヶノサー（アプライド　バイ
オノステムズ社製　４７７　Ａ型）を用いる自動エドマ
ン分解法を適用してアミノ酸配列を分析し、下記の構造
を得た。

Ｈ−ｒｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨ 該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

ＴＬＣｒｎ−ブタノール・酢酸・ビリノン　水−１５３
：１０：１２］ （シリカゲルプレート、ニンヒドリン発色）Ｒｆ：０．
２２ ｍ、ｐ：８１．２℃ 元素分ＦｆＴ　Ｃ４３Ｈ７４Ｎ、８０Ｉ□・０．ＤＨ２
０としてＣＨＮ 計算値　５０，２５　７．３５　２４．５２測定値　５
０．＋５　７．４１　２４．５３比旋光度［α］“　（
Ｃ＝１．０水）、−８６，３Ｄ’ （Ｂ）カツオブシに代えて鰯を用いｒ二辺外はＣＡ］と
同じ方法を行い、［Ａ　３と同しアミノ酸配列のペプチ
ドを得た。

該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

尚、ＴＬＣの溶媒は以下すべて、前記と同一である。

Ｒｆ：０．２２ ｍ、ｐ：８１．１℃ 元素分析　Ｃ４ｓＨ？４Ｎ　、８０１□・０．７Ｈ７Ｏ
としてＣＨＮ 計算値　５０．０５　７，３７　２４．４４測定値　５
０，０３　７．３１　２４．３８比旋光度［α］”；　
（Ｃ＝１．０水）、−８６，０ｆｃ］カツオブシに代え
て生鰹を用いた以外は［ＡＩと同じ方法を行い、［Ａ］
と同じアミノ酸配列のペプチドを得た。

該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

ＴＬＣ Ｒｆ：０．２２ ｍ、ｐ・８１．０℃ 元素分析　Ｃ４ｆｆＨ７＊Ｎ＋ｌｌ０ｚ・０゜３Ｈ２０
としてＣＨＮ 計算値　５０．４１　７．３４　２４．６１測定値　５
０，４５　７．３９　２４．５７比旋光度［α］％’；
（Ｃ＝１．Ｏ水）；−８６，１〔ペプチドの合成〕 市販のＢｏｃ（ブトキンカルボニル）　−Ｇ　ｌ　ｙ　
−０−Ｒｅｓｉｎ〔ヘンノル樹脂（置換率０．５５ｍｅ
ｑ／９）　：］　０．５５９をバイオサーチ社のペプチ
ド合成装置ＳＡＭ２の反応槽に分取し、以下のように合
成を行った。

４５％トリフルオロ酢酸、２５％アニソールを含む塩化
メチレノ中、２５分間の反応により、Ｂｏｃ基を除去し
たのち、塩化メチレンによる洗浄、ｌＯ％ノイソブロピ
ルエチルアミンを含む塩化メチレンによる中和、及び塩
化メチレンによる洗浄を行った。

これと５ａｌの０．４　Ｍ　Ｂｏｃ−Ｇｌｎ　（グルタ
ミン）のツメチルホルムアミド溶液、５ａｌの０．４Ｍ
ノイソプロビルカルホノイミトの塩化メチレン溶液とを
混合した後、反応槽に加え、室温にて２時間撹拌反応さ
せた。

得られた樹脂をツメチルホルムアミド、塩化メチレン、
１０％ノイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチレン
、塩化メチレン更に塩化メチレン及びツメチルホルムア
ミドとの混合液で洗浄し、Ｂｏｃ　−Ｇｌｎ　−Ｇｌｙ
−樹脂を得た。

引き続き同様のＢｏｃ基の除去、Ｂｏｃとアミノ酸のカ
ップリングを繰り返しＩｌｅ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ　−
Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｈｉ
ｓ（Ｔｏｓ）−Ｇｌｎ　−Ｇｌｙ−樹脂を得た。ＣＴｏ
ｓはトノルを示す〕 該樹脂を２０ｍ１の１０％アニソールを含むフッ化水素
中で０℃、１時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させ
た。フッ化水素を減圧留去し、残渣を３０％酢酸で抽出
し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラ
ム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　　５　Ｃ＋ａ）による逆相クロ
マトグラフィーにより精製し、Ｈ−１１ｅ−Ｍａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｙ−ＯＨ（収１１６０Ｂ）を得た。

氷晶を前記と同一のプロテインンーケンサーにより分析
した結果、上記の組成であることが判明した。

該ペプチドの物性値はづぎのとうりである。

ＴＬＣ Ｒｆ　　０２２ ｍ、１１）：８１．３８Ｃ 元素分析　Ｃ４３Ｈ？４Ｎ１８０１１・０．６Ｈ，０と
してＣＨＮ 計算値　５０，１４　７．３６　２４．４８測定値　５
０，１０　７．３２　２４．４２比旋光度［α］”　（
Ｃ＝１．０水）ニー８６．３Ｄ　′ 又、目的とするペプチドのアミノ散積に応して反応薬剤
を変更した以外は上記の合成例に準して各種のペプチド
を合成した。

ｔ（４ａｌ−Ｇｌｙ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ４１ｉｓ
−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−０）！該ペプチドの物性値はつぎの
とうりである。

ＴＬＣ Ｒｆ：０　１５ □、ｐ：Ｉ２５．５°Ｃ 元素分析　Ｃ３７Ｈ，、Ｎ、７０．。−０，７Ｈ，Ｏと
してＣＨＮ 計算値　４８，３８　７．０７　２５．９２測定値　４
８，３４　７．０１　２５．８７比旋光度［α］″’；
　（Ｃ＝０．５水）、−８８Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−ＨｉＳ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨ該ペプチド
の物性値はつぎのとうりである。

ＬＣ Ｒｆ：０．１０ ｍ、ｐ：１２３．５°Ｃ 元素分析　Ｃ３２Ｈ５４Ｎ　１８Ｈｓ　’　０　、４　
ＨｔｏとしてＣＨＮ 計算値　４７．２１　６．７９　２７．５３測定値　４
７，２８　６．８５　２７．４７比旋光度［α］”；　
（Ｃ＝０．５水）、−１０７，７Ｈ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨ該ペプチドの物
性値はつぎのとうりである。

ＬＣ Ｒｆ・０．１１ ｍ、ｐ：１２２．３℃ 元素分析　Ｃ３ｏＨｓ＋Ｉ’Ｊ＋ｓＯｓ・０．８ＨｔＯ
としてＣＨＮ 計算値　４７，１５　６．９４　２７．４９測定値　４
７．２２　６．９０　２７．５３比旋光度「αコ”：　
（Ｃ＝０．５水）；−８２，４Ｈ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ
ｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨ該ペプチドの物性値はつぎ
のとうりである。

ＬＣ Ｒｆ　：　０．１１ ｍ、ｐ：１０１．５°Ｃ 元素分析　Ｃ２，Ｈ３９Ｎ　＋　１０　？・０．９Ｈ２
０としてＣＨＮ 計算値　４７．２７　６．７４　２５．２７測定値　４
７，２１　６．７０　２５．３２′比旋光度［α］”、
（Ｃ＝０．５水）；−１４０，９実施例１〜５ （アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定）アンギオ
テンンン変換酵素阻害活性の測定は、ＣｈｅｕｎｇとＣ
ｕｓｈｍａｎの方法［ＢｉｏｃｈｅＩＩｌｉｃａｌ　Ｐ
ｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ　２０＋６３７（１９７１）
）に準して以下の方法で行った。

酵素基質；　Ｂｚ　（ベンノル）　−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−
Ｌｅｕ（８６Ｂを水８ｍｌとリン酸緩衝液８ＩＩ＋ｌに
溶解した溶液） 酵　素；うさぎの肺のアセトンパウダー（ングマ社製）
（Ｉｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍ１中で粉砕した
後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μＱ、酵素溶液を１２μρ及び
本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５
０μｇとした後、３７℃で３０分間反応を行った。

反応はｌＮ−ＨＣｌ　　２５０μＱを用いて終了させた
。

反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れＶ　ｏｒｔｅ
ｘて１５秒撹拌し、それを遠心分離した。

酢酸エチル層から１０１をとり出して、酢酸エチルを留
去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、抽
出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｒ＋ｍの値（ＯＤ　ｔ
ｔｓ）を測定した。

阻害率は阻害剤なして反応したときのＯＤ　ｚｚｅを１
００％とし、反応時間０分のときのＯＤ□８を０％とし
て求め阻害率５０％の時の阻害剤（本発明のペプチド）
の濃度ＩＣ５ｏ（μＭ）で活性を表示した。

結果を第１表に示す。

又、参考例として本発明以外の阻害剤についても測定を
行ったので、第１表に合わせて示す。

第　　１ （注） ｌｉｅ；イソロイノン Ｇｌｙ　；グリツジ Ｐｒｏ　　プロリン Ｇｌｎ　；グルタミン 表 Ｖａｌ　；バリン Ａｒｇ　；アルギニン Ｈｉｓ　；ヒスチノン ［効　　果コ 本発明ではアンギオテンンン変換酵素阻害剤として有用
な、新規なペプチドが得られる。

手 続 補 正 愈 臼 平成３年２月８日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ骨格をも
   つ新規ペプチド。 ２、蛋白質をサーモライシンで加水分解することを特徴
   とするＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ骨格を
   もつ新規ペプチドの製造方法。 ３、蛋白質としてアクチンを使用する請求項２記載の製
   造方法。 ４、蛋白質として魚肉を使用する請求項２記載の製造方
   法。 ５、蛋白質としてカツオブシを使用する請求項２記載の
   製造方法。 ６、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ骨格をも
   つペプチドを有効成分とするアンギオテンシン変換酵素
   阻害剤。