JPH0470320B2 - - Google Patents

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JPH0470320B2
JPH0470320B2 JP59208413A JP20841384A JPH0470320B2 JP H0470320 B2 JPH0470320 B2 JP H0470320B2 JP 59208413 A JP59208413 A JP 59208413A JP 20841384 A JP20841384 A JP 20841384A JP H0470320 B2 JPH0470320 B2 JP H0470320B2
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DEYUHON MERUKU PHARM CO ZA
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はキレート中の金属の少くとも一部が診
断または治療適用に適した二官能性金属キレート
への共有結合コンジユゲーシヨンにより追跡標識
された求標的生物活性分子に関する。そのような
求標的生物活性分子としては抗体または抗体フラ
グメントまたはその他任意の哺乳類の身体のある
臓器、組織または細胞中に選択的に局在している
化合物があげられる。 診断および治療目的に放射能標識求標的生物活
性分子（以後本明細書中ではBAMと称する）、
特に抗体およびその他の蛋白質を使用することは
非常に活発に行われている分野である。そのよう
な放射能標識の論義に関しては「Cancer
Research」第40巻第3036〜3042頁（1980）およ
び「J.Nucl.Med.」第23巻第840〜850頁（1982）
を参照されたい。放射標識抗体の最も広く使用さ
れている方法はＩ−131、Ｉ−125またはＩ−123
による直接的沃素化である。しかしこれら放射性
核種はある種の線量計的な、そして画像形成の不
利点を有している。ある種の金属放射性核種例え
ばTc−99mおよびIn−111はジシチレーシヨン写
真画像形成により適している。しかし、これまで
はこれら金属放射性核種を直接ほとんどのBAM
に結合させることは困難であつた。その理由は一
般に放射性核種とBAMとの間には充分な親和性
が存在していないからである。更にそのような結
合がある場合には、その放射性核種の結合が時に
よりBAMの生物学的活性を部分的または完全に
消失させる結果となる。 これらの理由のために当該技術では、金属キレ
ート剤を使用する共有結合コンジユゲート化によ
つて金属放射性核種を用いるBAMの放射能標識
化が多くの人により提案されている。例えば
「Science」第209巻第295〜297頁（1980）による
と、In−111ジエチレントリアミンペンタ酢酸
（DTPA）で標識付した心臓ミオシンの抗体およ
び心筋梗塞のためのこの標識抗体の画像形成用使
用が開示している。「Biochem.Biophys.Res.
Commun.」第77巻第581〜585頁（1977）は金属
放射性核種による人血清アルブミンのような蛋白
質の標識付のためのDTPAの使用を開示してい
る。「Proc.Soc.Exp.Biol.Med.」第151頁第297〜
302頁（1976）はIn−111をキレート化しうる種々
の薬剤例えばトランスフエリン、Ｄ−ペニシラミ
ンおよびデフエロキサミンへの抗体のコンジユゲ
ーシヨンを開示している。ヨーロツパ特許出願第
35765号明細書は蛋白質（例えばHSA、ウロキナ
ーゼ、フイブリノゲン）、抗生物質（例えば「ブ
レオマイシン」、「カナマイシン」）ホルモン、サ
ツカライドおよび脂肪酸を含む種々のBAMの放
射能標識のための二官能性キレーターとしてのデ
フエロキサミンを開示している。ヨーロツパ特許
出願第38546号明細書はDTPA、エチレンジアミ
ンラトラ酢酸（EDTA）およびエチレンジアミ
ンを抗体、抗原および抗体フラグメントを含む蛋
白質の放射能標識のための二官能性キレーターと
して開示している。米国特許第4287362号明細書
は蛋白質放射能標識のための二官能性キレート剤
として３−カルボキシ−２−オキソプロピオンア
ルデヒドビス（Ｎ−メチルチオセミカルバゾン）
（OPBMT）およびその同族体を開示している。
米国特許第3994966号および同第4043998号各明細
書および「Int.J.App.Radiation of Isotopes」第
29巻第687〜692頁（1978）によると二官能性
EDTA同族体例えば１−（ｐ−ベンゼンジアゾニ
ウム）−EDTAおよび１−ｐ−アミノフエニル−
EDTAを蛋白質標識用として開示している。「J.
Radioanal.Chem.」第57巻第553〜564頁（1980）
はDTTA−アゾイミデートと呼ばれる二官能性
キレーターとしてのDTPAのアゾ誘導体および
In−111によるHSA標識のためのその使用を開示
している。しかし、これまで記載されている二官
能性キレーターの各々は一般に特定の金属放射性
核種を配位するために計画されている。従つて
BAMの生物活性を保持させつつ、種々の金属陽
イオンを配位しうる、且つBAMとコンジユゲー
トしうるキレーターを開発することが望ましい。 更に現在の静脈内放射線写真用コントラスト剤
は沃素化芳香族化合物に基づいている。しかしな
がら、これら化合物はしばしば有用な濃度におい
ては生理学的に非和合性であることが見出されて
いる。従つて生理学的に和合性のそのような沃素
化化合物に代るものを開発することが望ましい。 また急速に発展しつつある核磁気共鳴
（NMR）画像形成分野においては、特にBAMと
コンジユゲートしうる場合の有用なコントラスト
剤は価値あるものであろう。NMR画像形成のコ
ントラスト強化法の総説、「Radiology」第147巻
第781〜788頁（1983）は「理想的」コントラスト
強化剤の判定基準の中で、その化合物は低濃度で
強いNMR活性を有しており、生体内で非反応性
であり、そして診断用量で無毒性であるべきであ
ると記している。 本発明はBAM標識の追跡標識金属の担体とし
てのメタロチオネインの使用に関する。メタロチ
オネインは広範な種々の金属に配位結合すること
の外にそれはまた１分子当り10ｇ原子もの金属と
結合するという利点を与える。従つて、メタロチ
オネインは広範な種々の追跡標識金属と結合しそ
して二官能性キレーター１モル当り１〜10モルの
金属の選択的包含を提供する。驚くべきことに、
メタロチオネインとBAMのコンジユゲーシヨン
はBAMの生物活性を損なわない。 本発明はメタロチオネインまたはフラグメント
の金属の少くとも一部がメタロチオネインまたは
フラグメントにそれを結合させるに充分な親和性
を有する放射性核種または非放射性追跡標識金属
である。BAMとメタロチオネインまたはメタロ
チオネインフラグメントとのコンジユゲートを提
供する。好ましくはそのようなトレース標識金属
はIn、Pb、Tc、Ru、Hg、Ag、Au、Pd、Cu、
Re、Sb、Bi、Ga、Pt、Ｗ、Co、Ni、Rhおよび
Osより選ばれる。 更に本発明はメタロチオネインまたはフラグメ
ント中のすべての金属が非追跡標識金属例えば
Znであるような、BAMとメタロチオネインまた
はメタロチオネインフラグメントとの共有結合コ
ンジユゲートを包含している。これらコンジユゲ
ートは交換標識、すなわち非追跡標識金属の少く
とも一部を金属追跡標識で置換させることによつ
て本発明の追跡標識コンジユゲートを製造するの
に中間体として有用である。 本発明はまた、金属のすべてまたは一部が金属
追跡標識である追跡標識非コンジユゲート化メタ
ロチオネインまたはメタロチオネインフラグメン
トを包含する。これら追跡標識非コンジユゲート
化メタロチオネインはなかんずく本発明の追跡標
識コンジユゲート化メタロチオネイン製造の中間
体として使用することができる。 メタロチオネイン メタロチオネインは「メタロチオネイン：
Proceedings of First International Meeting
on Metallothionein and Other Low
Molecular Weight Metal−Binding Proteins」
（チユーリツヒにて1978年７月17〜22日）−
Birkhauser社（バーゼル）（1979年版）−に記載
されている。この文献は以下のように要約され
る。メタロチオネインは1957年に発見され、カド
ミウムおよび亜鉛含有蛋白質は馬の腎臓から単離
された。実質的に同一の蛋白質が後に兎、人、サ
ル、牛、羊、豚、犬、ハムスター、ラツト、マウ
スおよびあざらし中に見出された。馬メタロチオ
ネインは分子量6000〜7000、高い金属含量、高い
システイン含量を有し、芳香族アミノ酸を含有し
ないこと、金属チオレート（メルカプタイド）の
光学的特性およびシステイン残基の一定の分散を
有することを特徴とする。前記の第一回メタロチ
オネイン国際会議の総会において、これらの特性
のいくらかの馬腎メタロチオネインに似た蛋白質
を「メタロチオネイン」と称することになつた。
そしてこの意味においてこの用語が本明細書中に
使用されている。勿論メタロチオネインフラグメ
ントも少くとも約６個のアミノ酸残基を有する機
能的に同様なポリペプチドと同じく本発明の実施
において有用である。 一般的に云つて、メタロチオネインは生体内で
生産され、且つ高い親和性をもつて広範な種種の
金属イオンとキレート化する低分子量蛋白質であ
る。メタロチオネインの生理学的機能ははつきり
とは理解されていない。しかしそれらは必須金属
の動的平衡および重金属の解毒に機能しているも
のとして一般に受入れられている。メタロチオネ
インは高等背椎動物、無背椎動物および真核およ
び前核微生物に遍在する。例えばCd、Hg、Znま
たはCuの金属イオンに多くの有機体をさらすと、
アポ蛋白チオネインに対するmRNAの産生が増
強されてメタロチオネインの迅速な新たな合成が
誘導される。従つてCd注入に反応してある種の
微生物により生産されるカジスチンのような分子
もまた本発明で使用を企図するものである。 哺乳類のすべてのチオネインは60〜61個のアミ
ノ酸残基を有しており、そして１モル当り７ｇ原
子の二価または10ｇ原子までの一価の金属イオン
を結合しうる。チオネインは芳香族またはヒスチ
ジン残基を有しておらずそして哺乳類チオネイン
中のアミノ酸残基の20個がシステインである。分
光光度計による証明によりチオネインの金属結紮
はほとんど例外なしにシステインのスルフヒドリ
ル部分を介したものである。 メタロチオネインのスルフヒドリル部分は金属
イオンに結合しているので、それらは一般には
BAMに対するコンジユゲート用の官能基として
作用するには役に立たない。しかしその他の基例
えば−NH2、−OHおよび−COOH基が役に立つ。
すなわち、メタロチオネインは以下に詳細に記載
するようにこれらの基を用いる試薬および方法を
使用してBAMに共有結合的にコンジユゲートさ
せることができる。 数種のメタロチオネインの完全なアミノ酸配列
が決定されている。 【表】 システイン残基は鎖に沿つて分布しており、そ
して多数の−Ｃ−Ｘ−Ｃ残基（式中Ｘはシステイ
ン以外のアミン酸を意味する）が存在することが
見られる。表は哺乳類メタロチオネインよりもは
るかに低い分子量のNeurospora crassaからのメ
タロチオネインを包含している。より高分子量の
メタロチオネイン（9500〜10000）が他の微生物
から単離されている。これらメタロチオネインの
すべては本発明の範囲内にあるが、哺乳類メタロ
チオネインがより好ましい。生体内診断および治
療目的には処理される哺乳類と同一種からのメタ
ロチオネインを使用することが特に好ましい。 例えば本明細書中に共に参考として包含されて
いる「Proc.Natl.Acad.Sci.」U.S.A第76巻第486
〜490頁および「Tetrahedron Letters」第24巻
第925〜928頁に報告されている金属結合チオネイ
ンフラグメントもまた本発明において使用しう
る。前者により合成されたマウスチオネインフラ
グメントは以下のアミノ酸配列を有しているがこ
こに文字記号は前記表１におけると同一の意味を
有している。 １ H2N−Ｋ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−OH ２ H2N−Ａ−Ｃ−Ｋ−Ｄ−Ｃ−Ｋ−Ｃ−Ｔ−
OH ３ H2N−Ｓ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−
Ａ−OH ４ H2N−Ｇ−Ｃ−Ｓ−Ｋ−Ｃ−Ａ−Ｑ−Ｇ−
Ｃ−Ｖ−OH ５ H2N−Ｇ−Ｃ−Ｖ−Ｋ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｄ−
Ｋ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−OH チオネインの金属結合フラグメント（すなわち
メタロチオネインフラグメント）例えば前者によ
り合成されたものは本発明の使用にとつて適当で
あるがしかし完全なメタロチオネインが現在は好
ましい。 メタロチオネインと機能的類似性を有するポリ
ペプチドならびに慣用の合成技術を使用して製造
されたメタロチオネイン／メタロチオネインフラ
グメントおよび単量体との共重合体はそれらが前
記に詳細を記したメタロチオネインの一般的特性
を示す限りは本発明を実施するのに有用であるこ
とは当業者には明白であろう。 金属追跡標識 これまでに知られている診断的および治療用放
射性核種の中で、次のものが本発明の実施に有用
である（半減期はｄ＝日、ｈ＝時間で与えられて
いる）。 表 診断用放射性核種 半減期 ルテニウム−97 2.9d テクネチウム−99m 6.0h 水銀−197 2.7d ガリウム−67 77.9h ガリウム−68 1.1h オスミウム−191 15d インジウム−111 2.8d インジウム−113m 1.7h 鉛−203 52h 治療放射性核種 半減期 パラジウム−103 17.0d 銀−111 7.5d アンチモニー−119 1.6d 金−198 2.7d 銅−67 2.6d レニウム−188 17.0h ビスマス−212 1.0h 診断用放射性核種はγ−放出体および／または
陽電子放出体であつて、30KeVおよび1MeVの間
のエネルギーを放出させ、そして約１分〜８日の
半減期を有している。これら放射性核種は例えば
平面単一光子または陽電子断層撮影法に基づく慣
用の放射能シンチグラフ画像形成技術と組合せて
用いるのが有用である。治療用放射性核種はα
−、β−、γ−変換電子または100eV〜2MeVの
エネルギーのアウガー電子を放出し、そして生体
内で細胞を殺すことができる。 勿論、これらの種々の放射性核種の診断および
治療への使用を論ずる場合には使用される用量は
多くの変数に依存することを当業者は理解してい
るであろう。画像形成目的のために放射性核種を
使用する場合には、使用される特定の用量は一般
には体重70Kg当り0.1〜20mCiの範囲の診断上有
用な画像を得るのに充分な高いものであるという
ことのみが必要である。それと対照的に、治療目
的のためには一般に体重70Kg当り0.1〜500mCiの
範囲のより高い用量を使用しうる。勿論適当な用
量は最終的には放射性核種の物理的性質例えば半
減期、放射のタイプおよび放射エネルギーおよび
放射能標識された薬剤の薬品作用機能に依存す
る。 NMR画像形成に対して有用であることがこれ
まで知られているコントラスト剤の中で、コバル
ト、ニツケル、銅およびルテニウムは本発明の実
施において有用であると考えられている。 放射線写真画像形成に有用であることがこれま
でに知られているコントラスト剤の中で、周期律
表72〜83番の金属元素が本発明の実施において有
用であると考えられ、そしてビスマス、鉛、水
銀、金、白金、レニウムおよびタングステンが好
ましい。 追跡標識メタロチオネイン 追跡標識メタロチオネイン生成に使用しうる二
つの一般法がある。第一のはチオネインの直接標
識である。第二のはメタロチオネイン例えばZn
−メタロチオネインを所望の金属追跡標識を用い
て交換標識させるものである。 第一の方法、すなわちチオネインの追跡標識に
よる直接標識はここに参考として包含されている
「Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）」第78巻第6709頁
（1981）に報告されているものと同様である。一
般に哺乳類チオネインをPH２で溶解させそして生
じた不溶性物質をすべて過により除去する。こ
のチオネイン溶液に金属追跡標識および任意の所
望の非追跡標識金属陽イオンを加える。追跡標識
および非追跡標識金属陽イオンの全濃度はチオネ
イン当り少くとも７個の二価金属陽イオンまたは
10個の一価金属陽イオンが確実に使用しうるまた
は二価陽イオンおよび一価陽イオンの適当な組合
せがメタロチオネインの金属結合部分のすべてを
確実に満すに充分なものであるべきである。チオ
ネインの独特の性質のために１個以上の金属陽イ
オンを有するメタロチオネインを製造することが
できる。従つてチオネインの全部の金属結合部分
が金属追跡標識により占有されうる可能性がある
ので、非常に高濃度の追跡標識メタロチオネイン
を製造することができる。 金属追跡標識として放射性核種を使用する場
合、添加される放射性核種の濃度は問題の臨床上
の応用に必要とされる比活性に依存する。診断の
適用に対しては、チオネイン１モル当りの放射性
核種のモル比は１またはそれ以下の小さいもので
あつてよい。治療の応用に対しては、この比はも
つと高いものであつてよい。非放射性金属陽イオ
ンは放射性陽イオンにより占有されていない金属
結合部分を占有させるに充分な量で加えることが
できる。放射性核種および場合により非放射性金
属陽イオンを加えた後、得られた溶液を完全に抜
気して酸素を除去し、そして不活性雰囲気中でPH
が7.0より高くなるまで中和させる。この中和の
間にチオネインは放射性核種および非放射性金属
陽イオンのまわりに折りたたまれて所望の放射能
標識メタロチオネインを生成する。標識メタロチ
オネインは慣用の技術例えば透析、サイズ排除
（size exclusion）またはイオン交換クロマトグ
ラフイーにより精製することができる。放射能標
識メタロチオネインの非放射性金属含量は原子吸
光によりまたは放射性崩壊を計数することにより
算定される放射性核種の含量により決定すること
ができる。この精製放射性核種標識メタロチオネ
インは以下に記載の二官能性カツプリング剤また
は交叉結合剤を使用して直接BAMにカツプリン
グさせることができる。放射性核種標識メタロチ
オネインの製造およびそれらを所望のBAMへカ
ツプリングするのに要する時間のために、この直
接標識技術での使用については、例えば24時間よ
り長い半減期を有するRu−97およびHg−197の
ような放射性核種が好ましい。 第二の標識法は追跡標識金属陽イオンをメタロ
チオネインの非追跡標識金属陽イオンの全部また
はその一部と交換することを包含する。この交換
反応を成功させるには追跡標識陽イオンが前に形
成されているメタロチオネインにおいて非追跡標
識陽イオンよりもより大きな親和性をメタロチオ
ネインのメルカプチドに対して有していることが
必要である。 例えば金属追跡標識として放射性核種を使用す
る場合、亜鉛陽イオンはテクネチウム、水銀また
は銀の陽イオンのいずれかよりも低い親和性をメ
タロチオネインのメルカプチドに対して有してい
る。従つて、テクネチウム−99m、水銀−197、
または銀−111の陽イオンの存在下にZn−メタロ
チオネイン（MTh）のZn（）陽イオンは容易
に置換されてそれぞれZn／99mTc−MTh、Zn／
197Hg−MThまたはZn／111Ag−MThを与える。
すなわちZn−MThは前記の方法によつて容易に
製造されるので、Zn−MThまたはZn−MTh−
BAMコンジユゲートの交換標識はZn−MThま
たはZn−MTh−BAMコンジユゲートを可溶性
の交換可能な放射性核種例えば99mTc−グルコヘ
プトネート、197HgCl2または111Ag（NH3）2 +のもの
と混合することによつて達成することができる。
交換の後で放射能標識メタロチオネインを慣用の
技術例えば透析、サイズ排除またはイオン交換ク
ロマトグラフイーにより精製することができる。
交換標識の収率は放射性崩壊を計数することによ
り測定されうるし、そしてこれはメタロチオネイ
ン中に包含された全放射活性の％を表わす。コバ
ルト（）、ニツケル（）、および亜鉛（）陽
イオンは表２に列記されている放射性核種を用い
る交換標識法で使用しうるメタロチオネインを生
成する。しかしこの交換標識には亜鉛（）陽イ
オンが好ましい非放射性陽イオンである。交換標
識法の使用は24時間より短い半減期を有する放射
性核種を使用する場合に特に有用である。その理
由はこの交換標識が臨床現場で実施されうるから
である。以下に更に論じられているように、Zn
−MTh−BAMコンジユゲートの短い寿命の放射
性核種による交換標識は使用直前の放射性核種の
導入を可能にし、そして崩壊による放射能の避け
られない損失を除く。 前記にあげた放射性核種の中で、Mo−99／Tc
−99m発生体から容易に得られ、そしてその放射
性核種の望ましい物理的特性の故に99mTcがその
比較的短い半減期により本発明の実施の際の交換
標識に最も好ましい。放射性核種Ag−111、Au
−198およびHg−197は両標識法を実施しうる容
易さのためにチオネインの直接標識または交換標
識のいずれかに対して最も好ましい。放射性核種
Ru−97、Pd−103およびSb−119は直接チオネイ
ン標識法によつて最適に使用される。 前述したようにこれら放射能標識チオネインは
以下に詳細に記載するように本発明の放射能標識
メタロチオネイン−BAMコンジユゲート生成の
中間体として使用しうる。また99mTc−標識メタ
ロチオネインまたはメタロチオネインフラグメン
トはそれ自体は腎機能画像形成剤として特に有用
でありうる。放射性核種Zn−65およびCd−109を
使用した場合の放射能標識メタロチオネインの臓
器分布は報告されているが、しかしこれら放射性
核種のどちらも生体内診断画像形成に適当な物理
的性質または放射線量測定を有していない。前記
に概略を記した交換標識法により製造された99m
Tc／Zn−MThは生体内で腎疾患の診断に使用す
ることができる。マウスに99mTc／Zn−MThを
静脈内注射した後、99mTc／Zn−MThは直ちに腎
により排泄される。注射後15分では99mTc活性の
75％は腎、膀胱および尿中に存在している。すな
わち腎機能は99mTc／Zn−MThの排除を追跡す
ることによつて生体内で非常に速やかに評価する
ことができる。その他の診断用腎薬剤例えば99m
TcDTPAに比べた場合の99mTc／Zn−MTh使用
する固有の利点はメタロチオネインが自然に発現
される解毒機構の肝要な一部分であるということ
である。人においては腎臓は重金属メタロチオネ
イン代謝の重要な役割を果している。 メタロチオネイン放射能標識について記載され
ているものと同様の方法を非放射性金属追跡標識
の導入に使用することができる。放射線写真対比
に対して有用なものすなわちBi、Rh、Hg、Au、
Pt、ReおよびＷの中で、水銀および金を交換標
識またはアポ蛋白への直接コンジユゲートによつ
てメタロチオネイン中に混在させることができ
る。残余の元素の包含は直接標識によつて達成さ
れる。NMR画像形成に有用なものすなわちCo、
Ni、Cu（）およびRuの中で、銅（）が交換
標識によつてメタロチオネイン中に最良に包含さ
れる。一方コバルト、ニツケルおよびルテニウム
は直接標識により包含される。 求標的生物活性分子 本明細書に使用されている場合の求標的生物活
性分子（BAM）の用語は抗体（特にモノクロー
ン抗体）、抗体のFab、Fab′およびＦ（ab′）2フラ
グメントおよび哺乳類体内のある臓器、組織また
は細胞中に局在するその他の分子を意味してい
る。そのようなその他の分子の例はホルモン例え
ばインシユリン、グルカゴン、プロスタグランジ
ン、ステロイドホルモンおよびペプチドならびに
ある細胞型に特異的に結合するその他の蛋白質例
えば卵巣中のレセプターに結合する黄体化ホルモ
ンである。メタロチオネインのコンジユゲートに
よる放射能標識に対して蛋白質のような大形分子
が一般には好ましい。しかしいくつかの小形分子
のコンジユゲートもまた適している。例えば心臓
のムスカリンコリンレセプターに結合するキヌク
リジニルベンジレートの数分子の放射能標識メタ
ロチオネインへのコンジユゲートは生体内での心
臓細胞の生活能力を追跡するための放射性薬物を
提供する。放射性標識メタロチオネインにコンジ
ユゲートさせたエストロジエンおよびニユーロペ
プチドは同様にそれぞれ乳癌および脳潅流剤を与
える。 驚くべきことに、BAM例えばモノクローン抗
体、抗−THY1.1〔「J.Immunology」第125巻第
837頁（1980）参照〕および抗人乳癌B6.2〔Proc.
Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）第78巻第3199頁（1981）
参照〕ならびにその他のものをZn−メタロチオ
ネインにコンジユゲートさせそしてそのコンジユ
ゲートをBAMの免疫学的活性を実質的に低下さ
せることなく例えばTc−99mで交換標識させる
ことができることが発見された。 コンジユゲーシヨン BAMはメタロチオネインの放射能標識の前ま
たはその後でメタロチオネインにコンジユゲート
させることができる。コンジユゲートの前に放射
能標識することが一般には好ましい。その理由は
コンジユゲートに対するよりも放射能標識に対し
てより厳しい条件が使用されうるからである。し
かし臨床的使用する直前に寿命の短い放射性核種
例えばTc−99mを交換標識させることにより放
射能標識することが所望されている場合には、以
下の例に示されるように放射能標識の前のコンジ
ユゲート化が好ましい。 哺乳類のメタロチオネインは典型的にはメタロ
チオネインを直接BAMにコンジユゲートさせる
ことのできる官能基を有している以下のアミノ酸
残基、システイン20チオール（−SH）基、リジ
ン８個のアミノ（−NH2）基、アスパラギン／
グルタミン酸、４または５個のカルボキシル（−
COOH）基、およびセリン／スレオニン10〜14
個のヒドロキシル（−OH）基を有している。メ
タロチオネイン中のすべてのアミノ酸残基がコン
ジユゲート用に使用可能であるとは限らない。そ
の理由はあるものはメタロチオネイン中の種々の
機能に関与しているからである。システインSH
基は金属結合に関与しておりそして一般には通常
の条件下ではチオールを目的とした試薬とは反応
しない。部分金属化メタロチオネインまたはメタ
ロチオネインのフラグメントの使用は、金属結合
に使用されない−SH基の反応を可能にする。そ
のような−SH基を直接コンジユゲート用に使用
しうるようにするためのメタロチオネインからの
金属の一部の除去はEDTAまたはDTPAのよう
な強いキレート化剤を用いる処理により実施され
うる。リジンおよびアルギニン残基はコンジユゲ
ートに対して大部分使用できないものである。そ
の理由はそれらはメタロチオネイン中で高度に負
の金属群との静電気結合に関与しているからであ
る。リジンのいくらか（１〜３）は通常使用しう
るものであるけれども、高いイオン強度の溶液へ
メタロチオネインをさらすのは静電結合の破壊を
まねきそして一層大きくリジンおよびアルギニン
残基を使用する結果となる。メタロチオネインの
表面上のカルボキシルおよびヒドロキシル基は一
般にBAMのコンジユゲートに使用可能であり、
従つてコンジユゲーシヨンに対して最も好ましい
ものでありうる。 チオネインの直線標識により生成された放射能
標識メタロチオネインへ、または後で放射性核種
で交換標識させるための非放射性メタロチオネイ
ンにBAMを結合させるにはメタロチオネインの
使用しうる−SH、−NH2、−NHC−（＝NH）
NH2、−CO2HまたはOH基をBAMの補合官能基
にコンジユゲートさせることが必要である。
BAMがモノクローン抗体またはその他の糖蛋白
質である場合には、それはメタロチオネインと同
一の官能基すなわち−SH、−NH2、−OH、−
CO2HおよびNHC（＝NH）NH2を有している。
そのような基を有しない比較的小さい薬物または
ホルモンを取扱う場合には、これらの基の一つを
その小分子中に合成的に取り込んで、メタロチオ
ネインとのコンジユゲート化を起させるようにす
ることができる。当業者には周知のように、方法
論はそのような一つの薬物またはホルモンごとに
広く変動する。そして主なる配慮点は生物学的特
異性および親和性の保持である。そのような合成
上の修正についての一般的論議に対しては、ここ
に参考として包含されている「Chemical
Modification of Proteins」〔ホルデン−デイ社
版（1971）〕を参照されたい。その後でメタロチ
オネインとBAMを直接適当な試薬および方法を
使用してコンジユゲートさせることができる。一
般的に蛋白質のメタロチオネインへのコンジユゲ
ーシヨンならびにコンジユゲーシヨンのためのメ
タロチオネインまたは蛋白質の変形には、メタロ
チオネインおよびBAMの変性および生物活性損
失を避けるために緩和な条件が要求される。反応
のPHは約３〜11、好ましくは５〜９の範囲であり
温度は０〜60℃の範囲であり、BAMおよびメタ
ロチオネイン各々の濃度は10-2〜10-6Mのの範
囲、好ましくは約10-4Mであるべきである。好ま
しい溶媒は一般には水である。しかし種々の量の
溶媒例えばジメチルスルホキサイドを加えて非極
性コンジユゲート剤を溶解させることができる。
非蛋白質BAMをメタロチオネインにコンジユゲ
ートさせるためにはメタロチオネインはいくらか
一層厳しい条件を許容しうるし、そして反応はジ
メチルスルホキサイドのような有機溶媒中で実施
しうる。 メタロチオネインとBAMが補合コンジユゲー
ト部分を含有していない場合には、メタロチオネ
インまたはBAMのどちらかまたはその両方を合
成的に修正する代りに所望のコンジユゲートを行
わせる交叉結合剤を使用することができる。交叉
結合剤はメタロチオネインとBAMの官能基と共
有結合を形成し、且つアルキルおよび／またはア
リール鎖により結合されている二つの化学的に相
容性の反応性基ＸおよびＹ、すなわちＸ−Co−
Ｙ（式中Coはアルキルまたはアリールである）を
有しているべきである。この反応性基ＸおよびＹ
は化学的に相容性であるべきである。すなわちそ
れらは相互に反応して重合体物質を生成させては
ならない。メタロチオネインおよびほとんどの
BAMは−NH2、−SHおよび−OH基を有してい
るのであるからＸおよびＹに対する好ましい反応
性基はアルキル化およびアシル化基である。Ｘお
よびＹに対する好ましいアルキル化基は−ハロ
酸、−ハロエステルまたは−ハロアミド、アリー
ルハライドおよびマレイミドである。メタロチオ
ネインおよびBAMの−NH2基の還元アルキル化
の使用による交叉結合もまた好ましい。交叉結合
剤例えばＸとＹがアルデヒドであり、そしてｎ＝
３であるグルタルアルデヒドはそのような−
NH2基の還元アルキル化によりモノクローン抗
体に放射能標識メタロチオネインを結合させるこ
とに有用性を示す。ＸおよびＹに対する好ましい
アシル化剤としては活性化カルボキシル官能分、
例えばクロリドおよび無水物、イミドエステル、
チオールエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルがあげられる。一般にアミンのア
シル化がヒドロキシルよりも好ましい。それはア
ミドが生体内ではエステルよりも安定であること
が知られているからである。 −NHC（＝NH）NH2基との共有結合形成にお
いて好ましいＸおよびＹに対する部分としては、
１，２−および１，３−ジカルボニル化合物、例
えばマロンジアルデヒド、シクロヘキサン−１，
２−ジオンおよびカンフアーキノンがあげられ
る。アルギニン残基とこれら試薬との反応は非常
に選択的でありかつ可逆的である。 交叉結合に対してメタロチオネインとBAMの
カルボキシル基を使用する場合における好ましい
ＸおよびＹ部分はアミン基である。水溶性カルボ
ジイミド例えば１−シクロヘキシル−３−（２−
モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまた
は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドにより活性化された場合、メ
タロチオネインまたはBAMの活性化カルボキシ
ル基は交叉結合剤のＸおよび／またはＹ＝−
NH2と反応してアミド結合を生成する。メタロ
チオネインおよびBAMのそのようなカルボキシ
ル基とアミノ基を含有する交叉結合剤との反応は
メタロチオネインをBAMに結合させるための好
ましい方法である。 一般にＸとＹを分離させている炭素鎖はｎが１
〜12個のアルキルまたはアリールでありうる。鎖
長の選択は結合させるBAMの性質によつて変動
する。大形のBAMの場合には、メタロチオネイ
ンに結合された交叉結合剤と大型蛋白質上の標的
官能基との間に至適な共有結合を形成させるため
に、より長鎖が必要である。小形のBAMの場合
には、メタロチオネインに結合されたBAMをそ
の細胞表面レセプターと相互反応させるためには
非常に長い鎖が必要となるかもしれない。すなわ
ち鎖長は交叉結合法を至適化させるために、また
はメタロチオネイン−BAMコンジユゲートの生
物学的活性保持を最大化させるために変動させる
ことができる。 メタロチオネインのモノクローン抗体への結合
においてはいつくかの市販の交叉結合剤が好まし
い。好ましい交叉結合の例としてはグルタルアル
デヒド、Ｎ−（２−クロロエチル）マレイミド、
ジサクシンイミジルタータレート、サクシンイミ
ジル４−ｐ−マレイミドフエニル）ブチレート、
２−イミノチオレインおよびジメチルアジピイミ
デートがあげられる。 本発明の追跡標識コンジユゲートは従来技術の
追跡標識BAMと同一の方法で使用することがで
きる。これらは保存および輸送のために凍結乾燥
させ、次いで通常の生理学的食塩水中で復元して
診断用画像形成または治療のために静脈内注射す
ることができるし、またはそれらを交換標識によ
つて使用直前に製造することができる。それらは
また従来技術の追跡標識化合物と同一の方法で生
体外検定および臨床的診断法で使用することがで
きる。 例 チオネインからの水銀−203標識メタロチオネ
インの製造 チオネインは「Biochemistry」第20巻第2852
頁（1981）の方法によつて兎肝臓から製造され
た。このチオネイン（３〜５mg）を1.0mlの金属
不含の0.1N HClに溶解させ、そしてすべての不
溶性物質を別した。得られたチオネインの濃度
は計算のために220nｍで7.9mg-1ml／cm-1の吸光
係数を使用して分光光度計的に測定された。この
チオネインの溶液（0.5mg／ml）に0.76ｍCiの
203HgCl2（比活性＝8.76×102ｍCi／ｍモル）を加
えた。真空下にこの混合物を交互に凍結および融
解させることによつて得られたチオネイン／
203HgCl2溶液を完全に脱気させて酸素を除去し
た。アルゴン雰囲気下にチオネイン／203HgCl2を
金属不含の0.5Mトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン（トリス）バツフアーで7.0より大き
いPHまで中和させた。得られた203Hg−MTを１
〜60ゲル過カラム（ウオーターズ・アソシエイ
ツ社製）を使用して、2.0ml／分で0.025Mホスフ
エートバツフアー（PH7.0）で溶出させるサイズ
排除HPLCにより評価した。クロマトグラフイー
の後、添加された203Hg放射性の98％が203Hg−
MTと共に残つていた。メタロチオネイン製造に
関しては同位元素効果は存在しないので、
197HgCl2の置換は比肩しうる結果を与えた。 例 Zn−メタロチオネインの交換標識によるZn／9
９ｍTc−メタロチオネインの製造 Zn−メタロチオネインを「Proc.Natl.Acad.
Sci.（USA）」第78巻第6709頁（1981）の方法によ
つて製造されそして0.01Mホスフエートバツフア
ー（PH6.5）で「スペクトラ／ポル６）透析管
「2000MWカツトオフ」（スペクトラム・メデイカ
ル・インストルメンツ社製）を使用して透析し
た。99Mo／99mTc放射性核種発生体の酸化成分不
含溶出液から得られた0.5ml生理学的食塩水中の
48.7ｍCi99mTc−パーテクネテートの添加により
製造された9.7ｍCiの99mTc−グルコスカン （ニ
ユーイングランド・ニユークリアー社製）を0.5
mgのZn−メタロチオネイン（1.0ml、10-4M）に
加えた。得られた交換混合物を30分間振盪および
インキユベートさせた。交換標識Zn99mTc−メタ
ロチオネインは例におけるようにサイズ排除
HPLCにより精製された。精製後Zn−メタロチ
オネインに加えられたテクネチウム−99m活性の
88％がZn、99mTc−MTと共に残留した。テクネ
チウム−99mの担体不含を考えると、16ピコモル
のテクネチウム−99mが0.5mgのZn−メタロチオ
ネインに交換された。 例 Zn−メタロチオネインの交換標識によるZn／1
１０ｍAg−メタロチオネインの製造 Zn−メタロチオネインを例に記載のように
して製造されそして0.01Mホスフエートバツフア
ー（PH7.0）で透析した〔「スペクトラ／ポル６」
（2000MWCO）使用〕。ニユーイングランド、ス
クレアー社より入手した0.5M HNO3中の110m
AgNO3（比活性＝1017ｍCi／ミリモル）を0.5N
NH4OHの添加によつてPH7.0に中和させた。
50uCiの110mAg（NH3）+ 2を0.5mgのZn−メタロチオ
ネイン（0.5ml、10-4M）に加えた。30分間イン
キユベートさせた後、交換標識Zn／110mAg−
MTを例におけるようにしてサイズ排除HPLC
により精製させた。精製後、110mAg（NH3）+ 2とし
て加えられた銀−110活性の70％がZn／110mAg−
MTと共に残存した。すなわち34nモルの銀−
110mが0.5mgZn−MTに交換された。メタロチオ
ネイン製造に関しては同位元素効果は存在してい
ないので、111Ag（NH3）+ 2の110mAg（NH3）+ 2への置
換は比肩しうる結果を与える。 例 Zn、99mTc−メタロチオネイン（MT）／抗
THY1.1コンジユゲートの製造および評価 (a) Zn、99mTc−MT／抗THY1.1−コンジユゲー
トの製造 0.01Mホスフエートバツフアー（PH7.0）中
のZn−メタロチオネイン（1.0mg／ml、10-4M）
にグルタルアルデヒド（１mg、最終濃度
10-2M）を加えた。１時間室温に置いた後、未
反応グルタルアルデヒドを６時間0.01Mホスフ
エートバツフアー（PH7.0）で透析（「スペクト
ラ／ポル６」〔2000MWCO）〕させることによ
り除去した。このグルタルアルデヒド処理メタ
ロチオネイン（10-4M）0.5mlにモノクローン
抗体（MAb）の0.2M重炭酸塩バツフアー（PH
9.5）0.5ml中の抗THY1.1 １mgを加えた。抗
TTHY1.1とグルタルアルデヒド処理Zn−メタ
ロチオネインとの間の反応を４℃でPH9.3で18
時間続けた。この時0.1mlの0.5Mトリス／0.1M
NaBH4の溶液を加えた。室温で１時間還元さ
せた後、Zn−メタロチオネイン／抗THY1.1−
コンジユゲートを24時間0.01Mホスフエートバ
ツフアー（PH6.8）で透析して〔「スペクトラ／
ポル６」（50000MWCO）〕未反応水素化硼素ナ
トリウムおよびグルタルアルデヒド処理Zn−
メタロチオネインを除去した。このコンジユゲ
ート0.1mgに3.5ｍCiの99mTc−グルコスカン
（ニユーイングランド・ニユークレアー社製）
を加えそしてこの混合物を30分インキユベート
させた。この交換標識Zn、99mTc−メタロチオ
ネイン／抗THY1.1コンジユゲートを、ビオラ
ドTSK−250ゲル過カラム（ビオラド社製）
を使用して、0.1Mホスフエートバツフアー
（PH7.0）で1.0ml／分で溶出させるHPLCにより
精製させた。精製後、0.53ｍCiの99mTcがZn、99
ｍTc−MT／抗THY1.1コンジユゲート（0.1
mg）と共に残存した。 (b) Zn、99mTc−MT／抗THY1.1−コンジユゲー
トのマウスSL1およびSL2腫瘍細胞への結合 抗原に対するZn、99mTc−MT／抗THY1.1コ
ンジユゲートの活性をマウスSL1およびSL2腫
瘍細胞をAKR／ジヤクソンおよびAKR／カン
バーランド胸腺細胞と置き換える「J.
Immunol.」第25巻第837頁（1980）記載の細胞
結合検定法を使用して評価した。SL1
（THY1.1抗原陰性）およびSL2（THY1.1抗原
陽性）腫瘍細胞〔「Virology」第81巻第363頁
（1977）参照〕を37℃で湿つた６％CO2定温器
中で20％馬血清および20ｍML−グルタミンを
補充したロスウエルパーク・メモリアル・イン
ステイテユート（RPMI）1640培地で増殖させ
た。細胞の増殖速度はSL1に対しては１日当り
約３倍、そしてSL2に対しては１日当り５倍で
あつた。検定に使用するために腫瘍細胞を単離
し、RPMI−1640培地に再懸濁し、そして標準
技術を使用して計算した。SL1およびSL2細胞
を共にZn、99mTc−MT／抗THY1.1（28nCiコン
ジユゲート、５ｍCi／mg）またはZn、99mTc−
MT（482nCi MT、395ｍCi／mg）と共に30分
インキユベートし、遠心によつて非結合MAb
から分離させ、洗い、そして99mTc活性を計算
した。約55％の99mTc標識抗−THY1.1が抗原
陽性SL2細胞に結合し、一方抗原陰性SL1細胞
には99mTc−標識コンジユゲートはほとんどま
たは全く結合しなかつた。事実、99mTc−標識
抗−THY1.1のテストされた抗原濃度に対する
プロツトは55％結合において水平化の徴候を示
さなかつた。非コンジユゲート化99mTc−標識
MTはSL1またはSL2腫瘍細胞のどちらにもほ
とんどまたは全く結合しなかつた。結論として
抗原による抗THY−1.1の結合はそのコンジユ
ゲーシヨンMTにより大きな悪影響を受けず、
そしてZn、99mTc−MT／抗−THY1.1コンジユ
ゲートは抗THY−1.1について見られる抗原特
異性を保持していた。従つて驚くべきことに、9
９ｍTc−MTの添加は抗THY−1.1の生物学的特
異性にほとんど影響を与えなかつた。 例 Zn、99mTc−メタロチオネイン／抗人乳癌B6.2
の製造および評価 (a) Zn、99mTc−MT／B6.2コンジユゲートの製
造 Zn、99mTc−メタロチオネイン／抗−
THY1.1の製造のための例記載の方法を0.6
mgZn−MT（５×10-5M）、１mgグルタルアルデ
ヒドおよび３mg抗人乳癌B6.2を使用して実施
した。Zn−MT／B6.2を最終的に0.15M NaCl
含有の0.01のホスフエートバツフアー（PH8.0）
で６時間、次いで0.15M NaCl含有の0.01Mホ
スフエートバツフアー（PH7.0）で18時間〔「ス
ペクトラ／ポル６」（50000MWCO）〕透析した
後、150ｍCiの99mTc−グルコスカン （ニユ
ーイングランド・ニユークリアー社製）を加え
そして30分混合させることによりこのコンジユ
ゲート（２mg）を交換標識させた。ピオラド
TSK−250ゲル過カラムを使用する1.0ml／
分で0.1Mホスフエートバツフアー（PH7.0）で
溶出させるサイズ排除HPLCによつてこの99m
Tc−MT−標識B6.2を精製させた。精製後、
30ｍCiの99mTcがZn、99mTcMT／B6.2コンジユ
ゲートと共に残存した。 (b) Zn、99mTc−MT／B6.2コンジユゲートの人
MCF−７およびA375腫瘍細胞への結合 MAbB6.2の、それが標的とする抗原を結合
する能力に対するMTコンジユゲーシヨンの効
果を細胞結合検定法で評価した。これには組織
培養で保存されている二つの人腫瘍セルライン
すなわち人乳癌MCF−７〔「J.Natl.Cancer
Inst」第51巻第1409〜1416頁（1973）参照〕お
よび人メラノーマA375〔「J.Natl Cancer Inst.」
第51巻第1417頁（1973）参照〕が使用された。
MCF−７腫瘍細胞はB6.2が結合する抗原を有
しており、〔「Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）」第
78巻第3199頁（1981）参照〕、一方A375細胞は
これを有していない。それらは放射能標識
B6.2の非特異的結合に関するコントロールと
して働く。検定に使用するための腫瘍細胞は次
の方法により得られる。接種３〜４日後トリプ
シン／EDTA試薬〔カタログNo.610〜5300（ギ
ブコ・ラボラトリーズ社製）〕を増殖培地の中
の腫瘍細胞のモノレイヤーに加えた。１〜２分
振盪後、トリプシン／EPTA混合物を除去しそ
して新しい同一混合物の区分量で置換させた。
得られた混合物を37℃で５〜10分インキユベー
トして完全な細胞剥離を確実にした。この細胞
を１％牛血清アルブミン（BSA）含有の
RPMI1640培地に懸濁させ、そして標準技術を
使用して計算した。このようにして製造された
MCF−７およびA375細胞をBSAでコーテイン
グさせたミクロ遠心管中で２時間37℃でZn、99m
Tc−MT／B6.2（0.01665uCiのコンジユゲート、
1.53ｍCi／mg）と共にインキユベートした。イ
ンキユベーシヨンの終りに細胞を遠心分離によ
つて非結合MAbから分離させ、RPMI1640培
地（＋１％BSA）で３回洗い、そして99mTc活
性を計算した。Tc−標識B6.2の約70％が単一
細胞懸濁において抗原陽性MCF−７細胞に結
合し、一方対照A375細胞には99mTc活性の５％
未満しか結合しなかつた。抗−THY1.1MAb
に見られるように、MTとB6.2のコンジユゲー
トは抗原に対する特異性が全般的に保持された
コンプレツクスを生成させる。 (c) Zn、99mTc−メタロチオネイン／B6.2の生体
薬品作用機構 放射性沃素化B6.2は無胸腺マウスで生体内
で人乳癌異種移植を標的としてきたことが示さ
れている〔「Cancer Research」第43巻第736頁
（1983）参照〕。MTのコンジユゲートがB6.2の
人乳癌を標的とする能力に及ぼす効果を測定す
るために、クラウザーまたはA375固型腫瘍を
有する無胸腺マウスにおいて99mTc標識MT／
B6.2を評価した。B6.2抗原陽性であるクラウ
ザー腫瘍〔「Cancer」第47巻第2269頁（1978）〕
およびB6.2抗原陰性のA375腫瘍〔「J.Natl.
Cancer Inst.」第51巻第1417頁（1973）〕を無
胸腺マウスの背中の表面上の皮下部位で増殖さ
せた。200〜600mgの腫瘍を有する各マウス（17
〜25ｇ）に50uCiのZn、99mTc−MT／B6.2を注
射しそして48時間にわたつて種々の時点で殺害
した（一つの時点あたり３〜４匹のマウス）。
選ばれた臓器を取り出し、秤量しそして99mTc
活性を測定した。抗原陽性（Ag+）クラウザー
および非特異性抗原陰性（Ag-）対照A375腫
瘍において見出されたZn、99mTc／B6.2の１ｇ
当りの％注入用量は表に与えられている。表
に示されているデータに基づいてZn、99mTc
−MT／B6.2は生体内でB6.2の人乳癌を標的と
する能力を保持しており、特に24時間ではクラ
ウザー腫瘍中の取込みはA375に比べて約３：
１である。放射性沃素化B6.2に対して発表さ
れた生体分布データと比べた場合〔前記
「Cancer Research」第43巻第736（1983）参照〕
99mTc−標識B6.2ははるかにより速やかに血液
から除去される。結論として、MTのB6.2への
コンジユゲートはその人乳癌に特異的に局在す
る能力を損なうことはなくそして血液からの放
射能標識B6.2の除去を促進させる。 【表】 (d) Zn、99mTc−MT／B6.2使用の腫瘍の検出 乳癌の検出に対して99mTc−MT／B6.2が有
用であることを示すために、200uCiのZn、99m
Tc−MT／B6.2をクラウザーまたはA375腫瘍
を有する無胸腺マウスに静脈内に注射した。各
動物を5.0mmピンホールコリメーターを有する
標準γ線カメラを使用して画像形成させた。注
射後６時間の早い時点で、クラウザー腫瘍
（Ag+）中には可視的な特異的なZn、99mTc−
MT／B6.2が蓄積されているのが証明された。
A375腫瘍（Ag-）中には取込みは証明されな
かつた。画像中に出現した唯一のその他の臓器
は肝臓であつた。注射後24時間ではクラウザー
腫瘍は明らかに輪郭が描かれていた。腫瘍中で
観察された99mTcのカウントは肝臓中で観察さ
れたものに等しいように思われた。膀胱および
腎臓中にもまた活性が存在していた。それと対
照的にA375腫瘍中には99mTc−標識B6.2の可視
的蓄積は存在しなかつた。これらの結果は、生
体内における乳癌組織中の99mTc−標識MT／
B6.2の迅速で特異的局在性および人乳癌の診
断およびステージ決定において99mTc−標識
MAbが有しうる有用性を示している。 例 Zn、99mTc−メタロチオネイン／抗人乳癌B6.2F
（ab′）2の製造および評価 (a) Zn、99mTc−MT／B6.2F（ab′）2の製造 シグマ・ケミカル社より入手したペプシン
（60ug）および３mlの0.1M酢酸ナトリウムバツ
フアー（PH4.0）中の抗人乳癌B6.2（３mg）の溶
液を37℃で１晩インキユベートさせた。生成し
た蛋白質分解フラグメントを0.05M燐酸ナトリ
ウムバツフアー（0.15M塩化ナトリウム含有、
PH7.0）で４℃で透析〔スペクトラ／ポル
（50000MWCO）〕することによりB6.2F（ab′）2
から分離させた。このB6.2F（ab′）2をビオラド
TSK−250カラムを使用して、1.0ml／分で
0.1M燐酸ナトリウムバツフアー（PH7.0）で溶
出させるサイズ排除HPLCおよび非還元性SDS
ポリアクリルアミドゲル電気添加により分析し
た。B6.2F（ab′）2を0.2Mカーボネート／バイカ
ーボネートバツフアー（PH9.5）中の溶液とす
る第２の透析の後で例においてB6.2につい
て記載されているようにして0.6mgZn−MTお
よび１mgのグルタルアルデヒドを使用して、
Zn−MTとのコンジユゲート化を達成した。こ
のZn−MT／6.2F（ab′）2（1.56mg）を165ｍCiの9
９ｍTc−グルコスカン （ニユーイングラン
ド・ニユークリアー社製）を加えそして30分混
合させることにより交換標識させた。ビオラド
TSK−250ゲル過カラムを使用し、且つ1.0
ml／分で0.1Mホスフエートバツフアー（PH
7.0）で溶出させるサイズ排除HPLCによる精
製後、17.6ｍCiの99mTcがZn、99mTc−MT／
B6.2F（ab′）2と共に残つた。 (b) Zn、99mTc−MT／B6.2F（ab′）2コンジユゲー
トの結合 B6.2が標的とする抗原に対するB6.2のＦ
（ab′）2二量体の活性についてMTコンジユゲー
シヨンの効果を例Ｖ、ｂに記載の細胞結合検定
を使用して評価した。Zn、99mTc−MT／B6.2F
（ab′）2コンジユゲート（2.29ng、比活性＝
11.3uCi／ug）を種々の濃度のMCF−７（Ag+）
およびA375（Ag-）細胞とインキユベートさせ
そして結合した99mTc−標識コンジユゲートの
パーセントを測定した。この結果は、99mTc−
標識コンジユゲートの約70〜80％が標的MCF
−７細胞に結合し、一方、非標的A375細胞に
は５％未満の結合しかなかつたことを示した。
すなわちB6.2のＦ（ab′）2に対するZn−MTのコ
ンジユゲーシヨンは抗原によりその結合を低下
させず、また抗原に対するその特異性を変化さ
せることもない。 (c) Zn、99mTc−MT／B6.2F（ab′）2の生体内薬品
作用機構 放射性沃素化B6.2F（ab′）2の、無胸腺マウス
における人乳癌異種移植を標的とする能力は
「Cancer Research」第43巻第736頁（1983）に
示されている。クラウザーおよびA375腫瘍を
担持する無胸腺マウスを使用して、Zn、99mTc
−MT／B6.2F（ab′）2の生内体特異性および薬
品作用機構を測定した。各腫瘍担持マウスに
48.5uCiの99mTc−標識Ｆ（ab′）2コンジユゲート
（比活性＝6.7uCi／ug）を注射し、そして種々
の時点で１ｇ当りの注入用量％を測定しそして
表に記載した。24時間の時点におけるクラウ
ザー腫瘍の取込みの、A375腫瘍の取込みに対
する比は約２：１であつた。このことはMTコ
ンジユゲーシヨン後のB6.2F（ab′）2の腫瘍特異
性の保存を明白に示している。 99mTc−標識B6.2F（ab′）2の血液よりの排除
（blood clearance）は99mTc標識無処理のB6.2
について観察されたものと大体同一であつた。
すなわちこの99mTc−標識B6.2F（ab′）2の特異
性およびその迅速な血液からの排除はMTで標
識されたB6.2のフラグメントがZn、99mTc−
MT／無処理B6.2に対して観察されたと同様の
生体内腫瘍標的性に対する有用性を有している
ことを示す。 【表】 【表】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 求標的生物活性分子とメタロチオネインまた
    は金属結合メタロチオネインフラグメントとの共
    有結合接合体であつて、 前記求標的生物活性分子は、レセプターに結合
    しかつ哺乳動物体のある器官、組織および細胞中
    に局在する抗体またはそのFab、Fab′またはＦ
    （ab′）2フラグメントであり、 前記金属結合メタロチオネインフラグメントは
    下記のアミノ酸配列 １ H2N−Ｋ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−OH ２ H2N−Ａ−Ｃ−Ｋ−Ｄ−Ｃ−Ｋ−Ｃ−Ｔ−
    OH ３ H2N−Ｓ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−
    Ａ−OH ４ H2N−Ｇ−Ｃ−Ｓ−Ｋ−Ｃ−Ａ−Ｑ−Ｇ−
    Ｃ−Ｖ−OHまたは ５ H2N−Ｇ−Ｃ−Ｖ−Ｋ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｄ−
    Ｋ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−OH （但し、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはア
    スパラギン酸、Ｇはグリシン、Ｋはリジン、Ｑは
    グルタミン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニンおよび
    Ｖはバリンを示す）を有し、 前記メタロチオネインまたは金属結合メタロチ
    オネインフラグメント中の金属の少なくとも一部
    はメタロチオネインまたは金属結合メタロチオネ
    インフラグメントを前記求標的生物活性分子に結
    合させるに充分な親和性を有するIn、Pb、Tc、
    Ru、Hg、Ag、Au、Pd、Cu、Re、Sb、Bi、
    Ca、Pt、Ｗ、Co、Ni、RhおよびOsよりなる群
    から選ばれた追跡標識金属であり、 そして前記共有結合接合体の共有結合は、メタ
    ロチオネイン上の−SH、−NH2、−NHC（＝NH）
    NH2、−OHまたは−COOH基と抗体上の−SH、
    −NH2、−NHC（＝NH）NH2、−COOHまたは
    −OH基との間に直接またはマロンジアルデヒ
    ド、シクロヘキサン−１，２−ジオン、カンフア
    ーキノン、１−シクロヘキシル−３−（２−モル
    ホリニル−４−エチル）カルボジイミド、１−エ
    チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
    ボジイミド、グルタルアルデヒド、Ｎ−（２−ク
    ロロエチル）マレイミド、ジサクシンイミジルタ
    ータレート、サクシンイミジル４−（ｐ−マレイ
    ミドフエニル）ブチレート、２−イミノチオレイ
    ンおよびジメチルアジピイミデートよりなる群か
    ら選ばれた交叉結合剤により形成されている ことを特徴とする接合体。 ２ 追跡標識金属が放射性核種である前記特許請
    求の範囲第１項記載の接合体。 ３ 放射性核種がTc−99m、In−111、In−
    113m、Pb−203、Ru−97、Hg−197、Ag−111、
    Au−198、Pd−103、Cu−67、Re−188、Sb−
    119、Bi−212、Ca−67、Ca−68およびOs−191
    よりなる群から選ばれる、前記特許請求の範囲第
    ２項記載の接合体。 ４ 放射性核種がTc−99m、Hg−197、Ag−
    111、Au−198、Pd−103、Cu−67、Re−188、
    Sb−119およびRu−97よりなる群から選ばれる、
    前記特許請求の範囲第２項記載の接合体。 ５ 放射性核種がTc−99m、Hg−197、Ag−
    111、およびAu−198よりなる群から選ばれる、
    前記特許請求の範囲第２項記載の接合体。 ６ 抗体がモノクロナール抗体である前記特許請
    求の範囲第１項記載の接合体。 ７ モノクロナール抗体が抗−THY1.1および抗
    人乳癌B6.2よりなる群から選ばれる、前記特許
    請求の範囲第６項記載の接合体。 ８ メタロチオネインまたは金属結合メタロチオ
    ネインフラグメントが哺乳類のものである、前記
    特許請求の範囲第１ないし７項のいずれか１つに
    記載の接合体。 ９ メタロチオネインまたは金属結合メタロチオ
    ネインフラグメントが哺乳類のものである、前記
    特許請求の範囲第１項記載の接合体。 １０ (a) チオネインまたはそのフラグメントあ
    るいはメタロチオネインまたはそのフラグメン
    トを、金属の少なくとも一部がIn、Pb、Tc、
    Ru、Hg、Ag、Au、Pd、Cu、Re、Sb、Bi、
    Ca、Pt、Ｗ、Co、Ni、RhおよびOsよりなる
    群から選ばれた追跡標識金属である金属塩また
    は塩コンプレツクスと反応させ、それによりチ
    オネインまたはそのフラグメントを少なくとも
    一部が追跡標識金属を含有しているメタロチオ
    ネインまたは金属結合メタロチオネインフラグ
    メントに変換するかあるいはメタロチオネイン
    またはそのフラグメント中の金属の少なくとも
    一部を追跡標識金属で置き換え、次いで (b) このメタロチオネインまたは金属結合メタロ
    チオネインフラグメントを、レセプターに結合
    しかつ哺乳動物体のある器官、組織および細胞
    中に局在する抗体またはそのFab、Fab′または
    Ｆ（ab′）2フラグメントより選ばれた求標的生物
    活性分子に共有結合により結合させることから
    なり、 前記金属結合メタロチオネインフラグメント
    は下記のアミノ酸配列 １ H2N−Ｋ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−OH ２ H2N−Ａ−Ｃ−Ｋ−Ｄ−Ｃ−Ｋ−Ｃ−Ｔ
    −OH ３ H2N−Ｓ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｓ−Ｓ−Ｃ
    −Ａ−OH ４ H2N−Ｇ−Ｃ−Ｓ−Ｋ−Ｃ−Ａ−Ｑ−Ｇ
    −Ｃ−Ｖ−OHまたは ５ H2N−Ｇ−Ｃ−Ｖ−Ｋ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｄ
    −Ｋ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−OH （但し、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄは
    アスパラギン酸、Ｇはグリシン、Ｋはリジン、
    Ｑはグルタミン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン
    およびＶはバリンを示す）を有し、 そして前記共有結合は、メタロチオネイン上
    の−SH、−NH2、−NHC（＝NH）NH2、−OH
    または−COOH基と抗体上の−SH、−NH2、−
    NHC（＝NH）NH2、−COOHまたは−OH基
    との間に直接またはマロンジアルデヒド、シク
    ロヘキサン−１，２−ジオン、カンフアーキノ
    ン、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリ
    ニル−４−エチル）カルボジイミド、１−エチ
    ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
    ボジイミド、グルタルアルデヒド、Ｎ−（２−
    クロロエチル）マレイミド、ジサクシンイミジ
    ルタータレート、サクシンイミジル４−（ｐ−
    マレイミドフエニル）ブチレート、２−イミノ
    チオレインおよびジメチルアジピイミデートよ
    りなる群から選ばれた交叉結合剤により形成さ
    れている ことを特徴とする、求標的生物活性分子とメタ
    ロチオネインまたは金属結合メタロチオネイン
    フラグメントとの接合体の製造方法。 １１ 追跡標識金属が放射性核種である前記特許
    請求の範囲第１０項記載の製造方法。 １２ 抗体がモノクロナール抗体である前記特許
    請求の範囲第１０項記載の製造方法。 １３ モノクロナール抗体が抗−THY1.1および
    抗人乳癌B6.2よりなる群から選ばれる、前記特
    許請求の範囲第１２項記載の製造方法。 １４ 放射性核種がTc−99m、Ag−111、Au−
    198、Hg−197、Ru−97、Pd−103およびSb−
    119よりなる群から選ばれる、前記特許請求の範
    囲第１１項記載の製造方法。
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