JPH0471490A - 固定化酵素ゲルの製造方法 - Google Patents
固定化酵素ゲルの製造方法Info
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- JPH0471490A JPH0471490A JP18265990A JP18265990A JPH0471490A JP H0471490 A JPH0471490 A JP H0471490A JP 18265990 A JP18265990 A JP 18265990A JP 18265990 A JP18265990 A JP 18265990A JP H0471490 A JPH0471490 A JP H0471490A
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野１
本発明は、固定化酵素ゲルの製造方法に係り、再利用に
よる活性の低下を抑制し、長時間活性を有する固定化酵
素ゲルのＷＩ！遣方法に関するものである。
よる活性の低下を抑制し、長時間活性を有する固定化酵
素ゲルのＷＩ！遣方法に関するものである。
［従来の技術とその課題］
酵素は、常温、常圧といった緩和な条件下で効率よく化
学反応を触媒し、作用特異性が非常に高い特徴を（１し
ているが、酵素を反応終了液から回収し、再利用するこ
とは不可能である。そのため。
学反応を触媒し、作用特異性が非常に高い特徴を（１し
ているが、酵素を反応終了液から回収し、再利用するこ
とは不可能である。そのため。
酵素の触媒活性を保持したまま水に不溶化すること、す
なわち、固定化する方法が検討されてきた。
なわち、固定化する方法が検討されてきた。
酵素の固定化方法には、担体結合法、架橋法、包括法な
どが知られている。従来より、水溶性ビニルモノマーを
用いて高分子ゲルの格子の中に酵素を包括固定化する方
法が知られているが、この方法で固定化したものは、水
溶性ビニルモノマーと架橋剤の池に重合開始剤、重合促
進剤を添加するため、これらにより酵素の活性が低下す
るという欠点があった。
どが知られている。従来より、水溶性ビニルモノマーを
用いて高分子ゲルの格子の中に酵素を包括固定化する方
法が知られているが、この方法で固定化したものは、水
溶性ビニルモノマーと架橋剤の池に重合開始剤、重合促
進剤を添加するため、これらにより酵素の活性が低下す
るという欠点があった。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは、水溶性ビニルモノマーと架橋剤だけで酵
素を高分子ゲルの格子の中に包括固定化する方法を鋭意
検討した。その結果、特定の水溶性ビニルモノマーと特
定の架橋剤を酵素液に溶解し、減圧下で一定時間保持す
ることだけでゲルが形成されるという事実を見出した。
素を高分子ゲルの格子の中に包括固定化する方法を鋭意
検討した。その結果、特定の水溶性ビニルモノマーと特
定の架橋剤を酵素液に溶解し、減圧下で一定時間保持す
ることだけでゲルが形成されるという事実を見出した。
すなわち、本発明方法は、目的の酵素をＭＷＲ溶液に溶
解し、その後、水溶性ビニルモノマーと架橋剤を溶解し
１次いで、減圧にして一定時間保持することから成る。
解し、その後、水溶性ビニルモノマーと架橋剤を溶解し
１次いで、減圧にして一定時間保持することから成る。
本発明において用いられる酵素は、グルコースオキシダ
ーゼ、アルコールオキシダーゼ、ウレアゼなどが知られ
ているが特にこだわる必要はない、また、水溶性ビニル
モノマーは、アクリルアミド、メタアクリルアミド、ア
クリル酸、メタアクリル酸などがあげられる。架橋剤は
、Ｎ、Ｎ’メチレンビスメタアクリルアミドである。
ーゼ、アルコールオキシダーゼ、ウレアゼなどが知られ
ているが特にこだわる必要はない、また、水溶性ビニル
モノマーは、アクリルアミド、メタアクリルアミド、ア
クリル酸、メタアクリル酸などがあげられる。架橋剤は
、Ｎ、Ｎ’メチレンビスメタアクリルアミドである。
水溶性とニルモノマーの濃度は５％から６５％。
架橋剤の濃度は、水溶性ビニルモノマーの濃度に対して
５％から６５％、一定時間保持する圧力は１００ｍｍＨ
ｇ以下、時間は３分以上が適当である。好ましくは、水
溶性ビニルモノマーの濃度は、１０％から３０％、架橋
剤の濃度は、水溶性ビニルモノマーに対して１０％から
２０％、一定時間保持する圧力は１０ ｍ ｍ ）（ｇ
以下、時間は３０分以上がよい０本発明によると重合反
応をさせる際に、従来の方法と異なり、窒素ガスなどの
不活性ガスの雰囲気下で行う必要はないが、不活性ガス
の雰囲気下で反応を行うと重合時間が短縮されて、酵素
活性の低下を防ぐのにさらに有効である。また、重合反
応が、比較的低温で行えるため、酵素の活性低下を防ぐ
のに有効である。なお、本発明は、対象物を酵素にこだ
わることなく、例えば、微生物、オルガネラなどへの応
用が可能であり、本発明によって製造されるゲルは、バ
イオセンサバイオリアクターへの応用が考えられる。ま
た、ゲルｒ適用樹脂、電気泳動用ゲルの製造方法にも応
用可能と考えられる。
５％から６５％、一定時間保持する圧力は１００ｍｍＨ
ｇ以下、時間は３分以上が適当である。好ましくは、水
溶性ビニルモノマーの濃度は、１０％から３０％、架橋
剤の濃度は、水溶性ビニルモノマーに対して１０％から
２０％、一定時間保持する圧力は１０ ｍ ｍ ）（ｇ
以下、時間は３０分以上がよい０本発明によると重合反
応をさせる際に、従来の方法と異なり、窒素ガスなどの
不活性ガスの雰囲気下で行う必要はないが、不活性ガス
の雰囲気下で反応を行うと重合時間が短縮されて、酵素
活性の低下を防ぐのにさらに有効である。また、重合反
応が、比較的低温で行えるため、酵素の活性低下を防ぐ
のに有効である。なお、本発明は、対象物を酵素にこだ
わることなく、例えば、微生物、オルガネラなどへの応
用が可能であり、本発明によって製造されるゲルは、バ
イオセンサバイオリアクターへの応用が考えられる。ま
た、ゲルｒ適用樹脂、電気泳動用ゲルの製造方法にも応
用可能と考えられる。
［実施例 １］
４アルコールオキシダーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄ
ｉｎｉｉ起源、シグマ社製）１０ｍｇ （５，Ｏｕｔ相
当）を５０ｍ１のバイアルビン（径１０ｍｍ１に入れ、
０５Ｍりん酸Ｍ析液（ｐＨ７，０）１．５ｍｌと混合し
溶解した。これに、アクリルアミド１５０ｍｇ、Ｎ、Ｎ
’−メチレンビスメタアクリルアミド（東京化成社製）
１５ｍｇを溶解した。この溶液を１０ｍｍＨｇの雰囲気
にして、３０’Ｃで３時間放置して固定化酵素ゲルを作
成した。
ｉｎｉｉ起源、シグマ社製）１０ｍｇ （５，Ｏｕｔ相
当）を５０ｍ１のバイアルビン（径１０ｍｍ１に入れ、
０５Ｍりん酸Ｍ析液（ｐＨ７，０）１．５ｍｌと混合し
溶解した。これに、アクリルアミド１５０ｍｇ、Ｎ、Ｎ
’−メチレンビスメタアクリルアミド（東京化成社製）
１５ｍｇを溶解した。この溶液を１０ｍｍＨｇの雰囲気
にして、３０’Ｃで３時間放置して固定化酵素ゲルを作
成した。
また、従来から一般的に行われている方法、すなわち、
アルコールオキシダーゼ１０ｍｇを５゜０ｍｌのバイア
ルビンに入れ、０．５Ｍリン酸緩衝液１．５ｍｌと混合
し溶解し、これに、アクリルアミド１５０ｍｇ、Ｎ、Ｎ
’−メチレンビスメタアクリルアミド１５ｍｇを溶解し
、次いで、重合促進剤として５％β−ジメチルアミノプ
ロピオニトリル水溶液０．１ｍｔと重合開始剤として１
％過［酸カリウム水溶液０．１ｍｌ加え、大気圧下で３
０℃で３時間放置して固定化酵素ゲルを作成した。この
ようにして、作成した固定化酵素ゲルをバイアルビンか
ら取りだし全体を扇型に８等分して、２０ｍ１のビーカ
ーに入れ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１．５
ｍｌを加えてゲルを浸した。その後、そのゲル溶液を３
０℃の恒温槽中で３．０％エチルアルコール水溶液（基
質）３．０ｍｌを加えてアルコールオキシダーゼの酵素
反応を行い、５分後に反応液０．１ｍｌを採取し生成し
た過酸化水素を過酸化水素計を用いて測定した。
アルコールオキシダーゼ１０ｍｇを５゜０ｍｌのバイア
ルビンに入れ、０．５Ｍリン酸緩衝液１．５ｍｌと混合
し溶解し、これに、アクリルアミド１５０ｍｇ、Ｎ、Ｎ
’−メチレンビスメタアクリルアミド１５ｍｇを溶解し
、次いで、重合促進剤として５％β−ジメチルアミノプ
ロピオニトリル水溶液０．１ｍｔと重合開始剤として１
％過［酸カリウム水溶液０．１ｍｌ加え、大気圧下で３
０℃で３時間放置して固定化酵素ゲルを作成した。この
ようにして、作成した固定化酵素ゲルをバイアルビンか
ら取りだし全体を扇型に８等分して、２０ｍ１のビーカ
ーに入れ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１．５
ｍｌを加えてゲルを浸した。その後、そのゲル溶液を３
０℃の恒温槽中で３．０％エチルアルコール水溶液（基
質）３．０ｍｌを加えてアルコールオキシダーゼの酵素
反応を行い、５分後に反応液０．１ｍｌを採取し生成し
た過酸化水素を過酸化水素計を用いて測定した。
本発明によるものと従来のものとの比較は、」ユ記測定
法を用い、アルコールオキシダーゼの酵素反応を行い反
応後５分後の過酸化水素を測定したのち、１０分後ゲル
を取りだしリン酸緩衝液で洗浄し、繰り返し９回測定し
比較した。その結果、固定化後、最初に測定した酵素の
活性は従来の方法で得られるものとほぼ同程度であり、
その時を１００％とすると、９回後の酵素の活性は、本
発明によるものは、約８９％の活性を維持していたが、
従来の方法で作成したものは、約４５％の活性を維持し
ていたにｔぎなかった。
法を用い、アルコールオキシダーゼの酵素反応を行い反
応後５分後の過酸化水素を測定したのち、１０分後ゲル
を取りだしリン酸緩衝液で洗浄し、繰り返し９回測定し
比較した。その結果、固定化後、最初に測定した酵素の
活性は従来の方法で得られるものとほぼ同程度であり、
その時を１００％とすると、９回後の酵素の活性は、本
発明によるものは、約８９％の活性を維持していたが、
従来の方法で作成したものは、約４５％の活性を維持し
ていたにｔぎなかった。
［発明の効果］
本発明方法によれば、重合促進剤や重合開始剤を添加す
ることなく、長時間活性を有する固定化酵素ゲルを製造
することができる。
ることなく、長時間活性を有する固定化酵素ゲルを製造
することができる。
４ 図面のｌ！ｊ！ｔ！な説明
図は、繰り返し酵素活性測定の結果を表すグラフである
。
。
ｉＡ許出出願
人本たばこ産業株式会社
操り返しく回）
Claims (5)
- （１）水溶性ビニルモノマーと架橋剤を目的の酵素液に
加え、一定減圧下に保持して重合させることを特徴とす
る固定化酵素ゲルの製造方法。 - （２）水溶性ビニルモノマーの濃度が５％から６５％、
架橋剤の濃度が水溶性ビニルモノマーの濃度に対して５
％から６５％である請求項（１）記載の固定化酵素ゲル
の製造方法。 - （３）架橋剤がＮ，Ｎ′−メチレンビスメタアクリルア
ミドである請求項（１）記載の固定化酵素ゲルの製造方
法。 - （４）減圧下で保持する時の圧力が１００ｍｍＨｇ以下
である請求項（１）記載の固定化酵素ゲルの製造方法。 - （５）減圧下で保持する時の温度が４〜６０℃、時間が
３分以上である請求項（１）記載の固定化酵素ゲルの製
造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18265990A JPH0471490A (ja) | 1990-07-12 | 1990-07-12 | 固定化酵素ゲルの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18265990A JPH0471490A (ja) | 1990-07-12 | 1990-07-12 | 固定化酵素ゲルの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0471490A true JPH0471490A (ja) | 1992-03-06 |
Family
ID=16122191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18265990A Pending JPH0471490A (ja) | 1990-07-12 | 1990-07-12 | 固定化酵素ゲルの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0471490A (ja) |
-
1990
- 1990-07-12 JP JP18265990A patent/JPH0471490A/ja active Pending
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