JPS5945885A - 固定化酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素及びその製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も実施されているが、従来は酵素を基質の水／８／＆に
溶解させて、この水溶液中で反応を行なわせている。し
かし、このような方法によれば、反応条件を一定に維持
しつつ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素
を失活させることなく、生成物と酵素を分離することが
非常に困難であり、酵素が不経済に消費される。そのう
え、反応が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するために、既に水不溶性の担体
に酵素を固定化し、この固定化酵素に基質を反応させる
ことが提案されている。このような酵素の固定化方法の
代表的なものに、水不溶性の担体に酵素を共有結合、イ
オン結合又は物理吸着によって結合させる担体結合法が
知られている。

しかし、従来、この方法において用いられている担体は
、通常、セルロース、デキストラン、アガロース等の多
ＩＮ類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、多孔性ガラ
ス等の径１韮乃至数ｍｌの粒子であり、このような粒子
に酵素が固定化された固定化酵素は、通常、カラムに充
填され、固定されて、基質溶液と接触されるので、基質
が高分子量の場合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応
に長時間を要すると共に、反応収率が低いという問題が
ある。

本発明は上記した問題を解決するためになされたもので
あって、反応系において遊離の酵素と同様に自由に移動
でき、従って、固定化酵素表面への基質の拡散が殆ど問
題にならない高活性の固定化酵素及びその製造方法を提
供することを特徴とする特に、水分散性を有する重合体
粒子を担体とする場合、これが酵素を共有結合させるだ
めの官能基を有しないときにも、この重合体粒子に共有
結合法により最も容易に酵素を固定化し得るアミノ基を
導入し、これを新たに担体として用いた固定化酵素、及
びその製造方法を提供することを目的とする。

本発明による固定化酵素は、水分散型高分子重合体粒子
の表面にポリアミンとジアルデヒドのシッフ塩基からな
り、且つ、遊離のアミノ基を有する重合体が沈着され、
上記アミノ基を介して酵素が共有結合にて固定されてい
ることを特徴とし、かかる固定化酵素は、本発明に従っ
て、水分散型高分子重合体粒子の水分散液中でポリアミ
ンを過剰としてポリアミンとジアルデヒドとを反応させ
、水分散型高分子重合体粒子の表面に遊離のアミノ基を
有する上記ポリアミンとジアルデヒドのシッフ塩基から
なる重合体を沈着させ、次に、上記のアミノ基を介して
共有結合にて酵素を固定化することによって得られる。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、そ
の平均粒径が０．０３μ〜２μ、好ましくは０．０７μ
乃至１μである。粒径が小さすぎると、これを担体とす
る固定化酵素を水中に分散させて酵素反応を行なわせた
後の回収が困難となり、一方、粒径が大きすぎると、単
位体積当りの粒子表面積が小さくなり、酵素の固定化量
が少なくなると共に、水中に分散させるのが困難となる
ので好ましくない。

また、上記水分散型高分子重合体粒子は、酵素反応の行
なわれる温度より高いガラス転移点を有する限りは、任
意の重合体からなっていてよく、例えば、エチレン、プ
ロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニ
ル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、スチ
レン、メチルスチレン、ビニルトルエン、ブタジェン、
イソプレン、アクリルアミド、メタクリルアミド、アク
リロニトリル、メタクリレートリル等の１種又は２種以
上の単量体を通常の方法に従って、乳化剤を用いて、又
は用いずして、乳化重合させることにより得られる。

好ましくは、本発明において用いる水分散型高分子重合
体粒子は側鎖に極性基を有する重合体からなる。かかる
極性基を有する水分散型高分子重合体粒子は、極性基を
有する単量体を上記のような単量体（以下、共重合性単
量体ということがある。）と通常の方法に従って乳化共
重合させることにより得ることができる。

上記極性基としては、例えば、スルホン酸基、カルボキ
シル基、リン酸基等の酸基、第３級アミノ基、第４級ア
ミノ基等の塩基性基等を挙げることができる。このよう
な極性基を有する単量体の具体例としては、スチレンス
ルホン酸、スルホプロピルメタクリレートのようなスル
ホン酸基を有する単量体、アクリル酸、メタクリル酸、
イタコン酸のようにカルボキシル基を有する単量体、ア
シツドホスホキシエチルメククリレーｉ・、３−クロロ
−２−アシツドホスホキシエチルメタクリレ−トのよう
なリン酸基を有する単量体、ジメチルアミノエチルメタ
クリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド
のような第３級アミノ基を有する単量体、メタクリルア
ミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、メタ
クリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロラ
イドのような第４級アミノ基ををする単量体を挙げるこ
とができる。

更に、本発明においては、極性基を有する単量体及びこ
れと共重合性を有する前記共重合性単量体に加えて、内
部架橋用多官能性単量体を乳化共重合させるのが好まし
い。このような内部架橋用多官能性単量体の具体例とし
ては、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレ
ングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコー
ルジメタクリレート、ジプロピレングリコールジメタク
リレート、１．３−ブチレングリコールジメタクリレー
ト、トリエチレングリコールジアクリレート、トリメチ
ロールプロパントリメタクリレート、トリメチロールプ
ロパントリアクリレート、テトラメチロールメタンテト
ラアクリレート等のような多価アルコールの（メタ）ア
クリレートが好ましく用いられる。ジビニルベンゼンも
好ましく用いられる。

内部架橋用多官能性単量体の使用は、極性基を有する単
量体と前記共重合性単量体との乳化共重合において、好
ましくない水溶性重合体の生成を抑えると共に、重合の
安定性を高めるのに役立つ。

本発明においては、極性基を有する単量体０．２〜３０
重量％と前記共重合性単量体７０〜９９．８重量％とを
乳化共重合させて水分散型高分子重合体粒子を得るのが
好ましいが、上記した内部架橋用多官能性単量体をも共
重合させる場合には、これを全単量体組成の２０重量％
までの範囲で使用するのがよい。余りに多量に使用する
と、却って重合の安定性を損なうおそれがあるからであ
る。

尚、本発明において、得られる水分散型高分子重合体粒
子に乳化剤が混在すると、酵素の固定化に際して酵素が
失活するおそれがあるので、好ましくは、上記のような
単量体を乳化重合させるときに乳化剤を用いないのがよ
いが、しかし、乳化剤が用いる酵素に対して有害な影響
を与えないときは、乳化剤を必要に応じて用いてもよい
のは勿論である。

また、本発明においては、極性基を有する水分散型高分
子重合体粒子を得るに際して、上記のように、予め極性
基を有する単量体を前記共重合性単量体と乳化共重合さ
せてもよいが、重合後に極性基に変換し得る官能性基を
有する単量体を、必要ならば共重合性単量体と共に乳化
共重合させて水分散型高分子重合体粒子を得、この後に
この重合体の有する官能性基を化学反応により極性基に
変換してもよい。極性基に変換し得る官能性基を有する
単量体として、例えば、アクリル酸エステルやメタクリ
ル酸エステルを挙げることができ、このような単量体成
分を含む重合体粒子を酸又はアルカリで処理すれば、極
性基としてカルボキシル基を有する水分散型高分子重合
体粒子を得ることができる。また、グリシジル基を有す
る単量体成分を含む重合体粒子にに第３級アミンを反応
させると、第し級アミノ基を有する重合体粒子を得るこ
とができる。

本発明によれば、先ず、上記した水分散型高分子重合体
粒子を水中に分散させ、ポリアミンを過剰として、上記
ポリアミンとジアルデヒドとを反応させることにより、
ポリアミンとジアルデヒドとからなるシッフ塩基の重合
体を水分散型高分子重合体粒子表面に沈着させる。

本発明において用いるポリアミンは、アルデヒド基と反
応し得るアミノ基を分子内に２個又はそれ以上有するア
ミン化合物又は重合体を意味し、好ましくは芳香族、脂
肪族又は脂環族のジアミンやトリアミンが好ましく用い
られ、具体的にはフェニレンジアミン、キシリレンジア
ミン、フェニレントリアミン、トリアミノトルエン、エ
チレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等が用いられ
る。また、ポリエチレンイミンも用いることができる。

ジアルデヒドも芳香族や脂肪族のジアルデヒドが好まし
く用いられるが、具体的にはグルタルアルデヒド、コハ
ク酸ジアルデヒド、グリオキザール、マレインジアルデ
ヒド、テレフタルジアルデヒド等が用いられる。

水分散型高分子重合体粒子の表面にシッフ塩基を沈着さ
せる反応において、用いるポリアミンとジアルデヒドと
の当量比ば１．５：１〜１０：１であり、好ましくは２
：１〜５：１である。この範囲を越えてジアルデヒドを
過多に用いるときは、形成されるシッフ塩基重合体の分
子量が小さすぎ、従って、少なくなるので好ましくない
。

」二記の反応は、シップ塩基を生成させるための通常の
反応条件下で行われる。例えば、水分散型高分子重合体
粒子の水分散液にポリアミンとジアルデヒドとのそれぞ
れの水溶液を加え、攪拌することにより行なうが、ポリ
アミンとジアルデヒドとのそれぞれの水溶液を加える順
序は特に制限されない。反応は通常、塩酸等による酸性
条件下で行なうことにより円滑に進行する。また、反応
は通常、常温で数時間行なえばよい。反応温度が高い程
、反応速度は大きいが、水分散型高分子重合体粒子の安
定性が一方において悪くなるので、反応は通常、５０℃
以下で行なうのが望ましい。この後、必要に応じて、未
反応のポリアミンとジアルデヒドとを遠心分離、膜分離
等の適宜手段により除去し、かくして、表面に遊離のア
ミノ基を有するシッフ塩基の重合体が沈着された水分散
型高分子重合体粒子を得る。

次いで、本発明によれば、このように処理された水分散
型高分子重合体粒子に酵素を共有結合にて固定化するこ
とにより、本発明による固定化酵素を得ることができる
。固定化の手法としては、水分散性高分子重合体粒子の
表面にあるアミノ基を介して酵素を共有結合し得るもの
であれば、とくに制限されることなく、従来より知られ
ている任意の手法によることができる。例えば、ジアゾ
ニウム法、カルボジイミド法、チオシアネート法、ジア
ルデヒド法等が適宜に採用される。尚、本発明において
、酵素をアミノ基に共有結合にて固定化する場合、必要
に応じて所謂スペーサー基を用いることができる。

本発明による固定化酵素は水分散液として用い１ られ、基質と接触される。固定化酵素の使用量は、固定
化酵素の粒径や酵素の固定化量、必要とする反応速度、
基質濃度等により適宜に決定される。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素でもよく
、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必ずしも高度に精
製されている必要はなく、抽出液や部分精製品も用いら
れる。更に、本発明に従って、単一の酵素を固定化して
もよいが、複数の酵素を同時に固定化してもよい。

本発明において酵素は特に制限されず、種々の酵素が用
いられる。具体例として、アミノ酸オキシダーゼ、カタ
ラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ
、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アスパラギ
ン酸アセチルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミ
ノトランスフェラーゼ、グリシンアミノ２ トランスフェラーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸アミ
ノトランスフェラーゼ、グルタミン酸−ビルピン酸アミ
ノトランスフェラーゼ、タレアチンホスホキナーゼ、ヒ
スタミンメチルトランスフェラーゼ、ピルビン酸キナー
ゼ、フラクトキナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンア
セチルトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチダー
ゼのような転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、アミラーゼ、アル
ギナーゼ、Ｌ−アルギニンデイミナーゼ、インベルター
ゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エステラ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カリクレイン、キモトリ
プシン、トリプシン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌ
クレオチダーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラス
ミン、ペクチナーゼ、ヘキソキナーゼ、ペプシン、ペク
チナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホ
スファターゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リボヌクレアー
ゼ、レンニンのような加水分解酵素、アスパラギン酸デ
カルボキシラーゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ
、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモ
ニアリアーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、
フマラーゼ、フマール酸ヒドラクーゼ、リンゴ酸シンテ
ターゼのようなりアーゼ、アラニンラセマーゼ、グルコ
ースイソメラーゼ、グルコースホスフェートイソメラー
ゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオ
ニンラセマーゼのような異性化酵素、アスパラギンシン
ターゼ、グルタチオンシンターゼ、ピルビン酸シンクー
ゼのようなりガーゼ等を挙げることができる。

本発明による固定化酵素は以上のように、水分散型高分
子重合体粒子に沈着された遊離のアルデヒド基を有する
シッフ塩基に、そのアミノ基を介して酵素が固定化され
ているので、従来のセルロース誘導体粒子等の場合と異
なり、固定化酵素自体が遊離の酵素と同様に反応系内を
自由に移動できるため、基質の拡散が反応に殆ど影響を
与えず、従って、高分子量の基質の場合にも遊離の酵素
と同様の高い反応速度で酵素反応を行なわゼることがで
きる。また、担体として用いる重合体粒子が官能基を有
しない場合でも、簡単な操作によってシッフ塩基を沈着
させ、その過剰のアミノ基を介して酵素を固定化するこ
とができるので、酵素反応に適するように重合体粒子を
設計することができ、且つ、このような重合体粒子への
酵素の固定化も、従来の共有結合法その他による酵素の
固定化と異なり、操作が簡単であるうえに、酵素の固定
化条件が緩やかであるため、固定化時の酵素の失活が少
なく、活性収率が高いという利点を有し、更に、長期に
わたる使用によっても、酵素活性が高く維持される。

しかも、本発明による固定化酵素は水不溶性の担体に固
定化されているため、酵素反応後には遠心分離、塩析、
凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性膜による膜分離等によ
って容易に回収でき、長期間にわたって繰返して使用す
ることができる。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により限定されるものではない。

５ 実施例１ メタクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムク
ロライド３ｇ１メチルメタクリレート８０ｇ、ｌ−リエ
チレングリコールジメタクリレート２ｇ及びアクリロニ
トリル１５ｇを蒸留水２３０ｇに加え、２，２”−アゾ
ビス−２−アミジノプロパンニ塩酸塩０．３ｇを水１０
ｇ′に溶解した重合開始剤水溶液を６０℃の温度で窒素
気流下に加え、１２　Ｏｒｐｍで攪拌しつつ８時間重合
させて、固形分３０％、平均粒径０．３μの重合体粒子
の水分散液を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分１０％とした分散
液１００ｍ１に、塩酸でｐＨを６に調整した１％のｍ−
キシリレンジアミン水溶液１０ｍ１を加えて攪拌し、次
に、１％のグルタルアルデヒド水溶液４ｍｌを加えて、
２５℃で５時間攪拌して反応させた。反応終了後、遠心
分離し、沈降した重合体粒子を蒸留水で洗滌して、未反
応のキシリレンジアミン及びグルタルアルデヒドを除去
した後、再び蒸留水１０’Ｏｍｌ中に分散させた。尚、
この重６ 合体粒子におけるアミノ基は、粒子１ｇ当り０．２５ミ
リモルであった。

次に、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ”−〔β−（Ｎ−メチル
モルホリノ）エチル〕カルボジイミドーｐ−トルエンス
ルホネート１．５ｇを水３０ｍ１に溶解し、塩酸でｐＨ
を５．０に調整した後、これを上記重合体粒子分散液５
０ｍ１に加え、更にウレアーゼ１ｇを水１０ｍ１に溶解
した酵素水溶液を加え、攪拌しながら５℃で２０時間反
応させた。反応終了後、遠心分離し、未固定のウレアー
ゼと未反応のカルボジイミドを除去した。沈降した重合
体粒子を０゜１Ｍリン酸水素二カリウム及び０．１　Ｍ
リン酸二水素カリウムから調製した緩衝液（ｐＨ７，０
）に再分散させて、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は重合体粒子１
ｇ当り１８■であり、また、固定化された酵素の活性の
理論量に対する実際の活性の割合として定義される活性
収率は４６％であった。活性収率は、０．０３Ｍの尿素
水溶液を基質とし、３５°Ｃで１０分間固定化酵素を反
応させ、生成したアンモニア量＜１１モル／分）を塩酸
滴定で求めて活性を測定し、これと等しい活性を有する
遊離の酵素量を酵素固定化量で除して求めた。

この固定化酵素を上記のようにして活性を測定した後、
緩衝液にて洗滌し、再び活性を測定するという操作を５
回繰り返したが、活性は初期の活性の９０％を保持して
いた。

実施例２ アクリル酸３ｇ、スチレン５０ｇ１メチルメタクリレー
ト２５ｇ、ジビニルベンゼン２ｇ及びアクリロニトリル
２０ｇを蒸留水２３０ｇに加え、過硫酸カリウム０．３
ｇを水１０ｇに溶解した重合開始剤水溶液を７０℃の温
度で窒素気流したに加え、］　２０　ｒｐｍで攪拌しつ
つ８時間重合させて、固形分３０％、平均粒径０．２μ
の重合体粒子の水分散液を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分１０％とした分散
液１００ｍ１に、塩酸でｐｌ＋を６に調整した１％のへ
キサメチレンジアミン水溶液１２ｍ１を加えて攪拌し、
次に、１％のグルタルアルデヒド水溶液５ｍｌを加えて
１，２５°Ｃで５時間攪拌して反応させた。反応終了後
、遠心分離し、沈降した重合体粒子を蒸留水で洗滌して
、未反応のへキサメチレンジアミン及びグルタルアルデ
ヒドを除去し、再び蒸留水中に分散させて、遊離のアミ
ノ基を有するシッフ塩基重合体の沈着した水分散型高分
子重合体粒子を得た。尚、この重合体における遊離アミ
ノ基は、重合体１ｇ当り０．０８ミリモルであった。

次に、この分散液１００ｍ１にｐ−ニトロヘンズアルデ
ヒドの１％エタノール溶液２００ｍ１を加え、室温で２
時間反応させた後、遠心分離、洗滌し、ニトロ基を有す
る水分散性高分子重合体粒子を得た。

この重合体粒子を水１００ｍ１に再分散させ、これに０
．１Ｍ亜ユニチオン酸ナトリウム０．５　Ｍ炭酸水素す
１−リウムを含有する水溶液１００ｍ１を加え、室温で
２時間反応させて、重合体粒子の有する二ｌ・口塞をア
ミノ基に還元した。遠心分離後、十分に洗滌し、アミノ
基を有する水分散性高分子重合９ 体粒子を得た。

この重合体粒子を水１００ｍ１に分散させ、これに０．
１　Ｍの亜硝酸ナトリウムの０．５　Ｎ塩酸水溶液５０
ｍ１を加えて、約３°Ｃの温度で１時間反応させ、重合
体粒子の有するアミノ基をジアゾニウム基に変えた。こ
の後、重合体粒子を十分に洗滌して、ジアゾニウム基を
有する水分散性高分子重合体粒子を得た。

この重合体粒子を水１００ｍ１に再分散させ、これにト
リプシン３ｇを実施例１と同様の緩衝液３０ｍ１に分散
させた酵素溶液を加え、５℃の温度で２４時間反応させ
た後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を緩衝液で洗滌
し、未固定のトリプシンを除去して、本発明による固定
化酵素を得た。

この固定化酵素におけるトリプシンの固定化量は、重合
体粒子１ｇ当り１２■であり、また、活性収率は３８％
であった。

尚、１％カゼイン水溶液を基質として、酵素を３５℃で
１０分間反応させた後、５％トリクロル酢酸により高分
子量タンパク質を沈殿させ、遊離０ の非タンパク性分解質量を２８０ｎｍの吸光度から求め
、この吸光度を１分間に１．０増加させる活性を１単位
として、活性収率を求めた。

実施例３ メチルメタクリレ−）８０ｇ、ｈジエチレングリコール
ジメタクリレート２ｇ及びアクリロニトリル１８ｇを蒸
留水２３０ｇに加え、過硫酸カリウム０．３ｇを水１０
ｇに熔解した重合開始剤水溶液を７０℃の温度で窒素気
流下に加え、１２０ｒｐｍで攪拌しつつ８時間重合させ
て、固形分３０％、平均粒径０．４μの重合体粒子の水
分散液を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分１０％とした分散
液１００ｍ１に、塩酸でｐｌ＋を６に調整した１％のｍ
−キシリレンジアミン水溶液１０ｍ１を加えて攪拌し、
次に、１％のグルタルアルデヒド水溶液４ｍｌを加えて
、２５℃で５時間攪拌して反応させた。反応終了後、遠
心分離し、沈降した重合体粒子を蒸留水で洗滌して、未
反応のキシリレンジアミン及びグルタルアルデヒドを除
去した後、再び蒸留水１００ｍ１中に分散させた。尚、
この重合体粒子におけるアミノ基は、粒子１ｇ当り０．
０６ミリモルであった。

このようにして得られた重合体粒子に実施例１と全く同
じ方法によりウレアーゼを固定化し、本発明による固定
化酵素を得た。この固定化酵素におけるウレアーゼ固定
化量は、重合体粒子１ｇ当りＬＩｇであって、活性収率
は４５％であった。

実施例４ メチルメタクリレート８０ｇ及びアクリロニトリル１７
ｇを蒸留水２３０ｇに加え、過硫酸アンモニウム０．３
ｇを水１０ｍ１に溶解した重合開始剤水溶液を７０°Ｃ
の温度で窒素気流下に１２　Ｏｒｐｍで攪拌しつつ８時
間重合させて、固形分２９％、平均粒径０．３０μの重
合体粒子の水分散液を得た。

この水分散液を用いて、実施例１と同様の方法により、
遊離のアミノ基を有する重合体粒子であって、且つ、シ
ッフ塩基重合体がその上に沈着した重合体粒子を得た。

この重合体粒子における遊離アミノ基量は重合体粒子１
ｇ当り０．１８　ミリモルであった。

このようにして得られた重合体粒子に実施例１と全く同
じ方法により、上記遊離のアミノ基を介してウレアーゼ
を固定化し、本発明による固定化酵素を得た。この固定
化酵素におけるウレアーゼ固定化量は、重合体粒子１ｇ
当り１０■であって、活性収率は４５％であった。

この固定化酵素を用いて、繰返し反応を行なった結果、
５回の繰返しによっても、初期の活性の９０％を保持し
ていた。

特許出願人　日東電気工業株式会社 代理人　弁理士　　牧　野　逸　部 ３ ４７７− ４

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）水分散型高分子重合体粒子の表面にポリアミンと
   ジアルデヒドのシッフ塩基からなり、且つ、遊離の−ｒ
   ＜ノ基を有する重合体が沈着され、上記アミノ基を介し
   て酵素が共有結合にて固定されていることを特徴とする
   固定化酵素。
2. （２）水分散型高分子重合体粒子が０．０３〜２μの平
   均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の固定化酵素。
3. （３）水分散性高分子重合体が側鎖に酸基及び／又は塩
   基性基を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   又は第２項記載の固定化酵素。
4. （４）水分散型高分子重合体粒子の水分散液中でポリア
   ミンを過剰としてポリアミンとジアルデヒドとを反応さ
   せ、水分散型高分子重合体粒子の表面に遊離のアミノ基
   を有する上記ポリアミンとジアルデヒドのシッフ塩基か
   らなる重合体を沈着させ、次に、上記の７ミノ基を介し
   て共有結合にて酵素を固定化することを特徴とする固定
   化酵素の製造方法。
5. （５）水分散型高分子重合体粒子が０．０３〜２μの平
   均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第４項
   記載の固定化酵素の製造方法。
6. （６）水分散型高分子重合体が側鎖に酸基及び／又は塩
   基性基を有することを特徴とする特許請求の範囲第４項
   又は第５項記載の固定化酵素の製造方法。