JPS5914791A - 固定化酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素及びその製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、・食品等の製造の過程で一部工業的
にも実施されているが、−従来は酵素を基質の水溶液に
熔解させて、この水溶液中で反応を行なわせている。し
かし、・・このような方法によれば、反応条件を一定に
維持しつつ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後幌
酵素を失活させることなく、生成物と酵素を分離するこ
とが非常に困りｔであり、酵素が不経済に消費される。

そのうえ、反応が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するために、既に水不溶性の担体
に酵素を固定化し、この固定化酵素に基質を反応させる
ことが提案されている。このような酵素の固定化方法の
代表的なものに、水不溶性の担体に酵素を共有結合、イ
オン結合又は物理吸着によって結合させる担体結合法が
知られている。

しかし、従来、この方法において用いられている担体は
、通常、セルロース、デキストラン、アガロース等の多
糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、多孔性ガラス
等の径１璽■乃至数鶴の粒子であり、このような粒子に
酵素が固定化された固定化酵素は、通常、カラムに充填
され、固定されて、基質溶液と接触されるので、基質が
高分子量の場合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に
長時間を要すると共に、反応収率が低いという問題があ
る。

特に、酵素を水不溶性担体にイオン結合にて固定した固
定化酵素は、例えば、イオン強度の高い水溶液中で使用
すると、酵素が容易に脱着して、酵素活性が速やかに低
下する欠点を有し、一方、共有結合法によれば、酵素の
脱着のおそれは小さ、　いが、固定化する際の反応が繁
雑であって、酵素が固定化の操作時に失活する場合も少
な（な（、更に費用も高価となる。

本発明は上記した問題を解決するためになされたもので
あって、反応系において遊離の酵素と同様に自由に移動
でき、従って、固定化酵素表面への基質の拡散が殆ど問
題にならない高活性の固定化酵素及びその製造方法を提
供することを目的とする。また、本発明は従来の共有結
合による酵素の固定化方法に比べて遥かに簡単でありな
がら、酵素が安定に固定化されて、その酵素活性が長期
にわたって高く保持される固定化酵素及びその製造方法
を提供することを目的とする。

本発明による固定化酵素は、水分散型高分子重合体粒子
のｉ面にポリアミンとジアルデヒドのシッフ塩基からな
り、且つ、遊離のアルデヒド基を有する重合体が沈着さ
れ、上記アルデヒド基を介して酵素が共有結合にて固定
されていることを特徴とし、かがる固定化酵素は、本発
明に従〕て、水分散型高分子重合体粒子の水分散液中で
シアル遊離のアルデヒド基を有する上記ポリアミンとジ
アルデヒドのシッフ塩基からなる重合体を沈着させ、次
に、上記のアルデヒド基を介して共有結合□にて酵素を
固定化することによって得らｉる。

本発明において用いる水分散型高分子量合体粒子は、そ
の平均粒径が０．０３μ〜２μ、好ましくは０．０７μ
乃至１μであ□る。粒径が小さすぎると、これを担体と
する固定化酵素を水中に分散させて酵素反応を行なわせ
た後の回収が困難となり、一方、粒径が大きすぎると、
単位体積当り゛の粒子表面積が小さくなり、酵素の固定
化量が少なくなると共に、水中に分散させるのが困難と
なるので好ましくない。　　　　　　　　　　　　“ま
た、上記水分散型高分子重合体粒子は、酵素反応の行な
われる温度より高いガラス転移点を有する限りは、任意
の重合体がらなっていてよく、例えば、エチンン、プロ
ピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル
、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、メチ１
ン、メヂルスチレン、ビニルトルエン、ブタジェン、イ
ソプレン、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリ
ロニトリル、メタクリロニトリル等の１種又は２種以上
の単量体を通常の方法に従って、乳化剤を用いて、又は
用いずして、乳化重合させることにより得□られる。

好ましくは、本発明において用いる水分散型高分子重合
体粒子は側鎖に極性基を有する重合体からなる。かかる
極性基を有する水分散型高分子重合体粒子は、極性基を
有する単量体を上記のような単量体（以下、共重合性単
量体ということがある。）と通常の方法に従って乳化共
重合させることにより得ることができる。

上記極性基としては、例えば、スルボン酸基、カルボキ
シル基、リン酸基等の酸基、第３級アミノ基、第４級ア
ミノ基等の塩基性基等を挙げることができる。こめよう
な極性基を有する単量体の具体例としては、スチレンス
ルホン酸、スルホプロピルメタクリレートのようなスル
ホン酸基を有する単量体、アクリル酸、メタクリル酸、
イタコン酸のようにカルボキシル基を有する単量体、ア
シッドホスホキシエチルメタクリレート、３−クロロ−
２−アシッドホスホキシエチルメタクリレートのような
リン酸基を有する単量体、ジメチルアミノエチルメタク
リレート、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミドの
ような第３級アミノ基を有する単量体、メタクリルアミ
ドプロピルトリメチルアンモ阻つムクロライド、メタク
リロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライ
ドのような第４級アミノ基を有する単量体を挙げる更に
、本発明においては、極性基を竺する単量体及びこれと
共重合性を有する前記共重合性単量体に加えて、内部架
橋用多官能性単量体を乳化共重合させるのが好ましい。

このような内部架橋用多官能性単量体の具体例としては
、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレング
リコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジ
メタクリレート、ジプロピレングリコールジメタクリレ
ート、１，３−ブチレングリコールジメタクリレート、
トリエチレングリコールジアクリレ−１・、トリメチロ
ールプロパントリメタクリレート、トリメチロールプロ
パントリアクリレート、テトラメチロールメタンテトラ
アクリレート等のような多価アルコールの（メタ）アク
リレートが好まし、　く用いられる。ジビニルベンゼン
も好ましく用いられる。

内部架橋用多官能性単量体の使用、は、極性基を、有す
る単量体と前記共重合性単量体との乳化共重合において
、好ましくない水溶性重合体の生成を、抑えると共に、
重合の安定性を高めるのに役立つ。

本発明においては、極性基を有する単量体０．２〜３０
重量、％と前記共重合性単量体７０〜９９．８、重量％
とを乳化共重合させて水分散型高分子重合体粒子を得る
のが好ましいが、上記した内部架橋用多官能性単量体を
も共重合させる場合には、これを全単量体組成の２０重
量％までの範囲で使用するのがよい。余りに多量に使用
すると、却って重合の安定性を損なうおそれがあるから
である。

尚、本発明において、得られる水分散型高分子重合体粒
子に乳化剤が混在すると、酵素の固定化に際して酵素が
失活する払それがあるので、好ま一シクは、上記のよう
な単量体を乳化重合させるときに乳化剤を用いないのが
よいが、しかし、乳化剤が用いる酵素に対して有害な影
響を与えないときは、乳化剤を必要に応じて用いてもよ
いのは勿論である。

また、本発明においては、極性基を有する水分散型高分
子重合体粒子を得るに際して、上記のように、予め極性
基を有する単量体を前記共重合性単量体と乳化共重合さ
せてもよいが、重合後に極性基に変換し得る官能性基を
有する単量体を、必要ならば共重合性単量体と共に乳化
共重合させて水分散型高分子重合体粒子を得、この後に
この重合体の有する官能性基を化学反応により極性基に
変換してもよい。極性基に変換し得る官興性基を有する
単量体として、例えば、アクリル酸エステルやメタクリ
ル酸エステルを挙げることができ１、このような単量体
成分を含む重合体粒子を酸又はアルカリで処理すれば、
極性基としてカルボキシル基を有する水分散型置、分子
重合体粒子を得ることができる。また、グ・リシジル基
を有する単量体成分を含む重合体粒子にに第３級アミン
を反応させると、第３級アミノ基を有する重合体粒子を
得ることができる。

本発明によれば、先ず、上記した水分散型高分子重合体
粒子を水中に分散させ、ジアルデヒドを過剰として、上
記ポリアミンとジアルデヒドとを反応させることにより
、ポリアミンとジアルデヒドとからなるシッフ塩基ψ重
合体を水分散型高分子重合体粒子表面に沈着奎せる。

本発明において用いるｉｔリアミンは、アルデヒ、ド基
と反応午得るア、ミノ蒸を分子内に２個又はそ、れ以上
有するアミン化合物又は重合体を意味し、好ましくは芳
香族、即肪族又は脂環族のジアミンやトリアミンが好ま
しく用いられ、具体的にはフェニレンジアミン、キシリ
レンジアミン、フェニレントリアミン、トリアミノトル
エン、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等が
用いられる。また、ポリエチレンイミンも用いることが
できる。ジアルデヒドも芳香族や脂肪族のジアルデヒド
が好ましく用いられるが、具体的にはグルタルアルデヒ
ド、コハク酸ジアルデヒド、グリオキザール、マレイン
ジアルデヒド、テレフタルジアルデヒド等が用いられる
。

水分散型高分子重合体粒子の表面にシッフ塩基を沈着さ
せる反応において、用いるポリアミンとジアルデヒドと
の当量比は１；１〜１：１０であり、好ましくは１：１
〜１：５である。この範囲を越えてジアルデヒドを過多
に用いるときは、形成されるシッフ塩基−合体量が少な
すぎ、従って、少なくなるので好ましくない。

上記の反応は、シッフ塩基を生成させるための通常の反
応条件下で行われる。例えば、水分散型高分子重合体粒
子の水分散液にポリアミンとジアルデヒドとのそれぞれ
の水溶液を加え、攪拌することにより行なうが、ポリア
ミンとジアルデヒドとのそれぞれの水溶液を加える順序
は特に制限されない。反応は通常、塩酸等による酸性条
件下で行なうことにより円滑に進行する。また、反応は
通常、常温で数時間行なえばよい。反応温度が高い程、
反応速度は大きいが、水分散型高分子重合体粒子の安定
性が一方において悪くなるので、反応は通常、５０℃以
下で行なうのが望ましい。この後、必要に応じて、未反
応のポリアミンとジアルデヒドとを遠心分離、膜分離等
の適宜手段により除去し、かくして、表面に遊離のアル
デヒド基を有するシップ塩基の重合体が沈着された水分
散型高分子重合体粒子を得る。

次いで、本発明によれば、このように処理された水分散
型高分子重合体粒子の水分散液に、酵素の失活が起こら
ない温度、ｐＨ等の条件下に酵素の水溶液を添加し、必
要に応じて攪拌することにより、酵素が上記遊離のアル
デヒド基に共有結合により結合する。この後、固定化さ
れなかった酵素を遠心分離、膜分離等の適宜の手段によ
って除去すれば、本発明による固定化酵素を得ることが
できる。

尚、本発明において、酵素をアルデヒド基に共有結合に
て固定化す”る鳩舎、必要に応じて所謂スペーサー基を
用いることができる。即ち、先ず、シッフ塩基の重合体
の有するアルデヒド基にキシリルンジアミン、ヘキサメ
チレン多アミン等□ジアミンに更にシッフ塩基を形成さ
せ、シッフ塩基を形成・したジアミンの遊離アミノ基を
利用して、これに酵素を従来より知られている方法にｔ
酵素を共有結合にて結合させるのである。　　゛本発明
による固定化酵素は水分散液としｔ′用いられ、基質と
接触される。固定化酵素あ使用量は、固□定化酵素の粒
径や酵素づ固定化量、必要とする反応速度、基質濃度等
により適宜に決定される。

本発明において固定化さ耗る酵素はｉ体重酵素でもよく
、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必ずしも高度に精
製されている必要はなく、抽出液や部分精製品も用いら
れ葛。更に、本発明に従って、単一の酵素を固定化しそ
もよいが、複数の酵素を同時に固定化してもよい。

本発明において酵素は特に制限されず、種々の酵素が用
いられる。具体例として、アミノ酸オキシダーゼ、カタ
ラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムｃｉ−キシダー
ゼ、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アスパラ
ギン酸アセチルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸ア
（ノトラレスフエラーゼ、グリシンアミノトランスフェ
ラーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸アミノトランスフ
ェラーゼ、グルタミン酸−ピ□°ルビシ酸アミへトラン
スフェラーゼ、タレアチンホスホキナーゼ、□ヒスタミ
ンメチルトランスフェラーゼ、ピルビン敵キナーゼ、フ
ラクトキナーゼ、ヘキソキナーゼミδ−□リジンアセチ
ルトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼの
ような転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコリンエ
ステラーゼ、アミノアシラーゼ、アミラーゼ、アルギナ
ーゼ、Ｌ−アラニンラセマ−ゼ、インベルターゼ、ウレ
アーゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β
−ガラクトシダーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、
トリプシン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチ
ダーゼ、パパイン、ヒャウロニダーゼ、プラスミン、ペ
クチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシジ、ベニシリナ
ーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスフ
ァターゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、
レンニンのような加水分解酵素、アスパラギン酸デカル
ボキシラーゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グ
ルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニア
リアーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、フマ
ラーゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リンゴ酸シンテター
ゼのようなリアーゼ、アラニンラセマーゼ、グルコース
イソメラーゼ、グルコースホスフェートイソメラーゼ、
グルタミン酸ラセマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニン
ラセマーゼのような異性化酵素、アスパラギンシンター
ゼ、グルタチオンシンターゼ、ピルビン酸シンターゼの
ようなりガーゼ等を挙げることができる。

本発明による固定化酵素は以上費ように、水分散型高分
子重合体粒子に沈着された遊離のワレデヒド基を有する
シッフ塩基に、そのアルデヒド基を介して酵素が固定化
されているので、従来のセルロース誘導体粒子等の場合
と異なり、固定化酵素自体が遊離の酵素と同様に反応系
内を自由に移動できるため、基質の拡散が反応に殆ど影
響を与えず、従って、高分子量の基質の場合にも遊離の
酵素と同様の高い反応速度で酵素反応を行なわせること
ができる。また、従来の共有結合法その他による酵素の
固定化と異なり、操作が簡単であるうえに、酵素の固、
走化条件が緩やかであるため、固定化時の酵素の失活が
少なく、活性収率が高いという利点に加え、長期にわた
る使用によっても、酵素活性が高く維持される。しかも
、本発明による固定化酵素は水不溶性の担体に固定化さ
れているため、酵素反応後には遠心分離、塩析、凝集剤
を用いる凝集沈殿、多孔性膜による膜分離等によつ正容
易に回収でき、長期間に、わたって繰返して使用するこ
とができる。

以下に実施例を挙げて本発明、を説明するが、本発明は
これら実施例により限定されるものではない。

実施例１ メククリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムク
ロライド３ｇ、メチルメタクリレート８０ｇ１　トリエ
チレングリコールジメタクリレー、ト２ｇ及びアクリロ
ニトリル１５ｇを蒸、留水２３０ｇに加え、２．２　’
−アゾビスー２−アミジノプログンニ塩酸塩０．３ｇを
水１０ｇに袴解した重合開始剤水溶液を６９”Ｃの温度
で窒素気流下に加え、１２　（ｊ　ｒｐｍで攪拌しっ７
８時間重合させて、固形分３０％、平均粒径０．３μの
重合体粒子の水分散液を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分１０％とした分散
液１００ｍ１に、塩酸でｐＨを６に調整した１％のｍ−
キシリレンジアミン水溶液４ｍｌを加え、、　て攪拌し
、次に、１％のグルタルアルデヒド水溶液１０ｍ１を加
えて、２５°Ｃで５時間攪拌して反応させた。反応終了
後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を蒸留水で洗滌し
て、未反応のキシリレンジアミン及びグルタルアルデヒ
ドを除去した後、再び蒸留水１００ｍ１中に分散させた
。尚、この重合体粒子におけるアルデヒド基は、粒子１
ｇ当り０．３３ミリモルであった。

次に、ウレア〒ゼ１ｇを水１０ｍ１に溶解した酵素水溶
液を上記重合体粒子分散液１００ｍ１に加え、攪拌しな
がら５℃で８時間反応させた。反応終了後、遠心分離し
、沈降した重合体粒子を０．１　Ｍリン酸水素二カリウ
ム及び０．１　Ｍリン酸二水素カリウムから調製した緩
衝液（ｐＨ７）で洗滌して、未固定のウレアーゼを除去
し、再び緩衝液中に分散させて、本発明による固定化酵
素を得た。

この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は重合体粒子１
ｇ当り２２■であり、また、固定化された酵素の活性の
理論量に対する実際の活性の割合として定義される活性
収率は４０％であった。活性収率は、０．０３　Ｍの尿
素水溶液を基質とし、３５℃で１０分間固定化酵素を反
応させ、生成したアンモニア量（８モル７分）を塩酸滴
定で求めて活性を測定し、これと等□しい活性を有する
遊離の酵素量を酵素固定化量で除して求めた。

この固定化酵素を上記のようにして活性を測定した後、
緩衝液にて洗滌し、再び活性を測定するという操作を５
回繰り返したが、活性は初期の活性の９６％を保持して
いた。

実施例２ アクリル酸３ｇ、スチレン５０ｇ、メチルメククリロニ
トリル２０ｇを蒸留水２３０ｇに加え、過硫酸カリウム
０．３ｇを水１０ｇに溶解した重合開始剤水溶液を７０
℃の温度で窒素気流したに加え、１２０　ｒｐｍで攪拌
しつつ８時間重合させて、固形分３０％、平均粒径０．
２μの重合体粒子の水分散液を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分１０％とした分散
液１００ｍ１に、塩酸でｐＨを６に調整した１％のへキ
サメチレンジアミン水溶液６ｍｌを加えて攪拌し、次に
、１％のグルタルアルデヒド水溶液１０ｍ１を加えて、
２５℃で５時間攪拌して反応させた。反応終了後、遠心
分離し、沈降した重合体粒子を蒸留水で洗滌して、未反
応のへキサメチレンジアミン及びグルタルアルデヒドを
除去し、再び蒸留水中に分散させて、遊離のアルデヒド
基を有するシッフ塩基重合体の沈着した水分散型高分子
重合体粒子を得た。尚、この重合体における遊離アルデ
ヒド基は、重合体１ｇ当り０．０５　ミリモルであった
。

次に、α−゛アミラーゼ１ｇを水１０ｍ１に熔解した酵
素水溶液を上記重合体粒子分散液１００ｍ１に加え、攪
拌しながら５℃で８時間反応させた。反応終了後、遠心
分離し、実施例１と同じ緩衝液にて重合体粒子を洗滌し
、未固定のα−アミラーゼを除去、し、再び緩衝液に分
散させて、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のα−アミラーゼの固定化量は重合体粒
子１ｇ当り１０■であり、また、活性収率は７０％であ
った。活性収率は、１％デンプン水溶液を基質として固
定化酵素を３５℃で１０分間反応させ、ヨウ素デンプン
反応からデンプンの分解量を求めることにより、固定化
酵素の活性、即ち、デンプン分解速度（■／分）を得、
これと等しい活性を有する遊離の酵素量を酵素固定化量
で除して求めた。

実施例３ メチルメタクリレート８０ｇ１アクリロニトリル１８ｇ
及びトリエチレングリコールジメタク１Ｊレー）２ｇを
蒸留水２３０ｇに加え、過硫酸アンモニウム０．３ｇを
水Ｌｏｇに溶解した重合開始剤水溶液を７０℃の温度で
窒素気流下に加え、１２０　ｒｐｍで攪拌しつつ８時間
重合、させて、固形分３０％、平均粒径０．４μの重合
体粒子の水分散液を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分１０％とした分散
液１００ｍ１に３．塩酸でｐＨを６に調整した１％のｍ
−キサメレンジアミン水溶液４ｍｌを加えて攪拌し、次
に、１％のグルタルアルデヒド水溶液１０ｍ１を加えて
、２５℃で５時間攪拌して反応させた。反応終了後ぐ遠
心分離し、沈降した重合体粒子を蒸留水で洗滌して、未
反応のキシリレンジアミン及びグルタル：アルデヒドを
除去した後、再び蒸留水１００ｍ１中ｊこ分散させた。

尚、この重合体粒子におけるアルデヒド基は、粒子１ｇ
当り次に、ウレアーゼ１ｇを水１０ｍ１に溶解した酵素
水溶液を上記重合体粒子分散液１００ｍ１に加え、攪拌
しながら５℃で８時間反応させた。反応終了後、遠心分
離し、沈降した重合体粒子を０．１　Ｍリン酸水素二カ
リウム及び０．１Ｍリン酸二水素カリウムから調製した
緩衝液（ｐＨ７）で洗滌して、未、□ 固定のウレアーゼを除去し、再び緩衝液中に分散□させ
て、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素あつ１アーゼの固定化量は重合体粒子１
ｇ当り８■であり、また、活性収率は６０％であった。

□

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　水分散型高分子重合体粒子の表面にポリアミ
   ンとジアルデヒドのシッフ塩基からなり、且つ、遊離の
   アルデヒド基を有する重合体が沈着され、上記アルデヒ
   ド基を介して酵素が共有結合にて固定されていることを
   特徴とする固定化酵素。
2. （２）水分散型高分子重合体粒子が０．０３〜２μの平
   均粒径を有することを特徴とする特許請求の範・囲第１
   項記載の固定化酵素。
3. （３）　　水分散型高分子重合体が側鎖に酸基及び／又
   は塩基性基を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項又は第２項記載の固定化酵素。
4. （４）　　水分散型高分子重合体粒子の水分散液中でジ
   アルデヒドを過剰としてポリアミンとジアルデヒドとを
   反応させ、水分散型高分子重合体粒子の表面に遊離のア
   ルデヒド基を有する上記ポリアミンとジアルデヒドのシ
   ッフ塩基からなる重合体を沈着させ、次に、上記のアル
   デヒド基を介して共有結合にて酵素を固定化することを
   特徴とする固定化酵素の製造方法。
5. （５）水分散型置、分子重、合体粒子が０．０３〜２μ
   の平均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   ４項記載の固定化酵素の製造方法。 （ａ）　、　ニアに分散型高分子重合体が側鎖に酸基及
   び／又は塩基性基を有することを特徴とする特許請求の
   範囲第４項又は第５項記載の固定化酵素の製造方法。、
   。