JPS5945357B2 - 固定化酵素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も行なわれているｈξ従来は酵素を基質の水溶液に溶解
させて、水溶液中で反応を行なわせている。

しかし、このような方法によれば、反応条件を一定に維
持しつつ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵
素を失活させるこ吉なく、生成物と酵素を分離すること
が非常に困難であり、酵素力５不経済に消費される。

そのうえ、反応が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するため、既に種々の方法にて酵
素を担体に固定化し、この固定化酵素に基質を反応させ
ることが提案されている。

このような酵素の固定化方法の一つとして、水不溶性の
担体に酵素を共有結合、イオン結合ヌは物理吸着にて結
合させる担体結合法が知られている。

しかし、従来、この方法において用いられている担体は
、通常、セルロース、デキストラン、アガロース等の多
糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、多孔性ガラス
等の径１７ＩｔｒＩＬ乃至敢闘の粒子であり、このよう
な粒子に酵素が固定化された固定化酵素は通常、カラム
に充填され、固定されて、基質溶液と接触されるので、
基質が高分子量の場合、固定化酵素表面に拡散し難く１
反応に長時間を要すると共に反応収率カＳ低いという問
題がある。

本発明は上記した問題を解決するためになされたもので
あって１反応系において遊離の酵素と同様に自由に移動
でき、従って、固定化酵素表面への基質の拡散が殆ど問
題にならない高活性の固定化酵素を提供することを目的
とする。

本発明による固定化酵素は、（ａ）イオン交換基を有す
る単量体０．２〜１０重量％、（ｂ）この単量体と共重
合し得る第一の単量体１０〜９５重量％、（ｃ）多官能
性内部架橋用単量体１〜２０重量％、及び（ｄ）第二の
共重合性単量体としてのアクリロニトリルヌはメタクリ
ロニトリル１〜６０重量％を乳化共重合させて得られる
水分散型高分子重合体粒子に酵素がイオン結合によって
固定化されていることを特徴とする。

イオン交換基を有する単量体のイオン交換基としては、
スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基等の酸基、第
３級アミノ基、第４級丁ミノ基等の塩基性基等を挙げる
ことができ、このようなイオン交換基を有する単量体の
具体例とにてスチレンスルホン酸、スルホプロピルメタ
クリレートのようなスルホン酸基を有する単量体、アク
リル酸、メタクリル酸、イタコン酸のようなカルボキシ
ル基を有する単量体、アラシドホスホキシエチルメタク
リレート、３−クロロ−２−アラシドホスホキシプロピ
ルメタクリレートのようなリン酸基を有する単量体、ジ
メチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプ
ロピルメタクリルアミドのような第３級アミン基を有す
る単量体、メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモ
ニウムクロライド、メタクリロイルオキシエチルトリメ
チルアンモニウムクロライドのような第４級アミノ基を
有する単量体を差げることかできる。

イオン交換基を有する単量体と共重合される第一の単量
体は、アクリロニトリル及びメタクリロニトリルを除い
て、共重合性を有する限りは特に制限されないが、好ま
しくはエチレン、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル
、プロピオン酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリ
ル酸エステル、スチレン、メチルスチレン、ビニルトル
エン、フタジエン、イソプレン、アクリルアミド、メタ
クリルアミド等の一種又は二種以上が用いられる。

特に、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル又は
スチレンが好ましく用いられる。

これらの共重合性単量体は、得られる共重合体力≦酵素
反応の行なわれる温度より高いガラス転移点を有するよ
うに選ばれる。

また、多官能性内部架橋用単量体（以下、内部架橋剤と
いう。

）としては多価アルコールのポリ（メタ）アクリレート
が好ましく、具体的にはエチレングリコールジメタクリ
レート、トリエチレングリコールジメタクリレート、ジ
プロピレングリコールジメタクリレート、１，３−ブチ
レングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコ
ールジアクリレート、トリメチロールプロパントリメタ
クリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート
、テトラメチロールメタンテトラアクリレート等が用い
られる。

ジビニルベンゼンも用いられる。

更に、本発明においては、水分散型高分子重合体粒子は
、第二の共重合性単量体成分としてアクリロニトリル及
び／ヌはメタクリロニトリルを含有することが必須であ
る。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は上記
各単量体を水媒体中にて通常の方法で乳化共重合させる
ことにより得ることができるが得られる重合体粒子中に
乳化剤が混在すると、酵素が失活する等の有害な影響が
あられれることがあるので、乳化重合に際しては乳化剤
を用いないのが好ましい。

本発明における単量体組成によれば、特に乳化剤を要せ
ずして安定に乳化共重合させることができるが、乳化剤
が酵素に対して有害な影響を与えなければ乳化剤を必要
に応じて用いてもよい。

本発明において乳化共重合させる単量体組成は、イオン
交換基を有する単量体０．２〜１０重量％、好ましくは
０．５〜８重量％、第一の単量体１０〜９５重量％、好
ましくは２０〜９０重量惣内部架橋剤１〜２０重量％、
好ましくは２〜１０重量％、及びアクリロニトリルヌは
メタクリロートリル１〜６０重量％、好ましくは５〜４
０重量％である。

イオン交換基を有する単量体の量は、後述する重合体粒
子の有するイオン交換基密度とも関連し、少なすぎると
きは酵素を十分な量にて固定化することができず、−力
、多すぎるときは、得られる重合体粒子に酵素を固定化
する際に酵素の失活が起こりやすくなるので好ましくな
い。

次に、一般に、イオン交換基を有する単量体とこれに共
重合性を有する単量体とを乳化共重合すると、前者の単
量体の親水性が高いために水媒体相中に遊離の水溶性重
合体が生じることが多い。

このような水溶性重合体が生じると、一部は水不溶性の
高分子重合体粒子の表面に吸着されて残り。

これを担体として酵素を固定化すると、この水溶性重合
体にも酵素が固定化される。

このように水溶性重合体を含む担体に酵素が固定化され
た固定化酵素は、酵素反応の際に水不溶性の水分散型高
分子重合体粒子から溶出し、固定化酵素自体の活性の経
時１氏下が著しいうえに、基質や反応生成物と混合する
ので、反応後にその分離を要する等の種々の不都合が生
じる。

しかしながら、本発明に従って、イオン交換基を有する
単量体と内部架橋剤とアクリロニトリル又はメタクリロ
ニトリルとを乳化共重合させることにより、重合の安定
性が確保されると共に、望ましくない水溶性重合体の生
成が抑止される。

このような結果が得られる理由は明確ではないが、重合
初期に生じるイオン交換基を有する単量体を主成分とす
る水溶性低分子量重合体にアクリロニトリル又はメタク
リロニトリルと内部架橋剤カ有効に共重合して水不溶化
すると共に、重合が安定化するのであろう。

従って、アクリロニトリル又はメタクリロニトリルの量
ｂ５上記範囲より少なすぎるとき、又は多すぎるときは
、重合の安定性が損なわれる。

また、内部架橋剤ｆ）３少なすぎるときは水溶性重合体
の副生が多くなり、−力、多すぎるときは重合が安定性
に欠けるようになる。

本発明において水分散型高分子重合体粒子の平均粒径は
０．０３μ〜２μ、好ましくは０．０７〜１μである。

粒径が小さすぎると、固定化酵素を水中に分散させて酵
素反応を行なわせた後の回収が困難となり、−力、粒径
が大きすぎると、単位体積当りの粒子表面積り５小さく
なり、酵素の固定化量が少なくなると共に、水中に分散
させるのが困難となるので好ましくない。

水分散型高分子重合体粒子の有するイオン交換基の量は
重合体粒子１ｇ当り０．００１〜５ミリ当量、好ましく
は０．Ｏ１〜２ミリ当量である。

イオン交換基量が少なすぎるときは、酵素の固定化量が
少なく、酵素反応カ５十分に行なわれず、−力、多すぎ
るときは酵素の失活が起こる傾向があるからである。

水分散型高分子粒子に酵素をイオン結合するには、酵素
の失活が起こらない温度、ｐＨ等適当な条件で重合体粒
子の分散液と酵素溶液とを混合すればよい。

例えば、ｐＨは酵素の等電点、イオン交換基の種類等に
応じて適宜に定められるｆ）Ｓ、一般的には５〜８が好
ましい。

このようにして酵素を重合体粒子にイオン結合した後、
固定されていない酵素を遠心分離、膜分離等によって除
去すれば、本発明の固定化酵素が得られる。

本発明の固定化酵素は分散液として用いられ、基質と接
触される。

固定化酵素の使用量は、固定化酵素の粒径や酵素の固定
化量、必要とする反応速度、基質濃度等により適宜に決
定される。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素でよく、
菌体外酵素でもよい。

また、酵素は必らずしも高度に精製されている必要はな
く、抽出液や部分製精品も用いられる。

更に、本発明に従って単一の酵素を固定化してもよいが
、複数の酵素を固定化してもよい。

酵素の具体例としては、アミノ酸オキシダーゼ、カタラ
ーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコース・オキシダ
ーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ
、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アスパラギ
ン酸アセチルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミ
ントランスフェラーゼ、グリシンアミノトランスフェラ
ーゼ、グルタミン酸−オサザロ酢酸アミントランスフェ
ラーゼ、グルタミン酸−ピルピン酸アミントランスフェ
ラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチル
トランスフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクトキ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチルトランス
フェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼのような転移
酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ
、アミノアシラーゼ、アミラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−
アルギニンデイミナーゼ、インベルターゼ、・ウレアー
ゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリ
プシン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダー
ゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラスミン、ペクチ
ナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシン、ペクチナーゼ、
ペニシリンアミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファター
ゼ、ラクターゼ。

リパーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのような加水分
解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、アスパル
ターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタミン酸デカルボキシ
ラーゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、フェニルアラ
ニンアンモニアリアーゼ、フマラーゼ、フマール酸ヒド
ラターゼ、リンゴ酸シンテターゼのようなリアーゼ、ア
ラニンラセマーゼ、クルコースイソメラーゼ、グルコー
スホスフェートイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ
、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼのような異性
化酵素、アスパラギンシンターゼ、グルタチオンシンタ
ーゼ、ピルヒン酸シンターゼのようなりガーゼ等を挙げ
ることができる。

本発明による固定化酵素は、以上のように、イオン交換
基を有する水分散型高分子重合体粒子にイオン結合にて
固定化されており、従来のセルロース誘導体担体粒子等
の場合と異なり、固定化酵素自体が遊離の酵素と同様に
反応系内を自由に移動できるため、基質の拡散ｆ）３反
応に殆ど影響を与えず、従って、高分子量の基質の場合
にも遊離の酵素と同様の高い反応速度で酵素反応を行な
わせることができる。

また、酵素の固定化条件カＳ穏やかであるため、固定化
時の酵素の失活が少なく、活性収率が高いという利点も
ある。

しかも、酵素は担体に固定化されているため、酵素反応
後には遠心分離、塩析、凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔
性膜による膜分離等によって容易に回収でき、長期間に
わたって繰返して使用することができる。

更に、本発明において用いる担体としての水分散性高分
子重合体粒子は、その製造面からみれば、乳化剤を用い
ることなく、且つ、望ましくない水溶性重合体の生成な
く、安定に乳化共重合にて得るととカ５できる。

また、アクリロニトリル又はメタクリレートリルと内部
架橋剤を併用することにより、得られる水分散型高分子
重合体粒子は強度６（大きいと共に、粒子相互の粘着も
起らない。

実施例 ｌ メタクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムク
ロライド３ｇ、メチルメタクリレート８０ｇ、トリエチ
レングリコールジメタクリレート２ｇ及びアクリロニト
リル１５ｇを蒸留水２３０Ｉに加え、２，２′−アゾビ
ス−２−アミジノプロパンニ塩酸塩０．３．９を水ｌｏ
ｇに溶解した重合開始剤水溶液を６０℃の温度で窒素気
流下に加え、１２０ｒｐｍで攪拌しつつ８時間重合させ
て、固形分３０％、平均粒径０．３μの重合体粒子の水
分散液を得た。

尚、凝集物は０．０５％であって、安定に重合が行なわ
れた。

また、分散液を遠心分離し、上澄について調べたところ
、仕込み量の１０％の第４級アミノ基しか定量されず、
水溶性重合体の副生は僅かであった。

次に、ウレアーゼ２ｇを０．１ Ｍ ＩＪン酸水素二カ
リウム及び０．１Ｍリン酸二水素カリウムから調製した
緩衝液（ｐＨ７）１００ｒｆＬＡに溶解した酵素溶液を
上記分散液１００ｍ／；に加え、５℃で２４時間放置後
、遠心分離した沈降した重合体粒子を緩衝液で洗滌して
未固定のウレアーゼを除去し、再び緩衝液中に分散させ
て本発明による固定化ウレアーゼを得た。

この固定化酵素のウレアーゼ固定化量は、重合体粒子１
ｇ当り４０ｍｇであり、また、０．０３Ｍ（７）尿素を
基質として測定した活性収率は９５％であった。

比較例 １ メタクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムク
ロライド３ｇ、メチルメタクリレート８２＃及びアクリ
ロニトリル１５ｇを実施例１と同様にして乳化共重合さ
せ、固形分２９％、平均粒径０．３０μの重合体粒子の
水分散液を得た。

凝集物は１％であった。

この分散液を遠心分離し、上澄について調べたところ、
仕込量の８０％の第４級アミン基が定量され、多量の水
溶性重合体の副生が認められた。

比較例 ２ メタクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムク
ロライド３ｇ、メチルメタクリレート９５ｇ及びトリエ
チレングリコール２ｇを実施例１と同様にして乳化重合
させ、固形分２８％、平均粒径０．３３μの重合体粒子
の水分散液を得た。

重合は不安定であって、凝集物は６％であった。

また、この分散液を遠心分離し、上澄を調べたところ、
仕込量の７５％の第４級アミノ基が定量された。

実施例 ２ アクリル酸３ｇ、スチレン５０ｇ、メチルメタクリレー
ト２５ｇ、ジビニルベンゼン２ｇ及びアクリロニトリル
２０ｇを蒸留水２３０ｇに力υえ、過硫酸カリウム０．
３９を水１０ｇに溶解した重合開始剤水溶液を窒素気流
下、７０℃の温度で加え。

１２Ｏｒｐｍで攪拌しつつ８時間反応させて、固形分３
０％、平均粒径０．２０μの重合体粒子の分散液を得た
。

重合は非常に安定であって、凝集物は０．０２であった
。

α−キモトリプシン２ｇを０．０５Ｍリン酸水素二ナト
リウムと０．０５Ｍリン酸水素二カリウムから調製した
緩衝液（ｐＨ７）１００即に溶解した酵素溶液を上記分
散液に加え、５°Ｃで２４時間放置後、遠心分離した。

沈降した重合体粒子を緩衝液にて洗滌して未固定のα−
キモトリプシンを除去し、再び緩衝液に分散させて本発
明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のα−キモトリプシンの固定化量は重合
体粒子ＩＩ当り３２ｍ９であり、０．０５ｍＭのＮ−ア
セチル−Ｌ−チロシンエチルエステルを基質として測定
した活性収率は９０％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（ａ）イオン交換基を有する単量体０．２〜１０重量
   ％、（ｂ）こ９単量体と共重合し得る第一の単量体１０
   〜９５重量％、（Ｃ）多官能性内部架橋用単量体１〜２
   ０重量％、及び（ｄ）第二の共重合性単量体としてのア
   クリロニトリルヌはメタクリロニトリル１〜６０重量％
   を乳化共重合させて得られる水分散型高分子重合体粒子
   に酵素がイオン結合によって固定化されていることを特
   徴とする固定化酵素。 ２ 水分散型高分子重合体粒子が０，０３〜２μの平均
   粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の固定化酵素。 ３ イオン交換基が酸基であることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の固定化酵素。 ４ イオン交換基がカルボキシル基、スルホン酸基又は
   リン酸基であることを特徴とする特許請求の範囲第３項
   記載の固定化酵素。 ５ イオン交換基が第３級アミン基又は第４級アミン基
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の固
   定化酵素。 ６ 第一の単量体ｆ）Ｓアクリル酸エステル、メタクリ
   ル酸エステル又はスチレンであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の固定化酵素。 １ 多官能性内部架橋用単量体が多価アルコールのポリ
   メクリレートヌはポリメタクリレートであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。