JPH0476676B2 - - Google Patents
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- JPH0476676B2 JPH0476676B2 JP60058116A JP5811685A JPH0476676B2 JP H0476676 B2 JPH0476676 B2 JP H0476676B2 JP 60058116 A JP60058116 A JP 60058116A JP 5811685 A JP5811685 A JP 5811685A JP H0476676 B2 JPH0476676 B2 JP H0476676B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- citric acid
- medium
- culture
- acid
- production
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は、好気的培養条件下に、酸素を通気す
ることにより、高収量でクエン酸を製造する方法
に関するものである。 従来技術 ノルマルパラフイン（炭素数10ないし20のパラ
フイン類）を発酵原料としてキヤンデイダ属
（candida）の酵母によりクエン酸を製造する方
法は従来から知られている。 また炭素源としてオレフイン類を含む発酵培地
を用い、キヤンデイダ・トロピカリス
（Candida・tropicalis）に属する微生物を好気的
に培養してクエン酸を製造する方法については本
出願人と同一出願人によつて特許出願されている
（特許第1096815号等）。炭素源としてパラフイン
類およびオレフイン類を含む発酵培地からのクエ
ン酸発酵においては培養条件によつて異なるが、
クエン酸の他に常にかなりの量のイソクエン酸の
生成をともなう。その量はクエン酸と同量または
それより多量である場合もある。 発明の解決しようとする問題点 従来、石油発酵および油脂発酵によるクエン酸
の製造においては副生してくるイソクエン酸の生
産を抑制してクエン酸の生産を支配的にするため
に、もつぱら変異株の使用による方法が採用され
てきた。 しかしながら、この方法では変異株の探索およ
びこれに適する培養条件の決定など多くの労力と
経費とを必要とする。また、取得した変異株を使
用する場合でも、回避不可能に近い鉄イオンの影
響により、イソクエン酸の生成をみることがあ
り、結果として、クエン酸の収量低下をきたすこ
とがある。 これは、菌体中に保持されている、クエン酸を
イソクエン酸に変換する酵素アコニターゼが鉄イ
オンの存在により再び賦活されるからである。 従つて、一端、イソクエン酸生成の少ない変異
株が得られたとしても、その保守管理に細心の注
意を要するものである。 本発明方法によれば変異株を使用することなく
イソクエン酸の生成を抑制することができるので
本発明の工業的意義はきわめて大きいものであ
る。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、クエン酸の収率向上を目的とし
てクエン酸を製造するにあたり、好気的条件下で
培養する際に酸素を通気することにより、培地中
の酸素濃度を増大させることによりイソクエン酸
の生成を抑制し、クエン酸の収率向上が図れるこ
とを発見して本発明に到達したものである。 本発明は、炭素源として油脂類、脂肪酸類、こ
れらのエステル類、直鎖状パラフイン類および糖
類を含む培地にキヤンデイダ属より選ばれた酵母
を好気的に培養し、該培地中にクエン酸を蓄積さ
せ、これを採取するクエン酸の製法において、好
気的条件下における培養の際に、酸素を通気する
ことにより、イソクエン酸の生成を抑制し、高収
量でクエン酸を得ることを特徴とするクエン酸の
製法に関するものである。 溶存酸素量は少なくとも10ppm以上、好ましく
は20ppm以上、さらに好ましくは30ppm以上であ
る。 溶存酸素量が10ppm以上であればイソクエン酸
生成の抑制効果が得られる。 本発明で使用する微生物は、各種炭素源を資化
してクエン酸を培地中に蓄積する能力を有するキ
ヤンデイダ属より選ばれた酵母である。更に、こ
れらの酵母の栄養要求変異株および変種も含むも
のである。 本発明において炭素源として使用する油脂類、
それら油脂類から得られる脂肪酸類、および天然
または合成脂肪酸類、それらのエステル類には特
に制限がなく、単独または混合物として適宜使用
することができる。 また、ノルマルパラフイン類としては炭素数10
ないし20のものが使用されるが、通常はｎ−C12
〜ｎ−C13がよく使われる。 さらに、各種糖類も良好な炭素源となる。 発酵原料の培地への添加量は１ないし20％（重
量）で、好ましくは５ないし15％（重量）であ
る。 窒素源としては無機アンモニウム塩、硝酸塩お
よびアンモニアも使用できる。上記の各種窒素源
は単独で使用してもよくまた２種以上を混合して
使用してもよい。 無機塩としては、第１燐酸塩、第２燐酸塩、硫
酸塩、塩酸塩、カリウム塩、ナトリウム塩、マグ
ネシウム塩、マンガン塩、銅塩、亜鉛塩などの通
常の無機塩類が使用できる。 更にPHを調整するため炭酸カルシウム、アンモ
ニア、水酸化ナトリウム等が使用される。 有機微量栄養素としては、ピオチンおよびチア
ミン単独またはこれらの混合物およびこれらを含
む酵母エキス、コンステイーブリカーなどの天然
物を使用してもよい。 チアミンおよびピオチンをそれぞれ単独で使用
する場合には1000μg／以下であれば十分で、
それ以上使用してもクエン酸の生成量には変化が
ない。好ましくは50ないし100μg／を使用する
場合が適当である。チアミンとビオチンとを併用
する場合は合計で1000μｇ／以下を使用すれば
十分である。 本発明方法で使用する発酵培地において、発酵
原料の培地への分散性を良くするため阻害効果の
ない界面活性剤を使用することは勿論差支えない
が、発酵原料を培養条件下で液状に保持できるの
で界面活性剤を使用する必要がない。従つて界面
活性剤による酵母への阻害作用を考慮する必要が
ない。 発酵条件は、酸素通気による好気的条件がよ
い。培養温度は25℃ないし40℃の範囲で、好まし
くは25℃から38℃である。培養中のPHは３ないし
10の範囲で、好ましくは４ないし６の範囲が適当
である。培養中のPHの調整は酸、アルカリ、炭酸
カルシウム、炭酸ナトリウムまたはアンモニアを
用いて行なうことができる。 培養は通常50ないし150時間、好ましくは60な
いし100時間行なわれる。 発酵培地中に蓄積されたクエン酸は、通常微生
物の培養によつて生産された有機酸塩類をその培
養物から分離するのに用いられる手段、たとえば
過、遠心分離などの方法で菌体を分離した後、
カラムクロマト処理、イオン交換樹脂処理、ある
いは濃縮処理などによりクエン酸またはその塩と
して分離採取される。 クエン酸とイソクエン酸の分析は高速液体クロ
マトグラム法で行なつた。 実施例 以下に実施例により本発明を説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。 実施例 １ 炭素源としてパームオレインを使用した。 使用菌株はキヤンデイダ・トロピカリスIFO−
0589（Candia tropicalis）であつた。 本発明方法で使用する培地の基本組成は次の如
くである。 種母用 パームオレイン （Palm Olein） ５（wt／vol％） NH4Cl 0.50（wt／vol％） KH2PO4 0.05（wt／vol％） MgSO4・7H2O 0.05（wt／vol％） FlSO4・7H2O １（mg／） MnSO4・7H2O 0.1（mg／） ZnSO4・nH2O 0.1（mg／） CuSO4・5H2O ５（μｇ／） ビオチン 100（μｇ／） チアミン塩酸塩 100（μｇ／） PH 5.0 生産用 パームオレイン （Palm Olein） 10wt％ NH4Cl 0.3（wt／vol％） KH2PO4 0.05（wt／vol％） ＭｇSO4・7H2O 0.03（wt／vol％） FlSO4・7H2O ５（mg／） MnSO4・7H2O 0.06（mg／） ZnSO4・nH2O 0.05（mg／） CuSO4・5H2O ５（μｇ／） ビオチン 50（μｇ／） チアミン塩酸塩 100（μｇ／） PH 5.0 種母培養はフラスコ振とう培養機を用い、つぎ
の条件で行つた。 種培養としてスラント培養後の上記組成の寒天
斜面培地から４白金耳量の菌株を、上記組成の培
地30mlを容量500mlの肩付振とうフラスコに入れ
た液体培地に接種した後、振とう数120往復／分、
振巾７cmの往復振とう機で30℃、３日間培養し
た。 なお、培地のPHが5.0以下に低下したとき、別
に殺菌したCaCO35wt／vol％を添加し、PHを調
整した。ジヤーフアメンターを使用して種母培養
する場合には酸素通気することができる。 この種母を用い生産培養を行つた。内容３の
ジヤーフアーメンターに上記培養液1258ml、パー
ムオレイン166ml、種母75mlを入れ、温度34℃、
回転数1200r.p.m、酸素通気量は培養液容量に対
して１／2V／Ｖ／min.（溶存酸素量10ppm以上）
である。 培養終了後、この培養物を塩酸でPH2.5にした
後珪藻土を過助剤として吸引過し、酵母を主
とする固型物はこれを少量の水で洗滌した。次に
液と洗滌液とを合せた後、苛性ソーダで中和後
加熱して沈澱を析出させ、これを冷却後吸引過
してクエン酸カルシウムを得た。 得られたクエン酸カルシウムは約10倍量の水に
懸濁し、これにその液が塩化バリウム溶液によ
つて硫酸根の存在をわずかに示すに至るまで撹拌
しつゝ、50％硫酸水溶液を滴下した後沸とう水中
で約30分間加熱する。 必要によつてはこれに脱色操作を施した後熱時
過して液を50〜80℃にて減圧濃縮し、途中石
膏の沈澱が析出した場合、これを別し、更にこ
れを別し、更に濃縮を続け、やゝうすいシラツ
プ状にする。このシラツプ状濃縮物を氷点下に放
置してクエン酸を析出させた。 同様の方法で、酸素にかえた空気通気による培
養も行つた。 その結果を第１表に示す。
ることにより、高収量でクエン酸を製造する方法
に関するものである。 従来技術 ノルマルパラフイン（炭素数10ないし20のパラ
フイン類）を発酵原料としてキヤンデイダ属
（candida）の酵母によりクエン酸を製造する方
法は従来から知られている。 また炭素源としてオレフイン類を含む発酵培地
を用い、キヤンデイダ・トロピカリス
（Candida・tropicalis）に属する微生物を好気的
に培養してクエン酸を製造する方法については本
出願人と同一出願人によつて特許出願されている
（特許第1096815号等）。炭素源としてパラフイン
類およびオレフイン類を含む発酵培地からのクエ
ン酸発酵においては培養条件によつて異なるが、
クエン酸の他に常にかなりの量のイソクエン酸の
生成をともなう。その量はクエン酸と同量または
それより多量である場合もある。 発明の解決しようとする問題点 従来、石油発酵および油脂発酵によるクエン酸
の製造においては副生してくるイソクエン酸の生
産を抑制してクエン酸の生産を支配的にするため
に、もつぱら変異株の使用による方法が採用され
てきた。 しかしながら、この方法では変異株の探索およ
びこれに適する培養条件の決定など多くの労力と
経費とを必要とする。また、取得した変異株を使
用する場合でも、回避不可能に近い鉄イオンの影
響により、イソクエン酸の生成をみることがあ
り、結果として、クエン酸の収量低下をきたすこ
とがある。 これは、菌体中に保持されている、クエン酸を
イソクエン酸に変換する酵素アコニターゼが鉄イ
オンの存在により再び賦活されるからである。 従つて、一端、イソクエン酸生成の少ない変異
株が得られたとしても、その保守管理に細心の注
意を要するものである。 本発明方法によれば変異株を使用することなく
イソクエン酸の生成を抑制することができるので
本発明の工業的意義はきわめて大きいものであ
る。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、クエン酸の収率向上を目的とし
てクエン酸を製造するにあたり、好気的条件下で
培養する際に酸素を通気することにより、培地中
の酸素濃度を増大させることによりイソクエン酸
の生成を抑制し、クエン酸の収率向上が図れるこ
とを発見して本発明に到達したものである。 本発明は、炭素源として油脂類、脂肪酸類、こ
れらのエステル類、直鎖状パラフイン類および糖
類を含む培地にキヤンデイダ属より選ばれた酵母
を好気的に培養し、該培地中にクエン酸を蓄積さ
せ、これを採取するクエン酸の製法において、好
気的条件下における培養の際に、酸素を通気する
ことにより、イソクエン酸の生成を抑制し、高収
量でクエン酸を得ることを特徴とするクエン酸の
製法に関するものである。 溶存酸素量は少なくとも10ppm以上、好ましく
は20ppm以上、さらに好ましくは30ppm以上であ
る。 溶存酸素量が10ppm以上であればイソクエン酸
生成の抑制効果が得られる。 本発明で使用する微生物は、各種炭素源を資化
してクエン酸を培地中に蓄積する能力を有するキ
ヤンデイダ属より選ばれた酵母である。更に、こ
れらの酵母の栄養要求変異株および変種も含むも
のである。 本発明において炭素源として使用する油脂類、
それら油脂類から得られる脂肪酸類、および天然
または合成脂肪酸類、それらのエステル類には特
に制限がなく、単独または混合物として適宜使用
することができる。 また、ノルマルパラフイン類としては炭素数10
ないし20のものが使用されるが、通常はｎ−C12
〜ｎ−C13がよく使われる。 さらに、各種糖類も良好な炭素源となる。 発酵原料の培地への添加量は１ないし20％（重
量）で、好ましくは５ないし15％（重量）であ
る。 窒素源としては無機アンモニウム塩、硝酸塩お
よびアンモニアも使用できる。上記の各種窒素源
は単独で使用してもよくまた２種以上を混合して
使用してもよい。 無機塩としては、第１燐酸塩、第２燐酸塩、硫
酸塩、塩酸塩、カリウム塩、ナトリウム塩、マグ
ネシウム塩、マンガン塩、銅塩、亜鉛塩などの通
常の無機塩類が使用できる。 更にPHを調整するため炭酸カルシウム、アンモ
ニア、水酸化ナトリウム等が使用される。 有機微量栄養素としては、ピオチンおよびチア
ミン単独またはこれらの混合物およびこれらを含
む酵母エキス、コンステイーブリカーなどの天然
物を使用してもよい。 チアミンおよびピオチンをそれぞれ単独で使用
する場合には1000μg／以下であれば十分で、
それ以上使用してもクエン酸の生成量には変化が
ない。好ましくは50ないし100μg／を使用する
場合が適当である。チアミンとビオチンとを併用
する場合は合計で1000μｇ／以下を使用すれば
十分である。 本発明方法で使用する発酵培地において、発酵
原料の培地への分散性を良くするため阻害効果の
ない界面活性剤を使用することは勿論差支えない
が、発酵原料を培養条件下で液状に保持できるの
で界面活性剤を使用する必要がない。従つて界面
活性剤による酵母への阻害作用を考慮する必要が
ない。 発酵条件は、酸素通気による好気的条件がよ
い。培養温度は25℃ないし40℃の範囲で、好まし
くは25℃から38℃である。培養中のPHは３ないし
10の範囲で、好ましくは４ないし６の範囲が適当
である。培養中のPHの調整は酸、アルカリ、炭酸
カルシウム、炭酸ナトリウムまたはアンモニアを
用いて行なうことができる。 培養は通常50ないし150時間、好ましくは60な
いし100時間行なわれる。 発酵培地中に蓄積されたクエン酸は、通常微生
物の培養によつて生産された有機酸塩類をその培
養物から分離するのに用いられる手段、たとえば
過、遠心分離などの方法で菌体を分離した後、
カラムクロマト処理、イオン交換樹脂処理、ある
いは濃縮処理などによりクエン酸またはその塩と
して分離採取される。 クエン酸とイソクエン酸の分析は高速液体クロ
マトグラム法で行なつた。 実施例 以下に実施例により本発明を説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。 実施例 １ 炭素源としてパームオレインを使用した。 使用菌株はキヤンデイダ・トロピカリスIFO−
0589（Candia tropicalis）であつた。 本発明方法で使用する培地の基本組成は次の如
くである。 種母用 パームオレイン （Palm Olein） ５（wt／vol％） NH4Cl 0.50（wt／vol％） KH2PO4 0.05（wt／vol％） MgSO4・7H2O 0.05（wt／vol％） FlSO4・7H2O １（mg／） MnSO4・7H2O 0.1（mg／） ZnSO4・nH2O 0.1（mg／） CuSO4・5H2O ５（μｇ／） ビオチン 100（μｇ／） チアミン塩酸塩 100（μｇ／） PH 5.0 生産用 パームオレイン （Palm Olein） 10wt％ NH4Cl 0.3（wt／vol％） KH2PO4 0.05（wt／vol％） ＭｇSO4・7H2O 0.03（wt／vol％） FlSO4・7H2O ５（mg／） MnSO4・7H2O 0.06（mg／） ZnSO4・nH2O 0.05（mg／） CuSO4・5H2O ５（μｇ／） ビオチン 50（μｇ／） チアミン塩酸塩 100（μｇ／） PH 5.0 種母培養はフラスコ振とう培養機を用い、つぎ
の条件で行つた。 種培養としてスラント培養後の上記組成の寒天
斜面培地から４白金耳量の菌株を、上記組成の培
地30mlを容量500mlの肩付振とうフラスコに入れ
た液体培地に接種した後、振とう数120往復／分、
振巾７cmの往復振とう機で30℃、３日間培養し
た。 なお、培地のPHが5.0以下に低下したとき、別
に殺菌したCaCO35wt／vol％を添加し、PHを調
整した。ジヤーフアメンターを使用して種母培養
する場合には酸素通気することができる。 この種母を用い生産培養を行つた。内容３の
ジヤーフアーメンターに上記培養液1258ml、パー
ムオレイン166ml、種母75mlを入れ、温度34℃、
回転数1200r.p.m、酸素通気量は培養液容量に対
して１／2V／Ｖ／min.（溶存酸素量10ppm以上）
である。 培養終了後、この培養物を塩酸でPH2.5にした
後珪藻土を過助剤として吸引過し、酵母を主
とする固型物はこれを少量の水で洗滌した。次に
液と洗滌液とを合せた後、苛性ソーダで中和後
加熱して沈澱を析出させ、これを冷却後吸引過
してクエン酸カルシウムを得た。 得られたクエン酸カルシウムは約10倍量の水に
懸濁し、これにその液が塩化バリウム溶液によ
つて硫酸根の存在をわずかに示すに至るまで撹拌
しつゝ、50％硫酸水溶液を滴下した後沸とう水中
で約30分間加熱する。 必要によつてはこれに脱色操作を施した後熱時
過して液を50〜80℃にて減圧濃縮し、途中石
膏の沈澱が析出した場合、これを別し、更にこ
れを別し、更に濃縮を続け、やゝうすいシラツ
プ状にする。このシラツプ状濃縮物を氷点下に放
置してクエン酸を析出させた。 同様の方法で、酸素にかえた空気通気による培
養も行つた。 その結果を第１表に示す。
【表】
培養最終段階近くで生産量及び全クエン酸中の
クエン酸生成比率が共に著しく向上していること
が判る。 実施例 ２ 炭素源として炭素数10ないし20のノルマルパラ
フインを使用した。ノルマルパラフイン混合物の
培地への添加量は10wt／vol％であつた。 生産培地の基本組成および培養条件は実施例１
と同様であつた。ただし、用いた菌はキヤンデイ
ダ・リポリテイカATCC−20346（Candida
lipolytica）であつた。 実験結果は第２表に示した。
クエン酸生成比率が共に著しく向上していること
が判る。 実施例 ２ 炭素源として炭素数10ないし20のノルマルパラ
フインを使用した。ノルマルパラフイン混合物の
培地への添加量は10wt／vol％であつた。 生産培地の基本組成および培養条件は実施例１
と同様であつた。ただし、用いた菌はキヤンデイ
ダ・リポリテイカATCC−20346（Candida
lipolytica）であつた。 実験結果は第２表に示した。
【表】
実施例 ３
炭素源をグルコースとし、培養条件は実施例１
と同様であつた。用いた菌種はキヤンデイダ・リ
ポリテイカATCC−20346（Candida lipolytica）
であつた。 実施例３の結果を第３表に示した。
と同様であつた。用いた菌種はキヤンデイダ・リ
ポリテイカATCC−20346（Candida lipolytica）
であつた。 実施例３の結果を第３表に示した。
Claims (1)
- １ 炭素源として、油脂類、脂肪酸類、これら脂
肪酸類のエステル類、直鎖状パラフイン類および
糖類の単独または混合物を含む培地に、それらを
資化してクエン酸を生成する能力をもつキヤンデ
イダ属（Candida）より選ばれた酵母を好気的に
培養し、該培地中にクエン酸を蓄積させ、これを
採取するクエン酸の製法において、好気的条件下
における培養の際に酸素を通気し、該培地中の酸
素濃度を溶存酸素量として30ppm以上とすること
により、イソクエン酸の生成を抑制し、高収率で
クエン酸を得ることを特徴とするクエン酸の製
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5811685A JPS61219391A (ja) | 1985-03-25 | 1985-03-25 | クエン酸の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5811685A JPS61219391A (ja) | 1985-03-25 | 1985-03-25 | クエン酸の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61219391A JPS61219391A (ja) | 1986-09-29 |
| JPH0476676B2 true JPH0476676B2 (ja) | 1992-12-04 |
Family
ID=13075008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5811685A Granted JPS61219391A (ja) | 1985-03-25 | 1985-03-25 | クエン酸の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61219391A (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5886091A (ja) * | 1981-11-18 | 1983-05-23 | Showa Shell Sekiyu Kk | クエン酸の製法 |
-
1985
- 1985-03-25 JP JP5811685A patent/JPS61219391A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61219391A (ja) | 1986-09-29 |
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