JPH0478946B2 - - Google Patents
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- JPH0478946B2 JPH0478946B2 JP61201887A JP20188786A JPH0478946B2 JP H0478946 B2 JPH0478946 B2 JP H0478946B2 JP 61201887 A JP61201887 A JP 61201887A JP 20188786 A JP20188786 A JP 20188786A JP H0478946 B2 JPH0478946 B2 JP H0478946B2
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は、インキユベーシヨン溶液で温度15〜
40℃で血漿試料の一成分に関する不均一イムノア
ツセイを行う方法に関する。 従来の技術 イムノアツセイ（免疫測定法）は広く行われて
いる。この場合均一相並びに不均一相での方法が
ある。不均一相で実施する場合には、反応成分の
１つは担体に結合する。イムノアツセイを不均一
相で行うためには、種々の方法の別法、例えばサ
ンドイツチ法、間接法及び競合法が公知である。
サンドイツチ法の場合には、抗体を担体に結合
し、試験溶液を添加し、その際試験溶液中に含ま
れた特異的抗原は抗体に結合する。更に標識され
た特異的抗体を添加すると抗原−抗体−複合体か
又は同複合体の１部分が得られる。この標識抗体
によつて抗原の量を計算することができる。間接
法の場合には、抗原は担体の結合する。これに試
験液を添加すると、試験溶液に含まれ前記の結合
抗原に対して特異的な抗体がこの抗原と反応す
る。標識された抗グロブリンを添加すると、抗グ
ロブリンは抗原−抗体−複合体に結合し、試験血
清中の未知の抗体の量は、標識された抗グロブリ
ンによつて測定することができる。競合法の場合
には、免疫反応の結合成分の１つが担体に結合す
る。次いでこれに未知量で存在する免疫反応の他
の成分並びに既知量の標識された免疫反応の他の
成分を含有する溶液を添加する。標識された及び
標識されない両成分は、担体に結合した免疫反応
の成分の結合個所の周りで競合する。第２の試料
に、標識成分だけを含有する標準液を添加する。
次いで標準物及び試料中の標識成分を測定して、
その差異から未知反応成分の量を計算することが
できる。 他の測定法は、少なくとも２価の抗原の場合に
抗体又は抗体断片であつてもよい３種の受容体を
用いて得られる。３種の受容体を用いるイムノア
ツセイを不均一相で行う場合には、３種の受容体
の１つは常に不溶であるが、他の２つは可溶であ
り、この場合２つの可溶受容体の１つは標識され
ているが、他のものは標識されていない。更に不
溶の受容体は、標識されていない可溶の受容体に
対応している。測定を行うためには、種々の別法
が可能である、つまり個々の受容体の添加を変え
ることのできる１段法並びに多段法がある。 すなわち１つの他の別法は、試料中の測定すべ
き抗原を最初の段階で標識されていない可溶の受
容体及び標識されている可溶の受容体と溶液中で
同時に反応させ、次いで生じた可溶のサンドイツ
チ複合体を第２の段階で不溶の受容体に結合させ
て不溶にすることである。 反応成分を標識するためには、種々の方法が可
能である。すなわち、反応成分の１つを放射能に
よつて標識することができ、その際測定放射能に
よつて、測定すべき反応成分の計算が可能にな
る。また、酸素でも標識することができる。この
場合にはイムノアツセイの通常の段階を実施した
後、標識として使用される酵素の基質を添加し、
次いで酵素反応によつて測定すべき反応成分の濃
度を計算する。他の方法は、蛍光性物質での標識
であり、その際蛍光を、直接にか又は染料で測定
することができ、評価は分光法又は測光法によつ
て行う。 イムノアツセイは次第に重要になつている。そ
れというのもこの方法によつて一方では物質を特
異的に検出することができ、他方では著しく大き
い感度を有するので、この方法を用いて物質をピ
コグラムの範囲まで検出することができるからで
ある。しかしながら不均一相のイムノアツセイ
は、種々の程度の分析上特定されない干渉、いわ
ゆる非特異的妨害によつて狂つてくる。この妨害
は既に“マトリツクス効果”、“バツクグラウン
ド”及び“非特異結合”と呼ばれた。特に、血漿
試料中の測定すべき物質の検出量は、サンドイツ
チ法の場合には、血清試料での検出量よりも明ら
かに小さく、競合法の場合には、血清試料での検
出量よりも明らかに大きいことが認められること
は不利である。ところが、このような測定結果の
狂いは、血漿中に存在するが、血清中は存在しな
いフイブリノーゲンによつて惹起されることが判
明した。この測定妨害は、血漿の安定化法には左
右されない、つまり添加するEDTA、クエン酸
塩、ヘパリンその他は検出に影響を及ぼさない。
この妨害は、不均一相のイムノアツセイの場合に
だけ生じる。 ところで、競合法を実施する場合には、フイブ
リノーゲンが見かけ上測定すべき分析物のように
挙動することが確認された。これは、交差反応に
よつて起きるのではなく、フイブリノーゲンが、
固相で存在する免疫反応の成分が結合されている
担体表面上に界面活性物質として固着しており、
従つて前記の結合成分の一部分をおおうことによ
つて起こる。他方、サンドイツチ法の場合にはフ
イブリノーゲンは小さい測定値をもたらす。この
難点を解決するために、血漿試料をイムノアツセ
イを行う前に水浴中で56℃に10分間加熱し、次い
で遠心分離することが既に提案された。この方法
は一方では費用がかかり、他方ではこの処理によ
つて変質しない物質を測定する場合に使用するに
過ぎない。更に、尿素の添加によつてフイブリノ
ーゲンの妨害作用を調節することが提案される。
しかしながらこの場合には、この調節は完全な測
定条件下で可能であるに過ぎず、この条件はそれ
ぞれ個々の血漿試料に対して新たに測定しなけれ
ばならないことが判明した。 発明が解決しようとする課題 本発明の課題は、費用のかかる方法段階を必要
としないで、フイブリノーゲンの妨害作用を除去
することのできる、不均一イムノアツセイを行う
方法を見出すことであつた。 課題を解決するための手段 前記課題は、冒頭記載の方法において、測定す
べき血漿試料の一成分に対するフイブリノーゲン
による妨害を除去するために十分な量のプラスミ
ノーゲン活性因子を前記試料に添加することを特
徴とする不均一イムノアツセイを行う方法によつ
て解決される。 意外にも、イムノアツセイでプラスミノーゲン
活性因子を血漿試料に添加することによつて検出
が改良されるので、血漿試料から得られる測定値
は血清試料から得られる測定値と十分に一致する
ことが立証された。これは驚異的なことであつ
た。それというのもこの改良は常用の方法を実施
する場合、即ち常用のインキユベーシヨン時間及
びインキユベーシヨン温度で得られるからであ
る。従来は文献から、プラスミノーゲン活性因子
によるフイブリノーゲンの分解は、長いインキユ
ベーシヨン時間及び高温度を必要とすることが知
られていたのである。本発明方法を用いることに
よつて他の方法段階を実施することなく、簡単な
混合によつて血漿試料のイムノアツセイを改善す
ることが可能である。 本方法はすべての血漿で使用することができ
る。この方法は、安定にするためにEDTAを添
加した血漿並びにヘパリン、クエン酸塩、蓚酸
塩、弗化物又は他の類似物質で安定にした血漿に
適する。 プラスミノーゲン活性因子によるイムノアツセ
イの影響を生じないので、該活性因子の添加によ
つて測定値の狂いは生じない。 本発明方法は、１段法並びに２段法の測定法で
使用することができる。この場合２段法では、プ
ラスミノーゲン活性因子を、既に第１のインキユ
ベーシヨンの際に添加するのが好ましい。それと
いうのも既に第１のインキユベーシヨンの際に血
漿試料を入れ、これと共に妨害を惹起するフイブ
リン又はフイブリノーゲンを供給するからであ
る。 プラスミノーゲン活性因子の作用によつて、血
漿中に存在するプラスミノーゲンがプラスミンに
変化し、次いでこれはフイブリノーゲンを蛋白分
解によつて分解する。 プラスミノーゲン活性因子としては、特に好ま
しくはストレプトキナーゼ又はウロキナーゼを使
用する。ストレプトキナーゼは、好ましくは10〜
300U／ml、特に好ましくは40〜50U／mlの量で
使用する。下限よりも少ない量では、作用はもは
や十分な程度で生じない。300U／mlよりも大き
い量は検出を更に改良しないので、不経済であ
る。 ウロキナーゼは、好ましくは10〜120U／ml、
特に好ましくは20〜80U／mlの量で使用する。こ
の場合にも下限よりも少ない量では作用はもはや
十分ではないが、上限よりも大きい値で存在する
濃度は役にたたない。 本発明方法の他の好ましい実施形式では、プラ
スミノーゲン活性因子として外因性プラスミノー
ゲン活性因子（EPA）を使用する。EPAは、好
ましくは0.2〜10μｇ／ml、特に好ましくは0.5〜
3μｇ／mlの量で使用する。本発明方法は、反応
成分の１つが固相で存在するすべての種類のイム
ノアツセイに対して使用することができる。すな
わち、本方法は競合法、サンドイツチ法及びすべ
ての種類の標識に対して適している。 実施例 溶液(1) インキユベーシヨン緩衝液 燐酸塩緩衝液 15ｍモル／、PH6.9 牛の血清アルブミン （RSA） 0.2重量％ メルチオレート 0.01重量％ 溶液(2) 溶液(1)にとかした抗−TSH−PCP−複合体 約40U／ 溶液(3) 基質／緩衝液−溶液 燐酸塩−クエン酸塩−緩衝液 95ｍモル／、
PH4.4 過硼酸ナトリウム 3.1ｍモル／ ABTSR 1.6ｍモル／ ２，2′−アジノ−ジ−［３−エチル−ベンズチ
アゾリン−スルホン酸(6)］−ジアンモニウム塩。 使用溶液、塗布試験管及び標準物は、エンチム
ン（Enzymun）試験 TSH（ベーリンガー社、
No.736083）から得られる。測定の実施は、製造者
の規定によつて行う。 抗−TSH−抗体を塗布した試験管に、TSH−
標準物（０〜50μU／ml）又は試料（血清、血漿）
それぞれ0.2ml及び溶液(1)１mlを入れ、20〜25℃
で60分間インキユベートする。この場合溶液(1)
は、種々の濃度のウロキナーゼ（０〜70U／ml）
又はストレプトキナーゼ（０〜50U／ml）を含有
する。吸引し、洗浄した後に、溶液(2)11mlを添加
する。20〜25℃での60分のインキユベーシヨン後
に、試験管を吸引し、洗浄する。続いて溶液(3)１
mlを添加し、更に20〜25℃で60分間インキユベー
トする。次いで溶液(3)に対して、空試験として測
光による測定を405nｍで行う。 次表に挙げた値は、それぞれインキユベーシヨ
ン緩衝液にウロキナーゼ又はストレプトキナーゼ
を添加しないで血清に対して得られた比較値100
％に対する。 エンチムン（Enzymun）試験 TSH ウロキナーゼの添加
40℃で血漿試料の一成分に関する不均一イムノア
ツセイを行う方法に関する。 従来の技術 イムノアツセイ（免疫測定法）は広く行われて
いる。この場合均一相並びに不均一相での方法が
ある。不均一相で実施する場合には、反応成分の
１つは担体に結合する。イムノアツセイを不均一
相で行うためには、種々の方法の別法、例えばサ
ンドイツチ法、間接法及び競合法が公知である。
サンドイツチ法の場合には、抗体を担体に結合
し、試験溶液を添加し、その際試験溶液中に含ま
れた特異的抗原は抗体に結合する。更に標識され
た特異的抗体を添加すると抗原−抗体−複合体か
又は同複合体の１部分が得られる。この標識抗体
によつて抗原の量を計算することができる。間接
法の場合には、抗原は担体の結合する。これに試
験液を添加すると、試験溶液に含まれ前記の結合
抗原に対して特異的な抗体がこの抗原と反応す
る。標識された抗グロブリンを添加すると、抗グ
ロブリンは抗原−抗体−複合体に結合し、試験血
清中の未知の抗体の量は、標識された抗グロブリ
ンによつて測定することができる。競合法の場合
には、免疫反応の結合成分の１つが担体に結合す
る。次いでこれに未知量で存在する免疫反応の他
の成分並びに既知量の標識された免疫反応の他の
成分を含有する溶液を添加する。標識された及び
標識されない両成分は、担体に結合した免疫反応
の成分の結合個所の周りで競合する。第２の試料
に、標識成分だけを含有する標準液を添加する。
次いで標準物及び試料中の標識成分を測定して、
その差異から未知反応成分の量を計算することが
できる。 他の測定法は、少なくとも２価の抗原の場合に
抗体又は抗体断片であつてもよい３種の受容体を
用いて得られる。３種の受容体を用いるイムノア
ツセイを不均一相で行う場合には、３種の受容体
の１つは常に不溶であるが、他の２つは可溶であ
り、この場合２つの可溶受容体の１つは標識され
ているが、他のものは標識されていない。更に不
溶の受容体は、標識されていない可溶の受容体に
対応している。測定を行うためには、種々の別法
が可能である、つまり個々の受容体の添加を変え
ることのできる１段法並びに多段法がある。 すなわち１つの他の別法は、試料中の測定すべ
き抗原を最初の段階で標識されていない可溶の受
容体及び標識されている可溶の受容体と溶液中で
同時に反応させ、次いで生じた可溶のサンドイツ
チ複合体を第２の段階で不溶の受容体に結合させ
て不溶にすることである。 反応成分を標識するためには、種々の方法が可
能である。すなわち、反応成分の１つを放射能に
よつて標識することができ、その際測定放射能に
よつて、測定すべき反応成分の計算が可能にな
る。また、酸素でも標識することができる。この
場合にはイムノアツセイの通常の段階を実施した
後、標識として使用される酵素の基質を添加し、
次いで酵素反応によつて測定すべき反応成分の濃
度を計算する。他の方法は、蛍光性物質での標識
であり、その際蛍光を、直接にか又は染料で測定
することができ、評価は分光法又は測光法によつ
て行う。 イムノアツセイは次第に重要になつている。そ
れというのもこの方法によつて一方では物質を特
異的に検出することができ、他方では著しく大き
い感度を有するので、この方法を用いて物質をピ
コグラムの範囲まで検出することができるからで
ある。しかしながら不均一相のイムノアツセイ
は、種々の程度の分析上特定されない干渉、いわ
ゆる非特異的妨害によつて狂つてくる。この妨害
は既に“マトリツクス効果”、“バツクグラウン
ド”及び“非特異結合”と呼ばれた。特に、血漿
試料中の測定すべき物質の検出量は、サンドイツ
チ法の場合には、血清試料での検出量よりも明ら
かに小さく、競合法の場合には、血清試料での検
出量よりも明らかに大きいことが認められること
は不利である。ところが、このような測定結果の
狂いは、血漿中に存在するが、血清中は存在しな
いフイブリノーゲンによつて惹起されることが判
明した。この測定妨害は、血漿の安定化法には左
右されない、つまり添加するEDTA、クエン酸
塩、ヘパリンその他は検出に影響を及ぼさない。
この妨害は、不均一相のイムノアツセイの場合に
だけ生じる。 ところで、競合法を実施する場合には、フイブ
リノーゲンが見かけ上測定すべき分析物のように
挙動することが確認された。これは、交差反応に
よつて起きるのではなく、フイブリノーゲンが、
固相で存在する免疫反応の成分が結合されている
担体表面上に界面活性物質として固着しており、
従つて前記の結合成分の一部分をおおうことによ
つて起こる。他方、サンドイツチ法の場合にはフ
イブリノーゲンは小さい測定値をもたらす。この
難点を解決するために、血漿試料をイムノアツセ
イを行う前に水浴中で56℃に10分間加熱し、次い
で遠心分離することが既に提案された。この方法
は一方では費用がかかり、他方ではこの処理によ
つて変質しない物質を測定する場合に使用するに
過ぎない。更に、尿素の添加によつてフイブリノ
ーゲンの妨害作用を調節することが提案される。
しかしながらこの場合には、この調節は完全な測
定条件下で可能であるに過ぎず、この条件はそれ
ぞれ個々の血漿試料に対して新たに測定しなけれ
ばならないことが判明した。 発明が解決しようとする課題 本発明の課題は、費用のかかる方法段階を必要
としないで、フイブリノーゲンの妨害作用を除去
することのできる、不均一イムノアツセイを行う
方法を見出すことであつた。 課題を解決するための手段 前記課題は、冒頭記載の方法において、測定す
べき血漿試料の一成分に対するフイブリノーゲン
による妨害を除去するために十分な量のプラスミ
ノーゲン活性因子を前記試料に添加することを特
徴とする不均一イムノアツセイを行う方法によつ
て解決される。 意外にも、イムノアツセイでプラスミノーゲン
活性因子を血漿試料に添加することによつて検出
が改良されるので、血漿試料から得られる測定値
は血清試料から得られる測定値と十分に一致する
ことが立証された。これは驚異的なことであつ
た。それというのもこの改良は常用の方法を実施
する場合、即ち常用のインキユベーシヨン時間及
びインキユベーシヨン温度で得られるからであ
る。従来は文献から、プラスミノーゲン活性因子
によるフイブリノーゲンの分解は、長いインキユ
ベーシヨン時間及び高温度を必要とすることが知
られていたのである。本発明方法を用いることに
よつて他の方法段階を実施することなく、簡単な
混合によつて血漿試料のイムノアツセイを改善す
ることが可能である。 本方法はすべての血漿で使用することができ
る。この方法は、安定にするためにEDTAを添
加した血漿並びにヘパリン、クエン酸塩、蓚酸
塩、弗化物又は他の類似物質で安定にした血漿に
適する。 プラスミノーゲン活性因子によるイムノアツセ
イの影響を生じないので、該活性因子の添加によ
つて測定値の狂いは生じない。 本発明方法は、１段法並びに２段法の測定法で
使用することができる。この場合２段法では、プ
ラスミノーゲン活性因子を、既に第１のインキユ
ベーシヨンの際に添加するのが好ましい。それと
いうのも既に第１のインキユベーシヨンの際に血
漿試料を入れ、これと共に妨害を惹起するフイブ
リン又はフイブリノーゲンを供給するからであ
る。 プラスミノーゲン活性因子の作用によつて、血
漿中に存在するプラスミノーゲンがプラスミンに
変化し、次いでこれはフイブリノーゲンを蛋白分
解によつて分解する。 プラスミノーゲン活性因子としては、特に好ま
しくはストレプトキナーゼ又はウロキナーゼを使
用する。ストレプトキナーゼは、好ましくは10〜
300U／ml、特に好ましくは40〜50U／mlの量で
使用する。下限よりも少ない量では、作用はもは
や十分な程度で生じない。300U／mlよりも大き
い量は検出を更に改良しないので、不経済であ
る。 ウロキナーゼは、好ましくは10〜120U／ml、
特に好ましくは20〜80U／mlの量で使用する。こ
の場合にも下限よりも少ない量では作用はもはや
十分ではないが、上限よりも大きい値で存在する
濃度は役にたたない。 本発明方法の他の好ましい実施形式では、プラ
スミノーゲン活性因子として外因性プラスミノー
ゲン活性因子（EPA）を使用する。EPAは、好
ましくは0.2〜10μｇ／ml、特に好ましくは0.5〜
3μｇ／mlの量で使用する。本発明方法は、反応
成分の１つが固相で存在するすべての種類のイム
ノアツセイに対して使用することができる。すな
わち、本方法は競合法、サンドイツチ法及びすべ
ての種類の標識に対して適している。 実施例 溶液(1) インキユベーシヨン緩衝液 燐酸塩緩衝液 15ｍモル／、PH6.9 牛の血清アルブミン （RSA） 0.2重量％ メルチオレート 0.01重量％ 溶液(2) 溶液(1)にとかした抗−TSH−PCP−複合体 約40U／ 溶液(3) 基質／緩衝液−溶液 燐酸塩−クエン酸塩−緩衝液 95ｍモル／、
PH4.4 過硼酸ナトリウム 3.1ｍモル／ ABTSR 1.6ｍモル／ ２，2′−アジノ−ジ−［３−エチル−ベンズチ
アゾリン−スルホン酸(6)］−ジアンモニウム塩。 使用溶液、塗布試験管及び標準物は、エンチム
ン（Enzymun）試験 TSH（ベーリンガー社、
No.736083）から得られる。測定の実施は、製造者
の規定によつて行う。 抗−TSH−抗体を塗布した試験管に、TSH−
標準物（０〜50μU／ml）又は試料（血清、血漿）
それぞれ0.2ml及び溶液(1)１mlを入れ、20〜25℃
で60分間インキユベートする。この場合溶液(1)
は、種々の濃度のウロキナーゼ（０〜70U／ml）
又はストレプトキナーゼ（０〜50U／ml）を含有
する。吸引し、洗浄した後に、溶液(2)11mlを添加
する。20〜25℃での60分のインキユベーシヨン後
に、試験管を吸引し、洗浄する。続いて溶液(3)１
mlを添加し、更に20〜25℃で60分間インキユベー
トする。次いで溶液(3)に対して、空試験として測
光による測定を405nｍで行う。 次表に挙げた値は、それぞれインキユベーシヨ
ン緩衝液にウロキナーゼ又はストレプトキナーゼ
を添加しないで血清に対して得られた比較値100
％に対する。 エンチムン（Enzymun）試験 TSH ウロキナーゼの添加
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ インキユベーシヨン溶液で温度15〜40℃で血
漿試料の一成分に関する不均一イムノアツセイを
行う方法において、測定すべき前記成分に対する
フイブリノーゲンによる妨害を除去するために十
分な量のプラスミノーゲン活性因子を前記試料の
添加することを特徴とする、不均一イムノアツセ
イを行う方法。 ２ プラスミノーゲン活性因子がストレプトキナ
ーゼである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ プラスミノーゲン活性因子がウロキナーゼで
ある、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ プラスミノーゲン活性因子が外因性プラスミ
ノーゲン活性因子である、特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ５ ストレプトキナーゼを10〜300U／インキユ
ベーシヨン溶液のmlの範囲の量で添加する、特許
請求の範囲第２項記載の方法。 ６ ストレプトキナーゼを40〜150U／インキユ
ベーシヨン溶液のmlの範囲の量で添加する、特許
請求の範囲第２項記載の方法。 ７ ウロキナーゼを10〜120U／インキユベーシ
ヨン溶液のmlの範囲の量で添加する、特許請求の
範囲第３項記載の方法。 ８ ウロキナーゼを20〜80U／インキユベーシヨ
ン溶液のmlの範囲の量で添加する、特許請求の範
囲第３項記載の方法。 ９ 外因性プラスミノーゲン活性因子を0.2〜10μ
ｇ／インキユベーシヨン溶液のmlの範囲の量で添
加する、特許請求の範囲第４項記載の方法。 １０ 外因性プラスミノーゲン活性因子を0.5〜
3μｇ／インキユベーシヨン溶液のmlの範囲の量
で添加する、特許請求の範囲第４項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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| DE19853530942 DE3530942A1 (de) | 1985-08-29 | 1985-08-29 | Verfahren und reagenz zur beseitigung der stoerung der analyt-wiederfindung in plasmaproben |
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| Publication Number | Publication Date |
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-
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