JPH0479882A - セルラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なセルラーゼとその製造法に関する。

［従来の技術］ セルラーゼの開発は従来、バイオマス資源、特にセルロ
ース資源の有効利用を目的として進められてきたが、バ
イオマス用セルラーゼの工業的規模での利用は必ずしも
多くはない。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途のひとつとして、
洗剤用酵素としてセルラーゼが洗浄力の向上に有効であ
るといわれ注目を集めている。洗剤用セルラーゼは、通
常の洗濯条件では洗浄液のｐＨが高アルカリ性であるた
め、高アルカリ条件下で機能するアルカリセルラーゼで
なければならず、更にはまた、洗剤成分の−っである陰
イオン性界面活性剤に対しても安定に機能しなければな
らない。

微生物の生産するアルカリセルラーゼは、好アルカリ性
バチルス属細菌の培養によるセルラーゼＡを採取する方
法（特公昭５Ｏ−２８５１５）、セルロモナス属に属す
る好アルカリ性細菌を培養してアルカリセルラーゼ３０
１−Ａを生産する方法（特開昭５８−２２４６８６）、
好アルカリ性バチルス属細菌ＫＳＭ６３５を培養してア
ルカリセルラーゼＫを生産する方法（特開昭６３−１０
９７７６）等が報告されている。

しかし、これら従来公知のセルラーゼは洗剤成分の一つ
である陰イオン性界面活性剤に対する安定性が必ずしも
十分ではない為、陰イオン性界面活性剤に対してより安
定な酵素の開発が望まれている。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、至適ｐＨが高アルカリ側にあり、また陰イオ
ン性界面活性剤に対しても安定な洗剤用酵素として適し
たセルラーゼを提供しようとするものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者等は上記のような性質を有するセルラーゼを得
るべく、多数の微生物を分離・培養して検索した結果、
東京部下の土壌中より分離したバチルス属に属するバク
テリアバチルス５Ｄ４０２株が洗剤用酵素として優れた
性質を有する新規セルラーゼを生産することを見出し、
本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は１）カルボキシメチルセルロース（ＣＭ
Ｃ）を基質とした場合の至適ｐＨが９．５〜１０．５、
至適温度が約５５℃であり、２）安定ｐＨ領域が３０℃
、３０分処理したときｐＨ６−１１であり、３）　３０
００　ｐｐｍの直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム存在下（ｐＨ９，０）で３０℃、２時間処理しても
９０％以」二の残存活性を有する等、界面活性剤に対し
ても極めて安定であり、４）分子量はＳＤＳ−ポリアク
リルアミド電気泳動法により測定した場合。

５２．０００±２０００であり、そして５）等電点はポ
リアクリルアミド電気泳動法によって測定した場合、４
．２±０．２である新規なセルラーゼ：バチルス属の上
記セルラーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、培
養物から目的のセルラーゼを採取することを特徴とする
上記セルラーゼの製造法；及び上記セルラーゼ生産能を
有するバチルス属の新規な菌株を提供せんとするもので
ある。

以下に本発明の新規セルラーゼとその製造法及びこれに
用いる新規な菌株について更に詳しく説明する。

本発明の新規セルラーゼの製造のために使用する微生物
は、前記の性質を有するセルラーゼを生産することが出
来るバチルス属に属するバクテリアであり次のような性
質を有する。

（ａ）形態 ■細胞の形及び大きさ　　桿菌であり、その太きさは０
．３〜０．５Ｘ　２．８〜 ■細胞の多形成 ■運動性 ■胞子 ■ダラム染色性 ■抗酸性 （ｂ）次の各培地での 生育状態 ■肉汁寒天平板培地 ■肉汁寒天斜面培地 ■肉汁液体培地 ■肉汁ゼラチン穿刺培養 ■リドマスミルク ５・２μｍである。

多形成を示さない。

周鞭毛を有する。

胞子を形成する。

その形は楕円形であり、 大きさは１．０〜１．５× １．８〜２．２μｍである。

陽性 陰性 集落は円形であり、表 面は偏平状で中心部が わずかに隆起している。

又、集落の色調は黄白 色の半透明である。

拡布状に生育する。

混濁 液化 凝固もペプトン化もし （Ｃ）生理学的性質 の硝酸塩の還元 ■脱窒反応 ■ＭＲテスト ■ＶＰテスト ■インドールの生成 ■硫化水素の生成 ■デンプンの加水分解 ■クエン酸の利用 ■無機窒素源の利用 ［相］色素の生成 ■ウレアーゼ ＠オキシダーゼ ０カタラーゼ ０生育の範囲（ｐＨ） ない 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陽性 陰性 硝酸塩及びアンモニラ ム塩を利用する。

陰性 陰性 陽性 陽性 ８．０で生育するが、７．１ で生育しない。

１０．８で生育するが、 １２．３で生育しない。

（温度） ■酸素に対する態度 ［相］Ｏ−Ｆテスト Ｏ糖類の酸化とガスの生成 Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース ０−マンノース Ｄ−フラクトース Ｄ−ガラクトース 麦芽糖 ショ糖 乳糖 トレハロース Ｄ−ソルビット Ｄ−マンニット イノジット グリセリン １５℃、４０℃で生育する が、５０℃で生育しない。

好気的 発酵（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） （１５）デンプン　　　　　　　　＋ 以上の菌学的性質についてバーシーズ・マニュアル・オ
ブ・システマティック・バクテリオロジイー（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、及びザ・ジーナス・バチ
ルス（Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を参照
した結果、重両は有胞子桿菌であるバチルス・アルカロ
フイラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕ
ｓ）に類縁の菌であると認められた。しかし、前記バー
シーズ・マニュアル・オブ・システマテインク・バクテ
リオロジイーに記載のバチルス・アルカロフイラスの標
準株ＮＣＩＢ　１０４３８と重両は、肉汁寒天培地及び
リドマスミルクでの生育状態、ガラクトースからの酸の
生成などその菌学的性質に於て異なる性質を有し、明か
に新規な菌株であることが認められ、そこでバチルス５
Ｄ４０２と命名され、漱工研菌寄第１１５３３号として
寄託された。

尚、本発明に用いる微生物は上記バチルス５Ｄ４０２株
に限らず、本発明の後記する特性を有するセルラーゼの
生産性を有する限り如何なる菌株であっても良い。また
バチルス５Ｄ４０２についても、その自然または人偽的
突然変異株や遺伝子工学的手法による改良株も包含され
る。

鹿支１丑 本発明のセルラーゼを製造するに当たって、上述の如き
微生物の培養方法については、特別な要件はなく慣用の
方法により適宜実施できる。

培地の栄養源としては通常培養に用いられているものが
広く利用できる。炭素源としては同化できる炭素化合物
またはこれを含有するものであればよく１例えばグルコ
ース、マルトース、デンプン、ＣＭＣなどが用いられる
。窒素源としても同化可能な窒素化合物、またはこれを
含有するものであればよく、例えばアンモニウム塩、ペ
プトン、大豆粉、脱脂大豆粉などが用いられる。また、
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩などの塩類
が使用される。その他、菌の生育及び酵素生産に必要な
各種の有機物や無機物またはこれを含有するもの１例え
ばビタミン類、酵母エキスを培地に添加することが出来
る。

培養は液体、または固体培養いずれでも良いが液体培養
の方が好ましい。液体培養における培養条件は培地組成
により多少異なるが、生産の目的物であるセルラーゼの
生産に最も有利な条件を選択する。培養温度は２５〜３
５℃の範囲であり、培養時間は１２時間から３日程度で
あり、セルラーゼ生産が最高に達したときに培養を終了
すれば良い。

培地のｐＨは８以上が良く、９〜１０がセルラーゼ生産
に好適である。このような培養により、目的とするセル
ラーゼが培養液中に得られる。

１１幕１１ このようにして得られた培養液からのセルラーゼの採取
は、酵素を採取するための常法に従って、分離、精製す
ることができる。すなわち、ｉ！！過法、遠心分離法な
どの公知の適当な方法により菌体や培地固形物を分離し
て、上澄液または濾液を得ることができる。これらの分
離液を濃縮し、噴霧乾燥する方法や凍結乾燥する方法、
または濃縮することなく可溶性塩類を添加し沈澱させる
塩析法、親水性有機溶剤を添加して沈澱させる沈澱法に
よリセルラーゼを得ることができる。さらに酵素を精製
するには、例えばイオン交換樹脂等を用いた吸着脱離法
、ゲル渡過法等の精製手段を単独または複数組み合わせ
て、セルラーゼを精製することができる。

酵」Ｌの４Ｌ質 本発明のセルラーゼについて、その詳細な性質を記載す
る。

の　　　　　゛ ■カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）をＭ／２０炭酸
ナトリウム−Ｍ／２０ホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）で溶解したものを基質として用い測定する。

具体的には、ＣＭＣを０．　５％（ｐＨ９，０）となる
ように、　Ｍ／２０炭酸ナトリウム−Ｍ／２０ホウ酸−
塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９，０）に溶解した基質溶液
０　、９ｍｌに酵素液０．１耐を加え、３０℃、１５分
間反応した。反応後、４−ヒドロキシベンゾインクヒド
ラジド（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ　ｈｙｄｒ
ａｚｉｄｅ）法　（ｐＨＢＡＨ法）にて還元糖の定量を
行った。すなわち、反応液１．０　ｍｌにｐＨＢＡＨ試
薬３．０　ｍｌを加え、１０分間、１００℃で加熱発色
させ、冷却後、波長４１０　ｎｗで比色定量した。酵素
力価は、上記の条件下で１分間に１μｍｏｌのグルコー
スに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

■アビセラーゼ活性 アビセル（メルク社）を前処理により水溶性画分を除去
した後、Ｍ／２０炭酸ナトリウム−Ｍ／２０ホウ酸−塩
化カリウム緩衝液（ｐＨ９，０）に懸濁したものを基質
に用い測定した。具体的には、１．０％アビセル（ｐＨ
９，０）　０．９膳ｌに酵素液０．１ｍｌを加え、３０
℃、３００分間反応せた０反応後、反応液１．０　ｍｌ
にｐＨＢＡＨ試薬３．０　ｍｌを加え、１０分間、１０
０℃で加熱発色させ、冷却後、波長４１０　ｎｍで比色
定量した。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μ１
ＩＩ０１のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素
量を１単位とした。

■β−グルコシダーゼ及びｐ−ニトロフェニルセロビオ
シド分解活性 合成基質であるｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラ
ノシド（ｐＮＰＧ）、　　及びｐ−ニトロフェニルβ−
Ｄ−セロビオシド（ＰＮＰＣ）を基質に用い測定した。

具体的には、Ｍ／２０炭酸ナトリウム−Ｍ／２０ホウ酸
−塩化カリウム緩衝液（ｐｌ（９，０）１．５　ｒｍｌ
−５０ａＭ　ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｇまたは、　５ａＭｐＮＰＣ
０，１ｍｌからなる基質溶液に酵素液０．１　ｍｌを加
え、３０℃、３００分間反応せ、遊離するｐ−ニトロフ
ェノールを波長４００ｎ鳳で比色定量した。この条件下
で１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離さ
せる酵素量を１単位とした。

１巣■並１ （１）作用 本酵素は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）や結
晶性の高いアビセルに作用して、βグルコシド結合を加
水分解する。また１合成基質であるｐ−ニトロフェニル
セロビオシドに作用して、ｐ−ニトロフェノールを遊離
させる。

（２）基質特異性 本酵素は、ＣＭＣ、アビセル、ｐ−ニトロフェニルβ−
Ｄ−セロビオシド（ｐＮＰＣ）に作用し、Ｐ−ニトロフ
ェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）には作用
しない。ＣＭＣアーゼ活性を１００とすると、アビセラ
ーゼ活性は０．０４ｐＮＰＧ分解活性は０．　３の相対
活性を示す。

基質　　　　　　　相対活性 ＣＭＣ１００ アビセル　　　　　　　　　０．０４ ｐＮＰＧ　　　　　　　　　　０ ｐＮＰＣ０，３ （３）至適ｐＨ ブリトン・ロビンソン（Ｂｒ１ｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓ
ｏｎ）の広域緩衝液（ｐＨ６〜１１）を用い、ＣＭＣを
基質として測定した場合、９．５〜１０．５である。

反応ｐＨと相対活性との関係を第１図に示す。

（４）安定ｐＨ範囲 ｐＨの異なる緩衝液の下で、３０℃で３０分間放置し、
ＣＭＣ（ｐＨ９，０）を基質として測定した場合、安定
ｐＨは６〜１１である。処理ｐ　Ｈと残存活性を第２図
に示す。

（５）至適温度 ＣＭＣを基質として測定した場合、至適温度は約５５℃
である。反応温度と相対活性の関係を第３図に示す。

（６）熱安定性 Ｍ／２０炭酸ナトリウム−Ｍ／２０ホウ酸−塩化カリウ
ム緩衝液（ｐＨ９，０）の下で、各温度（５〜６５℃）
で３０分間熱処理し、ＣＭＣを基質として測定した場合
、４０℃付近まで全く失活せず、　５５℃で約５０％、
６５℃で約３０％の残存活性を有する。

熱処理温度と残存活性の関係を第４図に示す。

（７）酵素阻害剤、金属イオン及びキレート剤の影響 Ｃｕ″”（５ｍＭ）、パラマーキュリ安息香酸（５ｍ　
Ｍ　）によって阻害を受け、Ｃａ”（５ｍＭ）によって
活性化される。Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（５ｍ　Ｍ　）による
影響は受けない。

（８）界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム３０００　
ｐｐｍの存在下（ｐ　Ｈ９，０）で３０℃、２時間処理
してもほとんど失活しない。処理時間と残存活性の関係
を第５図に示す。

（９）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得ら
れた分子量は、５２０００±２０００である。

（１０）等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定
した結果、４．２±０．２である。

本酵素は、バチルス属に属する菌株バチルス５Ｄ４０２
株によって生産され、高アルカリｐＨ領域に最適ｐＨを
有するものであり、特公昭５０−２８５１５号及び、特
開昭６３−１０９７７６号に記載されているアルカリセ
ルラーゼと比較した場合は、本酵素の分子量が５２００
０±２０００であるのに対し、上記アルカリセルラーゼ
の分子量は１５０００．　３００００及び１８００００
であること並びに他の物理化学的性質が異なる点におい
て明かに別異の酵素である。

［発明の効果コ 本発明のセルラーゼは、至適ｐＨが９．５〜１０．５と
高く、ｐＨ１１においても最適ｐＨの約７０％の相対活
性を有しいると共に、ｐＨ６においても約６０％の相対
活性を有し、広いｐＨ領域で活性を保持している。また
低温側においても充分活性を有する。更に洗剤成分であ
る陰イオン性界面活性剤に対する安定性が高いため、洗
剤用酵素として使用でき、洗浄力の増強を図ることが出
来る。

次に本発明について代表的な実施例を挙げて更に具体的
に説明する。

実ＪＬ例」− ペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸二カリ
ウム０．１％、硫酸マグネシウム０６０５％、酵母エキ
ス０．５％、セロビオース０．５％、ＣＭＧＯ，５％、
炭酸ナトリウム０．５％からなる液体培地を試験管に分
注し、常法により滅菌した。これに５Ｄ４０２株を接種
し、３５℃で２５時間振盪培養した。培養液を遠心分離
し、その上澄のセルラーゼ活性を測定したところＯ−２
Ｌｌ／ｉｆであった。

支ｍ 大豆粉２％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸二カリウ
ム０．１％、硫酸マグネシウム０．０２％、酵母エキス
０．５％、マルトース０．５％、ＣＭＣＯ，１％、炭酸
ナトリウム０．３％からなる液体培地を５Ｌ培養槽に入
れ、蒸気滅菌した。これにあらかじめ培養しておいた５
Ｄ４０２株を接種し、３５℃で３５時間通気攪拌培養を
行った。この培養液を遠心分離し、上澄を得た。この上
澄のセルラーゼ活性は１．Ｉ　Ｕ／ｍｌであった。この
上澄液１８３Ｌを限外濾過膜で濃縮し、凍結乾燥してセ
ルラーゼ比活性１００　ｕ／（の粗酵素を得た。

爽１舅１ 実施例２で得られた粗酵素から本発明のセルラーゼを精
製した。

粗酵素４ｇを２００　ｍ　ｌの１０　ｍ　Ｍ　　炭酸ナ
トリウム−１０ｍ　Ｍ　ホウ酸−塩化カリウム緩衝液（
ｐ　ｔｌ　９　）に溶かし、硫酸アンモニウム沈澱法に
て２０７０％画分の沈澱を得た。この沈澱を上記ｎＮ液
に溶かし、限外濾過膜により脱塩後、　１０ｍＭビス−
トリス緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＣＭ（カルボ
キシメチル）陽イオン交換樹脂カラム（２５ｍ　ｍφ、
　３０　ｃ　ｍ　）で精製し、得られた活性画分を更に
、同ＣＭ陽イオン交換樹脂カラムで精製を行った。同操
作で溶出した活性画分を限外濾過膜で濃縮脱塩後、１０
ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）で平衡化した
ＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル）陰イオン交換樹脂
カラム（２５ｍｍφ、３６ｃｍ）に吸着させ、塩化ナト
リウムの濃度勾配（０〜ＬＭ）で溶出させた。粗酵素中
にＣＭＣアーゼは少なくとも３成分存在した。ＤＥＡＥ
陰イオン交換樹脂での分画と活性の関係を第６図に示し
た。この主成分であるＣＭＣアーゼ（分画番号１２２〜
１４１）を限外濾過膜で濃縮脱塩後、更に同ＤＥＡＥ陰
イオン交換樹脂にて精製を行った。同操作で溶出した活
性画分を限外濾過膜にて脱塩を行い、凍結乾燥後、１０
ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐＨ７，０）に溶かし、１０
ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したフ
ェニルセファロース　ＣＬ４Ｂカラムに吸着させ、硫酸
アンモニウムの濃度勾配（１〜ＯＭ）で溶出させた。同
操作で溶出した活性画分を限外濾過膜にて脱塩を行い、
凍結乾燥した。この過程で２．２ｍｇの凍結乾燥標品を
得た。

この凍結乾燥標品は白色であり、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により試験したところ単一であることが確
認された。

この凍結乾燥標品を用いて、至適ｐＨ−ｐＨ安定性、至
適温度、熱安定性、界面活性剤に対する安定性を調べた
結果は第１図〜第５図に示した通りである。

１Ｌ月１ 本発明セルラーゼの洗浄試験を実施した。

（ａ）汚染布の作成 約２００　ｍ　ｌの活性炭を乳バチへ入れ、純水で練り
ながら水溶液にする。パレット中で綿布に均一に塗布し
、自然乾燥させ、２０回づつスポンジでこすり余分な活
性炭を除く。５　ｃ　ｍ　Ｘ　５　ｃ　ｍに裁断し、洗
浄試験に供した。

（ｂ）洗浄試験 洗浄はターボトメ−ター（Ｔｅｒｚ−０−Ｔｏｍｅｔｅ
ｒ）にて行った。洗浄条件は回転数１２０ｒｐｍにて３
０℃、１０分間、洗剤（ＪＩＳ無リン）濃度１３３０　
Ｐｐｍとした。実施例２で得られた粗酵素を１０ｅ＋ｇ
／Ｌの濃度で添加すると無添加に比べ、白皮で５％、洗
濯効率で８％の向上がみられた。

【図面の簡単な説明】

第１図は反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフであ
る。 第２図は熱処１！ＩｐＨと残存活性を示すグラフである
。 第３図は反応温度と相対活性の関係を示すグラフである
。 第４図は熱処理温度と残存活性の関係を示すグラフであ
る。 第５図は直鎖アルカリベンゼンスルホン酸ナトリウム ３０００ｐｐｍの存在下での安定性を示すグラフ第１図 である。 第６図は一回目のＤＥＡＥ陰イオン交換樹脂での分画と
活性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の性質を有するセルラーゼ； （１）至適ｐＨ、至適温度 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質とした場
   合の至適ｐＨが９．５〜１０．５、至適温度が約５５℃
   である。 （２）安定ｐＨ ３０℃で３０分処理したときｐＨ６〜１１まで安定であ
   る。 （３）界面活性剤の影響 ３０００ｐｐｍの直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナト
   リウム存在下（ｐＨ９．０）で３０℃、２時間処理して
   も９０％以上の残存活性を有する。 （４）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により測定した分
   子量が５２０００±２０００である。 （５）等電点 等電点電気泳動によつて測定した等電点が ４．２±０．２である。 ２、バチルス属に属し請求項１に記載のセルラーゼ生産
   能を有する微生物を培地に培養し、培養物から目的とす
   るセルラーゼを採取することを特徴とする請求項１に記
   載のセルラーゼの製造方法。