JPH0480676B2 - - Google Patents
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- JPH0480676B2 JPH0480676B2 JP59149585A JP14958584A JPH0480676B2 JP H0480676 B2 JPH0480676 B2 JP H0480676B2 JP 59149585 A JP59149585 A JP 59149585A JP 14958584 A JP14958584 A JP 14958584A JP H0480676 B2 JPH0480676 B2 JP H0480676B2
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- lipase
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- culture
- enzyme
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6418—Fatty acids by hydrolysis of fatty acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/882—Staphylococcus
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- Medicinal Chemistry (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は新規リパーゼの製造法に関するもので
ある。さらに詳しくは、スタフイロコツカス・キ
ヤピテイス（Staphylococcus capitis）に属する
微生物によるトリグリセリドから遊離脂肪酸およ
びグリセリンを生じせしめる新規リパーゼの製造
法に関するものである。 （従来の技術） 微生物、とくにバクテリアを用いるリパーゼの
製造法としては、シユードモナス属、クロモバク
テリウム属、アクロモバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属などに属する菌を利用する方法が知
られている。しかしながら、これらの微生物に由
来するリパーゼを用いて油脂類、特にトリグリセ
リドを分解した場合、脂肪酸及びグリセリンのほ
かにかなりの量のモノグリセリド及びジグリセリ
ドが生成する。これは、一旦分解生成した脂肪酸
とグリセリンがリパーゼの作用により再度結合す
るか、又はリパーゼによる分解がモノグリセリド
もしくはジグリセリドの段階で停止するためであ
ると考えられる。従つて、このような従来から知
られているリパーゼを用いて油脂を分解するとに
よつて脂肪酸を製造する方法には、技術的にも経
済的にも難点があつた。 （発明が解決しようとする問題点） 発明者等は、トリグリセリドを完全に分解して
脂肪酸及びグリセリンを生成せしめ、モノグリセ
リド及びジグリセリドを実質上生成せしめず、油
脂の酵素的分解による脂肪酸の工業的製造に使用
することができるリパーゼを開発すべく、広範囲
の微生物を検索した結果、スタフイロコツカス・
キヤピテイス（Staphylococcus capitis）が上記
の能力を有する新規なリパーゼを生産することを
見出し、このリパーゼを純粋に分離することに成
功し、この発明を完成した。 （問題点を解決するための手段） 従つて、この発明は、スタフイロコツカス・キ
ヤピテイス（Staphylococcus capitis）に属し、
新規リパーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に
培養し、培養液中に該リパーゼを蓄積せしめ、該
培養液から該リパーゼを採取することを特徴とす
る新規リパーゼの製造方法を提供するものであ
り、このリパーゼはトリグリセリドを実質上完全
に脂肪酸とグリセリンとに分解し、有意量のモノ
グリセリド及びジグリセリドを生成せしめない。 リパーゼ生産菌 この発明において使用するリパーゼ生産菌はス
タフイロコツカス・キヤピテイスに属し、リパー
ゼ生産能を有する細菌である。このような細菌で
あればいずれもこの発明の方法において使用する
ことができ、例えばアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨン（ATCC）に保存されてお
り、容易に入手することができるスタフイロコツ
カス・キヤピテイスを使用することができる。こ
のような菌として例えばスタフイロコツカス・キ
ヤピテイスATCC27840、ATCC27841、
ATCC27842、及びATCC27843を挙げることがで
きる。 さらに、この発明の方法に使用することができ
る新菌株として、本発明者等がヒトの頭皮から初
めて分離したスタフイロコツカス・キヤピテイス
Ｔ−１−１株を挙げることができる。この菌株は
次のような菌学的諸性質を有する。 (A) 形態 (1) 大きさ；直径0.8〜1.2μｍの球菌、２〜４
個集つて存在。 (2) 運動性；なし。 (3) 胞子形成；観察されず。 (4) グラム染色性；陽性。 (5) 抗酸性；なし。 (B) 生育状態 (1) 肉汁寒天板培養；やや凸状、円形、表面平
滑、不透明白色のコロニーを形成。コロニー
は小さく、径１〜３ｍ／ｍである。 (2) 肉汁液体培養；生育良好、液全体が混濁。 (3) 肉汁ゼラチン穿刺培養；ゼラチンを液化せ
ず、線状に生育。 (4) 肉汁寒天斜面培養；やや凸状、表面平滑。
不透明白色。生育良好。 (5) リトマスミルク；色調変化せず。凝固又は
液化を認めず。 (6) メチルレツド（MR）テスト；陽性 (7) フオーゲス・プロスカウエル（VP）テス
ト；陽性 (8) インドール生成；なし。 (9) 硫化水素生成；なし。 (10) デンプン分解能；なし。 (11) クエン酸利用能；ユーザー・クリステン
セン反応陽性 (12) 無機窒素源利用能；硝酸塩を利用する
が、アンモニウム塩を利用せず。 (13) 色素産生能；なし。 (14) ウレアーゼ反応；陰性。 (15) オキシダーゼ反応；陰性。 (16) カタラーゼ反応；陽性。 (17) 生育範囲；PH５〜９、温度20℃〜40℃最
適生育温度32℃〜35℃。 (18) 酸素要求性；通性嫌気性。 (19) 糖利用能； 酸生成（＋）；Ｄ−グリコース、Ｄ−フラ
クトース、Ｄ−マンノース、シユクロー
ス、グリセリン。 酸、ガス生成（−）；Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、マル
トース、ラクトース、トレハロース、Ｄ−
ソルビツト、イノシツト、デンプン。Ｄ−
グリコースから乳酸を生成。 (20) 耐塩性；あり（10〜20％の食塩水中生
育）。 (21) リパーゼ活性；あり。 (22) レシチナーゼ活性；あり。 (23) コアグラーゼ活性；なし (24) フオスフアターゼ活性；なし。 (25) デオキシリボヌクレアーゼ活性；あり。 なお、本菌は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄託受託番号第843号（FERMBP−
834）として寄託されている。 培 養 本発明を実施するにあたつては、上記のスタフ
イロコツカス・キヤピテイスに属するリパーゼ生
産菌を培地に培養する。 培地に栄養源としては、本菌が円滑に生育する
限り特に限定するものではなく、炭素源としては
グリコース、スクロース、糖蜜、油脂などをあげ
ることができ、また窒素源としては、各種ペプト
ン、大豆粉、コーンステイープリカー、酵母エキ
ス等の同化可能なものをひとつあるいは組み合わ
せて用いることができる。また、Mg2+、Ca2+、
Na+等の塩類や各種ビタミン類、また培養に即し
て消泡剤を培地に添加することもできる。 本発明において培養の形態は液体培養でも固体
培養でもよいが、通常は液体培養が好ましく、振
とう培養、通気撹拌培養を行ない、リパーゼを得
ることができる。本発明における培養条件は使用
する菌株、培地組成により多少異なるが、目的物
であるリパーゼの生産に最も有利な条件を選択設
定すればよく、本菌株のうちＴ−１−１株の場合
を配せば、培養温度は20〜40℃、とくに好ましく
は30〜37℃である。また培地の至適PHはPH５〜９
にあり、特にPH６〜７においては円滑なリパーゼ
生産が行なわれる。 上述の如く、本発明に従い、スタフイロコツカ
ス・キヤピテイスに属するリパーゼ生産菌を培地
に培養して新規リパーゼを生産させる場合、培地
にオリーブ油等の油脂、あるいはレシチン等のリ
ン脂質を添加することにより生産性が著しく増加
する。これらの脂質の添加量はその適当量を設定
して培地に添加されるが、通常培地に対し0.01〜
２％添加するのが適当である。培養期間は菌株に
より異なるが１〜３日においてリパーゼ生産は完
了する。 リパーゼの採取・精製 本新規リパーゼは菌体外酵素であるためリパー
ゼは通常の遠心法あるいは過法により菌体から
容易に分離することができる。さらに精製を行な
う場合は、酵素の採取精製に通常用いられる手
法、例えば、硫安等を用いる塩析、エタノール、
アセトン等を用いた溶媒沈澱、等電点沈澱、活性
炭、リン酸カルシウム等を用いた物理吸着、イオ
ン交換クロマトグラフイー、ゲル過法やアフイ
ニイークロマトグラフイーなど酵素精製に用いら
れている一般的な方法のひとつ、あるいは複数の
組み合わせにより各々の使用目的に応じた種々の
純度の酵素標品を得ることができる。 精製方法の具体例を示すと次の如くである。本
発明の方法により得られた培養液を過または遠
心分離することにより、透明な酵素液が得られ
る。この酵素液を濃縮し20ｍＭ Tris−HCl緩衝
液（PH7.0）で透析後、同緩衝液で平衡化した
DEAE−セルロースに吸着させNaClでグラジエ
ント溶出させる。本リパーゼはNaCl濃度0.4〜
0.5M付近で溶出される。適宜濃縮後100ｍＭ
NaCl含有100ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH8.0）
で平衡化したウルトロゲルAcA34（LKB製）を用
いてゲル過を行うことにより電気泳動的に単一
な標品を得ることができる。また上記培養液を限
外過膜により濃縮し、その濃縮液を希塩酸を用
いてPH3.9〜4.0に調整し、低温（４℃が好まし
い）に数時間保持した後、遠心分離または過す
ることにより沈澱物を回収し、凍結乾燥すること
により酵素標品を得ることができる。 リパーゼの性質 こうして精製された本リパーゼの諸性質は次の
通りである。 基質特異性 広く油脂を基質とする。オリーブ油、ヤシ
油、ヒマシ油などの植物油、牛脂などの動物油
脂およびトリブチリン等水溶性脂質を分解す
る。 油脂およびトリグリセライドを基質とした際
のリパーゼ活性を、オリーブ油およびトリオレ
インを基質とした際の活性を100％とした相対
活性値として、それぞれ第１図及び第２図に示
す。 至適PHおよび安定PH範囲 本リパーゼは第３図に示す通りPH4.5〜10.5
の範囲で活性を示し、至適PHは7.5〜8.0と弱ア
ルカリ側である。 種々の緩衝液中で４℃、24時間保持したとき
の残存リパーゼ活性は第４図に示す通りであ
る。PH４より酸性側およびPH11以上のアルカリ
側で失活がおこり、PH５〜10の範囲では安定が
ある。 至適温度および安定温度範囲 本リパーゼは第５図に示す通り、20〜45℃の
範囲で活性を示し、至適温度30〜35℃である。 各温度で30分間処理したときの残存リパーゼ
活性は第６図に示す通りである。30分間処理で
は45℃まで安定である。 阻害および活性化 ２価金属イオン、SH試薬、界面活性剤のリ
パーゼ活性に及ぼす影響を、処理後の残存リパ
ーゼ活性を測定して求めた阻害度により調べ
た。10ｍＭのCa2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、
Zn2+、及び１ｍＭ Fe2+などではいずれも阻
害はみられない。とくにCa2+の存在によりリ
パーゼ活性は３〜５倍程度活性化される。 また、２ｍＭラウリル硫酸ナトリウム
（SDS）、ヨードアセトアミド、0.1％のツウイ
ーン20、ツウイーン80、トライトンＸ−100に
より活性は90％以上阻害される。 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法お
よびゲル過法により求めた分子量は約128000
である。 等電点 キヤリアーアンホライン（LKB製）を用い
た等電点電気泳動法により求めた等電点は3.9
±0.1である。 アミノ酸組成 次の表の通りである。
ある。さらに詳しくは、スタフイロコツカス・キ
ヤピテイス（Staphylococcus capitis）に属する
微生物によるトリグリセリドから遊離脂肪酸およ
びグリセリンを生じせしめる新規リパーゼの製造
法に関するものである。 （従来の技術） 微生物、とくにバクテリアを用いるリパーゼの
製造法としては、シユードモナス属、クロモバク
テリウム属、アクロモバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属などに属する菌を利用する方法が知
られている。しかしながら、これらの微生物に由
来するリパーゼを用いて油脂類、特にトリグリセ
リドを分解した場合、脂肪酸及びグリセリンのほ
かにかなりの量のモノグリセリド及びジグリセリ
ドが生成する。これは、一旦分解生成した脂肪酸
とグリセリンがリパーゼの作用により再度結合す
るか、又はリパーゼによる分解がモノグリセリド
もしくはジグリセリドの段階で停止するためであ
ると考えられる。従つて、このような従来から知
られているリパーゼを用いて油脂を分解するとに
よつて脂肪酸を製造する方法には、技術的にも経
済的にも難点があつた。 （発明が解決しようとする問題点） 発明者等は、トリグリセリドを完全に分解して
脂肪酸及びグリセリンを生成せしめ、モノグリセ
リド及びジグリセリドを実質上生成せしめず、油
脂の酵素的分解による脂肪酸の工業的製造に使用
することができるリパーゼを開発すべく、広範囲
の微生物を検索した結果、スタフイロコツカス・
キヤピテイス（Staphylococcus capitis）が上記
の能力を有する新規なリパーゼを生産することを
見出し、このリパーゼを純粋に分離することに成
功し、この発明を完成した。 （問題点を解決するための手段） 従つて、この発明は、スタフイロコツカス・キ
ヤピテイス（Staphylococcus capitis）に属し、
新規リパーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に
培養し、培養液中に該リパーゼを蓄積せしめ、該
培養液から該リパーゼを採取することを特徴とす
る新規リパーゼの製造方法を提供するものであ
り、このリパーゼはトリグリセリドを実質上完全
に脂肪酸とグリセリンとに分解し、有意量のモノ
グリセリド及びジグリセリドを生成せしめない。 リパーゼ生産菌 この発明において使用するリパーゼ生産菌はス
タフイロコツカス・キヤピテイスに属し、リパー
ゼ生産能を有する細菌である。このような細菌で
あればいずれもこの発明の方法において使用する
ことができ、例えばアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨン（ATCC）に保存されてお
り、容易に入手することができるスタフイロコツ
カス・キヤピテイスを使用することができる。こ
のような菌として例えばスタフイロコツカス・キ
ヤピテイスATCC27840、ATCC27841、
ATCC27842、及びATCC27843を挙げることがで
きる。 さらに、この発明の方法に使用することができ
る新菌株として、本発明者等がヒトの頭皮から初
めて分離したスタフイロコツカス・キヤピテイス
Ｔ−１−１株を挙げることができる。この菌株は
次のような菌学的諸性質を有する。 (A) 形態 (1) 大きさ；直径0.8〜1.2μｍの球菌、２〜４
個集つて存在。 (2) 運動性；なし。 (3) 胞子形成；観察されず。 (4) グラム染色性；陽性。 (5) 抗酸性；なし。 (B) 生育状態 (1) 肉汁寒天板培養；やや凸状、円形、表面平
滑、不透明白色のコロニーを形成。コロニー
は小さく、径１〜３ｍ／ｍである。 (2) 肉汁液体培養；生育良好、液全体が混濁。 (3) 肉汁ゼラチン穿刺培養；ゼラチンを液化せ
ず、線状に生育。 (4) 肉汁寒天斜面培養；やや凸状、表面平滑。
不透明白色。生育良好。 (5) リトマスミルク；色調変化せず。凝固又は
液化を認めず。 (6) メチルレツド（MR）テスト；陽性 (7) フオーゲス・プロスカウエル（VP）テス
ト；陽性 (8) インドール生成；なし。 (9) 硫化水素生成；なし。 (10) デンプン分解能；なし。 (11) クエン酸利用能；ユーザー・クリステン
セン反応陽性 (12) 無機窒素源利用能；硝酸塩を利用する
が、アンモニウム塩を利用せず。 (13) 色素産生能；なし。 (14) ウレアーゼ反応；陰性。 (15) オキシダーゼ反応；陰性。 (16) カタラーゼ反応；陽性。 (17) 生育範囲；PH５〜９、温度20℃〜40℃最
適生育温度32℃〜35℃。 (18) 酸素要求性；通性嫌気性。 (19) 糖利用能； 酸生成（＋）；Ｄ−グリコース、Ｄ−フラ
クトース、Ｄ−マンノース、シユクロー
ス、グリセリン。 酸、ガス生成（−）；Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、マル
トース、ラクトース、トレハロース、Ｄ−
ソルビツト、イノシツト、デンプン。Ｄ−
グリコースから乳酸を生成。 (20) 耐塩性；あり（10〜20％の食塩水中生
育）。 (21) リパーゼ活性；あり。 (22) レシチナーゼ活性；あり。 (23) コアグラーゼ活性；なし (24) フオスフアターゼ活性；なし。 (25) デオキシリボヌクレアーゼ活性；あり。 なお、本菌は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄託受託番号第843号（FERMBP−
834）として寄託されている。 培 養 本発明を実施するにあたつては、上記のスタフ
イロコツカス・キヤピテイスに属するリパーゼ生
産菌を培地に培養する。 培地に栄養源としては、本菌が円滑に生育する
限り特に限定するものではなく、炭素源としては
グリコース、スクロース、糖蜜、油脂などをあげ
ることができ、また窒素源としては、各種ペプト
ン、大豆粉、コーンステイープリカー、酵母エキ
ス等の同化可能なものをひとつあるいは組み合わ
せて用いることができる。また、Mg2+、Ca2+、
Na+等の塩類や各種ビタミン類、また培養に即し
て消泡剤を培地に添加することもできる。 本発明において培養の形態は液体培養でも固体
培養でもよいが、通常は液体培養が好ましく、振
とう培養、通気撹拌培養を行ない、リパーゼを得
ることができる。本発明における培養条件は使用
する菌株、培地組成により多少異なるが、目的物
であるリパーゼの生産に最も有利な条件を選択設
定すればよく、本菌株のうちＴ−１−１株の場合
を配せば、培養温度は20〜40℃、とくに好ましく
は30〜37℃である。また培地の至適PHはPH５〜９
にあり、特にPH６〜７においては円滑なリパーゼ
生産が行なわれる。 上述の如く、本発明に従い、スタフイロコツカ
ス・キヤピテイスに属するリパーゼ生産菌を培地
に培養して新規リパーゼを生産させる場合、培地
にオリーブ油等の油脂、あるいはレシチン等のリ
ン脂質を添加することにより生産性が著しく増加
する。これらの脂質の添加量はその適当量を設定
して培地に添加されるが、通常培地に対し0.01〜
２％添加するのが適当である。培養期間は菌株に
より異なるが１〜３日においてリパーゼ生産は完
了する。 リパーゼの採取・精製 本新規リパーゼは菌体外酵素であるためリパー
ゼは通常の遠心法あるいは過法により菌体から
容易に分離することができる。さらに精製を行な
う場合は、酵素の採取精製に通常用いられる手
法、例えば、硫安等を用いる塩析、エタノール、
アセトン等を用いた溶媒沈澱、等電点沈澱、活性
炭、リン酸カルシウム等を用いた物理吸着、イオ
ン交換クロマトグラフイー、ゲル過法やアフイ
ニイークロマトグラフイーなど酵素精製に用いら
れている一般的な方法のひとつ、あるいは複数の
組み合わせにより各々の使用目的に応じた種々の
純度の酵素標品を得ることができる。 精製方法の具体例を示すと次の如くである。本
発明の方法により得られた培養液を過または遠
心分離することにより、透明な酵素液が得られ
る。この酵素液を濃縮し20ｍＭ Tris−HCl緩衝
液（PH7.0）で透析後、同緩衝液で平衡化した
DEAE−セルロースに吸着させNaClでグラジエ
ント溶出させる。本リパーゼはNaCl濃度0.4〜
0.5M付近で溶出される。適宜濃縮後100ｍＭ
NaCl含有100ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH8.0）
で平衡化したウルトロゲルAcA34（LKB製）を用
いてゲル過を行うことにより電気泳動的に単一
な標品を得ることができる。また上記培養液を限
外過膜により濃縮し、その濃縮液を希塩酸を用
いてPH3.9〜4.0に調整し、低温（４℃が好まし
い）に数時間保持した後、遠心分離または過す
ることにより沈澱物を回収し、凍結乾燥すること
により酵素標品を得ることができる。 リパーゼの性質 こうして精製された本リパーゼの諸性質は次の
通りである。 基質特異性 広く油脂を基質とする。オリーブ油、ヤシ
油、ヒマシ油などの植物油、牛脂などの動物油
脂およびトリブチリン等水溶性脂質を分解す
る。 油脂およびトリグリセライドを基質とした際
のリパーゼ活性を、オリーブ油およびトリオレ
インを基質とした際の活性を100％とした相対
活性値として、それぞれ第１図及び第２図に示
す。 至適PHおよび安定PH範囲 本リパーゼは第３図に示す通りPH4.5〜10.5
の範囲で活性を示し、至適PHは7.5〜8.0と弱ア
ルカリ側である。 種々の緩衝液中で４℃、24時間保持したとき
の残存リパーゼ活性は第４図に示す通りであ
る。PH４より酸性側およびPH11以上のアルカリ
側で失活がおこり、PH５〜10の範囲では安定が
ある。 至適温度および安定温度範囲 本リパーゼは第５図に示す通り、20〜45℃の
範囲で活性を示し、至適温度30〜35℃である。 各温度で30分間処理したときの残存リパーゼ
活性は第６図に示す通りである。30分間処理で
は45℃まで安定である。 阻害および活性化 ２価金属イオン、SH試薬、界面活性剤のリ
パーゼ活性に及ぼす影響を、処理後の残存リパ
ーゼ活性を測定して求めた阻害度により調べ
た。10ｍＭのCa2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、
Zn2+、及び１ｍＭ Fe2+などではいずれも阻
害はみられない。とくにCa2+の存在によりリ
パーゼ活性は３〜５倍程度活性化される。 また、２ｍＭラウリル硫酸ナトリウム
（SDS）、ヨードアセトアミド、0.1％のツウイ
ーン20、ツウイーン80、トライトンＸ−100に
より活性は90％以上阻害される。 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法お
よびゲル過法により求めた分子量は約128000
である。 等電点 キヤリアーアンホライン（LKB製）を用い
た等電点電気泳動法により求めた等電点は3.9
±0.1である。 アミノ酸組成 次の表の通りである。
【表】
【表】
リポプロテインリパーゼ活性
リパーゼ活性を有すると同時にリポプロテイ
ンリパーゼ活性をも有する。 リパーゼ活性の測定法 次にリパーゼ活性の測定法は次の通りである。 大型試験管（φ25×200mm）に25ｍＭ Tris−
HCl緩衝液（PH8.0）／10ｍＭ CaCl2 ５mlを含
む反応液にオリーブ油１mlを添加し、ミキサーで
激しく撹拌した後、酵素液0.5mlを加え、毎分300
回転の速度で往復振とうしながら30℃にて30分間
反応させる。その後、20mlのエタノールを加えて
反応を止め、生成脂肪酸を0.05N水酸化ナトリウ
ム水溶液で滴定する。盲検値は上記組成の反応液
にエタノールを加えた後に酵素液を加えたものを
アルカリ滴定して求める。 リパーゼ活性の単位（Unit）は、国際生化学
連合（I.U.B）と酵素委員会の提案に従い、上記
の反応条件で１分間に1μmoleの脂肪酸を遊離す
る活性を1Unitと定める。 次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説
明する。 実施例 １ グリコース0.1％、酵母エキス0.5、ポリペプト
ン１％及びNaCl0.5％から成る液体培地（PH7.0）
にスタフイロコツカス・キヤピテイスＴ−１−１
株（FERM BP−834）を接種し、30℃にて18時
間振とう培養して種菌とした。 AFFペプトン（大豆蛋白加水分解物；味の素
K.K.製）10％及びNaCl0.5％から成る液体培地
（PH6.3）100mlを500ml容坂口フラスコに分注し、
滅菌し、この培地（10％AFFペプトン培地）に、
１容量％の前記種菌を接種し、30℃にて300回／
分の往復振とう機を用いて２日間振とう培養し
た。 培養液を集め、遠心分離によつて菌体を除去
し、上澄液を得た。この上澄液のリパーゼ活性を
測定したところ10.3U／mlであつた。この酵素液
1360mlについて硫安塩析を行い生じた沈澱区分を
遠心分離することにより集め、20ｍＭ Tris−
HCl緩衝液（PH7.0）中で一夜透析を行つた後、
同緩衝液で平衡化したDEAK−セルロースカラ
ムを用いてクロマトグラフイー（ワツトマン製；
φ36×210mm）に付し０→1MNaClグラジエント
溶出を行つたところ0.4〜0.5MNaClで本リパーゼ
が溶出された。適当に濃縮後、100ｍＭ Tris−
HCl緩衝液（PH8.0）／100ｍＭ NaClで平衡化
したUltrogel AcA34カラムクロマトグラフイー
（LKB製；φ25×440mm）に付し適宜再クロマトグ
ラフイーを行うことにより電気泳動的に単一な酵
素標品を得ることができた。上記精製過程での比
活性（mg蛋白質当りの活性）、回収率はそれぞれ
136.2U／mg、34％であつた。 実施例 ２ 実施例１に示したのと同様の培養上澄液につい
て限外過（日本ミリポア製、ペリコンラボカセ
ツト；分子量10000限外過膜PTGC OLC05）
により濃縮した後、20ｍＭ Tris−HCl緩衝液
（PH7.0）で平衡化したDEAE−セルロースカラム
を用いるクロマトグラフイーに付し、以下実施例
１に示した方法で精製を行い電気泳動的に単一な
酵素標品を得ることができた。 実施例 ３ AFFペプトン（大豆蛋白質加水分解物）５％、
NaCl0.5％から成る液体培地（PH6.3）７を14
容ジヤーフアーメンター（NEW BRUNSWICK
SCIENTIFIC社製）に入れて殺菌し、培地を調
製した。 実施例１の場合と同様にして培養した種菌〔ス
タフイロコツカス・キヤピテイスＴ−１−１
（FERM BP−834）〕200mlを上記の培地に接種
し、培養温度30℃、撹拌数300r.p.m.、通気量
2.0v.v.mにて24時間培養を行つた。培養液を遠心
分離して菌体を除き、限外過（日本ミリポア
製、ペリコンラボカセツト分子量10000限外過
膜、PTGC OLC 05）により４倍濃縮し、この
濃縮液を塩酸を用いてPH3.9に調整し、低温（４
℃が好ましい）に２時間放置した後、生じた沈澱
物を遠心分離または過により回収し溶解した後
凍結乾燥することにより精製酵素標品を得た。上
記精製過程での比活性（mg蛋白質当りの活性）、
回収率はそれぞれ87.0U／mg、28％であつた。 実施例 ４ 実施例１で得られた酵素標品を用いて、トリオ
レイン（99％純度、半井化学）を基質として酵素
反応を行い、その反応生成物をシリカゲル薄層ク
ロマトグラフイーで同定した。すなわち25ｍＭ
Tris−HCl緩衝液（PH8.0）／10ｍＭ CaCl22ml
にトリオレイン10μを加え、これに酵素を総活
性として3Uとなるように添加し30℃で反応を行
つた。 また、比較のため、市販のリゾプス・アルヒズ
ス（Rhizopus arrhizus）由来のリパーゼ、キヤ
ンデイダ・シリンドラセー（Candida
cylindracea）由来のリパーゼ、及びシユードモ
ナスsp.（Pseudomonas sp.）由来のリパーゼを用
いて同様の反応を行つた。 反応中10分、30分、60分、及び120分後にサン
プルを採取し、クロロホルムにより生成物を抽出
し、そして抽出液1μを薄層クロマトグラフイ
ーにより分析した。 この薄層クロマトグラフ系は次の通りとした。 溶媒系：クロロホルム／アセトン（96：４）。 発色：１％Ce（SO4）2／10％H2SO4加熱。 薄層板：シリカゲルKieselgel60F254（Merk社
製）。 この結果を第７図に示す。この図から明らかな
通り、リゾプス（糸状菌）由来のリパーゼ、キヤ
デイダ（酵母）由来のリパーゼ、及びシユードモ
ナス（細菌）由来のリパーゼを用いた場合には、
いずれの反応時間においてもジグリセリドである
１，３−ジオレイン及び１，２−（２，３）−ジオ
レイン、並びにモノグリセリドであるモノオレイ
ンが生成し、これらは反応時間の経過と共にむし
ろ増加する傾向を示したが、本発明のリパーゼを
用いた場合には、全反応時間にわたつてモノオレ
イン及びジオレインは検出されず、オレイン酸の
みが生成した。 実施例 ５ 実施例１で得られた酵素標品を用いてトリオレ
イン、ジオレイン及びモノオレインを基質として
酵素反応を行い、その反応生成物をシリカゲル薄
層クロマトグラフイーで同定した。すなわち25ｍ
Ｍ Tris−HCl緩衝（PH8.0）／10ｍＭ CaCl21
mlにトレオレイン（99％純度）7.5μ；同緩衝液
１mlにジデオレイン（99％純度）5μ；同緩衝
液１mlにもモノオレイン（99％純度）3μを加
え、各々酵素液を総活性として3Uとなるよう添
加し、30℃にて60分間同条件で反応させた後、ク
ロロホルムにより抽出し、この抽出液を、実施例
４の場合と同様にしてシリカゲル薄層クロマトグ
ラフイーに付した。この結果を第８図に示す。図
から明らかな通り、いずれの基質からもオレイン
酸のみが生じた。 実施例 ６ 10％AFFペプトン培地（実施例１参照のこと）
に１％のオリーブ油を加え、次の菌株を接種して
30℃にて、３日間振とう培養した。 (1) スタフイロコツカス（St.）・キヤピテイス
ATCC27840 (2) St.キヤピテイス ATCC27841 (3) St.キヤピテイス ATCC27842 (4) St.キヤピテイス ATCC27843 (5) St.キヤピテイスＴ−１−１（FERM BP−
834） 培養後、遠心分離により菌体を除去し、上澄液
を得、これを酵素液として使用した。この酵素液
のリパーゼ力価は次の通りであつた。
ンリパーゼ活性をも有する。 リパーゼ活性の測定法 次にリパーゼ活性の測定法は次の通りである。 大型試験管（φ25×200mm）に25ｍＭ Tris−
HCl緩衝液（PH8.0）／10ｍＭ CaCl2 ５mlを含
む反応液にオリーブ油１mlを添加し、ミキサーで
激しく撹拌した後、酵素液0.5mlを加え、毎分300
回転の速度で往復振とうしながら30℃にて30分間
反応させる。その後、20mlのエタノールを加えて
反応を止め、生成脂肪酸を0.05N水酸化ナトリウ
ム水溶液で滴定する。盲検値は上記組成の反応液
にエタノールを加えた後に酵素液を加えたものを
アルカリ滴定して求める。 リパーゼ活性の単位（Unit）は、国際生化学
連合（I.U.B）と酵素委員会の提案に従い、上記
の反応条件で１分間に1μmoleの脂肪酸を遊離す
る活性を1Unitと定める。 次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説
明する。 実施例 １ グリコース0.1％、酵母エキス0.5、ポリペプト
ン１％及びNaCl0.5％から成る液体培地（PH7.0）
にスタフイロコツカス・キヤピテイスＴ−１−１
株（FERM BP−834）を接種し、30℃にて18時
間振とう培養して種菌とした。 AFFペプトン（大豆蛋白加水分解物；味の素
K.K.製）10％及びNaCl0.5％から成る液体培地
（PH6.3）100mlを500ml容坂口フラスコに分注し、
滅菌し、この培地（10％AFFペプトン培地）に、
１容量％の前記種菌を接種し、30℃にて300回／
分の往復振とう機を用いて２日間振とう培養し
た。 培養液を集め、遠心分離によつて菌体を除去
し、上澄液を得た。この上澄液のリパーゼ活性を
測定したところ10.3U／mlであつた。この酵素液
1360mlについて硫安塩析を行い生じた沈澱区分を
遠心分離することにより集め、20ｍＭ Tris−
HCl緩衝液（PH7.0）中で一夜透析を行つた後、
同緩衝液で平衡化したDEAK−セルロースカラ
ムを用いてクロマトグラフイー（ワツトマン製；
φ36×210mm）に付し０→1MNaClグラジエント
溶出を行つたところ0.4〜0.5MNaClで本リパーゼ
が溶出された。適当に濃縮後、100ｍＭ Tris−
HCl緩衝液（PH8.0）／100ｍＭ NaClで平衡化
したUltrogel AcA34カラムクロマトグラフイー
（LKB製；φ25×440mm）に付し適宜再クロマトグ
ラフイーを行うことにより電気泳動的に単一な酵
素標品を得ることができた。上記精製過程での比
活性（mg蛋白質当りの活性）、回収率はそれぞれ
136.2U／mg、34％であつた。 実施例 ２ 実施例１に示したのと同様の培養上澄液につい
て限外過（日本ミリポア製、ペリコンラボカセ
ツト；分子量10000限外過膜PTGC OLC05）
により濃縮した後、20ｍＭ Tris−HCl緩衝液
（PH7.0）で平衡化したDEAE−セルロースカラム
を用いるクロマトグラフイーに付し、以下実施例
１に示した方法で精製を行い電気泳動的に単一な
酵素標品を得ることができた。 実施例 ３ AFFペプトン（大豆蛋白質加水分解物）５％、
NaCl0.5％から成る液体培地（PH6.3）７を14
容ジヤーフアーメンター（NEW BRUNSWICK
SCIENTIFIC社製）に入れて殺菌し、培地を調
製した。 実施例１の場合と同様にして培養した種菌〔ス
タフイロコツカス・キヤピテイスＴ−１−１
（FERM BP−834）〕200mlを上記の培地に接種
し、培養温度30℃、撹拌数300r.p.m.、通気量
2.0v.v.mにて24時間培養を行つた。培養液を遠心
分離して菌体を除き、限外過（日本ミリポア
製、ペリコンラボカセツト分子量10000限外過
膜、PTGC OLC 05）により４倍濃縮し、この
濃縮液を塩酸を用いてPH3.9に調整し、低温（４
℃が好ましい）に２時間放置した後、生じた沈澱
物を遠心分離または過により回収し溶解した後
凍結乾燥することにより精製酵素標品を得た。上
記精製過程での比活性（mg蛋白質当りの活性）、
回収率はそれぞれ87.0U／mg、28％であつた。 実施例 ４ 実施例１で得られた酵素標品を用いて、トリオ
レイン（99％純度、半井化学）を基質として酵素
反応を行い、その反応生成物をシリカゲル薄層ク
ロマトグラフイーで同定した。すなわち25ｍＭ
Tris−HCl緩衝液（PH8.0）／10ｍＭ CaCl22ml
にトリオレイン10μを加え、これに酵素を総活
性として3Uとなるように添加し30℃で反応を行
つた。 また、比較のため、市販のリゾプス・アルヒズ
ス（Rhizopus arrhizus）由来のリパーゼ、キヤ
ンデイダ・シリンドラセー（Candida
cylindracea）由来のリパーゼ、及びシユードモ
ナスsp.（Pseudomonas sp.）由来のリパーゼを用
いて同様の反応を行つた。 反応中10分、30分、60分、及び120分後にサン
プルを採取し、クロロホルムにより生成物を抽出
し、そして抽出液1μを薄層クロマトグラフイ
ーにより分析した。 この薄層クロマトグラフ系は次の通りとした。 溶媒系：クロロホルム／アセトン（96：４）。 発色：１％Ce（SO4）2／10％H2SO4加熱。 薄層板：シリカゲルKieselgel60F254（Merk社
製）。 この結果を第７図に示す。この図から明らかな
通り、リゾプス（糸状菌）由来のリパーゼ、キヤ
デイダ（酵母）由来のリパーゼ、及びシユードモ
ナス（細菌）由来のリパーゼを用いた場合には、
いずれの反応時間においてもジグリセリドである
１，３−ジオレイン及び１，２−（２，３）−ジオ
レイン、並びにモノグリセリドであるモノオレイ
ンが生成し、これらは反応時間の経過と共にむし
ろ増加する傾向を示したが、本発明のリパーゼを
用いた場合には、全反応時間にわたつてモノオレ
イン及びジオレインは検出されず、オレイン酸の
みが生成した。 実施例 ５ 実施例１で得られた酵素標品を用いてトリオレ
イン、ジオレイン及びモノオレインを基質として
酵素反応を行い、その反応生成物をシリカゲル薄
層クロマトグラフイーで同定した。すなわち25ｍ
Ｍ Tris−HCl緩衝（PH8.0）／10ｍＭ CaCl21
mlにトレオレイン（99％純度）7.5μ；同緩衝液
１mlにジデオレイン（99％純度）5μ；同緩衝
液１mlにもモノオレイン（99％純度）3μを加
え、各々酵素液を総活性として3Uとなるよう添
加し、30℃にて60分間同条件で反応させた後、ク
ロロホルムにより抽出し、この抽出液を、実施例
４の場合と同様にしてシリカゲル薄層クロマトグ
ラフイーに付した。この結果を第８図に示す。図
から明らかな通り、いずれの基質からもオレイン
酸のみが生じた。 実施例 ６ 10％AFFペプトン培地（実施例１参照のこと）
に１％のオリーブ油を加え、次の菌株を接種して
30℃にて、３日間振とう培養した。 (1) スタフイロコツカス（St.）・キヤピテイス
ATCC27840 (2) St.キヤピテイス ATCC27841 (3) St.キヤピテイス ATCC27842 (4) St.キヤピテイス ATCC27843 (5) St.キヤピテイスＴ−１−１（FERM BP−
834） 培養後、遠心分離により菌体を除去し、上澄液
を得、これを酵素液として使用した。この酵素液
のリパーゼ力価は次の通りであつた。
【表】
【表】
この酵素液を、Tris−HCl緩衝液（PH8.0、10
ｍＭ CaCl2）により、リパーゼ力価が総活性と
して3Uとなるように希釈し、これにトリオレイ
ン10μ／mlを加えて30℃にて振とうし、０分、
10分、30分、60分、及び120分後にサンプリング
し、これをクロロホルムで抽出し、クロロホルム
層2μを例３に記載した薄層クロマトグラフイ
ーにより分析した。この結果を第９図に示す。図
から明らかな通り、いずれの菌株の由来する酵素
液を使用した場合にも、反応液中にモノオレイン
及びジオレインは検出されなかつた。
ｍＭ CaCl2）により、リパーゼ力価が総活性と
して3Uとなるように希釈し、これにトリオレイ
ン10μ／mlを加えて30℃にて振とうし、０分、
10分、30分、60分、及び120分後にサンプリング
し、これをクロロホルムで抽出し、クロロホルム
層2μを例３に記載した薄層クロマトグラフイ
ーにより分析した。この結果を第９図に示す。図
から明らかな通り、いずれの菌株の由来する酵素
液を使用した場合にも、反応液中にモノオレイン
及びジオレインは検出されなかつた。
第１図はオリーブ油を基質とした場合の活性を
100として、この発明のリパーゼの各種基質に対
する相対活性を示し、第２図はトリオレインを基
質とした場合の活性を100とし、この発明のリパ
ーゼの各種基質に対する相対活性を示し、第３図
はこの発明のリパーゼの活性に対するPHの影響を
示し、第４図はこの発明のリパーゼのPHに対する
安定性を示し、第５図はこの発明のリパーゼの活
性に対する温度の影響を示し、第６図はこの発明
のリパーゼの温度に対する安定性を示し、第７図
はこの発明のリパーゼと従来技術のリパーゼとを
反応生成物に関して比較した薄層クロマトグラム
であり、第８図は各種のオレイン酸グリセリドに
対するこの発明のリパーゼの反応性を示す薄層ク
ロマトグラムであり、そして第９図はこの発明の
種々の酵素液（菌株を異にする）によりトリオレ
インを分解した場合の生成物を示す薄層クロマト
グラムである。第３図及び第４図中―●―は0.1M
酢酸緩衝液を使用して測定した活性を示し、―○
―は0.1M燐酸緩衝液を使用して測定した活性を
示し、そして―□―は0.1Mグリシン−NaOH緩
衝液を使用して測定した活性を示す。
100として、この発明のリパーゼの各種基質に対
する相対活性を示し、第２図はトリオレインを基
質とした場合の活性を100とし、この発明のリパ
ーゼの各種基質に対する相対活性を示し、第３図
はこの発明のリパーゼの活性に対するPHの影響を
示し、第４図はこの発明のリパーゼのPHに対する
安定性を示し、第５図はこの発明のリパーゼの活
性に対する温度の影響を示し、第６図はこの発明
のリパーゼの温度に対する安定性を示し、第７図
はこの発明のリパーゼと従来技術のリパーゼとを
反応生成物に関して比較した薄層クロマトグラム
であり、第８図は各種のオレイン酸グリセリドに
対するこの発明のリパーゼの反応性を示す薄層ク
ロマトグラムであり、そして第９図はこの発明の
種々の酵素液（菌株を異にする）によりトリオレ
インを分解した場合の生成物を示す薄層クロマト
グラムである。第３図及び第４図中―●―は0.1M
酢酸緩衝液を使用して測定した活性を示し、―○
―は0.1M燐酸緩衝液を使用して測定した活性を
示し、そして―□―は0.1Mグリシン−NaOH緩
衝液を使用して測定した活性を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ スタフイロコツカス・キヤピテイス
（Staphylococcus capitis）に属し、リパーゼ生
産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培地中
に該リパーゼを蓄積せしめ、該培地から該リパー
ゼを採取することを特徴とする新規リパーゼの製
造方法。 ２ 前記リパーゼが微アルカリ域に至適PHを有
し、トリグリセリドを脂肪酸およびグリセリンに
変換する酵素である特許請求の範囲第１項記載の
製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14958584A JPS6128387A (ja) | 1984-07-20 | 1984-07-20 | リパ−ゼの製造法 |
| EP19850903698 EP0187869A4 (en) | 1984-07-20 | 1985-07-19 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF LIPASE. |
| PCT/JP1985/000409 WO1986000925A1 (fr) | 1984-07-20 | 1985-07-19 | Procede de preparation de lipase |
| US06/844,389 US4791059A (en) | 1984-07-20 | 1985-07-19 | Process for preparing lipase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14958584A JPS6128387A (ja) | 1984-07-20 | 1984-07-20 | リパ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6128387A JPS6128387A (ja) | 1986-02-08 |
| JPH0480676B2 true JPH0480676B2 (ja) | 1992-12-21 |
Family
ID=15478413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14958584A Granted JPS6128387A (ja) | 1984-07-20 | 1984-07-20 | リパ−ゼの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4791059A (ja) |
| EP (1) | EP0187869A4 (ja) |
| JP (1) | JPS6128387A (ja) |
| WO (1) | WO1986000925A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5128264A (en) * | 1990-08-13 | 1992-07-07 | Suntory Limited | Process for preparing optically active 3-hydroxybutane derivatives using lipase |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5542532A (en) * | 1978-09-19 | 1980-03-25 | Maruho Kk | Novel monoglyceride-lipase |
| JPS56140887A (en) * | 1980-04-04 | 1981-11-04 | Maruho Kk | Novel lipase |
| JPS58225006A (ja) * | 1982-06-25 | 1983-12-27 | Suntory Ltd | 養毛化粧料 |
| JPS59134710A (ja) * | 1983-01-21 | 1984-08-02 | Suntory Ltd | 発酵養毛化粧料 |
| JPS6067409A (ja) * | 1983-09-22 | 1985-04-17 | Suntory Ltd | 頭髪用化粧料 |
-
1984
- 1984-07-20 JP JP14958584A patent/JPS6128387A/ja active Granted
-
1985
- 1985-07-19 US US06/844,389 patent/US4791059A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-07-19 WO PCT/JP1985/000409 patent/WO1986000925A1/ja not_active Ceased
- 1985-07-19 EP EP19850903698 patent/EP0187869A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0187869A4 (en) | 1988-07-14 |
| EP0187869A1 (en) | 1986-07-23 |
| WO1986000925A1 (fr) | 1986-02-13 |
| JPS6128387A (ja) | 1986-02-08 |
| US4791059A (en) | 1988-12-13 |
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