JPH08225599A - Ｃ１−エステラーゼ阻害剤濃厚物（ｃ１−ｉｎｈ）の調製法、および治療的使用のための得られた濃厚物 - Google Patents

Ｃ１−エステラーゼ阻害剤濃厚物（ｃ１−ｉｎｈ）の調製法、および治療的使用のための得られた濃厚物

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JPH08225599A
JPH08225599A JP7208482A JP20848295A JPH08225599A JP H08225599 A JPH08225599 A JP H08225599A JP 7208482 A JP7208482 A JP 7208482A JP 20848295 A JP20848295 A JP 20848295A JP H08225599 A JPH08225599 A JP H08225599A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝性の血管性水腫での交換治療および炎症
を示す他の疾患に使用することができるC1-INHの濃厚物
の取得法の提供。 【解決手段】 テンタキュラー型（tentacular type)の
イオン交換ゲルでの２つの分離工程を含んで成る、ヒト
血漿起源のC1-エステラーゼ阻害剤濃厚物の調製法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術】本発明は陰イオン交換体、次に陽
イオン交換体での２つのクロマトグラフィー分離工程、
ならびにウイルス混入の可能性を除去する２回の処理を
含んで成る、ヒト血漿画分起源のC1-エステラーゼ阻害
剤濃厚物の調製法に関する。得られた濃厚物は治療目的
に使用することを意図する。
【０００２】C1-エステラーゼ阻害剤（C1-INHという略
称で知られている）は血漿に存在するプロテアーゼ阻害
剤であり、これは補体第１成分（C1）の活性化を制御
し、そして副−成分C1rおよびC1sを不活性化する。これ
はカリクレイン、プラスミン−活性化ハゲマン因子（Ha
geman factor)および第XIａ因子のような、凝固および
フィブリン溶解性、ならびに接触系の他のセリンプロテ
アーゼも阻害する。
【０００３】ヒト血漿由来のC1-INHは、分子量が104 00
0ダルトンの１つのグリコシル化ポリペプチド鎖から成
る。
【０００４】C1-INHの欠如には致命的にもなりうる重い
病状が多少なりとも付随する。遺伝性の血管性水腫を患
っている患者はC1-INH（１型）が欠損しているか、ある
いはC1-INH活性の減少を示す(II型)。遺伝性の血管性水
腫の他の型（III型）はアルブミンのC1-INHへの異常結
合から生じる。阻害剤の異常に高い同化作用または自己
−抗体の存在による後天的C1-INH欠損症もある。
【０００５】この疾患は顔面水腫として、四肢、胃壁お
よび上部呼吸気道中の水腫に現れる。
【０００６】
【従来の技術】発作の重症度を減ずるために、抗フィブ
リン溶解剤またはホルモンを使用する様々な治療法が主
に予防に応用されたが、それらは急性の発症に効果的で
はなく、そのうえ、それらは長期間の治療には適合しな
い副作用を誘発する。急性の発症にアプロチニンのよう
なカリクレイン阻害剤を投与すると、それらはアレルギ
ー反応を引き起こしてしまう。
【０００７】新鮮な血漿を使用するC1-INH交換治療法は
すでに口腔外科手術を受けている高い危険率の患者に適
用された。この治療により疾患症状が軽減された。しか
し、血漿にさらに役に立たないタンパク質（特に病状を
悪化させる補体第Ｃ２およびＣ４構成物）をもたらす。
【０００８】精製されたC1-INHでの交換治療法は、長期
治療または同様に手術前の予防のために、急性発作治療
の選択となるように思われる。
【０００９】現在、幾つかの部分精製された濃厚物を入
手できるが、すべての記載されている調製法は、技術的
問題または使用する材料のコストから工業的規模に適用
するには難しい： −Harrison(Biochemistry 1983;22:5001-5007)は、分子
の特性を決定する目的で実験室規模に応用できる精製法
を報告しているが、この方法にかかる時間は工業規模に
転換するには長すぎる； −Reboulら(Fed.Eur.Biochem.Soc.Lett.1977;79:45-50)
およびPilatteら(J.Immunol.Methods 1989;120:37-43)
はレクチンのアフィニティークロマトグラフィーを含ん
で成る調製法を報告している; −Prograisら(J.Immunol.Methods 1987;99:113-122)は
亜鉛でのゲルキレート化アフィニティクロマトグラフィ
ーを含んで成る方法を報告している; −Alsenzら(J.Immunol.Methods 1987;96:107-114)はモ
ノクローナル抗体を使用する免疫吸着法による調製法を
報告している。
【００１０】これらのすべての方法で、C1-INH活性を保
護するために緩衝液に毒性の安定化剤が加えられてい
る。
【００１１】−最初の大規模調製法はVogelaarら(Vox S
ang.1974;26:118-127)により、DEAE-Sephadex(商標)の
バッチ式吸着、そして高塩濃度で溶出、次にアルブミン
およびセルロプラスミンを除去するための硫酸アンモニ
ウムによる沈殿を用いて記載された。 −この方法は、2つのバッチ様式のクロマトグラフィー
工程(DEAE-Sephadex:商標、次にCM-Sephadex:商標)、そ
してPEGによる沈殿により改良され(Wickerhauser.第18
回合同会議、ISH/16th会議、ISBT、Montreal 1980、抄
録：161およびGadekら、New Eng.J.Med.1980;302:542-5
46)、その最終生成物は“中程度の純度”であった。
【００１２】最終的に“高純度”生成物は塩の存在下で
最終的な沈殿工程を加えるか（Wickerhauser.Vox Sang.
1987;53:1-6)、またはCM-Sephadex(商標)をCM-Sepharos
e(商標)-FFに代えるか(Bennyら、J.Chromatogr.1988;43
3:363-366)により得られた。Fuhgeら(Transfus.Sci.199
0,11:23S-33S)も2つのクロマトグラフィー工程(QAE-お
よびPhenyl-Sepharose(商標)）および硫酸アンモニウム
による沈殿工程を報告している。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】これらの様々な方法に
は後で遠心をしなければならない沈殿工程を含み；これ
らの方法は選択性が悪く、大規模で行うには困難であ
り、そして収量が低い。
【００１４】
【課題を解決するための手段】これらの困難を回避する
ために、沈殿工程またはバッチ吸着を含まず、カラムク
ロマトグラフィーのみによる方法の開発に成功した。
【００１５】さらに様々な種類のクロマトグラフィーゲ
ルを試験して、従来にはない“テンタキュラー型(tenta
cular type)”イオン交換体ゲルを選択し、特にこれのC
1-INHに対する分離能の性能を証明した。
【００１６】このテンタキュラーイオン交換体ゲルはMu
ller（J.Chromatography、1990;510:133-140)ににより記
載されている。それらはメルク（Merck)(ダーモスタッ
ト、独国)によりFractogel-EMD(商標)というイオン交換
体基の略号(TMAE-、DEAE-、DMAE-、SO3−、COO-）によ
り表された商品名で販売されている。それらは不活性な
多孔性かつ半−固定Fractogel(商標）型マトリックスか
ら成り、このマトリックスはオリゴエチレングリコール
グリシジルメタクリレートおよびペンタエリスリトール
−ジメタクリレートコポリマーから成り、その上に直線
状のビニルポリマー鎖から成る移植されたテンタクル
（tentacule)が存在する（直線状であり、従来のように
架橋結合していない）。これらの直線鎖により保持され
ているこのイオン交換基は、従来の網目状の配置より、
より大きい移動度を持ち、かつよりマトリックスから独
立している。これらの特性により可動アームまたはテン
タクルを持つゲルの組織が正当化される。
【００１７】従って本発明の方法はテンタキュラー型の
イオン交換ゲルを使用するクロマトグラフィーカラムの
２つの分離工程を含んで成り、第一は弱陰イオン交換体
ゲル、第二は強陽イオン交換体ゲルである。
【００１８】弱陰イオン交換体はDMAE-型交換体であ
り、マトリックスに移植されたビニルポリマーは式CH2=
CHCONH(CH2)2N(CH3)2のモノマーにより構成されてい
る。
【００１９】強陽イオン交換体はSO3-基であり、マトリ
ックスに移植されたビニルポリマーは式CH2=CHCONH(C
H3)2N(CH2)SO3 -のモノマーにより構成されている。
【００２０】本発明の方法を行うために、出発物質とし
て寒冷沈殿物を含まないヒト血漿分画を使用し、そして
DEAE-Sephadex(商標)型のDEAE-基を移植したゲルへの吸
着により前-精製され(これはビタミンK-依存性タンパク
質を排除する)、次にアンチトロンビンIIIを固定化ヘパ
リンのアフィニティークロマトグラフィーを使用するこ
とにより排除する。
【００２１】従って本方法は治療目的の他の血液因子の
分画および調製を妨害しない。
【００２２】本発明は以下の工程を含んで成る： −前精製した血漿画分を第一クロマトグラフィーカラム
に添加し、 −弱陰イオン交換体ゲルのクロマトグラフィー分離、そ
してアルブミン、IgG、IgA、α.ATおよびα2-マクログ
ロブリンを含む濾液を廃棄し、 −補体C3構成物を溶出、そして廃棄し、 −C1-INHを含む画分を溶出、そして取り出し、 −溶出液を第二クロマトグラフィーカラムに添加し、 −強陽イオン交換体ゲルでクロマトグラフィー分離を行
い、そして濾液およびIgMを含む第一画分を廃棄し、 −C1-INHを溶出、そして取り出し、 −溶出液を濃縮し、そして凍結乾燥する。
【００２３】第一クロマトグラフィー分離は、60mMのNa
Clを補充した20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)中で
行う。緩衝液のNaCl濃度を120mMに上げることにより、
所望しないタンパク質(特に補体C3構成物)を溶出でき；
次にNaCl濃度を170mMに上げることによりC1-INHの溶出
を可能にする。
【００２４】第二クロマトグラフィー分離は、30mMのNa
Clを補充した20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)中で
行い、緩衝液のNaCl濃度を90mMに上げることによりC1-I
NHの溶出が得られる。IgMを含む初めの少量の分画を同
条件で溶出し、そして廃棄する;C1-INHを含む主要画分
は第一のものからきれいに別れた分画として出てくる。
また本発明の方法は好ましくは２つのウイルスの不活性
化処理を含んで成る。溶媒／表面活性剤を使用する第一
処理は、溶媒／表面活性剤が第二クロマトグラフィーの
濾液から排出されるように第一クロマトグラフィーの溶
出液に適用する。第二処理は可能性のある小さいサイズ
のウイスルの混入を排除することを目的とした35nm、次
に15nmフィルターによるの連続的なナノ濾過（nanofilt
ration）である。この処理を第二クロマトグラフィーの
濃縮された溶出液に行う。
【００２５】本発明はまた比活性が少なくとも6U/mgタ
ンパク質を示すC1-INH濃厚物に関し、これは純度が85％
よりも高いことに対応する。その純度、生化学的特性お
よび生物学的活性は、上記のようなC1-INH欠損を補うだ
けでなく、カリクレインおよび活性化ハゲマン因子によ
り触媒される炎症反応の種々の病状を治療するための治
療的使用にすべて許容できるものである。
【００２６】以下の実施例では範囲を制限することなく
本発明を説明する。
【００２７】
【実施例】実施例１ C1-INHの精製 寒冷沈殿物を含まないヒト血漿画分を２−工程の前精製
に供した。
【００２８】−DEAE-Sephadex(商標)A50(ファルマシア-
LKB:Pharmacia-LKB)への吸着によりビタミンK-依存性タ
ンパク質を除去し、 −そしてヘパリン-Sepharose(商標)(ファルマシア-LKB)
のアフィニティークロマトグラフィーによりアンチトロ
ンビン-IIIを除去した。
【００２９】ヘパリン−Sepharoseのカラムクロマトグ
ラフィーの濾液は平均0.24g/lの血漿の正常C1-INH濃度
の50-70％を含有した。
【００３０】精製工程は室温で前精製画分について各々
180リットルのバッチで行った。
【００３１】クロマトグラフィー平衡化緩衝液に対して
10K限外濾過システム(Filtron:商標)中での透析後、血
漿画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。血
漿画分をクロマトグラフィーカラムModuline(商標)P630
-250(アミコン:Amicon)（DMAE-Fractogel EMD(商標)650
M(メルク:Merck)を充填し、そして60mMのNaClを補充し
た20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7で平衡化した)に添
加した。
【００３２】ゲルを平衡化緩衝液で濾液の吸収がベース
ラインに落ちるまで洗浄した。このカラムクロマトグラ
フィーの濾液はベースヘインを含んでいた。このクロマ
トグラフィーの濾液はアルブミン、IgG、IgA、α-ATお
よびα2-マクログロブリンを含み、これらは分画回路で
再利用した。次に緩衝液に120mM濃度のNaClを補充し、
所望でないタンパク質、特に補体C3構成物を除去した。
【００３３】次にC1-INHは緩衝液のNaCl濃度を170mMに
上げることにより溶出した。
【００３４】IgM、セルロプラスミンおよび補体C4構成
物はカラムに強く吸着し残った。
【００３５】溶出液は1,3±0,2U C1-INH/mgタンパク質
の比活性を示し、これは純度約30％に対応する。溶出液
を10gタンパク質／ｌに濃縮し、そして続くカラムクロ
マトグラフィー（SO3-Fractogel）の平衡化緩衝液に対
し透析した（Fractogel:商標10K カセットで）。
【００３６】溶出液をTnBP 0,3％およびTween80 １％
（最終濃度）と混合し、そして25℃で7時間ゆるやかに
撹拌しながらインキューベーションすることにより溶媒
／表面活性剤でのウイルス不活化処理に供した。
【００３７】次に溶液をSO3-Fractogel EMD（商標）の
陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。
【００３８】溶媒／表面活性剤で処理した溶液を、SO3-
Fractogel EMD（商標）650(M)(メルク)を充填したBiopr
ocess(商標)252カラム(ファルマシア)（30mMのNaClを補
充した20mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7で平衡化した
もの)に添加した。
【００３９】ゲルを少なくとも12倍のカラム容量で洗浄
し、ウイルス不活化剤を除去した。C1-INHを次に緩衝液
中のNaCl濃度を90mMに上げて溶出した。
【００４０】本質的にIgMを含む第一画分を捨てた。C1-
INHを含有する主要画分を次に溶出し、明らかに第一と
は分離し、そして回収した。これは6,5±0,5U/mgタンパ
ク質の比活性を示し、84-92％純度に対応する。
【００４１】精製生成物の回収率は出発画分の40-50％
であり、そして全血漿の25-30％であった。
【００４２】溶出液を次に濃縮し、そして150mMのNaCl
を補充した10mM トリスナトリウムクエン酸緩衝液(pH7)
中で透析した(Filtron:商標、30Kカセットで)。
【００４３】両方の種類のカラムを１M NaCl、1M ヒド
ロキシドナトリウムおよび2M NaClで連続して洗浄する
ことにより再生した。
【００４４】濃縮された溶出液（約10g/lのC1-INH抗原
が1,2リットル)を、35nm次に15nm(アサヒBMM:Asahi BM
M)孔のフィルターで連続してナノ濾過することにより2
回目のウイルス除去に供した。小さいサイズのマーカー
ウイルス（ポリオウイルスおよびウシパルボウイルスの
ような）を除去するためのこの処理の効率は、すでに実
証されている。
【００４５】この濃厚物を次に容器に分配（5ml／容
器）し、そして凍結乾燥した。
【００４６】実施例２ 最終生成物の分析 C1-INH活性を色素生産性基質(Berichrom:商標)によりC1
-エステラーゼを阻害する能力として測定した。C1-INH
活性の1単位(UI)は正常血漿1ml中に存在する活性と定義
した。
【００４７】凍結乾燥最終生成物を、すぐに注入できる
水中の溶液で即座（＜１分）に再構成し；溶液は透明、
無色であり、そして室温で24時間安定であった。
【００４８】最終生成物の特徴を次の表に示す 全タンパク質、g/l 10,5±1,5 C1-INH-抗原、g/l 9±2 C1-INH-活性、U/ml 70±10 比活性、U/mgタンパク質 6,5±0,5 C3、g/l 0,59±0,29 C4、g/l ＜0,006 IgG、g/l 0,041±0,004 IgA、g/l 0,056±0,006 IgM、g/l 0,14±0,03 アルブミン、g/l 0−0,03 フィブリノーゲン、g/l 0,071±0,005 セルロプラスミン、g/l ＜0,015 Tween 80、ppm ＜10 TnBP、ppm 0,2 C1-INH活性とC1-INH-抗原量の比はU/mlで表すと1,7から
2であり、阻害剤がすべての精製工程を通して安定に存
在することを示している。
【００４９】主な混入物は補体C3構成物であり、全タン
パク質の4-10％を示す。
【００５０】動物実験では生成物が非パイロジェン性で
あり、マウスに対していかなる毒性も示さなかった（耐
容投与量はマウスの2000U/kg体重より高かった)。最高
投与量が300U/kg体重ラットの静注では、高血圧症また
は不整脈を誘発しなかった。本発明の特徴および主な態
様は次の通りである。
【００５１】１．第一工程を弱陰イオン交換体ゲルで、
第二工程を強陽イオン交換体ゲルで行う、テンタキュラ
ー型イオン交換体ゲルを充填したクロマトグラフィーカ
ラムの２つの分離工程を含んで成ることを特徴とする、
治療目的のＣ１−エステラーゼ阻害剤濃厚物、C1-INHの
調製法。
【００５２】２．ゲルが、イオン性基を持つ移植された
非架橋の直線状ビニルポリマー（テンタクル）を持つオ
リゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレートお
よびペンタエリスロール−ジメタクリレート型コポリマ
ーの不活性な多孔性マトリックスから成ることを特徴と
する上記１記載の方法。
【００５３】３．弱陰イオン交換体がDMAE-型であるこ
とを特徴とする上記1または２記載の方法。
【００５４】４．強陽イオン交換体がSO3-基であること
を特徴とする上記１ないし３のいずれか１つに記載の方
法。
【００５５】５．出発物質が寒冷沈殿物を含まないヒト
血漿であり、移植DEAE-基をもつゲルへの吸着により、
そして次にヘパリン固定化アフィニティークロマトグラ
フィーにより前−精製されていることを特徴とする、上
記１ないし４のいずれか1つに記載の方法。
【００５６】６．−前記５記載の前精製した血漿画分を
第一クロマトグラフィーカラムに添加し、 −前記３記載の弱陰イオン交換体ゲルのクロマトグラフ
ィーで分離し、そして濾液を廃棄し、 −補体C3成分を溶出、そして廃棄し、 −C1-INHを溶出、そして取り出し、 −溶出液を第二クロマトグラフィーカラムに添加し、 −前記４記載の強陽イオン交換体ゲルでクロマトグラフ
ィー分離を行い、そしてIgMを含む溶出液の第一画分を
廃棄し、 −C1-INHを溶出、そして取り出し、 −溶出液を濃縮し、そして凍結乾燥する、 工程を含んで成ることを特徴とする前記１ないし５のい
ずれか１つに記載の方法。
【００５７】７．第一クロマトグラフィー分離を60mMの
NaClを補充した20mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7で行
い、そして緩衝液中のNaCl濃度を120mMに上げることに
よりC3の溶出を、そして緩衝液中のNaCl濃度を170mMに
上げることによりC1-INHの溶出を得ることを特徴とする
前記６記載の方法。
【００５８】８．第二クロマトグラフィー分離を30mMの
NaClを補充した20mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7で行
い、そして緩衝液中のNaCl濃度を90mMに上げることによ
りC1-INHの溶出を得ることを特徴とする前記６記載の方
法。
【００５９】９．第一クロマトグラフィーの溶出液を溶
媒／表面活性剤でのウイルス不活化処理に供することを
特徴とする前記１ないし８のいずれか１つに記載の方
法。
【００６０】１０．第二クロマトグラフィーの濃縮溶出
液のナノ濾過により、存在しうる小さいサイズのウイル
ス混入物を除去する工程を含んで成ることを特徴とする
上記１ないし９のいずれか１つに記載の方法。
【００６１】１１．純度が85％より高いことに相当する
少なくとも6U/mgタンパク質に等しい比活性を示すこと
を特徴とする前記１ないし１０のいずれか１つに記載の
方法により得られた治療用C1-INH濃厚物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミシエル・プール フランス・エフ−59136バブラン・リユレ オンガンベタ１ (72)発明者 ミルヤナ・ビユルヌフ フランス・エフ−59136バブラン・リユデ ユドクトウールシヤフネ５

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第一工程を弱陰イオン交換体ゲルで、第
    二工程を強陽イオン交換体ゲルで行う、テンタキュラー
    型イオン交換体ゲルを充填したクロマトグラフィーカラ
    ムの２つの分離工程を含んで成ることを特徴とする、治
    療目的のＣ１−エステラーゼ阻害剤濃厚物、C1-INHの調
    製法。
  2. 【請求項２】 −前精製した血漿画分を第一クロマトグ
    ラフィーカラムに添加し、−弱陰イオン交換体ゲルのク
    ロマトグラフィーで分離し、そして濾液を廃棄し、−補
    体C3成分を溶出、そして廃棄し、 −C1-INHを溶出、そして取り出し、 −溶出液を第二クロマトグラフィーカラムに添加し、 −強陽イオン交換体ゲルでクロマトグラフィー分離を行
    い、そしてIgMを含む溶出液の第一画分を廃棄し、 −C1-INHを溶出、そして取り出し、 −溶出液を濃縮し、そして凍結乾燥する、 工程を含んで成ることを特徴とする請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 純度が85％より高いことに相当する少な
    くとも6U/mgタンパク質に等しい比活性を示すことを特
    徴とする請求項１または２に記載の方法により得られた
    治療用C1-INH濃厚物。
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