JPH0482839A - 蛋白質類・脂質小体複合体 - Google Patents
蛋白質類・脂質小体複合体Info
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- JPH0482839A JPH0482839A JP2193590A JP19359090A JPH0482839A JP H0482839 A JPH0482839 A JP H0482839A JP 2193590 A JP2193590 A JP 2193590A JP 19359090 A JP19359090 A JP 19359090A JP H0482839 A JPH0482839 A JP H0482839A
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は蛋白質類の血中半減期を延ばし、その効力を十
分に発揮することを目的とする蛋白質類・脂質小体複合
体に関する。
分に発揮することを目的とする蛋白質類・脂質小体複合
体に関する。
蛋白質類は、血中半減期が短いため、効力が十分に発揮
されないという問題点があった。一方、蛋白質ｆｊ：含
有させてなる蛋白ｗＮ−脂質小体複合体にした場合、血
中半減期は延びるが、蛋白質類が脂質小体から遊離しな
いため効力が十分に発揮されないという問題点があった
。
されないという問題点があった。一方、蛋白質ｆｊ：含
有させてなる蛋白ｗＮ−脂質小体複合体にした場合、血
中半減期は延びるが、蛋白質類が脂質小体から遊離しな
いため効力が十分に発揮されないという問題点があった
。
本発明の目的は、蛋白質の血中半減期を延ばし、且つそ
の効力を発揮することの出来る蛋白質類・脂質小体複合
体を提供することにある。
の効力を発揮することの出来る蛋白質類・脂質小体複合
体を提供することにある。
本発明者らは、上記の事情に鑑みて種々検討を重ねた結
果、脂質と、正電荷及び／又は負電荷脂質からなる脂質
膜表面に蛋白質類を結合させることによって、蛋白質類
の血中半減期を延ばし、その効力を十分に発揮できるこ
とを見出し、本発明の完成に至った。
果、脂質と、正電荷及び／又は負電荷脂質からなる脂質
膜表面に蛋白質類を結合させることによって、蛋白質類
の血中半減期を延ばし、その効力を十分に発揮できるこ
とを見出し、本発明の完成に至った。
即ち、本発明の蛋白質類・脂質複合体は、脂質と、正電
荷脂質及び／又は負電荷脂質からなる脂質膜表面に、蛋
白質類を結合させてなることを特徴とする蛋白質類・脂
質小体複合体である。
荷脂質及び／又は負電荷脂質からなる脂質膜表面に、蛋
白質類を結合させてなることを特徴とする蛋白質類・脂
質小体複合体である。
以下、該蛋白質類・脂質小体複合体の構成を詳述する。
（ｉ）脂質小体
本発明において、脂質小体は、リポソーム、脂肪乳剤、
Ｗ１０／−型エマルジョンであることが好ましい。本発
明において、脂質小体（リポソーム）は、多重同心二重
層、単一層あるいは多重層の構造を成し、脂質膜表面が
各種蛋白質類を結合する能力を有しており、例えば、脂
質と、正電荷脂質及び／又は負電荷脂質とから形成され
た脂質膜を、蛋白質類を含有する溶液に接触させ、蛋白
質類をこの脂質小体の膜脂質中及び膜表面に結合させる
ことによって調製される。
Ｗ１０／−型エマルジョンであることが好ましい。本発
明において、脂質小体（リポソーム）は、多重同心二重
層、単一層あるいは多重層の構造を成し、脂質膜表面が
各種蛋白質類を結合する能力を有しており、例えば、脂
質と、正電荷脂質及び／又は負電荷脂質とから形成され
た脂質膜を、蛋白質類を含有する溶液に接触させ、蛋白
質類をこの脂質小体の膜脂質中及び膜表面に結合させる
ことによって調製される。
当該脂質小体を形成するための脂質としては、小胞体（
リポソーム）を作り得るものであれば、特に限定されず
、リン脂質、糖脂質、誘導脂質、脂肪酸等が挙げられる
。
リポソーム）を作り得るものであれば、特に限定されず
、リン脂質、糖脂質、誘導脂質、脂肪酸等が挙げられる
。
当該リン脂質としては、生理的に許容され、代謝される
リン脂質であれば、いずれも本発明に用いられる。例え
ば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホ
スファチジン酸、ホスファチジルグリセリン、ホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール
、スフィンゴミエリン、ジセチルホスフェート、リゾホ
スファチジルコリン（リゾレシチン）、あるいはこれら
の混合物である大豆リン脂質、卵黄リン脂質等が用いら
れる。このうち、最も好ましいリン脂質としては、大豆
あるいは卵黄のリン脂質が例示される。
リン脂質であれば、いずれも本発明に用いられる。例え
ば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホ
スファチジン酸、ホスファチジルグリセリン、ホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール
、スフィンゴミエリン、ジセチルホスフェート、リゾホ
スファチジルコリン（リゾレシチン）、あるいはこれら
の混合物である大豆リン脂質、卵黄リン脂質等が用いら
れる。このうち、最も好ましいリン脂質としては、大豆
あるいは卵黄のリン脂質が例示される。
糖脂質としてはセレブロシド、含硫脂質（Ｓｕｌｆａｔ
ｉｄｅ） 、ガングリオシド類が例示される。
ｉｄｅ） 、ガングリオシド類が例示される。
誘導脂質としては、コール酸、デオキシコール酸、デヒ
ドロコール酸等が例示される。
ドロコール酸等が例示される。
正電荷脂質としては、正電荷を有する脂質であれば特に
限定されない。例えば、炭素数１２〜２２の飽和または
不飽和脂肪族アミン、塩基性アミノ酸に脂肪酸やコレス
テロール等を結合したもの、脂肪酸含有４級アミン類等
が挙げられ、具体的にはオレイルアミン、ステアリルア
ミン等が例示される。
限定されない。例えば、炭素数１２〜２２の飽和または
不飽和脂肪族アミン、塩基性アミノ酸に脂肪酸やコレス
テロール等を結合したもの、脂肪酸含有４級アミン類等
が挙げられ、具体的にはオレイルアミン、ステアリルア
ミン等が例示される。
負電荷脂質としては、負電荷を有する脂質であれば特に
限定されない。例えば、オレイン酸、ホスファチジン酸
、ホスファチジルセリン等の酸性リン脂質（エーテル型
でも可）、ジセチルリン酸等の合成リン脂質、炭素数１
４〜２２の飽和又は不飽和高級脂肪酸等が挙げられる。
限定されない。例えば、オレイン酸、ホスファチジン酸
、ホスファチジルセリン等の酸性リン脂質（エーテル型
でも可）、ジセチルリン酸等の合成リン脂質、炭素数１
４〜２２の飽和又は不飽和高級脂肪酸等が挙げられる。
正電荷及び／又は負電荷脂質の添加量はリン脂質１００
、Ｉ／１１０＋に対して１〜１０００μｍＯ１程度あ
る。
、Ｉ／１１０＋に対して１〜１０００μｍＯ１程度あ
る。
正電荷脂質及び／または負電荷脂質はリン脂質と混合し
て用い、その比率（モル比）はリン脂質：正電荷脂質及
び／又は負電荷脂質−１００：１〜１：１０、好ましく
は２：１程度である。
て用い、その比率（モル比）はリン脂質：正電荷脂質及
び／又は負電荷脂質−１００：１〜１：１０、好ましく
は２：１程度である。
正電荷脂質及び／又は負電荷脂質は、正電荷脂質もしく
は負電荷脂質単独でもよいが、正電荷脂質及び負電荷脂
質の併用がより好ましい。
は負電荷脂質単独でもよいが、正電荷脂質及び負電荷脂
質の併用がより好ましい。
（１１）蛋白質類
本発明で使用される蛋白質類は、蛋白質はもちろんのこ
と、ポリペプチド、ペプチドを含む概念である。当該蛋
白質には、特に制限はないが、血中半減期が短く、その
ためその活性を十分に発揮できない蛋白質類である場合
、特に本発明の効果が顕著に表れる。また蛋白質類は下
記のものに限定されず、その誘導体をも包含する概念で
ある。
と、ポリペプチド、ペプチドを含む概念である。当該蛋
白質には、特に制限はないが、血中半減期が短く、その
ためその活性を十分に発揮できない蛋白質類である場合
、特に本発明の効果が顕著に表れる。また蛋白質類は下
記のものに限定されず、その誘導体をも包含する概念で
ある。
蛋白質類としては、具体的には、ウロキナーゼ（ＵＫ）
、ウロキナーゼ前駆体（ＰＰＡ）、グロブリン（Ｉｇ
Ｌ インターロイキン（ＴＬ）類、コロニー刺激因子（
ｃｓＦ） 、エリスロボエチン（ＥＰＯ）、インターフ
ェロン（ＩＦＮ）、リンホカイン類等が挙げられる。
、ウロキナーゼ前駆体（ＰＰＡ）、グロブリン（Ｉｇ
Ｌ インターロイキン（ＴＬ）類、コロニー刺激因子（
ｃｓＦ） 、エリスロボエチン（ＥＰＯ）、インターフ
ェロン（ＩＦＮ）、リンホカイン類等が挙げられる。
このような蛋白質類の由来には特に制限はなく、例えば
細胞培養法、遺伝子工学法などにより調製されたものが
例示される。また蛋白質類は上記のものに限定されず、
その誘導体をも包含する概念である。
細胞培養法、遺伝子工学法などにより調製されたものが
例示される。また蛋白質類は上記のものに限定されず、
その誘導体をも包含する概念である。
蛋白質の添加量としては（ｉ）記載の脂質膜の形成に用
いた脂質１００重量部に対し、０．０１〜１０重量部程
度が例示される。
いた脂質１００重量部に対し、０．０１〜１０重量部程
度が例示される。
（ｉｉｉ ）脂質小体の構造
脂質小体（リポソーム）の構造としてはマルチラメラベ
シクル（ＭＬＶ）、スモールユニラメラベシクル（ＳＵ
Ｖ）、ラージュニラメラヘシクル（ＬＵＶ） 、リハー
スフェーズエハポレーションヘシクル（ＲＥＶ）などが
挙げられる。
シクル（ＭＬＶ）、スモールユニラメラベシクル（ＳＵ
Ｖ）、ラージュニラメラヘシクル（ＬＵＶ） 、リハー
スフェーズエハポレーションヘシクル（ＲＥＶ）などが
挙げられる。
（１■）脂質小体の製法
脂質小体の製法の概略を以下に述べるが、これは−例で
あり、本発明を限定するものではない。
あり、本発明を限定するものではない。
適当な脂質及び正電荷脂質及び／又は負電荷脂質を含有
する溶液（脂質を変成しない溶媒、例えばクロロホルム
、エタノール等の溶液）から溶媒を留去して脂質の薄膜
を作り、この薄膜に溶液を加えて激しく振盪し、好まし
くは超音波処理を行い、脂質を均一分散させて脂質懸濁
液を調製する。
する溶液（脂質を変成しない溶媒、例えばクロロホルム
、エタノール等の溶液）から溶媒を留去して脂質の薄膜
を作り、この薄膜に溶液を加えて激しく振盪し、好まし
くは超音波処理を行い、脂質を均一分散させて脂質懸濁
液を調製する。
溶液に使用される溶媒としては、脂質小体を変成、分解
せず、かつ生理的に許容されるものであればよく、例え
ばｐＨ４〜１１、好ましくは６〜９に調整した緩衝液（
例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、
生理食塩溶液）、エタノール等が挙げられる。
せず、かつ生理的に許容されるものであればよく、例え
ばｐＨ４〜１１、好ましくは６〜９に調整した緩衝液（
例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、
生理食塩溶液）、エタノール等が挙げられる。
脂質小胞に結合すべき蛋白質類は脂質懸濁液が調製され
た後で添加すればよい。
た後で添加すればよい。
なお、脂質膜の調製に際し、コレステロールを安定化剤
として添加してもよい。また、好ましくは、リン脂質の
安定化のために抗酸化剤、たとえばトコフェロール（ビ
タミンＥ）を、好適にはリン脂質に対する重量％が約０
．０１〜０．５％（Ｗ／Ｗ） ）程度になるように添加
する。
として添加してもよい。また、好ましくは、リン脂質の
安定化のために抗酸化剤、たとえばトコフェロール（ビ
タミンＥ）を、好適にはリン脂質に対する重量％が約０
．０１〜０．５％（Ｗ／Ｗ） ）程度になるように添加
する。
更に、蛋白質類添加前に、例えば、４０〜９０°Ｃ１数
分〜１時間加熱処理を行ってもよい。蛋白質類としてウ
ロキナーゼ前駆体を用いた場合、該ウロキナーゼ前駆体
含有溶液添加量は、脂質膜の形成に用いたリン脂質１に
対し、０．０００１〜１重量部である。
分〜１時間加熱処理を行ってもよい。蛋白質類としてウ
ロキナーゼ前駆体を用いた場合、該ウロキナーゼ前駆体
含有溶液添加量は、脂質膜の形成に用いたリン脂質１に
対し、０．０００１〜１重量部である。
また、本発明製剤はグルコース、マンニトール等の単Ｆ
類、マルトース、シュクロース等の二糖頻、デキストラ
ン等の多１１！類、ビニル重合体、非イオン性界面活性
剤、ゼラチン、ヒドロキシエチル澱粉から選ばれた高分
子物質を安定化剤として配合してもよい。
類、マルトース、シュクロース等の二糖頻、デキストラ
ン等の多１１！類、ビニル重合体、非イオン性界面活性
剤、ゼラチン、ヒドロキシエチル澱粉から選ばれた高分
子物質を安定化剤として配合してもよい。
当該高分子安定化剤は、脂質小体内の空隙に取り込まれ
ていてもよいし、また蛋白質類を結合させた脂質小体製
剤に添加配合（即ち、脂質小体外に添加・配合）しても
よい。もちろん脂質小体の内外ともに配合してもよいこ
とはいうまでもない。
ていてもよいし、また蛋白質類を結合させた脂質小体製
剤に添加配合（即ち、脂質小体外に添加・配合）しても
よい。もちろん脂質小体の内外ともに配合してもよいこ
とはいうまでもない。
当該安定化剤の添加量は脂質１重量部に対し０．５〜１
０重量部、好ましくは１〜５重量部である。
０重量部、好ましくは１〜５重量部である。
本発明において、リポソームは、超音波処理法〔野鳥庄
七他、リポソーム、２７ （１９８８）］、フレンチプ
レス法〔同上、３０ （１９８８月、界面活性剤法〔
同上、３２ （１９８８） ） 、エクストルージョ
ン法［（Ｈｏｐｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ。
七他、リポソーム、２７ （１９８８）］、フレンチプ
レス法〔同上、３０ （１９８８月、界面活性剤法〔
同上、３２ （１９８８） ） 、エクストルージョ
ン法［（Ｈｏｐｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ。
４０−１０２ （１９８６）］ 、２イクロフルダイズ
法［Ｔａｌｓｍａｅｔ ａｌ、、 Ｄｒｕｇ ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈ
ａｒｍａｃｙ、 １５ （２） １９７−２０７
（１９８９Ｎ、逆相蒸発法（Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ、
、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７５．
４１９４（１９７８）］ や］カルシウムーＥＤＴＡキ
レート法Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ
、、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
法［Ｔａｌｓｍａｅｔ ａｌ、、 Ｄｒｕｇ ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈ
ａｒｍａｃｙ、 １５ （２） １９７−２０７
（１９８９Ｎ、逆相蒸発法（Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ、
、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７５．
４１９４（１９７８）］ や］カルシウムーＥＤＴＡキ
レート法Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ
、、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ａｃｔａ、、 ３９４．４８３． （１９７５）］等
目的に応じ、種々の方法で調製すればよい。
目的に応じ、種々の方法で調製すればよい。
平均直径が約０．０２〜０，１ μｍの範囲の蛋白質類
・脂質小体複合体を提供でき、要すればさらに分子ふる
い処理または遠心分離によって夾雑物または遊離物の除
去を行うことができる。
・脂質小体複合体を提供でき、要すればさらに分子ふる
い処理または遠心分離によって夾雑物または遊離物の除
去を行うことができる。
かくして得られた蛋白質類 脂質小体複合体は蛋白質添
加量の８０％以上が脂質小体に結合しており、しかもそ
の粒子径は均一であり、極めて微小であることから医療
用製剤として好ましい。
加量の８０％以上が脂質小体に結合しており、しかもそ
の粒子径は均一であり、極めて微小であることから医療
用製剤として好ましい。
尚、蛋白質類の脂質小体への結合率は、調製された脂質
小体をエタノールで溶解し、液体クロマトグラフィー（
ゲル濾過クロマトグラフィー）分析を行って得られた値
を示す。
小体をエタノールで溶解し、液体クロマトグラフィー（
ゲル濾過クロマトグラフィー）分析を行って得られた値
を示す。
蛋白質類を結合した脂質小体は沈澱物として回収するこ
とができる。例えば、脂質小体を含有する媒体を超遠心
処理、もしくはショ糖密度勾配遠心分離をし、脂質小体
を回収することができる。
とができる。例えば、脂質小体を含有する媒体を超遠心
処理、もしくはショ糖密度勾配遠心分離をし、脂質小体
を回収することができる。
このものは次いで要すれば生理的に許容される水溶液で
洗浄し、ペレット状、懸濁状製剤として調製する。製剤
化は医薬品の製法において広く公知の方法に準する。ま
た、本複合体は、液状製剤を凍結させた後、減圧下で乾
燥させ、凍結乾燥製剤として提供される。
洗浄し、ペレット状、懸濁状製剤として調製する。製剤
化は医薬品の製法において広く公知の方法に準する。ま
た、本複合体は、液状製剤を凍結させた後、減圧下で乾
燥させ、凍結乾燥製剤として提供される。
本発明の複合体は、−船釣に注射剤又は経口剤として使
用される。使用時は、生理的に許容される水溶液によっ
て用時熔解または希釈して用いられるのが一般的である
が、製剤上の工夫によって錠剤化、カプセル化、腸液性
カプセル化してもよい。
用される。使用時は、生理的に許容される水溶液によっ
て用時熔解または希釈して用いられるのが一般的である
が、製剤上の工夫によって錠剤化、カプセル化、腸液性
カプセル化してもよい。
本発明の複合体は、蛋白質そのものに比べて、生体内、
特に血中での蛋白質類の消失を抑え、血中濃度を上昇さ
せることができ、更に、血中半減期のコントロールが可
能となる。
特に血中での蛋白質類の消失を抑え、血中濃度を上昇さ
せることができ、更に、血中半減期のコントロールが可
能となる。
従って、蛋白質の本来の性質と併せてその効力を増強さ
せることができる。
せることができる。
〔実施例］
本発明をより詳細に説明するために実施例および実験例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
実施例１
卵黄レシチン１．５ｇ、オレイン酸２８２．５ ｍｇお
よびＤＣ−α−トコフェロール１．５ ｍｇに０．１１
リス緩衝液を１．０ｍｆｌを加え、氷水で冷却しながら
超音波処理を行うことによって、平均粒子径が５０ｎｍ
以下のリポソームを調製した。リポソーム液のｐＨは０
．ＩＭ トリス緩衝液またはＩＮ塩酸を添加することに
よって、ｐ＋（８，０に調整した。また、リポソーム液
のレシチン感度は０．１Ｍ）リス緩衝液、 ｐＩＩ８．
０を添加することによって、１００ｍｇ／ｍｌに調整し
た。
よびＤＣ−α−トコフェロール１．５ ｍｇに０．１１
リス緩衝液を１．０ｍｆｌを加え、氷水で冷却しながら
超音波処理を行うことによって、平均粒子径が５０ｎｍ
以下のリポソームを調製した。リポソーム液のｐＨは０
．ＩＭ トリス緩衝液またはＩＮ塩酸を添加することに
よって、ｐ＋（８，０に調整した。また、リポソーム液
のレシチン感度は０．１Ｍ）リス緩衝液、 ｐＩＩ８．
０を添加することによって、１００ｍｇ／ｍｌに調整し
た。
こうして調製したリポソーム′ａ、１．５ａｆｆにウロ
キナーゼ前駆体１０００単位（０，５ｍｆ）を混合した
（リポソーム１とする）。
キナーゼ前駆体１０００単位（０，５ｍｆ）を混合した
（リポソーム１とする）。
実施例２
卵黄レシチン１．５ｇ、オレイルアミン２６７．５ ｍ
ｇおよびＤＩ、−α−トコフェロール１５ｍｇに０．１
Ｍ）リス緩衝液を７．０戒を加え、氷水で冷却しながら
超音波処理を行うことによって、平均粒子径が５０ｎｍ
以下のリポソームを調製した。リポソーム液のｐＩＩは
０．１門 トリス緩衝液またはＩＮ塩酸を添加すること
によって、ｐＩＩ８．０に調整した。また、リポソーム
液のレシチン濃度は０．１Ｍ）リス塩酸緩衝液、 ｐＩ
Ｉ８．０を添加することによって、１００■／ｄに調整
した。
ｇおよびＤＩ、−α−トコフェロール１５ｍｇに０．１
Ｍ）リス緩衝液を７．０戒を加え、氷水で冷却しながら
超音波処理を行うことによって、平均粒子径が５０ｎｍ
以下のリポソームを調製した。リポソーム液のｐＩＩは
０．１門 トリス緩衝液またはＩＮ塩酸を添加すること
によって、ｐＩＩ８．０に調整した。また、リポソーム
液のレシチン濃度は０．１Ｍ）リス塩酸緩衝液、 ｐＩ
Ｉ８．０を添加することによって、１００■／ｄに調整
した。
こうして調製したリポソーム液１．５ｍｌにウロキナー
ゼ前駆体１０００単位（０、５ｍｆｌ ）を混合した（
リポソーム２とする）。
ゼ前駆体１０００単位（０、５ｍｆｌ ）を混合した（
リポソーム２とする）。
実施例３
卵黄レシチン１．５ｇ、オレイン酸２８２．５■、オレ
イルアミン２６７．５ ｍｇおよびＤＬ−α−トコフェ
ロル１５ｍｇにＯ，Ｉ−トリス緩衝液を７．０ｍｌを加
え、氷水で冷却しながら超音波処理を行うことによって
、平均粒子径が５０ｎｍ以下のリポソームを調製した。
イルアミン２６７．５ ｍｇおよびＤＬ−α−トコフェ
ロル１５ｍｇにＯ，Ｉ−トリス緩衝液を７．０ｍｌを加
え、氷水で冷却しながら超音波処理を行うことによって
、平均粒子径が５０ｎｍ以下のリポソームを調製した。
リポソーム液のｐＩＩは０．］、Ｍ）リス塩酸緩衝液ま
たはＩＮ塩酸を添加することによって、ｐＩＩ８．０に
調整した。また、リポソーム液のレシチン濃度は０．１
Ｍトリス緩衝液、 ｐＩＩ８．Ｏを添加することによっ
て、１００ｍｇ／成に調整した。
たはＩＮ塩酸を添加することによって、ｐＩＩ８．０に
調整した。また、リポソーム液のレシチン濃度は０．１
Ｍトリス緩衝液、 ｐＩＩ８．Ｏを添加することによっ
て、１００ｍｇ／成に調整した。
こうして調製したリポソーム液１．５ｍｌにウロキナー
ゼ前駆体１０００単位（０，５ｍｆｆ１）を混合した（
リポソーム３とする）。
ゼ前駆体１０００単位（０，５ｍｆｆ１）を混合した（
リポソーム３とする）。
比較例１
卵黄レシチン１５０ｍｇ、オレイン酸１５．８ｍｇおよ
びＯＬ−α−トコフェロール１．５ｍｇにウロキナーゼ
前駆体１ 、０００単位を含む０．１Ｍ）’Ｊス塩酸緩
衝液（ｐＨ８、帆約１．０ｍ、ｅ）を加え、氷水で冷却
しながら超音波処理を行うことによって、平均粒子径が
５０ｎｍ以下のリポソームを調製した。リポソーム液の
ｐＨは０．１Ｍ’ｌ−リス緩衝液またはＩＮ塩酸を添加
することによって、ρ１１８．０に調整した。また、リ
ポソーム液のレシチン濃度は０．１Ｍ ）リス塩酸緩衝
液、 ｐＩＩ８゜０を添加することによって、７５ｍｇ
／ｄに調整した（リポソーム４とする）。
びＯＬ−α−トコフェロール１．５ｍｇにウロキナーゼ
前駆体１ 、０００単位を含む０．１Ｍ）’Ｊス塩酸緩
衝液（ｐＨ８、帆約１．０ｍ、ｅ）を加え、氷水で冷却
しながら超音波処理を行うことによって、平均粒子径が
５０ｎｍ以下のリポソームを調製した。リポソーム液の
ｐＨは０．１Ｍ’ｌ−リス緩衝液またはＩＮ塩酸を添加
することによって、ρ１１８．０に調整した。また、リ
ポソーム液のレシチン濃度は０．１Ｍ ）リス塩酸緩衝
液、 ｐＩＩ８゜０を添加することによって、７５ｍｇ
／ｄに調整した（リポソーム４とする）。
実験例Ｉ
リポソーム１〜４のＰＰＡ活性を測定した。ＰＰＡ活性
は、リポソーム液試料をゼラチンを含有する緩衝液（ｐ
Ｈ８，４）に適度に希釈した後、一定量を量り取り、プ
ラスミンを加えて加温することによりによってＰＰＡを
ウロキナーゼに活性化した後、ペプチド蛍光基質（Ｇｌ
ｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｖ−３０９７，ペプチド
研究所）を用いて測定した。尚、プラスミンを添加する
前に界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した試
料についても同様に測定した。
は、リポソーム液試料をゼラチンを含有する緩衝液（ｐ
Ｈ８，４）に適度に希釈した後、一定量を量り取り、プ
ラスミンを加えて加温することによりによってＰＰＡを
ウロキナーゼに活性化した後、ペプチド蛍光基質（Ｇｌ
ｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｖ−３０９７，ペプチド
研究所）を用いて測定した。尚、プラスミンを添加する
前に界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した試
料についても同様に測定した。
リポソームを界面活性剤処理していない系およに界面活
性剤処理した系のＰＰＡ活性を表１にまとめて示した。
性剤処理した系のＰＰＡ活性を表１にまとめて示した。
尚、数値はリポソームに添加したＰＰＡ活性に対する値
として百分率表示で示した。
として百分率表示で示した。
〔以下余白］
リポソーム
ＰＰＡ
ＰＰＡ活性（％）
Ｎｏ １ ］、００．５
１００．７Ｎｏ ２ １００．３
］、ＯＯ，ＩＮｏ、 ３
９８．４ １０２．１Ｎｏ、
４ ３２．９ ４６．４実
験例２ 遠心管中で各リポソーム液０．１．ｍ！ｌと２．５Ｍシ
ョ糖を含む０．１Ｍ＋−リス塩酸緩衝液、ｐｌ＋８．０
を０．２戒混合し、その上に０．５Ｍショ糖を含む０．
１Ｍ）リス塩酸緩衝液、ｐＨ８，０を４．３ｍｆｉ重層
した。これを超遠心機を用いζ５０．００ＯｒｐｍでＩ
Ｇ時間遠心分離し、下層から５画分に分画し、画各分の
ＰＰＡ活性及びレシチン濃度を測定した。
１００．７Ｎｏ ２ １００．３
］、ＯＯ，ＩＮｏ、 ３
９８．４ １０２．１Ｎｏ、
４ ３２．９ ４６．４実
験例２ 遠心管中で各リポソーム液０．１．ｍ！ｌと２．５Ｍシ
ョ糖を含む０．１Ｍ＋−リス塩酸緩衝液、ｐｌ＋８．０
を０．２戒混合し、その上に０．５Ｍショ糖を含む０．
１Ｍ）リス塩酸緩衝液、ｐＨ８，０を４．３ｍｆｉ重層
した。これを超遠心機を用いζ５０．００ＯｒｐｍでＩ
Ｇ時間遠心分離し、下層から５画分に分画し、画各分の
ＰＰＡ活性及びレシチン濃度を測定した。
実験例３
ヒ１〜血漿に１２５１標識ヒトフイブリノゲンを添加し
たもの一定量を試験管にとり、Ｃａ１ｌ。及びと１トロ
ンビンを添加して凝固させた。こうして調製したクロッ
トを生理食塩水で十分洗浄した後、ヒト血漿に浮遊させ
、これに被検薬剤としてリボーム１〜４並びにリポソー
ム１〜４をショ糖密度勾配遠心法で分離したときの、そ
れぞれ第５画分（脂質量で一定量）を添加してインキュ
ベーションした。５時間後の血漿を採取し、その放射活
性からクロット溶解率を算出した。結果を表２に示した
。
たもの一定量を試験管にとり、Ｃａ１ｌ。及びと１トロ
ンビンを添加して凝固させた。こうして調製したクロッ
トを生理食塩水で十分洗浄した後、ヒト血漿に浮遊させ
、これに被検薬剤としてリボーム１〜４並びにリポソー
ム１〜４をショ糖密度勾配遠心法で分離したときの、そ
れぞれ第５画分（脂質量で一定量）を添加してインキュ
ベーションした。５時間後の血漿を採取し、その放射活
性からクロット溶解率を算出した。結果を表２に示した
。
Ｎｏ、 １ ８８．３Ｎｏ
、２ ８４．６Ｎｏ、 ３
８７．５Ｎｏ、 ４
４４．９Ｎｏ、１の第５画分
６７．４Ｎｏ、２の第５画分 １８．４
Ｎｏ、３の第５画分 ４４．６Ｎｏ、４の ５
１０．６ 実験例４ 体重２００〜２５０ｇのウィスター系雄性ラットの尾静
脈からリポソーム１〜４を投与し、頚動脈から経時的に
採血し、血漿中のＰＰＡ活性を測定した。
、２ ８４．６Ｎｏ、 ３
８７．５Ｎｏ、 ４
４４．９Ｎｏ、１の第５画分
６７．４Ｎｏ、２の第５画分 １８．４
Ｎｏ、３の第５画分 ４４．６Ｎｏ、４の ５
１０．６ 実験例４ 体重２００〜２５０ｇのウィスター系雄性ラットの尾静
脈からリポソーム１〜４を投与し、頚動脈から経時的に
採血し、血漿中のＰＰＡ活性を測定した。
実験例５
ラットの血漿に１２５１標識フイブリノゲンを加え、こ
れにＣａＣ１□及びヒトトロンビンを添加して凝固させ
た。こうして調製したクロットを生理食塩水で十分に洗
浄した後、液体窒素で冷却した乳鉢中で粉砕した。
れにＣａＣ１□及びヒトトロンビンを添加して凝固させ
た。こうして調製したクロットを生理食塩水で十分に洗
浄した後、液体窒素で冷却した乳鉢中で粉砕した。
体重２００〜２５０ｇのウィスター系雄性ラットの尾静
脈からＮａＩを注入し、その後、１２５Ｉ標識フイブリ
ノゲン懸濁液を注入し、肺塞栓を作製した。１′Ｉ標識
フィブリノゲン懸濁液投与５分後に被検薬剤としてリポ
ソーム１〜４ （ＰＰＡとして３００υ／ｋｇ）を尾静
脈からｂｏｌｕｓ投与した。薬剤投与５５分後にラット
を層殺し肺に残存する放射活性からクロット溶解率を算
出した。結果を表３に示した。
脈からＮａＩを注入し、その後、１２５Ｉ標識フイブリ
ノゲン懸濁液を注入し、肺塞栓を作製した。１′Ｉ標識
フィブリノゲン懸濁液投与５分後に被検薬剤としてリポ
ソーム１〜４ （ＰＰＡとして３００υ／ｋｇ）を尾静
脈からｂｏｌｕｓ投与した。薬剤投与５５分後にラット
を層殺し肺に残存する放射活性からクロット溶解率を算
出した。結果を表３に示した。
（以下余白〕
Ｎｏ、 ２
ＮＯｌ ３
Ｎｏ ４
７８．５
４４．２
６１．３
４２．３
４４．８
５７．８
６３．４
７６．７
第１図は、実施例１〜３及び比較例１で調製したリポソ
ーム１〜４をショ糖密度勾配遠心分離法で分画したとき
の、各両分のＰＰＡ活性及びレシチン濃度を示したグラ
フである。第２図はリポソーム１〜４及びＰＰＡをラッ
トに静注したときの血中ＰＰＭ活性の推移を示したグラ
フである。 ■ （ＩＬＬＩ／ｌ０ＬＬＩｎ） 圓鯛ｆ％＋４１ （＋ｕｕｌｎ） ■ ｄｄ 皿 （＋ｕｌ＋ｏｕ＋ｎ） 誼＠／ニーＨ＜＜ 口 （＋１１１７１１） 易狼 ｄｄ 口 （ＩＬＬＩ／ｌ０ＬＬＩｎ） 譲條Ｘ壬４４ （＋ＬＬｌｔｎ） 聡界 ｄｄ 冊 （＋ｕｕｌ＋ｏｕｕｎ） 誼副／％＋４１ （＋ｕｕＩｎ） ■ ｄｄ
ーム１〜４をショ糖密度勾配遠心分離法で分画したとき
の、各両分のＰＰＡ活性及びレシチン濃度を示したグラ
フである。第２図はリポソーム１〜４及びＰＰＡをラッ
トに静注したときの血中ＰＰＭ活性の推移を示したグラ
フである。 ■ （ＩＬＬＩ／ｌ０ＬＬＩｎ） 圓鯛ｆ％＋４１ （＋ｕｕｌｎ） ■ ｄｄ 皿 （＋ｕｌ＋ｏｕ＋ｎ） 誼＠／ニーＨ＜＜ 口 （＋１１１７１１） 易狼 ｄｄ 口 （ＩＬＬＩ／ｌ０ＬＬＩｎ） 譲條Ｘ壬４４ （＋ＬＬｌｔｎ） 聡界 ｄｄ 冊 （＋ｕｕｌ＋ｏｕｕｎ） 誼副／％＋４１ （＋ｕｕＩｎ） ■ ｄｄ
Claims (1)
- 脂質と、正電荷脂質及び／又は負電荷脂質よりなる脂質
膜表面に蛋白質類を結合させてなることを特徴とする蛋
白質類・脂質小体複合体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2193590A JPH0482839A (ja) | 1990-07-20 | 1990-07-20 | 蛋白質類・脂質小体複合体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2193590A JPH0482839A (ja) | 1990-07-20 | 1990-07-20 | 蛋白質類・脂質小体複合体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0482839A true JPH0482839A (ja) | 1992-03-16 |
Family
ID=16310497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2193590A Pending JPH0482839A (ja) | 1990-07-20 | 1990-07-20 | 蛋白質類・脂質小体複合体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0482839A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996029989A1 (en) * | 1995-03-31 | 1996-10-03 | Amgen Inc. | Stable protein:phospholipid compositions and methods____________ |
| WO2000025747A1 (fr) * | 1998-10-29 | 2000-05-11 | Sankyo Company, Limited | Liposome de toxicite reduite |
| JP2006523683A (ja) * | 2003-04-15 | 2006-10-19 | オッパーバス・ホールディング・ビー・ブイ | タンパク質及び／またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む医薬組成物 |
-
1990
- 1990-07-20 JP JP2193590A patent/JPH0482839A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996029989A1 (en) * | 1995-03-31 | 1996-10-03 | Amgen Inc. | Stable protein:phospholipid compositions and methods____________ |
| WO2000025747A1 (fr) * | 1998-10-29 | 2000-05-11 | Sankyo Company, Limited | Liposome de toxicite reduite |
| JP2006523683A (ja) * | 2003-04-15 | 2006-10-19 | オッパーバス・ホールディング・ビー・ブイ | タンパク質及び／またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む医薬組成物 |
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