JPH0527399B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は新規な過酸化水素分析用の試薬および
これを含む多層化学分析要素に関するものであ
る。さらに詳しくは、過酸化水素の存在下、ペル
オキシダーゼなど酸化作用を有する物質が触媒と
して働き、呈色する新規な発色体およびこれを含
む過酸化水素または過酸化水素を形成しうるアナ
ライト（被検体の）の定量分析に適した多層化学
分析要素に関するものである。 （従来の技術） 近年、臨床検査における酵素学的分析方法は、
その特異性が高く評価され、急速に普及しつつあ
る。それらのうち、尿および体液中のグリコー
ス、尿酸、コレステロール、トリグリセリド、乳
酸、クレアチニン、遊離脂肪酸、グルタミン酸ピ
ルビン酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸オキ
ザロ酢酸トランスアミナーゼ、コリンエステラー
ゼ、クレアチンホスホキナーゼ、乳酸脱水素酵素
などを測定する方法としてそれぞれの系における
最終的に定量すべき物質の酸化酵素を作用させて
生成した過酸化水素を定量することにより、目的
物を定量する方法がしばしば用いられている。 過酸化水素の定量方法としては、例えば特開昭
50−115892、特開昭53−110897、特開昭54−
25892、特開昭55−20471、特開昭55−92696、特
開昭55−121149、特開昭55−131400、特開昭56−
37557、特開昭56−39072、特開昭56−42599、特
開昭57−142562、特開昭57−150399等の各明細書
に開示の方法が知られている。これらの方法はペ
ルオキシダーゼの存在下に、ｏ−トリジン、２，
７−ジアミノフルオレン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ
−フエニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｏ−
アミノフエノール、等の色原体を酸化型の発色体
に変化させて比色定量する方法、４−アミノアン
チビリンとフエノール又はＮ，Ｎ−ジアルキルア
ニリンあるいはＮ，Ｎ−ジアルキルトルイジンと
の組合せ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
ヒドラゾンとｏ−トリジン又はＮ，Ｎ−ジメチル
アニリンあるいはＮ，Ｎ−ジエチルアニリンとの
組合せ、あるいは二量体を形成する４−メトキシ
−１−ナフトール及びその誘導体等の色原体を酸
化縮合させて発色体として比色定量する方法等で
ある。 これらの化合物では、１モルの発色体（色素）
を形成するために２モルの過酸化水素を必要とす
るが、本発明者らは１モルの過酸化水素で１モル
の色素を形成しうる過酸化水素分析用試薬、その
試薬を用いた過酸化水素又はペルオキシダーゼの
分析方法、及びその試薬を含む試薬層を有する多
層化学分析要素を発明し、その内容を特許出願し
た（特開昭59−193352号）。 （発明が解決しようとする問題点） 前述の各化合物の場合には１モルィの発色体を
形成するために２モルの過酸化水素を必要とする
ため、微量成分の定量にとつて、不利な方法であ
る。それ故１モルの色素を形成するために、１モ
ルだけの過酸化水素で十分な過酸化水素定量用試
薬が望まれていた。 本発明の目的は、前記先願の試薬に加え、ペル
オキシダーゼの触媒作用または関与の下に１モル
の過酸化水素で１モルの色素を形成しうる、新た
な高感度の過酸化水素定量用試薬およびその試薬
を含む試薬層を有する過酸化水素定量用多層化学
分析要素を提供することである。 （問題点を解決するための手段） 本発明は、下記一般式〔１〕で表わされる化合
物とペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ活
性を有する無機化合物を用いることにより前記の
目的が達成されることを見出した。 一般式〔１〕において、 R¹およびR²はｐ−位にモノまたはジ低級アル
キル置換アミノ基を有するフエニル基を表わし、
両者は同じでも異なつてもよい。 R³は２−または３−ピロリル基、置換２−ま
たは３−ピロリル基、２−または３−インドリル
基または置換２−または３−インドリル基を表わ
す。 一般式〔１〕において、R¹、R²で表わされる
ｐ−位にモノまたはジ低級アルキル置換アミノ基
を有するフエニル基の好ましい具体例は４−（ジ
メチルアミノ）フエニル基、４−（ジエチルアミ
ノ）フエニル基等である。R³で表わされる置換
−２−または３−ピロリル基、置換−２−または
３−インドリル基の置換基としては、ハロゲン
（塩素原子、臭素原子等）、シアノ基、アルキル
基、置換アルキル基、アリール基、ヒドロキシル
基、カルボキシル基、ニトロ基、スルホンアミド
基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、ア
ニールオキシ基、モノアルキルアミノ基、ジアル
キルアミノ基、カルバモイル基、Ｎ−アルキルカ
ルバモイル基、アルキルスルホニル基、スルフア
モイル基等の置換基より選ばれ、１個又は同種ま
たは異種のこれらの置換基を２個以上有すること
ができる。これらの置換基の中では合成のし易
さ、特性面よりアリール基、ハロゲン、アルコキ
シ基、シアノ基、ニトロ基が好ましい。アリール
基としてはフエニル基、ヒドロキシフエニル基、
アルキル基としてはメチル基、エチル基、アルコ
キシ基としてはメトキシ、エトキシが好ましい。
R³で表わされる置換基の好ましい具体例は、２
−ピロリル基、３−インドリル基、２−クロロ−
３−インドリル基、５−クロロ−３−インドリル
基、５−シアノ−３−インドリル基、５−ニトロ
−３−インドリル基、２−フエニル−３−インド
リル基、２−メトキシカルボニル−３−インドリ
ル基、２−エトキシカルボニル−３−インドリル
基、５−メトキシカルボニル−３−インドリル
基、５−エトキシカルボニル−３−インドリル基
等である。 次に、一般式〔１〕で表わされる化合物の好ま
しい具体例を示すが、本発明に用いられる化合物
はこれらの化合物のみに限定されるものではな
い。 なお、以下の式でMeはメチル基を。Et、はエ
チル基を、Phはフエニル基を表わす。 一般式〔１〕で表わされる新規化合物は米国特
許第3297710号に記載されている方法に従つて合
成することができる。次に一般式〔１〕で表わさ
れる化合物の合成例を示すが具体的に示されてい
ない化合物も以下の合成例に準じて容易に合成す
ることができる。 合成例 １ 化合物(4) ２−（２−フエニル−３−インドリ
ル）−４，５−ジ〔４−（ジメチルアミノ）フエ
ニル〕イミダゾールの合成 ビス〔ｐ−（ジメチルアミノ）フエニル〕エタ
ンジオン2.2ｇ、２−フエニル−３−ホルミルイ
ンドール2.8ｇ、酢酸アンモニウム５ｇを氷酢酸
17ml中で２時間加熱還流して反応させた。冷却
後、水150ml、アンモニア水20mlの混合液に滴下
したところ、黄緑色の結晶が析出した。析出した
結晶を取し、水洗、乾燥後、ベンゼン−酢酸エ
チルエステル（１：１）で再結晶して化合物(4)が
3.9ｇ得た。融点228〜231℃ 合成例 ２ 化合物(7) ２−（２−クロロ−３−インドリル）
−４，５−ジ〔４−（ジメチルアミノ）フエニ
ル〕イミダゾールの合成 ビス〔ｐ−（ジメチルアミノ）フエニル〕エタ
ンジオン2.2ｇ、２−クロロ−３−ホルミルイン
ドール2.5ｇ、酢酸アンモニウム５ｇを氷酢酸17
ml中で２時間加熱還流して反応させた。冷却後、
水150mlとアンモニア水20mlの混合液に滴下した
ところ、黄緑色の結晶が析出した。析出した結晶
を取し、水洗、乾燥後、ベンゼン−酢酸エチル
エステル（１：１）で再結晶して化合物(7)を得
た。融点179〜182℃ 本発明の過酸化水素分析用試薬と過酸化水素と
の反応（呈色反応）は例えば〔２〕式により表わ
される。 ペルオキシダーゼには特公昭56−45599号、特
公昭57−5520等に開示の植物起源および動物起源
のペルオキシダーゼ（EC1.11.7）、および特開昭
57−99192等に開示の微生物起源のペルオキシダ
ーゼ（EC1、11.7）のうちから適宜に１種または
２種以上を組合せて用いることができる。 植物起源のペルオキシダーゼの例として、西洋
わさび、じやがいも、いちじく樹液、かぶ、だい
こんから抽出されたペルオキシダーゼを、動物起
源のペルオキシダーゼの例として、牛乳から抽出
されたラクトペルオキシダーゼ、白血球から抽出
されたベルトペルオキシダーゼを、微生物起源の
ペルオキシダーゼとしてAlternaria属、
Cochliobolus属、Curvularia属、Pellicularia属
に属し非特異的ペルオキシダーゼ生産能を有する
微生物起源のペルオキシダーゼを、それぞれあげ
ることができる。 これらのうちで植物起源または微生物起源の非
特異的ペルオキシダーゼが好ましい。 なお、ペルオキシダーゼ活性を有する無機化合
物、例えば、特公昭56−45599、特公昭57−5520
等に開示のチオキシアン酸鉄、タンニン酸鉄、フ
エロシアン化鉄（いずれも鉄（＋２）化合物）、
クロム硫酸カリウム、沃化ナトリウム、沃化カリ
ウム、モリブデン酸アンモニウム、モリブデン酸
カリウム等をペルオキシダーゼのかわりに用いる
こともできる。 本発明において、定量試薬として一般式〔１〕
で示されるイミダゾール誘導体およびペルオキシ
ダーゼのほかに、さらに酸化酵素を組合わせるこ
とによつて、より広い範囲への応用が可能とな
る。すなわち、最終的に定量すべき物質が酸化酵
素の作用により過酸化水素を生成する場合に、酸
化酵素を本発明の試薬系に組み合わせることによ
つて、生成する過酸化水素を定量して目的とする
種々の物質を定量することが可能になる。具体的
には、尿および体液（例、血液）の中のグルコー
ス、尿酸、コレステロール、トリグリセリド、乳
酸、クレアチニン、遊離脂肪酸、グルタミン酸ピ
ルビン酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸オキ
ザロ酢酸トランスアミナーゼ、コリンエスチラー
ゼ、クレアチンホスホキナーゼ、乳酸脱水素酵素
などを測定することができる。これらの測定に用
いる酸化酵素としては、グルコースオキシダー
ゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、
Ｌ−α−グリセロ燐酸オキシダーゼ、ピルビン酸
オキシダーゼなどが挙げられる。これらの酸化公
素意はいかなる起源のものでもよい。 本発明の過酸化水素分析試薬は、各成分をそれ
ぞれ別個の固体（粉末または顆粒など）として、
あるいは水溶液、水懸濁液または緩衝水溶液とし
て調製し、使用時、すなち被検試料を定量分析す
る操作の再にこれらの形の成分を組みあわせ混合
して使用することができ、また各成分の固体（粉
末または顆粒など）の混合物、あるいは全成分を
含む水または緩衝水溶液（または懸濁液）として
あらかめ調製しておいて使用することもできる。
全成分を含む溶液または懸濁液として用いる場合
には各成分を同時にあるいは適宜な順序で溶解し
て全成分を含む水または緩衝水溶液（または懸濁
液）を調製することができる。 本発明の過酸化水素分析用試薬を水溶液または
水懸濁液として用いる場合には、一般式〔１〕で
表わされるイミダゾール誘導体の溶媒（例、アセ
トン、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタ
ノール等）、界面活性剤（好ましくはノニオン性
界面活性剤、例、ポリオキシエチレンアルキルフ
エニルエーテル等）を用いることが好ましい。 本発明の過酸化水素分析用試薬の好ましい用途
態様例として、特開昭49−53888、特開昭50−
137192、特開昭51−40191、特開昭55−90859、特
開昭55−164356、特開昭57−66359、実開昭57−
42951等の各明細書に開示されているような水不
透過性光透過性支持体の上に試薬層および多孔性
展開層（または定面積多孔性層）がこの順に設け
られてなる一体型多層化学分析要素（フイルムま
たはシート）の試薬層の中に（または必要により
設けられる他の層の中と試薬層の中に）本発明の
試薬の各成分を配合して含有される態様がある。
支持体にはポリエステル（例、ポリエチレンテレ
フタレート、ビスフエノールのポリカーボネー
ト）、セルロースエステル（例、セルロースジア
セテート、セルローストリアセテート、セルロー
スアセテートプロピオネート、セルロースアセテ
ートブチレート、セルロースニトレート）、ポリ
スチレン、光学ガラス等の近紫外部、可視光部、
近赤外部にかけて透明性のよい材料でできた厚さ
約10μｍから約0.5mm、好ましくは約20μｍから約
0.3mmまでの板状物又はその積層物を用いること
ができる。また、支持体としてシリコーン樹脂等
の離型剤をごくうすく塗布した前述の支持体又は
他の支持体（紙、プラスチツク、金属箔等の半透
明又は不透明な支持体をも用いることができる。）
を用いると、保護の役目をし、測定の際にはこれ
を剥がして除去してから測定することができる。 試薬層としては特開昭49−53888、特開昭53−
26188、特開昭55−164356等に開示のゼラチン、
ポリビニルアルコール、ポリアクレルアミド等の
親水性バインダーの中に〔１〕で表わされるイミ
ダゾール誘導体および必要により組みあわされる
酵素等が実質的に均一に分散されてなる層、特開
昭56−8549に開示の親水性バインダーの中に試薬
を含有する疎水性微小粒子が分散してなる層等が
あげられる。 多孔性展開層としては特開昭49−53888等に開
示のメンブランフイルタ（ブラツシユポリマー
層）；ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロビー
ズ、珪藻土が親水性ポリマーバインダーに保持さ
れてなる連続空隙含有多孔性層、特開昭55−
90859に開示のポリマーミクロビーズ、ガラスミ
クロビーズ等が水で膨潤しないポリマー接着剤で
点接触状に接着されてなる連続微空隙含有多孔性
層（三次元格子状粒条構造物層）等の非繊維質等
方的多孔性展開層、特開昭55−164356、特開昭57
−66359等に開示の織物展開層、特願昭59−79158
に開示の編物展開層、特開昭57−148250に開示の
有機ポリマー繊維パルプを抄造紙からなる展開層
等の繊維質多孔性展開層等があげられる。 本発明の一体型多層分析要素には前述の諸特許
明細書に開示の検出層、光遮蔽層、光反射層、
過層、半透膜層、バリヤ層、拡散防止層（マイグ
レーシヨン防止層）、吸水層等やこれら単独の層
を有する機能を二つ以上併せもつ層を組みこむこ
とができる。一体型多層分析要素は前述の諸特許
明細書に開示の方法に従つて製造することができ
る。 本発明の一体型多層分析要素は特開昭54−
156079、実開昭56−142454、特開昭57−63452、
特表昭58−501144等に開示のスライド枠に収めて
使用することが好ましい。この他の使用形態とし
て長いテープ状で、または透明収容部分またはは
さみこみ部分をパンチカードに収めて使用するこ
ともできる。 本発明の分析方法は、例えば次のように実施す
ることができる。被検試料に一般式〔１〕で表わ
されるイミダゾール誘導体、および反応触媒とし
てのペルオキシダーゼを前記の形で同時に、また
は適宜の順序で添加し、混合物を５℃から40℃、
好ましくは20℃から40℃の範囲の温度およびPH
3.0から9.0、好ましくはPH4.5から8.0の範囲にお
いて１分から60分の時間範囲において反応を進行
させ、生成した色素を含有する反応混合物の吸光
度を測定する。あるいは前記の諸特許明細書に記
載された多層化学分析要素（フイルムまたはシー
ト）中に一般式〔１〕で表わされるイミダゾール
誘導体およびペルオキシダーゼを含有させ、その
多孔性展開層に約6μから約15μの被検試料
液、またはその定面積多孔性層に約10μから約
30μの範囲内の一定量の被検試料液を滴状に付
着供給（以下、点着という。）し、20℃から40℃、
好ましくは25℃から40℃の範囲の温度で１分から
20分、好ましくは２分から10分の時間範囲でイン
クベーシヨンし多層化学分析要素の光学濃度を反
射分光測光する。吸光度または反射光学濃度の測
定方法はend point法およびreaction rate法を適
宜に選択して実施することができる。 酸化酵素を併用する場合には、酸化酵素の作用
によりH₂O₂をあらかじめ生成させてもよいが、
H₂O₂生成反応と発色反応を同時に進行させるこ
とが好ましい。酸化酵素の使用量はその種類、目
的とする基質、または混在物などに応じて適宜定
められる。 本発明の分析方法は前述の式〔２〕の例にみら
れるように鵜、ペリオキシダーゼの触媒作用のも
とで一般式〔１〕で表わさせるイミダゾール化合
物と過酸化水素とが化学量論に従つて反応して色
素を生成するので、試薬として一般式〔１〕で表
わされるイミダゾール化合物とH₂O₂を組みあわ
せた試薬または両者を含む他層化学分析要素に活
性値が未知のペルオキシダーゼを含む試料を添加
または点着し生成する色素を測定することにより
試料中のペルオキシダーゼ活性を分析または定量
することができる。この方法はペルオキシダーゼ
を標識物質として用いた酵素免疫測定法に利用で
きる。 本発明は人ばかりでなく種々の動物、例えば家
畜、愛玩動物、実験動物などの尿、体液（例、血
液）などの過酸化水素または過酸化水素を生成し
うるアナライトの分析にももちろん利用できる。 （作用及び発明の効果） 本発明の過酸化水素分析用試薬は１モルの過酸
化水素から１モルの色素が生成するので、被検試
料から以下酸化水素を高感度で定量することがで
きる。従つて、本発明の分析試薬および多層化学
分析要素はアナライトとして微量の過酸化水素
（または過酸化水素を形成しうるアナライト）を
含む試料の過酸化水素の定量に特に有利である。
本発明の分析試薬は反応性が良好であり、この試
薬を用いた分析方法は操作が極めて簡単である。
この分析方法によれば大量の試料を短時間に処理
することができ、従つて例えば臨床分析などに好
適である。 （実施例） 実施例 １ (1) 発色液の調製：化合物(4) 15mgをアセトンに
溶解しペルオキシダーゼ500単位をPH7.5の硼酸
塩緩衝水溶液に溶解し全溶を25mlになるように
して発色液を調製した。 (2) 過酸化水素の定量：発色液３mlを試料セルに
とり、濃度既知の過酸化水素20μを加えて、
ブランク（過酸化水素水溶液のかわりに蒸留水
を加えたもの）を対照として37℃で10秒後640
波長ｎｍで吸光度を測定し次の結果を得た。

【表】 実施例 ２ ゼラチン下塗り層を有する厚さ185μｍの無色
透明ポリエチレンテフタレート（PET）フイル
ムを上に次の成分からなる試薬層塗布液を塗布し
乾燥させた。 （以下、数値は乾燥後の各層における各成分の含
有割合を示す。） 試薬層塗布液の成分（溶媒：適宜量の水） ウリカーゼ 150U／m² 化合物(4) 0.2ｇ／m² ペルオキシダーゼ 2500U／m² ゼラチン 10ｇ／m² PH8.5硼酸塩緩衝剤 調製された試薬層を水で湿潤させ、その上に多
孔性展開層としてセルロースアセテートメンブラ
ンフイルター（最大孔径3.0μｍ、厚さ180μｍ、富
士写真フイルム社製ミクロフイルターFM−
300^(R)）をラミネートして一体化させて尿酸定量
用多層化学分析要素を調製した。 えられた多層化学分析要素を評価するために尿
酸水溶液（濃度６；１；12mg／dlおよび尿酸不含
のブランク溶液）の各10μを多孔製展開層に点
着し、37℃で２分インクベーシヨンした後直ちに
シアンフイルターを備えたマクベス反射分光光度
計を用いてPETフイルム側から発色光学濃度を
測定波長630nｍ近傍で反射側光し、次の値をえ
た。 尿酸溶液 反射光学濃度 （濃度mg／dl） ０（ブランク） 0.41 ６ 1.05 10 1.33 12 1.42 この結果から、この多層化学分析要素を用い、
反射側光により比色法によつて尿酸濃度の定量を
実施できることが明らかになつた。 実施例 ３ ゼラチン下塗層を有する厚さ185μｍの無色透
明PETフイルムの上に次の成分からなる試薬層
塗布液を塗布し乾燥させた。 試薬層塗布液の成分（溶媒；適宜量の水） ウリカーゼ 200U／m² 化合物(7) 0.25ｇ／m² ゼラチン 10ｇ／m² ペルオキシダーゼ 3000U／m² オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
（トリトン×−100 ） 0.15ｇ／m² PH8.5硼酸塩緩衝剤 試薬層の上に次の成分からなる光反射層塗布分
散液を塗布し乾燥させた。 光反射層塗布分散液の成分（分散媒：適宜量の
水） 二酸化チタン微粉末 ３ｇ／m² ゼラチン １ｇ／m² オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
0.1ｇ／m² 光反射層の上にさらに次の成分からなる妨害物
質排除層欲液を塗布乾燥させた。 妨害物排除層塗布液の成分（溶媒：適宜量の
水） アスコルビン酸オキシダーゼ 4000U／m² ゼラチン ４ｇ／m² PH8.5硼酸塩緩衝剤 このようにできあがつた妨害物排除層を水で湿
潤させておき、100番手の綿糸から織られたブロ
ード布（水洗し脱脂された後乾燥された布）をラ
ミネートし一体化させて尿酸定量用多層化学分析
要素を調製した。 ついで実施例２と同様にして既知の尿酸濃度に
対する多層化学分析要素の発色反射光学濃度値を
えた。 尿酸溶液 反射光学濃度 （濃度mg／dl） ０（ブランク） 0.26 ６ 0.69 10 0.90 12 0.99 実施例 ４ ゼラチン下塗り層を有する厚さ185μｍの無色
透明PETフイルムの上に次の成分からなる試薬
層塗布液を塗布し乾燥させて第二試薬層を形成し
た。 第二試薬層塗布液の成分（溶媒：適宜量の水） ペルオキシダーゼ 5000U／m² 化合物(7) １ｇ／m² ゼラチン 10ｇ／m² オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
（トリトン×−100 ） 0.15ｇ／m² PH6.5燐酸塩緩衝剤 この層の上に次の成分からなる光反射層塗布分
散液を塗布し乾燥させて光反射層を形成した。 光反射層塗布分散液の成分（分散液：適宜量の
水） 二酸化チタン微粉末 ３ｇ／m² ゼラチン １ｇ／m² オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
0.1ｇ／m² さらにこの層の上に次の成分からなる試薬層塗
布液を塗布し乾燥させて第一試薬層を形成した。 第一試薬層塗布液の成分（溶媒：適宜量の水） コレステロールオキシダーゼ 2000U／m² ゼラチン 10ｇ／m² オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
0.1ｇ／m² PH6.5燐酸塩緩衝剤 ついで第一試薬層を水で湿潤し、その上にセル
ロースアセテートメンブランフイルター（最大孔
径3.0μｍ、厚さ180μｍ、富士写真フイルム社製ミ
クロフイルターFM−300 ）を軽く圧着ラミネ
ートし一体化させて多孔性展開層を設け、コレス
テロール定量用多層化学分析要素を調製した。 えられたコレステロール定量用多層化学分析要
素を評価するためにコレステロール含有コントロ
ール血清（コレステロール含有量50：100：200：
300：500mg／dlおよびコレステロール不含のブラ
ンク）の各10μを展開層に点着し、37℃で10分
インクベーシヨンし、直ちにシアンフイルターを
備えたマクベス反射分光光度計を用いてPETフ
イルム側から発色光学濃度を測定波長600nｍで
反射光し、次の値をえた。 コレステロール含有コントロール 反射光学濃度 血清（含有量mg／dl） ０（ブランク） 0.26 50 0.49 100 0.68 200 0.98 300 1.18 500 1.48 この結果からこのコレステロール定量用多層化
学分析要素を用い、反射測光により比色法によつ
てコレステロール含有量の定量を実施できること
が明らかになつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式［１］で表わされるイミダゾール誘導
   体とペルオキシダーゼまたはペリオキシダーゼ活
   性を有する無機化合物からなることを特徴とする
   過酸化水素分析試薬 一般式［１］において、 R¹およびR²はｐ−位にモノまたはジ低級アル
   キル置換アミノ基を有するフエニル基を表わし、
   両者は同じでも異なつてもよい。 R³は２−または３−ピロリル基、置換２−ま
   たは３−ピロリル基、２−または３−インドリル
   基または置換２−または３−インドリル基を表わ
   す。 ２ 水不透過性光透過性支持体、試薬層および多
   孔層展開層がこの順に設けられてなる多層化学分
   析要素において、前記試薬層に一般式［１］で表
   わされるイミダゾール誘導体とペルオキシダーゼ
   またはペルオキシダーゼ活性を有する無機化合物
   が含まれていることを特徴とする過酸化水素また
   は過酸化水素を生成しうるアナライト分析用の多
   層化学分析要素 一般式［１］において、 R¹およびR²はｐ−位にモノまたはジ低級アル
   キル置換アミノ基を有するフエニル基を表わし、
   両者は同じでも異なつてもよい。 R³は２−または３−ピロリル基、置換２−ま
   たは３−ピロリル基、２−または３−インドリル
   基または置換２−または３−インドリル基を表わ
   す。 ３ 前記多孔性層が多孔性展開層である特許請求
   の範囲２に記載の要素。 ４ 前記多孔性層が定面積多孔性層である特許請
   求の範囲２に記載の要素。