JPH05105693A - Ｗｓ４４１８物質、その製法及び用途 - Google Patents
Ｗｓ４４１８物質、その製法及び用途Info
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- JPH05105693A JPH05105693A JP3293784A JP29378491A JPH05105693A JP H05105693 A JPH05105693 A JP H05105693A JP 3293784 A JP3293784 A JP 3293784A JP 29378491 A JP29378491 A JP 29378491A JP H05105693 A JPH05105693 A JP H05105693A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 新菌種キタザトスポリア・オワセネア（Ｋｉ
ｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ ｏｗａｓｅｎｅａ）Ｎｏ．
４４１８株を培養して、融点が１５２〜１５４℃である
酸性の白色粉末ＷＳ４４１８物質を製造する。 【効果】 この物質は、すぐれたコラゲナーゼ阻害作用
を有する。
ｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ ｏｗａｓｅｎｅａ）Ｎｏ．
４４１８株を培養して、融点が１５２〜１５４℃である
酸性の白色粉末ＷＳ４４１８物質を製造する。 【効果】 この物質は、すぐれたコラゲナーゼ阻害作用
を有する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＷＳ４４１８物質、そ
の製法及び用途に関するものである。ＷＳ４４１８物質
は、キタザトスポリア属菌の培養物から分離採取された
従来未知の新規物質であり、すぐれたコラゲナーゼ阻害
作用を示し、ヒト線維芽細胞由来コラゲナーゼ阻害剤と
して有用であり、医薬、例えば慢性関節リウマチ、変形
性関節炎等における骨破壊の予防、治療薬として使用す
ることが可能である。
の製法及び用途に関するものである。ＷＳ４４１８物質
は、キタザトスポリア属菌の培養物から分離採取された
従来未知の新規物質であり、すぐれたコラゲナーゼ阻害
作用を示し、ヒト線維芽細胞由来コラゲナーゼ阻害剤と
して有用であり、医薬、例えば慢性関節リウマチ、変形
性関節炎等における骨破壊の予防、治療薬として使用す
ることが可能である。
【０００２】
【従来の技術】慢性関節リウマチ、変形性関節炎等は、
痛みが激しく、骨の破壊もひき起されて、治療が難しい
疾病のひとつに挙げられている。しかしながら、安全に
して有効性が高くしかも長期間投与が可能な治療薬は、
現在のところ未だ開発されていないのが実状である。
痛みが激しく、骨の破壊もひき起されて、治療が難しい
疾病のひとつに挙げられている。しかしながら、安全に
して有効性が高くしかも長期間投与が可能な治療薬は、
現在のところ未だ開発されていないのが実状である。
【０００３】
【発明が解決すべき課題】本発明は、このような技術の
現状に鑑みてなされたものであって、慢性関節リウマ
チ、変形性関節炎等において特にその骨破壊の面に着目
し、その予防及び／又は治療に用いることのできる新規
物質を開発する目的でなされたものである。
現状に鑑みてなされたものであって、慢性関節リウマ
チ、変形性関節炎等において特にその骨破壊の面に着目
し、その予防及び／又は治療に用いることのできる新規
物質を開発する目的でなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、各方面から検討し
た結果、該骨破壊の予防、治療薬のひとつとしてコラゲ
ナーゼ阻害剤に着目した。
成するためになされたものであって、各方面から検討し
た結果、該骨破壊の予防、治療薬のひとつとしてコラゲ
ナーゼ阻害剤に着目した。
【０００５】そこで、有効性はもとより長期間投与にも
耐え得る安全性の高いヒト由来線維芽細胞コラゲナーゼ
阻害物質を開発することを目的として、微生物の発酵生
産物に着目した。そして各種微生物を検索した結果、三
重県、尾鷲市近郊の土壌試料から分離した微生物Ｎｏ．
４４１８株が培養液中に目的物質を産生蓄積することを
発見した。そして更に、この物質についてその理化学的
性質を詳細に研究したところ、従来未知の新規物質であ
ることを確認し、この物質を新たにＷＳ４４１８物質と
命名し、そして更に研究の結果、この物質について、工
業的製法を確立しただけでなくコラゲナーゼ阻害作用も
併せて確認し、また、微生物Ｎｏ．４４１８株について
も従来未知の新菌種であると同定するに至り、これらの
新知見に基づき遂に本発明が完成されたのである。
耐え得る安全性の高いヒト由来線維芽細胞コラゲナーゼ
阻害物質を開発することを目的として、微生物の発酵生
産物に着目した。そして各種微生物を検索した結果、三
重県、尾鷲市近郊の土壌試料から分離した微生物Ｎｏ．
４４１８株が培養液中に目的物質を産生蓄積することを
発見した。そして更に、この物質についてその理化学的
性質を詳細に研究したところ、従来未知の新規物質であ
ることを確認し、この物質を新たにＷＳ４４１８物質と
命名し、そして更に研究の結果、この物質について、工
業的製法を確立しただけでなくコラゲナーゼ阻害作用も
併せて確認し、また、微生物Ｎｏ．４４１８株について
も従来未知の新菌種であると同定するに至り、これらの
新知見に基づき遂に本発明が完成されたのである。
【０００６】本発明に係るＷＳ４４１８物質は、下記の
表３〜表４に示される理化学的性質を有している。
表３〜表４に示される理化学的性質を有している。
【０００７】
【表３】
【０００８】
【表４】
【０００９】本発明に係るＷＳ４４１８物質は、例えば
本発明者らが三重県尾鷲市近郊の土壌サンプルから新た
に分離した微生物Ｎｏ．４４１８株によって生産され
る。
本発明者らが三重県尾鷲市近郊の土壌サンプルから新た
に分離した微生物Ｎｏ．４４１８株によって生産され
る。
【００１０】本菌株の形態、培養性状、生理的性質等菌
学的性質についての研究の内、培地、方法はシャーリン
グとゴットリーブ（下記の表５、表６、表７で示される
各参考文献の内の１）、ワックスマン（同じく参考文献
２）に従った。それぞれの培養は３０℃で１４日間行っ
た後、観察した。形態観察は、オートミール寒天、でん
ぷん・酵母エキス寒天で培養後、光学及び走査型電子顕
微鏡で観察した。生育温度はｐＨの生育範囲、食塩耐性
は酵母エキス・麦芽エキス寒天を用いた。色名は“メシ
ューエン・ハンドブック・オブ・カラー”（参考文献
３）から引用した。細胞壁タイプ（参考文献４、５）、
全菌体糖（参考文献６）、リン脂質成分（参考文献
７）、及びメナキノン（参考文献８）は、それぞれ各参
考文献に記載された方法にしたがって調べた。
学的性質についての研究の内、培地、方法はシャーリン
グとゴットリーブ（下記の表５、表６、表７で示される
各参考文献の内の１）、ワックスマン（同じく参考文献
２）に従った。それぞれの培養は３０℃で１４日間行っ
た後、観察した。形態観察は、オートミール寒天、でん
ぷん・酵母エキス寒天で培養後、光学及び走査型電子顕
微鏡で観察した。生育温度はｐＨの生育範囲、食塩耐性
は酵母エキス・麦芽エキス寒天を用いた。色名は“メシ
ューエン・ハンドブック・オブ・カラー”（参考文献
３）から引用した。細胞壁タイプ（参考文献４、５）、
全菌体糖（参考文献６）、リン脂質成分（参考文献
７）、及びメナキノン（参考文献８）は、それぞれ各参
考文献に記載された方法にしたがって調べた。
【００１１】
【表５】
【００１２】
【表６】
【００１３】
【表７】
【００１４】以下に、本発明に係る微生物Ｎｏ．４４１
８株の菌学的性質を示す。
８株の菌学的性質を示す。
【００１５】
【（１）形態的性質】Ｎｏ．４４１８株の基生菌糸はよ
く発達し不規則に分枝する。基生菌糸から伸びた気菌糸
は長い胞子鎖を形成する。気菌糸及び胞子鎖の形態は直
状又は波状（参考文献１）である。成熟した胞子鎖は、
２０個以上の胞子を連鎖する。胞子の形は円筒形、大き
さは０．５−０．７×１．０−２．３μｍ、表面は平滑
である、菌核、胞子のう、遊走子は観察されなかった。
く発達し不規則に分枝する。基生菌糸から伸びた気菌糸
は長い胞子鎖を形成する。気菌糸及び胞子鎖の形態は直
状又は波状（参考文献１）である。成熟した胞子鎖は、
２０個以上の胞子を連鎖する。胞子の形は円筒形、大き
さは０．５−０．７×１．０−２．３μｍ、表面は平滑
である、菌核、胞子のう、遊走子は観察されなかった。
【００１６】
【（２）培養性状及び生理的性質】Ｎｏ．４４１８株の
培養性状を、下記の表８、表９で示される第１表に示
し、生理的性質を下記の表１０で示される第２表に示
し、そして炭素源利用性を下記の表１１で示される第３
表に示す。
培養性状を、下記の表８、表９で示される第１表に示
し、生理的性質を下記の表１０で示される第２表に示
し、そして炭素源利用性を下記の表１１で示される第３
表に示す。
【００１７】
【表８】
【００１８】
【表９】
【００１９】
【表１０】
【００２０】
【表１１】
【００２１】上記結果から明らかなように、気菌糸の形
成は、テストした多くの培地で不良又貧弱であり、気菌
糸を着生した場合、その色調は白であった。生育初期に
は、生育の表面が湿ることがある。基生菌糸の色は黄橙
から赤茶を呈する。酵母エキス・麦芽エキス寒天、チロ
シン寒天、でんぷん・酵母エキス寒天で赤味茶色の可溶
性色素が少量産生された。これらの色素はｐＨ感受性で
はない。メラノイド色素の産生はみられなかった。炭素
源の利用性は全般に不良で、テストした中ではグルコー
ス、グリセリン、ガラクトースを利用した。
成は、テストした多くの培地で不良又貧弱であり、気菌
糸を着生した場合、その色調は白であった。生育初期に
は、生育の表面が湿ることがある。基生菌糸の色は黄橙
から赤茶を呈する。酵母エキス・麦芽エキス寒天、チロ
シン寒天、でんぷん・酵母エキス寒天で赤味茶色の可溶
性色素が少量産生された。これらの色素はｐＨ感受性で
はない。メラノイド色素の産生はみられなかった。炭素
源の利用性は全般に不良で、テストした中ではグルコー
ス、グリセリン、ガラクトースを利用した。
【００２２】
【（３）化学分類学的性質】本菌株の全菌体分解物中に
は、メソジアミノピメリン酸と少量のＬＬ−ジアミノピ
メリン酸が含まれていた。全菌体分解物中の糖としては
ガラクトースを含む。特徴的リン脂質としてフォスファ
チジルエタノールアミンを含む。主要メナキノンとして
ＭＫ−９（Ｈ6）とＭＫ−９（Ｈ8）が検出された（下記
の表１２で示される第４表）
は、メソジアミノピメリン酸と少量のＬＬ−ジアミノピ
メリン酸が含まれていた。全菌体分解物中の糖としては
ガラクトースを含む。特徴的リン脂質としてフォスファ
チジルエタノールアミンを含む。主要メナキノンとして
ＭＫ−９（Ｈ6）とＭＫ−９（Ｈ8）が検出された（下記
の表１２で示される第４表）
【００２３】
【表１２】
【００２４】
【（４）同定】上記した形態的特徴と化学分析の結果
は、本菌株がキタザトスポリア（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐ
ｏｒｉａ）属に属することを示した（参考文献９、１
０）。そこで、同属の既知種の記載を考照すると（参考
文献１１〜２０）、本菌株の性質はキタザトスポリア・
セタエ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ ｓｅｔａｅ）
以外の種とは明らかに相違していた。そこで、本菌株と
Ｋ．ｓｅｔａｅ ＩＦＯ １４２１６とについて詳細な
比較対照実験を行い、下記の表１３で示される第５表の
結果を得た。
は、本菌株がキタザトスポリア（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐ
ｏｒｉａ）属に属することを示した（参考文献９、１
０）。そこで、同属の既知種の記載を考照すると（参考
文献１１〜２０）、本菌株の性質はキタザトスポリア・
セタエ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ ｓｅｔａｅ）
以外の種とは明らかに相違していた。そこで、本菌株と
Ｋ．ｓｅｔａｅ ＩＦＯ １４２１６とについて詳細な
比較対照実験を行い、下記の表１３で示される第５表の
結果を得た。
【００２５】
【表１３】
【００２６】この結果から明らかなように、両株間には
培養的、生理的性質について多くの相違点が見出され
た。そして、これらの相違は、両菌株を別種とするのに
充分であると考えられ、そこでＮｏ．４４１８株はＫｉ
ｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ属の新種であると結論し、分
離源の土壌採取地に因み、キタザトスポリア・オワセネ
アＫｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ ｏｗａｓｅｎｅａ
ｓｐ．ｎｏｖ．）と命名した。この新種であるＮｏ．４
４１８株は、通産省工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２１０６、
寄託日：１９９１年３月１４日）。
培養的、生理的性質について多くの相違点が見出され
た。そして、これらの相違は、両菌株を別種とするのに
充分であると考えられ、そこでＮｏ．４４１８株はＫｉ
ｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ属の新種であると結論し、分
離源の土壌採取地に因み、キタザトスポリア・オワセネ
アＫｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ ｏｗａｓｅｎｅａ
ｓｐ．ｎｏｖ．）と命名した。この新種であるＮｏ．４
４１８株は、通産省工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２１０６、
寄託日：１９９１年３月１４日）。
【００２７】本物質の生産は、単に説明を目的として挙
げただけの本明細書記載の特定の微生物の使用に限定さ
れるものではないことを理解すべきである。この発明
は、記載の微生物からＸ線照射、紫外線照射、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミ
ノプリン等の変異処理により取得できる人工変異株並び
に自然変異株を含めて本物質を生産しうる全ての変異株
の使用をも包含するものである。
げただけの本明細書記載の特定の微生物の使用に限定さ
れるものではないことを理解すべきである。この発明
は、記載の微生物からＸ線照射、紫外線照射、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミ
ノプリン等の変異処理により取得できる人工変異株並び
に自然変異株を含めて本物質を生産しうる全ての変異株
の使用をも包含するものである。
【００２８】本発明に係る物質は、キタザトスポリア属
に属する該物質生産菌（例えばＫｉｔａｓａｔｏｓｐｏ
ｒｉａ ｏｗａｓｅｎｅａ ｓｐ． ｎｏｖ． Ｎｏ．
４４１８）を資化しうる炭素及び窒素源を含む栄養培地
中に接種し、好気条件下で培養することにより（例え
ば、振とう培養、通気撹拌培養等）、生産せしめること
ができる。
に属する該物質生産菌（例えばＫｉｔａｓａｔｏｓｐｏ
ｒｉａ ｏｗａｓｅｎｅａ ｓｐ． ｎｏｖ． Ｎｏ．
４４１８）を資化しうる炭素及び窒素源を含む栄養培地
中に接種し、好気条件下で培養することにより（例え
ば、振とう培養、通気撹拌培養等）、生産せしめること
ができる。
【００２９】炭素源としては、グルコース、シュークロ
ース、澱粉、変性澱粉、フラクトース、グリセリンその
他の炭水化物を使用するのが好ましい。
ース、澱粉、変性澱粉、フラクトース、グリセリンその
他の炭水化物を使用するのが好ましい。
【００３０】窒素源としては、オートミール、酵母エキ
ス、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、綿実油粕、大
豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、
落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）尿素、アミノ酸
等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用することが
できる。
ス、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、綿実油粕、大
豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、
落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）尿素、アミノ酸
等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用することが
できる。
【００３１】これらの炭素源及び窒素源は、併用するの
が有利であるが、純粋なものを必らずしも使用する必要
はない。不純なものには、生長因子や微量要素が含まれ
ている場合などもあり、有利な場合があるからである。
が有利であるが、純粋なものを必らずしも使用する必要
はない。不純なものには、生長因子や微量要素が含まれ
ている場合などもあり、有利な場合があるからである。
【００３２】必要ある場合には、例えば次のような無機
塩類を培地に添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリ
ウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。
塩類を培地に添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリ
ウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。
【００３３】特に、培地が強く発泡するのであれば、必
要あるときに、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物
油、シリコン等を添加してもよい。
要あるときに、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物
油、シリコン等を添加してもよい。
【００３４】目的物質を大量に工業生産するには、他の
発酵生産物の場合と同様に、通気撹拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。
発酵生産物の場合と同様に、通気撹拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。
【００３５】また、培養を大きなタンクで行う場合、本
物質の生産工程において菌の生育遅延を防止するため、
はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、
次に培養物を大きな生産タンクに移してそこで生産培養
するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地及
び生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一で
あってもよいし必要あれば両者を変えてもよい。
物質の生産工程において菌の生育遅延を防止するため、
はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、
次に培養物を大きな生産タンクに移してそこで生産培養
するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地及
び生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一で
あってもよいし必要あれば両者を変えてもよい。
【００３６】培養は通気撹拌条件で行うのが好ましく、
例えばプロペラやその他機械による撹拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したも
のを用いる。
例えばプロペラやその他機械による撹拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したも
のを用いる。
【００３７】培養温度は、本物質生産菌が本物質を生産
する範囲内で適宜変更しうるが、通常は１〜４０℃、好
ましくは１０〜３６℃で培養するのがよい。培養時間
は、培養条件や培養量によっても異なるが通常は約１日
〜１週間である。
する範囲内で適宜変更しうるが、通常は１〜４０℃、好
ましくは１０〜３６℃で培養するのがよい。培養時間
は、培養条件や培養量によっても異なるが通常は約１日
〜１週間である。
【００３８】発酵終了後、培養物から目的とする本物質
を回収する。すなわち、菌体は、直接水及び／又は有機
溶媒による抽出、あるいは、これを機械的に又は超音波
等既知の手段を用いて破壊した後、水及び／又は有機溶
媒で抽出した後、常法にしたがって回収、精製する。培
養液の場合は、直接、常法にしたがって回収、精製すれ
ばよい。
を回収する。すなわち、菌体は、直接水及び／又は有機
溶媒による抽出、あるいは、これを機械的に又は超音波
等既知の手段を用いて破壊した後、水及び／又は有機溶
媒で抽出した後、常法にしたがって回収、精製する。培
養液の場合は、直接、常法にしたがって回収、精製すれ
ばよい。
【００３９】回収、精製方法としては、例えば、水、有
機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出：クロマトグ
ラフィー；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が
適宜単独であるいは組合わせて使用できる。
機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出：クロマトグ
ラフィー；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が
適宜単独であるいは組合わせて使用できる。
【００４０】本物質の回収、精製は、上記のような既知
の方法を適宜利用して行うが、例えば次のようにしても
よい。先ず培養物を濾過し、濾液をＤｏｗｅｘ １×２
（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）等の樹脂に吸着さ
せ、食塩水で溶出し、溶出液を中性吸着樹脂〔例えばダ
イヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）〕に吸着させ、
水性メタノールで溶出し、溶出液を濃縮乾固させた後シ
リカゲルカラムクロマトグラフィーし、水性イソプロパ
ノール溶出液を得る。その内の活性フラクションについ
て逆相シリカゲルグロマトグラフィー処理し、活性物質
を含有する水性メタノール溶出液を濃縮した後、例えば
ダイヤイオンＨＰ−２０ ＳＳ（三菱化成社製）に吸着
させ、水性メタノールで溶出し、溶出液を濃縮、凍結乾
燥して、目的物質粉末を得ることができる。
の方法を適宜利用して行うが、例えば次のようにしても
よい。先ず培養物を濾過し、濾液をＤｏｗｅｘ １×２
（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）等の樹脂に吸着さ
せ、食塩水で溶出し、溶出液を中性吸着樹脂〔例えばダ
イヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）〕に吸着させ、
水性メタノールで溶出し、溶出液を濃縮乾固させた後シ
リカゲルカラムクロマトグラフィーし、水性イソプロパ
ノール溶出液を得る。その内の活性フラクションについ
て逆相シリカゲルグロマトグラフィー処理し、活性物質
を含有する水性メタノール溶出液を濃縮した後、例えば
ダイヤイオンＨＰ−２０ ＳＳ（三菱化成社製）に吸着
させ、水性メタノールで溶出し、溶出液を濃縮、凍結乾
燥して、目的物質粉末を得ることができる。
【００４１】本発明に係る薬剤組成物は、ＷＳ４４１８
物質及び／又はその塩を有効成分としてこれに常用され
る無機又は有機の担体を加えて、固体、半固体又は液体
の形で、経口投与剤のほか、外用剤等の非経口投与剤に
製剤化する。
物質及び／又はその塩を有効成分としてこれに常用され
る無機又は有機の担体を加えて、固体、半固体又は液体
の形で、経口投与剤のほか、外用剤等の非経口投与剤に
製剤化する。
【００４２】経口投与のための製剤としては、錠剤、丸
剤、顆粒剤、軟・伸カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤、エリキシル
等が挙げられる。非経口投与のための製剤としては、注
射剤、点滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、ス
プレー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。本
発明の有効成分を製剤化するには、常他にしたがえばよ
く、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安
定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その他常用される佐薬を
適宜使用する。
剤、顆粒剤、軟・伸カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤、エリキシル
等が挙げられる。非経口投与のための製剤としては、注
射剤、点滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、ス
プレー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。本
発明の有効成分を製剤化するには、常他にしたがえばよ
く、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安
定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その他常用される佐薬を
適宜使用する。
【００４３】本発明に係る薬剤組成物の投与量は、その
種類、治療ないし予防対象疾病の種類、投与方法、患者
の年令、患者の症状、処理時間等によって相違するが、
静脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分（本物
質）を０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．
１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与し、筋肉投与の場合は同じく
０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１
００ｍｇ／ｋｇ投与し、経口投与の場合も同じく０．５
〜２０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ／
ｋｇの範囲内で投与する。
種類、治療ないし予防対象疾病の種類、投与方法、患者
の年令、患者の症状、処理時間等によって相違するが、
静脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分（本物
質）を０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．
１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与し、筋肉投与の場合は同じく
０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１
００ｍｇ／ｋｇ投与し、経口投与の場合も同じく０．５
〜２０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ／
ｋｇの範囲内で投与する。
【００４４】以下、本発明を実施例について更に詳しく
説明する。
説明する。
【００４５】
【実施例１】
【００４６】
【（１）Ｎｏ．４４１８株の培養】Ｐｉｎｅｄｅｘ ＃
３（商品名、酸性可溶性澱粉）１％、グルコース０．５
％、酵母エキス０．５％、麦芽エキス０．５％、ポリペ
プトン０．５％、０．１％Ｋ2ＨＰＯ4を含有する液状種
培地（ＮａＯＨによりｐＨを６．０に調整）を、５００
ｍｌ容三角フラスコ２５本にそれぞれ１６０ｍｌずつ分
注し、１２５℃で３０分間滅菌した。これに、Ｋｉｔａ
ｓａｔｏｓｐｏｒｉａ ｏｗａｓｅｎｅａｓｐ． ｎｏ
ｖ． Ｎｏ．４４１８（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１０６）の
スラントを一白金耳接種し、３０℃、４日間、ロータリ
ーシェーカー（毎分２２０回転、５．１ｃｍストロー
ク）で培養を行い、種培養液とした。
３（商品名、酸性可溶性澱粉）１％、グルコース０．５
％、酵母エキス０．５％、麦芽エキス０．５％、ポリペ
プトン０．５％、０．１％Ｋ2ＨＰＯ4を含有する液状種
培地（ＮａＯＨによりｐＨを６．０に調整）を、５００
ｍｌ容三角フラスコ２５本にそれぞれ１６０ｍｌずつ分
注し、１２５℃で３０分間滅菌した。これに、Ｋｉｔａ
ｓａｔｏｓｐｏｒｉａ ｏｗａｓｅｎｅａｓｐ． ｎｏ
ｖ． Ｎｏ．４４１８（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１０６）の
スラントを一白金耳接種し、３０℃、４日間、ロータリ
ーシェーカー（毎分２２０回転、５．１ｃｍストロー
ク）で培養を行い、種培養液とした。
【００４７】別に、可溶性澱粉５％、落花生粉末１％、
大豆粉末１％、コーンスティープリカー１％、ＣａＣＯ
3 ０．２％を含有する滅菌培地（ＮａＯＨによりｐＨ
６．９に調整）を、２００ｌ容ジャーファーメンターに
１２０ｌ注入し、これに上記の種培養液を接種して、通
気量１２０ｌ／分、回転数２００回転／分、３０℃で３
日間通気撹拌培養を行った。
大豆粉末１％、コーンスティープリカー１％、ＣａＣＯ
3 ０．２％を含有する滅菌培地（ＮａＯＨによりｐＨ
６．９に調整）を、２００ｌ容ジャーファーメンターに
１２０ｌ注入し、これに上記の種培養液を接種して、通
気量１２０ｌ／分、回転数２００回転／分、３０℃で３
日間通気撹拌培養を行った。
【００４８】
【（２）ＷＳ４４１８物質の分離精製】上記の培養方法
で得た培養ブロスを合し（４５０ｌ）、これをラジオラ
イト（商品名、濾過助剤）を用いて濾過した。濾液（４
００ｌ）をＤｏｗｅｘ １×２（商品名、米国Ｄｏｗ
ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）（Ｃｌタイプ、３４ｌ）のカ
ラムに付した後、カラムを水（９０ｌ）で洗滌し、次い
で０．２Ｍ ＮａＣｌ（１２０ｌ）で溶出した。溶出液
をダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製、６ｌ）のカ
ラムに吸着せしめ、カラムを水（１８ｌ）、そして３０
％水性メタノールで洗滌した後、５０％水性メタノール
（１８ｌ）で溶出した。溶出液を減圧濃縮、乾固せし
め、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（Ｓｉｌｉｃａ
ｇｅｌ６０、メルク社製、４ｌ）に付した。カラムを
イソプロピルアルコール（４ｌ）、９０％水性イソプロ
ピルアルコール（８ｌ）で洗滌した後、８５％水性イソ
プロピルアルコール（１２ｌ）を用いて活性物質をカラ
ムから溶出した。
で得た培養ブロスを合し（４５０ｌ）、これをラジオラ
イト（商品名、濾過助剤）を用いて濾過した。濾液（４
００ｌ）をＤｏｗｅｘ １×２（商品名、米国Ｄｏｗ
ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）（Ｃｌタイプ、３４ｌ）のカ
ラムに付した後、カラムを水（９０ｌ）で洗滌し、次い
で０．２Ｍ ＮａＣｌ（１２０ｌ）で溶出した。溶出液
をダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製、６ｌ）のカ
ラムに吸着せしめ、カラムを水（１８ｌ）、そして３０
％水性メタノールで洗滌した後、５０％水性メタノール
（１８ｌ）で溶出した。溶出液を減圧濃縮、乾固せし
め、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（Ｓｉｌｉｃａ
ｇｅｌ６０、メルク社製、４ｌ）に付した。カラムを
イソプロピルアルコール（４ｌ）、９０％水性イソプロ
ピルアルコール（８ｌ）で洗滌した後、８５％水性イソ
プロピルアルコール（１２ｌ）を用いて活性物質をカラ
ムから溶出した。
【００４９】活性フラクションを合し、水性溶液の容量
が３００ｍｌになるまで濃縮した。該溶液を、逆相シリ
カゲルカラムＯＤＳ ６０Ａ（商品名、山村化学研究
所）（タイプＩ−４０／６４、４ｌ）に付し、カラムを
水（１２ｌ）で洗滌し、そして５％水性メタノール（１
６ｌ）を用いて活性物質をカラムから溶出した。溶出液
を濃縮して水性溶液８０ mlを得、ｐＨを７．０に調整
し、そしてダイヤイオンＨＰ−２０ ＳＳ（三菱化成社
製、３００ｍｌ）のカラムに通した。カラムを水（１．
２ｌ）で洗滌し、そして５％水性メタノール（４００ｍ
ｌ）を用いて活性物質を溶出し、次いで、この溶出液を
濃縮、凍結乾燥することにより、精製されたＷＳ４４１
８物質の白色粉末６８２．６ｍｇを得た。
が３００ｍｌになるまで濃縮した。該溶液を、逆相シリ
カゲルカラムＯＤＳ ６０Ａ（商品名、山村化学研究
所）（タイプＩ−４０／６４、４ｌ）に付し、カラムを
水（１２ｌ）で洗滌し、そして５％水性メタノール（１
６ｌ）を用いて活性物質をカラムから溶出した。溶出液
を濃縮して水性溶液８０ mlを得、ｐＨを７．０に調整
し、そしてダイヤイオンＨＰ−２０ ＳＳ（三菱化成社
製、３００ｍｌ）のカラムに通した。カラムを水（１．
２ｌ）で洗滌し、そして５％水性メタノール（４００ｍ
ｌ）を用いて活性物質を溶出し、次いで、この溶出液を
濃縮、凍結乾燥することにより、精製されたＷＳ４４１
８物質の白色粉末６８２．６ｍｇを得た。
【００５０】
【（３）ＷＳ４４１８物質の理化学的性質】ＷＳ４４１
８物質の理化学的性質については、表３、４で明らかに
したところであるが、更にアミノ酸分析を行って次の結
果を得た。すなわちＷＳ４４１８物質（１ｍｇ）を、６
Ｎ ＨＣｌ（１ｍｌ）を用いて１１０℃、２０時間加水
分解した。反応混合物を蒸発乾固し、得られた加水分解
物をアミノ酸自動分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ ８３５ Ａ
ｕｔｏｍａｔｉｃ Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙ
ｓｅｒ）で分析して、次の結果を得た：Ｓｅｒ（１）及
びＶａｌ（１）。また更に上記した理化学的性質に基づ
き天然物の構造解析法を利用して、ＷＳ４４１８物質の
化学構造を一応下記の化１のような推定した。
８物質の理化学的性質については、表３、４で明らかに
したところであるが、更にアミノ酸分析を行って次の結
果を得た。すなわちＷＳ４４１８物質（１ｍｇ）を、６
Ｎ ＨＣｌ（１ｍｌ）を用いて１１０℃、２０時間加水
分解した。反応混合物を蒸発乾固し、得られた加水分解
物をアミノ酸自動分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ ８３５ Ａ
ｕｔｏｍａｔｉｃ Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙ
ｓｅｒ）で分析して、次の結果を得た：Ｓｅｒ（１）及
びＶａｌ（１）。また更に上記した理化学的性質に基づ
き天然物の構造解析法を利用して、ＷＳ４４１８物質の
化学構造を一応下記の化１のような推定した。
【００５１】
【化１】
【００５２】
【実施例２】 コラゲナーゼ阻害アッセイ
【００５３】
【（１）ヒトの皮膚線維芽細胞の調製】細胞は、通常の
健康な人の皮膚の移植片から得たものであるが、これ
は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（５０Ｕ／ｍ
ｌ）、ストレプトマイシン（５０Ｕ／ｍｌ）を添加した
ダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で、湿潤雰
囲気下（５％ＣＯ2−９５％空気）３７℃で生育せしめ
たものである。そこで該細胞は、トリプシン処理により
継代培養し、５〜１５代継代したものを使用した。
健康な人の皮膚の移植片から得たものであるが、これ
は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（５０Ｕ／ｍ
ｌ）、ストレプトマイシン（５０Ｕ／ｍｌ）を添加した
ダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で、湿潤雰
囲気下（５％ＣＯ2−９５％空気）３７℃で生育せしめ
たものである。そこで該細胞は、トリプシン処理により
継代培養し、５〜１５代継代したものを使用した。
【００５４】
【（２）コラゲナーゼの誘導】線維芽細胞（１．５×１
０6個）を７５ｃｍ2のプラスチックフラスコにシード
し、培養した。３日後、培地を除去し、細胞を２０ｍｌ
のＤＭＥＭで３回洗滌した後、ウシ血清アルブミン（３
ｍｇ／ｍｌ）とインターロイキン １β（Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ社、米国、１００Ｕ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ（１
１．２５ｍｌ）で３日間培養した。培養物を集め、１５
００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞断片を除去した
後、使用するまで−２０℃に保存した。使用に当って
は、培養上清ｌ ml をトリプシン（Ｓｉｇｍａ社、１０
０μｇ／ｍｌ）２００μｌで活性化した後、大豆トリプ
シンインヒビター（Ｓｉｇｍａ社、４００μｇ／ｍｌ）
２００μｌを加えた。
０6個）を７５ｃｍ2のプラスチックフラスコにシード
し、培養した。３日後、培地を除去し、細胞を２０ｍｌ
のＤＭＥＭで３回洗滌した後、ウシ血清アルブミン（３
ｍｇ／ｍｌ）とインターロイキン １β（Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ社、米国、１００Ｕ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ（１
１．２５ｍｌ）で３日間培養した。培養物を集め、１５
００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞断片を除去した
後、使用するまで−２０℃に保存した。使用に当って
は、培養上清ｌ ml をトリプシン（Ｓｉｇｍａ社、１０
０μｇ／ｍｌ）２００μｌで活性化した後、大豆トリプ
シンインヒビター（Ｓｉｇｍａ社、４００μｇ／ｍｌ）
２００μｌを加えた。
【００５５】
【（３）アッセイ】反応は、すべて、Ｕ型マイクロタイ
タープレート内で行った。０．４Ｍ ＮａＣｌと１０ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2を含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ７．５）を用いて、２５μｌのインヒ
ビターを連続的に希釈した。ＦＩＴＣ（フルオレセイン
イソチオシアナート）−コラーゲン（コラーゲン技術
研修会製、１ｍｇ／ｍｌ）溶液５０μｌ、及び、１０倍
に希釈したコラゲナーゼ（トリプシン−活性化線維芽細
胞上清）溶液２５μｌを加え、３７℃で２時間インキュ
ベートした。インキュベート後、５μｌの８０ｍＭｏ−
フェナントロリンを５μｌ加え、そして次に１時間イン
キュベートした。反応混合物に、エタノール７０μｌと
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー ３０μｌを加え、撹拌
し、そして３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上
清について、コラゲナーゼによって除去されたＦＩＴＣ
に由来する蛍光強度（励起 ４８５ｎｍ、放射 ５３８
ｎｍ）を測定し、テストサンプルの阻害％を計算し、下
記の表１４の結果を得た。
タープレート内で行った。０．４Ｍ ＮａＣｌと１０ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2を含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
バッファー（ｐＨ７．５）を用いて、２５μｌのインヒ
ビターを連続的に希釈した。ＦＩＴＣ（フルオレセイン
イソチオシアナート）−コラーゲン（コラーゲン技術
研修会製、１ｍｇ／ｍｌ）溶液５０μｌ、及び、１０倍
に希釈したコラゲナーゼ（トリプシン−活性化線維芽細
胞上清）溶液２５μｌを加え、３７℃で２時間インキュ
ベートした。インキュベート後、５μｌの８０ｍＭｏ−
フェナントロリンを５μｌ加え、そして次に１時間イン
キュベートした。反応混合物に、エタノール７０μｌと
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー ３０μｌを加え、撹拌
し、そして３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上
清について、コラゲナーゼによって除去されたＦＩＴＣ
に由来する蛍光強度（励起 ４８５ｎｍ、放射 ５３８
ｎｍ）を測定し、テストサンプルの阻害％を計算し、下
記の表１４の結果を得た。
【００５６】
【表１４】
【００５７】
【実施例３：注射剤の製造】 （１）実施例１で製造したＷＳ４４１８物質 ５ｇ （２）食塩 ９ｇ （３）炭酸水素ナトリウム １ｇ
【００５８】（１）〜（３）の全成分を蒸留水１０００
ｍｌに溶解した後、アンプルに１ｍｌずつ分注して、注
射剤１０００本を製造した。
ｍｌに溶解した後、アンプルに１ｍｌずつ分注して、注
射剤１０００本を製造した。
【００５９】
【発明の効果】本発明はＷＳ４４１８物質を提供するも
のであるが、この物質は従来未知の新規薬理活性物質で
あって、すぐれたコラゲナーゼ阻害作用を示し、医薬、
例えば慢性関節リウマチ、変形性関節炎等における骨破
壊の予防／治療薬等として、コラゲナーゼによる疾病の
予防／治療に有用である。
のであるが、この物質は従来未知の新規薬理活性物質で
あって、すぐれたコラゲナーゼ阻害作用を示し、医薬、
例えば慢性関節リウマチ、変形性関節炎等における骨破
壊の予防／治療薬等として、コラゲナーゼによる疾病の
予防／治療に有用である。
【００６０】また、本発明によって、微生物を利用する
上記物質の工業的製法も確立されただけでなく、上記物
質生産菌は従来未知の新菌種であるところから、微生物
学の研究の面のほか、新規生理活性物質の発見の面で
も、本発明は、バイオテクノロジーの技術分野でおおい
に期待されるものである。
上記物質の工業的製法も確立されただけでなく、上記物
質生産菌は従来未知の新菌種であるところから、微生物
学の研究の面のほか、新規生理活性物質の発見の面で
も、本発明は、バイオテクノロジーの技術分野でおおい
に期待されるものである。
【図１】ＷＳ４４１８物質の1Ｈ核磁気共鳴スペクトル
を示す図面である。
を示す図面である。
【図２】ＷＳ４４１８物質の13Ｃ核磁気共鳴スペクトル
を示す図面である。
を示す図面である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 1/02 Ｂ 2114−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 岡 本 正 則 茨城県つくば市並木 ３−22−６ (72)発明者 奥 原 正 国 茨城県つくば市梅園２−14−10
Claims (4)
- 【請求項１】 下記表１に示される物性を有することを
特徴とするＷＳ４４１８物質。 【表１】 - 【請求項２】 キタザトスポリア（Ｋｉｔａｓａｔｏｓ
ｐｏｒｉａ）属に属するＷＳ４４１８物質生産菌を培養
しＷＳ４４１８物質を生産せしめ、これを採取すること
を特徴とするＷＳ４４１８物質の製造方法。 - 【請求項３】 ＷＳ４４１８物質を有効成分とすること
を特徴とするコラゲナーゼ阻害剤。 - 【請求項４】 下記表２に示される菌学的性質を有する
新菌種キタザトスポリア・オワセネア（Ｋｉｔａｓａｔ
ｏｓｐｏｒｉａ ｏｗａｓｅｎｅａ）。 【表２】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3293784A JPH05105693A (ja) | 1991-10-15 | 1991-10-15 | Ｗｓ４４１８物質、その製法及び用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3293784A JPH05105693A (ja) | 1991-10-15 | 1991-10-15 | Ｗｓ４４１８物質、その製法及び用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05105693A true JPH05105693A (ja) | 1993-04-27 |
Family
ID=17799131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3293784A Pending JPH05105693A (ja) | 1991-10-15 | 1991-10-15 | Ｗｓ４４１８物質、その製法及び用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05105693A (ja) |
-
1991
- 1991-10-15 JP JP3293784A patent/JPH05105693A/ja active Pending
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