JPH0764872B2

JPH0764872B2 - Ｆｒ９０１２２８物質およびその製造法

Info

Publication number: JPH0764872B2
Application number: JP1186760A
Authority: JP
Inventors: 正國奥原; 俊男後藤; 康宏堀; 隆藤田; 博嗣上田; 伸治重松
Original assignee: 藤沢薬品工業株式会社
Priority date: 1988-07-26
Filing date: 1989-07-19
Publication date: 1995-07-12
Anticipated expiration: 2010-07-12
Also published as: NO893021D0; CA1335083C; EP0352646A3; FI893359A7; AU3829089A; GB8817743D0; FI893359A0; ATE94561T1; IL90949A0; ZA895121B; DE68909139T2; NO893021L; DE68909139D1; JPH0285296A; US4977138A; HU211514A9; DK366889A; CN1040054A; EP0352646A2; FI893359L

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、生物活性を有する新規化合物（以下FR9012
28物質という）に関する。より詳しくは、この発明は、
抗菌活性および抗腫瘍活性を有する生物学的に活性な新
規FR901228物質、その製造法およびそれを含有する医薬
組成物に関する。

この発明のFR901228物質は、クロモバクテリウム・ビオ
ラセウム（Chromobacterium violaceum）WB968のごと
き、クロモバクテリウム属に属するFR901228物質生産菌
を栄養培地中で培養することにより製造できる。

以下、この醗酵法を詳細に説明する。

（１）微生物 FR901228物質の製造に用いる微生物の詳細を以下に説明
する。

WB968株の分類学的研究：日本国山形県で採取された土壌試料からWB968株が単離
された。

この分類学的研究には、主として、バージーズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（第
１巻）に記載されている諸方法を採用した。

（ｉ）形態学的特徴 WB968株の形態観察は、栄養ブロスおよび寒天上、30℃
で20時間培養した細胞について、光学顕微鏡および電子
顕微鏡を用いて行った。

WB968株は、グラム陰性の運動性細菌であった。細胞の
形態は、桿菌で、大きさが約0.5〜0.6×1.2〜1.8μｍで
あった。

結果を第１表に示した。

（ii）生理学的特徴 WB968株の生理学的特徴を第２表にまとめた。成育温度
域は15℃〜40℃であった。

WB968株は、オキシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性であ
り、Ｏ−Ｆテストで醗酵性であった。カゼインは加水分
解されたが、エスクリン加水分解は陰性であった。グル
コース、フルクトースおよびトレハロースは醗酵した。
インドールテストは陰性であった。フォーゲル・ブロス
カウエルテストは陰性であった。β−ガラクトシダーゼ
テスト（ONPGテスト）も陰性であった。

（iii）同定バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バ
クテリオロジー（第１巻）に従い、上記諸特徴から、WB
968株を、クロモバクテリウム・ビオラセウムと同定し
た。

クロモバクテリウム・ビオラセウムWB968の培養物を、
ブダペスト条約ルートにより、1988年７月20日に、工業
技術院微生物工業技術研究所（日本国305茨城県つくば
市東１丁目１−３）に、寄託番号FERM BP-1968で寄託さ
れている。

これに関して、WB968株は、それの上記機関への寄託時
には、アエロモナス種（Aeromonas sp.）と同定されて
いたが、現在では前記のように同定されている。

（２）FR901228物質の生産この発明のFR901228物質は、クロモバクテリウムに属す
るFR901228物質生産性菌株（たとえば、クロモバクテリ
ウム・ビオラセウムWB968）を、同化性炭素源および同
化性窒素源を含有する栄養培地中で、好気的条件下に
（たとえば振盪培養、液内培養など）成育させるとき、
生産される。

栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコース、デンプ
ン、フルクトース、グリセリンなどの炭水化物である。

好ましい窒素源は、ブイヨン、酵母エキス、ペプトン、
グルテン・ミール、綿実粉、大豆粉、コーン・スティー
プ・リカー、乾燥酵母、麦芽など、ならびに、アンモニ
ウム塩（たとえば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、燐酸アンモニウムなど）、尿素、アミノ酸などの無
機および有機窒素化合物である。

炭素源および窒素源は、組合せて使用するのが有利であ
るが、微量の成長因子類および相当量の無機栄養素を含
有する、あまり純粋でない材料も使用に適しているの
で、それらを純粋な形で使用する必要はない。

所望するときは、培地に、炭酸ナトリウムまたはカルシ
ウム、燐酸ナトリウムまたはカリウム、塩化ナトリウム
またはカリウム、沃化ナトリウムまたはカリウム、マグ
ネシウム塩類、銅塩類、コバルト塩類などの無機塩類を
添加してもよい。

必要ならば、とくに培地が著しく泡立つときは、流動パ
ラフィン、脂肪油、植物油、鉱油、シリコーンなどの消
泡剤を添加してもよい。

他の生物活性物質の大量生産に好んで用いられる方法の
場合と同様に、FR901228物質の大量生産にも、好気的液
内培養条件が好ましい。

少量生産には、フラスコ中での振盪培養を採用する。

また、培養を大型タンク中で実施する場合には、FR9012
28物質生産プロセスでの成育遅延を避けるため、生産タ
ンクへの接種に該細菌の増殖型細胞を用いるのが好まし
い。従って、まず、相対的に少量の培地に該細菌の細胞
を接種し、該接種培地を培養して該細菌の増殖型細胞を
生産し、つぎに、これら培養増殖型細胞を大型タンクに
移すのが望ましい。増殖型細胞を生産する培地は、FR90
1228物質の生産に用いる培地と実質的に同じであっても
異なっていてもよい。

培養混合物の攪拌、通気は、種々の方法で達成できる。
攪拌は、プロペラ型などの機械的攪拌装置により、醗酵
槽の回転または振盪により、種々のポンプ装置により、
あるいは無菌空気を培地に通すことによりもたらしう
る。通気は、無菌空気を醗酵混合物に通すことにより実
施できる。

醗酵は、通常、約10℃〜40℃、好ましくは25℃精製法、
たとえばクロマトグラフィーあるいは適当な溶媒または
何種類かの溶媒の混合物からの再結晶によって、精製す
る。

FR901228物質の物理化学的性質上記の醗酵法に従って得られるFR901228物質は、次の物
理化学的性質をもつ。

外観：無色プリズム晶本質：中性物質融点:235〜245℃（分解）比旋光度：＋39゜（ｃ＝1.0,CHC1₃）分子式：C₂₄H₃₆N₄O₆S₂ 元素分析：C₂₄H₃₆N₄O₆S₂・CH₃CNとしての計算値:C,53.6
8;H,6.76;N,12.04;S,11.02（％）実測値:C,53.68;H,6.71;N,11.80;S,11.09（％）分子量:540,72 FAB-MS m/z 541.(M+H)⁺ 溶解性：可溶：クロロホルム、酢酸エチル〜35℃の間の温度で、醗酵条件および規模によっても変
りうるが、約15〜50時間にわたって実施する。

醗酵が完了るすると、培養液を、生物活性物質の回収お
よび精製に慣用的に使用される種々のプロセス、たとえ
ば適当な溶媒または何種かの溶媒の混合物による溶媒抽
出、クロマトグラフィーあるいは適当な溶媒または何種
かの溶媒の混合物からの再結晶に付して、FR901228物質
を回収する。

この発明によれば、一般に、FR901228物質は主として細
菌細胞内に見出される。しかし、濾液もFR901228物質を
含有する。従って、培養液全体を、たとえば、熱水、ア
セトン、酢酸エチルなどの適当な溶媒あるいはこれらの
溶媒の混合物を用いての抽出による、FR901228物質単離
プロセスに直接付すのが好ましい。

抽出液を常法により処理すると、FR901228物質が得られ
る。たとえば、抽出液を蒸発または蒸留によって少量に
なるまで濃縮し、得られる活性物質（すなわちFR901228
物質）含有残渣を、慣用的僅溶：メタノール、エタノー
ル不溶：水、ヘキサン呈色反応：陽性：硫酸セリウム反応、硫酸反応、沃素蒸気反応陰性：ニンヒドリン反応、塩化第二鉄反応、エールリッ
ヒ反応、モリッシュ反応薄層クロマトグラフィー：紫外吸収スペクトル：末端吸収（メタノール中）赤外吸収スペクトル：添付の図面の図１に示す通り、 ¹H核磁気共鳴スペクトル：添付の図面の図２に示す通り、［CDC1₃−CD₃OD（10:1）,400MHz］ δ:8.41（1H,s,交換可能）,8.25（1H,d, J＝4Hz,交換可能）,7.80（1H,d,J＝6.5Hz,交換可
能）,7.66（1H,d,J＝8Hz, 交換可能）,6.31（1H,q,J＝7Hz）,5.76 （1H,m）,5.70−5.63（2H,m）,4.69（1H,m）， 4.51（1H,m）,3.97（1H,dd,J＝６および 4Hz）,3.20−3.07（3H,m）,2.95（1H,m）， 2.83（1H,dd,J＝14および1.5Hz）,2.66 （1H,dd,J＝14および6Hz）,2.65−2.60 （2H,m）,2.37（1H,m）,2.22（1H,m）,1.7 2 （3H,d,J＝6.5Hz）,1.10（3H,d,J＝7Hz）， 1.08（3H,d,J＝7Hz）,1.00（3H,d, J＝6.5Hz）,0.97（3H,d,J＝7Hz）¹³ C核磁気共鳴スペクトル：添付の図面の図３に示す通り、（CDC1₃−CD₃OD（10:1）,100MHz） δ:172.34（ｓ）,171.43（ｓ）,169.17（ｓ）， 168.37（ｓ）,165.59（ｓ）,130.36（ｄ）， 129.64（ｄ）,129.62（ｓ）,129.04（ｄ）， 70.15（ｄ）,62.42（ｄ）,58.10（ｄ）,56.57 （ｄ）,37.75（ｔ）,37.56（ｔ）,34.46（ｔ）， 31.65（ｄ）,30.02（ｔ）,28.88（ｄ）,19.09 （ｑ）,18.96（ｑ）,18.29（ｑ）,18.03（ｑ）， 13.04（ｑ）アミノ酸分析： FR901228物質（4mg）を、封管中、6N塩酸（2ml）により
110℃で20時間加水分解した。反応混合物を自動アミノ
酸分析装置で分析した。FR901228物質のアミノ酸分析の
結果、バリンおよびアンモニアの存在が判明した（バリ
ンとアンモニアとの比は2:1）。

上記のデータを含めての物理化学的性質およびFR901228
物質から誘導した若干の誘導体の化学構造の解析から、
FR901228物質は次の化学式をもつことが証明される： FR901228物質から誘導された誘導体： FR901228物質から若干の誘導体を誘導した。

製造例１ FR901228物質から、FR123392物質およびFR125441物質を
誘導した。

FR901228物質（54mg）のメタノール（2ml）溶液に、1N
水酸化ナトリウム水溶液（200ml）を加えた。室温で12
時間攪拌後、塩酸を加えてpHを１に調整し、酢酸エチル
で抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過したの
ち、溶媒を蒸発させた。残渣をメタノールに溶解し、ト
リメチルシリルジアゾメタン（1ml）を加えた。５分後
に酢酸１滴を加え、溶媒を蒸発させた。残渣を分取薄層
クロマトグラフィー（0.5mm×２）で精製し、クロロホ
ルム中10％メタノールで展開して、FR123392物質（15m
g）およびFR125441物質（10mg）を得た。

FR123392物質：¹ H核磁気共鳴スペクトル：［CDC1₃−CD₃OD（10:1）,200MHz］ δ:0.98（12H,m）,1.75（3H,d,J＝7Hz）,2.0− 2.9（10H,m）,3.05（1H,dd,J＝４および 14Hz）,3.71（3H,s）,4.13（1H,d,J＝8Hz）， 4.37（2H,m）,4.57（1H,dd,J＝５および 10Hz）,5.6（2H,m）,6.64（1H,q,J＝7Hz）， 7.48（1H,d,J＝10Hz）赤外吸収スペクトル： FR125441物質：¹ H核磁気共鳴スペクトル：［CDC1₃−CD₃OD（10:1）,400MHz］ δ:0.95（12H,m）,1.76（3H,d,J＝7Hz）,2.20 （1H,m）,2.35（3H,m）,2.7（4H,m）,2.98 （1H,dd,J＝13および8Hz）,3.08（1H,dd, Ｊ＝13および4.5Hz）,3.72（3H,s）,4.14 1H,d,J＝6Hz）,4.35（1H,d,J＝7Hz）,4.43 （2H,m）,5.67（1H,dd,J＝６および15Hz）， 5.78（1H,dt,J＝15および6Hz）,6.70（1H,q,J＝7Hz） FAB-MS m/z 573 (M+H)⁺ 製造例２ FR125441物質から、FR123393物質を誘導した。

FR125441物質（10mg）のピリジン（0.8ml）溶液に、無
水酢酸（0.4ml）を加えた。室温で12時間攪拌後、溶媒
を蒸発させた。残渣を分取薄層クロマトグラフィー（0.
5mm×１）に付し、クロロホルム中５％メタノールで展
開して、FR123393物質（10mg）を得た。

FR123393物質：¹ H核磁気共鳴スペクトル：［CDC1₃−CD₃OD（10:1）,200MHz］ δ:1.0（12H,m）,1.75（3H,d,J＝7Hz）,2.05 （3H,s）,1.9−3.3（10H,m）,3.70（3H,s）， 4.20（1H,d,J＝8Hz）,4.34（1H,d,J＝7Hz）， 4.84（1H,m）,5.5（2H,m）,5.84（1H,dt, Ｊ＝15および7Hz）,6.65（1H,q,J＝7Hz）赤外吸収スペクトル：製造例３ FR901228物質から、FR123395物質を誘導した。

FR901228物質（54mg）のジオキサン（2ml）溶液に、ト
リフェニルホスフィン（55mg）を加えた。室温で72時間
攪拌後、溶媒を減圧下に除去した。残渣を分取薄層クロ
マトグラフィー（0.5mm×２）に付し、クロロホルム中
２％メタノールで展開して、FR123395物質（10mg）を得
た。

FR123395物質：¹ H核磁気共鳴スペクトル：［CDC1₃−CD₃OD（10:1）,200MHz］ δ:1.0（12H,m）,1.5（1H,m）,1.85（3H,d, Ｊ＝7Hz）,2.1−3.1（9H,m）,3.90（1H,d, Ｊ＝8Hz）,4.45（1H,d,J＝7Hz）,5.65−6.0 （4H,m）,6.24（1H,q,J＝7Hz）赤外吸収スペクトル： FR901228物質の生物学的性質 FR901228物質の生物活性を示す例として、若干の生物学
的データを以下に説明する。

試験例１ FR901228の抗菌活性 FR901228の抗菌活性を、サブロー培地中で寒天稀釈法に
よって求めた。

最小阻止濃度（MIC）を、25℃で48時間インキュベーシ
ョン後に、μg/mlで表わす。結果を第３表に示す。

第３表 FR901228物質の抗菌活性菌株 MIC(μg/ml) シゾサッカロマイセス・ポンベ 10(Schizosaccharomyces pombe) オーレオバシジウム・プルランス 10(Aureobasidium pullulans) IFO 4466 アスペルギルス・ニゲル 100(Aspergillus niger) 試験例２ FR901228物質によるインビトロでのヒト腫瘍細胞成育阻
害ウシ胎児血清10％、ペニシリン（50単位/ml）およびス
トレプトマイシン（50μg/ml）を追加したダルベッコの
最小必須培地100μｌ中の腫瘍細胞３×10³個を各ウエル
に含有するマイクロタイタープレートで細胞毒性試験を
行った。細胞を37℃で４日間インキュベートし、モスマ
ン（Mosmann:J.Immunol.Methods,65,55-63,1983）が記載
している方法に従って、比色MTT［３−（4,5−ジメチル
チアゾール−２−イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリ
ウム・ブロミド、シグマ社製］アッセイを行った。MTT
を燐酸緩衝溶液（PBS）に5mg/ml濃度に溶解し、濾過し
て滅菌するとともに少量の不溶残渣を除去した。ヒト腫
瘍細胞の培養終了後、このMTT溶液を全てのアッセイウ
エルに加え（培地100μｌ当り10μｌ）、プレートをさ
らに37℃で４時間インキュベートした。酸性イソプロパ
ノール（イソプロパノール中0.04N HC1 100μｌ）を全
てのウエルに加え、よく混ぜて、暗青色の結晶を溶解さ
せた。全部の結晶が溶解後、プレートを、550nm、参照
波長660nmで、２波長マイクロプレート光度計（MTP-22
型；日本国勝田市コロナ電気株式会社）にかけて読み取
った。この発明の目的化合物はメタノールに溶解し、ダ
ルベッコの最小必須培地で稀釈し、培養物に加えて最終
濃度を１μg/ml以下とした。結果を第４表に示す。

試験例３ P388マウス白血病に対するFR901228物質の抗腫瘍活性 FR901228物質の抗腫瘍活性を、マウス腫瘍系で測定し
た。P388白血病細胞（１×10⁶）を、BDF₁マウス（雌
性、８週令）の腹腔内に移植した。腫瘍細胞接種24時間
後に、FR901228物質をマウスに腹腔内投与した。もう３
日間毎日１回のFR901228物質の腹腔内投与を続けた。FR
901228物質は0.9％食塩水に懸濁させた。対照マウスに
は0.9％食塩水を腹腔内投与した。

結果を第５表に示す。抗腫瘍活性は、群の平均生残り時
間として、また平均生残り時間のT/C％（100×処置群対
照群）として表わした。

試験例４ FR901228物質の急性毒性 BDF₁マウスに腹腔内投与したときのFR901228物質の急性
毒性は、5.6mg/kgであった。

上記試験結果から、FR901228物質が生物活性を有するこ
とが認められる。

この発明の医薬組成物は、たとえば活性成分としてのFR
901228物質を、外用、経口または非経口適用に適した有
機または無機の担体または賦形剤との混合物として含有
する固体、半固体または液体形態の医薬製剤の形で使用
できる。該活性成分は、たとえば、錠剤、ペレット、カ
プセル、坐剤、液剤、乳濁液、懸濁液、その他の使用に
適した形態用の、通常の、無毒性で、医薬として許容し
うる担体と混ぜ合せることができる。更に、必要なら
ば、助剤、安定剤、増粘剤、着色剤および香料を使用し
てもよい。FR901228物質は、疾患の過程または状態に対
して所望の抗腫瘍効果を生じるのに十分な量を該医薬組
成物に含ませればよい。

該組成物をヒトに適用するには、静脈内、筋肉内または
経口投与によってこれを適用するのが好ましい。FR9012
28物質の治療上有効な用量は、処置すべき個々の患者の
年令および状態によっても相違し、それらに依存もする
が、通常、静脈内投与の場合には、ヒトの体重1kg当りF
R901228物質の１日量0.1〜100mg、筋肉内投与の場合に
は、ヒトの体重1kg当りFR901228物質の１日量0.1〜100m
g、経口投与の場合には、ヒトの体重1kg当りFR901228物
質の１日量0.1〜100mgを投与して腫瘍を処置する。

上記したFR901228物質から誘導した誘導体も抗腫瘍活性
を有する。

以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するために示
したものである。

実施例１醗酵グルコース（１％）およびブイヨン（１％）を含有する
培地（160ml）を、500ml三角フラスコの各々に注入し、
120℃で30分間滅菌した。クロモバクテリウム・ビオラ
セウムWB968の斜面培養物１白金耳を培地の各々に接種
し、回転振盪機上、30℃で24時間培養した。得られた培
養物を、グルコース（１％）、ブイヨン（１％）および
アデカノール（消泡剤、商標、旭電化工業製）（0.05
％）を含む培地（15l）を12本の30リットルジャーファ
ーメンターの各々に入れ、前もって120℃で30分間滅菌
したものに接種し、20l/分の通気、200rpmの攪拌のもと
に、30℃で24時間培養した。

単離および精製：培養終了後、各ジャーファーメンターを120℃で30分間
滅菌した。こうして得た培養液を珪藻土（10kg）を用い
て濾過した。濾液（150l）を酢酸エチル（150l）で２回
抽出した。抽出液を減圧下に蒸発させて、油状の残渣を
得た。この油状残渣をシリカゲル（キーゼルゲル60、70
〜230メッシュ、E.メルク社製）500gと混合し、この混
合物をメタノール中でスラリー化した。溶媒を蒸発後、
生じた乾燥粉末を、ｎ−ヘキサンを用いて充填した同じ
シリカゲル（0.5l）によるカラムクロマトグラフィーに
付した。カラムをｎ−ヘキサン（2l）、ｎ−ヘキサンと
酢酸エチルとの混合物（3:1v/v、3l;1:1v/v、3l;1:2v/
v、3l）および酢酸エチル（5l）で展開した。目的化合
物を含有する画分を集めて、減圧下に濃縮し、僅かに黄
色がかった粉末の形のFR901228物質を得た。この粉末
を、ジクロロメタンとメタノールとの混合物（10:1 v/
v、10ml）に溶解した。この溶液にアセトニトリル（20m
l）を加えた。これを室温に保持して、精製FR901228物
質（920mg）を無色の結晶として得た。

【図面の簡単な説明】

図１はFR901228物質の赤外吸収スペクトルを表わす。図２はFR901228物質の¹H核磁気共鳴スペクトルを表わ
す。図３はFR901228物質の¹³C核磁気共鳴スペクトルを表わ
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次式で表わされるFR901228物質：
【請求項２】FR901228物質を生産しうるクロモバクテリ
ウム属所属菌株を水性栄養培地中で好気性条件下に培養
し、FR901228物質を回収することを特徴とするFR901228
物質の製造法。
【請求項３】クロモバクテリウム属所属菌株がクロモバ
クテリウム・ビオラセウムWB968（FERM BP-1968）であ
ることを特徴とする請求項２）に記載の方法。
【請求項４】クロモバクテリウム・ビオラセウムWB968
（FERM BP-1968）の生物学的に純粋な菌株。
【請求項５】有効成分としてFR901228物質を含有する抗
腫瘍剤。