JPH05255366A - 新規血管新生阻害物質ｆｒ９０１４８４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
属に属するＷＢ１８５９株を培養して、酸性黄色粉末、
ＦＲ９０１４８４物質を製造する。 【効果】 この物質は、すぐれた血管新生阻害作用及び
抗腫瘍作用を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＦＲ９０１４８４物
質、その製法及び用途に関するものである。ＦＲ９０１
４８４物質は、微生物、特に細菌の培養物から分離採取
された従来未知の新規物質であり、すぐれた血管新生阻
害活性を示し、血管新生阻害剤及び制癌剤をはじめ各種
の医薬として有用である。

【０００２】

【従来の技術】生体内において血管が新生するのを抑制
ないし阻害することは、生理学的見地から非常に重要な
意義を有する。例えば、癌細胞またはその周辺細胞にお
ける血管の新生を阻害すれば、これらの細胞に対して酸
素や各種の栄養成分が運ばれなくなるため、結局死滅せ
ざるを得なくなり、間接的に癌細胞を征圧することとな
る。したがって、すぐれた血管新生阻害剤はすぐれた制
癌剤として大いに期待することができる。

【０００３】本発明に係る物質は、血管内皮細胞に対す
る管腔形成阻害を指標として血管新生阻害物質を発酵生
産物からスクリーニングする過程で発見された物質であ
って、従来全く未知の新規物質である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、安全性が高
くしかもきわめて有効な血管新生阻害剤ないし抗腫瘍剤
を開発する目的でなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記した目的
を達成するためになされたものである。

【０００６】そこで、本発明者らは、安全性の面から天
然物に着目し、微生物の醗酵生産物に注目するに至り、
各種微生物を探索した結果、宮崎県で採取した土壌サン
プルから新たに分離したＷＢ１８５９株が目的物質を生
成することを発見し、そして更にこの物質についてその
理化学的性質を詳細に研究したところ、従来未知の新規
物質であることを確認し、この物質を新たにＦＲ９０１
４８４物質と命名し、そして更に研究の結果、その工業
的製法を確立し、本発明を完成するに至った。

【０００７】本発明に係るＦＲ９０１４８４物質は、下
記表２、表３に示される理化学的性質を有する新規物質
である。

【０００８】

【表２】

【０００９】

【表３】

【００１０】本発明に係るＦＲ９０１４８４物質は、例
えば宮崎県で採取した土壌サンプルから新たに分離した
ＷＢ１８５９株によって生産される。以下にＷＢ１８５
９株の菌学的性質を示すが、分類学的研究は、主にＢｅ
ｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌｕｍｅ １）に
記載された方法に従った。

【００１１】（１）形態的特徴 本菌をニュートリエント寒天培地上において３０℃、２
４時間生育せしめた後、光学顕微鏡下で形態の観察を行
なった。その結果を下記の表４に示す。その結果から明
らかなように、本菌株は、グラム陰性、運動性の桿菌で
ある。細胞は、０．８−１．０×１．５−４．０μｍの
大きさである。本菌株は、ニュートリエント寒天培地上
で、黄色の色素を生産する。

【００１２】

【表４】

【００１３】（２）生理的特徴 本菌の生理的特徴を、下記の表５〜７に示した。その結
果から明らかなように、本菌の生育温度範囲は、８℃か
ら３５℃であった。オキシダーゼ、カタラーゼ、ウレア
ーゼは、陽性であった。ゼラチンの液化、カゼイン加水
分解、Ｔｗｅｅｎ８０加水分解、デンプンの加水分解は
陰性であった。本菌は、Ｄ−フラクトースから酸を産生
し、資化した。

【００１４】

【表５】

【００１５】

【表６】

【００１６】

【表７】

【００１７】（３）同定 以上の特徴をＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏ
ｌｕｍｅ １）より検索した結果、Ｎｏ．１８５９株
は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属す
るものと考えられ、本菌株を、シュードモナス エスピ
ー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｎｏ．１８５９
と同定し、これを通産省工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託した（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１２７３６
寄託日：１９９２年１月３１日）。

【００１８】ＦＲ９０１４８４物質の生産は、単に説明
を目的として挙げただけの本明細書記載の特定の微生物
の使用に限定されるものではないことを理解するべきで
ある。この発明は、記載の微生物からＸ線照射、紫外線
照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン、２−アミノプリン等の変異処理により取得できる
人工変異株並びに自然変異株を含めてＦＲ９０１４８４
物質を生産しうる全ての変異株の使用をも包含するもの
である。

【００１９】本発明に係るＦＲ９０１４８４物質は、細
菌に属する該物質生産菌（例えばＮｏ．１８５９株）を
資化しうる炭素及び窒素源を含む栄養培地中に接種し、
好気条件下で培養することにより（例えば、振とう培
養、通気撹拌培養等）、生産せしめることができる。

【００２０】炭素源としては、グルコース、シュークロ
ース、澱粉、変性澱粉、フラクトース、グリセリンその
他の炭水化物を使用するのが好ましい。

【００２１】窒素源としては、オートミール、酵母エキ
ス、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、綿実油粕、大
豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、
落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）尿素、アミノ酸
等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用することが
できる。

【００２２】これらの炭素源及び窒素源は、併用するの
が有利であるが、純粋なものを必らずしも使用する必要
はない。不純なものには生長因子や微量要素が含まれて
いる場合などもあり、有利な場合があるからである。

【００２３】必要ある場合には、例えば次のような無機
塩類を培地に添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリ
ウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。

【００２４】特に、培地が強く発泡するのであれば、必
要あるときに、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物
油、シリコン等を添加してもよい。

【００２５】目的物質を大量に工業生産するには、他の
発酵生産物の場合と同様に、通気撹拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。

【００２６】また、培養を大きなタンクで行う場合、Ｆ
Ｒ９０１４８４物質の生産工程において菌の生育遅延を
防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接
種培養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移して
そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に
使用する培地及び生産培養に使用する培地の組成は、両
者ともに同一であってもよいし必要あれば両者を変えて
もよい。

【００２７】培養は通気撹拌条件で行うのが好ましく、
例えばプロペラやその他機械による撹拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したも
のを用いる。

【００２８】培養温度は、ＦＲ９０１４８４物質生産菌
が本物質を生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は
１〜４０℃、好ましくは１８〜３２℃で培養するのがよ
い。培養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが
通常は約１日〜１週間である。

【００２９】発酵終了後、培養物から目的とするＦＲ９
０１４８４物質を回収する。すなわち、菌体は、直接水
及び／又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機械
的に又は超音波等既知の手段を用いて破壊した後、水及
び／又は有機溶媒で抽出した後、常法にしたがって回
収、精製する。培養液の場合は、直接、常法にしたがっ
て回収、精製すればよい。

【００３０】回収、精製方法としては、例えば、水、有
機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグ
ラフィー：単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が
適宜単独であるいは組合わせて使用できる。

【００３１】ＦＲ９０１４８４物質の回収、精製は上記
のような既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次の
ようにしてもよい。培養物をアセトン水で抽出し、さら
に酢酸エチルで抽出した後、クロマトグラフィーで精製
する。ＦＲ９０１４８４物質は酸性物質であり、塩基と
反応して塩を形成することができる。ＦＲ９０１４８４
物質は遊離の状態（ＦＲ９０１４８４物質自体）でも回
収、精製することができるし、またそれらの塩としても
回収、精製できる。また、これらは常法により相互に交
換することもできる。ＦＲ９０１４８４物質の塩基との
塩としてはナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金
属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土金
属塩などが挙げられる。

【００３２】本発明に係るＦＲ９０１４８４物質は、後
記するところからも明らかなように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
での血管内皮細胞の増殖阻害作用及びｉｎ ｖｉｖｏで
の鶏卵漿尿膜上での血管新生阻害作用を有することが確
認され、且つ低毒性で安全性が高いことも確認され、血
管新生阻害剤として非常に有効である。また、本発明に
係る物質は、マウス固形癌ＭｅｔｈＡの増殖抑制作用を
有することも確認され、血管新生阻害作用とも相まっ
て、抗腫瘍剤としても非常に有効である。

【００３３】したがって本発明に係る物質は、医薬の有
効成分として使用することができ、このような医薬も本
発明に包含されるものである。本発明に係る薬剤組成物
は、ＦＲ９０１４８４物質及び／又はその塩を有効成分
としてこれに常用される無機又は有機の担体を加えて、
固体、半固体又は液体の形で、経口投与剤のほか、外用
剤等の非経口投与剤に製剤化する。

【００３４】経口投与のための製剤としては、錠剤、丸
剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤、エリキシル
剤等が挙げられる。非経口投与のための製剤としては、
注射剤、点滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、
スプレー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。
本発明の有効成分を製剤化するには、常法にしたがえば
よく、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、
安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その他常用される佐薬
を適宜使用する。

【００３５】本発明に係る薬剤組成物の投与量は、その
種類、治療ないし予防対象疾病の種類、投与方法、患者
の年令、患者の症状、処理時間等によって相違するが、
静脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分（ＦＲ
９０１４８４または／およびその塩）を０．０１〜１０
００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ
投与し、筋肉投与の場合は同じく０．０１〜１０００ｍ
ｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与
し、経口投与の場合も同じく０．５〜２０００ｍｇ／ｋ
ｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内で投与
する。

【００３６】以下、本発明を実施例について更に詳しく
説明する。

【００３７】

【実施例１】

【００３８】［（１）ＦＲ９０１４８４の発酵生産］バ
クテリアＷＢ１８５９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７３６）
のスラント斜面培養物を、下記の表８に示した前培養培
地（１８０ｍｌ／５００ｍｌ 容コルベン）に一白金耳
ずつ接種し、３０℃で１日培養した。さらに、この培養
物を下記の表８に示した本培養培地１８Ｌを注入した３
０Ｌ容ジャーファメンター（通気量１ＶＶＭ，回転数２
００ｒｐｍ）５基にそれぞれ３６０ｍｌずつ植菌し２日
間、３０℃にて培養した。

【００３９】

【表８】

【００４０】［（２）ＦＲ９０１４８４の抽出、精製］

【００４１】（１）ブロスーアセトン抽出 培養液８０Ｌにアセトン１６０Ｌを加え時々撹拌し、５
時間放置した。その後、ラジオライト＃６００（昭和化
学工業）を１ｋｇ加えて濾過し、濾液２４０Ｌを得た。

【００４２】（２）酢酸エチル抽出 （１）で得られた濾液を減圧下で濃縮し、８０Ｌの濃縮
水溶液とした。この水溶液に６ＮＨＣｌを用いてｐＨを
２に調整後、４０Ｌの酢酸エチルで２回活性物質を抽出
した。得られたこの酢酸エチル抽出画分を減圧下で濃縮
し濃縮液２Ｌを得た。

【００４３】 （３）シリカゲルカラムクロマトクラフィー （２）で得られた濃縮液２Ｌを無水硫酸ナトリウムで脱
水した後、０．５ＬのＳＩＬＩＣＡＲ ＣＣ−４（Ｍａ
ｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ社製）にまぶした。これを、あら
かじめｎ−ヘキサンで調整しておいたＳＩＬＩＣＡＲ
ＣＣ−４カラム１．５Ｌに上層した（ｔｏｔａｌ ｃｏ
ｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ ２．ＯＬ）。かラムをｎ−ヘ
キサン：酢酸エチル（５：１）４Ｌにて洗浄後、活性画
分をｎ−ヘキサン：酢酸エチル（１：１）６Ｌにて溶出
した。この活性画分を集め、減圧下で濃縮乾固した。

【００４４】（４）ＯＤＳカラムクロマトグラフィー （３）で得られた活性画分を１０ｍｌのメタノールに溶
解し、あらかじめ８０％メタノールで調整しておいた３
２０ｍｌのＬｉｃｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８ゲル（４
０〜６３μｍ；Ｍｅｒｃｋ社製）にチャージした。８０
％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５
００ｍｌで洗浄後、活性画分を２Ｌの８５％メタノー
ル、０．１％ＴＦＡで溶出した。目的物質を含む画分を
集め、減圧下で濃縮乾固し、黄色粉末２００ｍｇを得
た。

【００４５】［実施例２：ＦＲ９０１４８４の生物化学
的性質］

【００４６】［（１）血管内皮細胞管腔形成阻害］下記
する〜にしたがってアッセイを行った。

【００４７】［ＴｙｐｅＩコラーゲン ゲル化］下記
の表９に示す組成でコラーゲンのゲル化を行った。すな
わち、該組成からなる混合溶液を５０μｌずつマイクロ
タイタープレート（９６穴）の各穴に分注し、３７℃で
２４時間インキュベーとすることにより、ゲル化を行っ
た。

【００４８】

【表９】

【００４９】［内皮細胞培養］サブコンフレントなウ
シ動脈血管内皮細胞を１．５×１０⁵／ｍｌとなるよう
に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）−ＭＥＭ培地で調整
し、これを１００μｌ（１．５×１０⁴／ｗｅｌｌ）ず
つでゲル化したマイクロタイタープレートに加え、さ
らに３〜５日３７℃で培養し細胞をコンフレントな状態
にする。

【００５０】［管腔形成］細胞がコンフレントになっ
たのち、培地をアスピレーターで吸引除去し、新しく
０．１％ウシ血清アルブミンを含むＭＥＭ培地をそれぞ
れの穴に１００μｌずつ分注する。マイクロタイタープ
レートの左１列目にはさらに１００μｌの培地を加えた
後、各濃度のサンプルを１０μｌ添加する。培地とサン
プルをよく撹拌後、１００μｌずつ２列目以降に撹拌希
釈していく（１／２希釈）。希釈後、塩基性繊維芽細胞
増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）を各穴あたり２５ｎｇ／ｍｌと
なるように添加し、３７℃で３日培養する。培養後細胞
は３次元的管腔を形成している。この管腔の形成阻害度
を顕微鏡観察により判定する。

【００５１】上記のアッセイ法によって本物質の管腔形
成阻害度を顕微鏡観察によって判定した結果、本物質の
管腔形成阻害のＩＣ₅₀は２．０μｇ／ｍｌであった。

【００５２】［（２）細胞毒性（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）］
ウシ血管内皮細胞およびマウス リンパ腫ＥＬ−４細胞
に対する細胞毒性ｉｎｖｉｔｒｏの測定はマイクロタイ
タープレートに予め各々の培地を加えて希釈した薬剤
に、各濃度の細胞をまき、ＣＯ₂インキュベーター中で
培養し、数日後、その増殖抑制を調べた。

【００５３】すなわち、ウシ血管内皮細胞は、ＭＥＭ培
地（１０％ＦＢＳ）を用い、７．５×１０³ ｃｅｌｌ
ｓ／ｗｅｌｌの細胞濃度で３日間培養する。また、ＥＬ
−４細胞はダルベッコ（Ｄｕｌ）培地（１０％ＦＢＳ）
を用い、１×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２日間培
養し、その抑制活性をＭＴＴ法（Ｔ．Ｍｏｓｍａｎ；
Ｊ．Ｊｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，６５，５５（１９
８３）により算出した。

【００５４】ＦＲ９０１４８４の細胞増殖抑制は、ウシ
血管内皮細胞に対してＩＣ₅₀：５．２ｘ１０-⁸Ｍ（２．
０ｘ１０-²μｇ／ｍｌ、ＥＬ−４に対してＩＣ₅₀：４．
２ｘ１０-⁷Ｍ（１．６ｘ１０-¹μｇ／ｍｌ）とそれぞれ
強い細胞増殖抑制を示した。また、顕微鏡観察による
と、その作用はｃｙｔｏｔｏｘｉｃでなく、ｃｙｔｏｓ
ｔａｔｉｃであった。

【００５５】［（３）ＣＡＭ ａｓｓａｙ（ｉｎ ｖｉ
ｖｏ）ｃｈｉｃｋ ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ
ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓｓａｙ］ 鶏受精卵漿尿膜（ＣＡＭ）による血管新生に対する本化
合物の抑制作用をＮ．Ｇ．Ｔａｎａｋａらの方法（Ｅｘ
ｐ．Ｐａｔｈｏｌ．３０，１４３，１９８６）に多少の
改良を加えて検討した。

【００５６】３日令の鶏受精卵の卵殻に約１ｃｍ四方の
小窓を開け、２日間培養後鶏胚漿尿膜上に、あらかじめ
ＦＲ９０１４８４をエチレンビニル酢酸（ＥＶＡ）ポリ
マー（８％）を含むジクロロメタンに溶解した後、乾燥
させ、ペレット状となったサンプルをのせた。さらに２
日間３７℃で培養させたのち、漿尿膜内へ脂肪乳剤を注
入し、ペレットのまわりの血管阻止ゾーンを顕微鏡下で
測定した。血管新生阻害活性は、試験された総検体あた
りの血管新生阻害作用が観察された検体の割合で示し
た。結果を図３に示した。（＋）はサンプル周辺の血管
新生が完全に抑制された検体の割合、また、（±）はサ
ンプル周辺の血管新生が中程度抑制された検体の割合を
示す。この結果から明らかなように、本物質は０．３〜
１００μｇ／ｅｇｇで有意に血管新生を抑制した。

【００５７】［（４）抗腫瘍活性］マウス繊維肉腫Ｍｅ
ｔｈ Ａに対するＦＲ９０１４８４の抗腫瘍活性の測定
は、マウスＢａｌｂ／ｃ（雌、８週令）の腹腔中で８日
間継代した ＭｅｔｈＡ細胞を、１ｘ１０⁵細胞ずつＢ
ａｌｂ／ｃマウスにｉｄ（皮内）移植し、１４日後に腫
瘍サイズを測定した。ＦＲ９０１４８４はｄａｙ１〜４
およびｄａｙ７〜１０に腹腔内（ｉｐ）へ０．２ｍｌず
つ、各濃度で投与し抗腫瘍効果を検討した。相対的抗腫
瘍重量はＮＣＩ（ＵＳＡ）のマニュアルによって測定し
た。

【００５８】得られた結果を図４に示した。その結果か
ら明らかなように、本物質は、０．３〜１０ｍｇ／ｋｇ
において対照に比べ、有意に６０％以上の抑制効果を有
することが確認された。

【００５９】

【（５）毒性試験】生後５週令のＩＣＲ系雌マウス５匹
に、ＦＲ９０１４８４物質を１００ｍｇ／ｋｇの投与量
で毎日１回、３日間連続腹腔内注射したが死亡例はな
く、体重増加も無投与マウス群と全く同じであり、ＦＲ
９０１４８４物質の安全性の高さが確認された。

【００６０】

【実施例３：注射剤の製造】 （１）実施例１で製造したＦＲ９０１４８４物質 ５ｇ （２）食 塩 ９ｇ （３）炭酸水素ナトリウム １ｇ

【００６１】（１）〜（３）の全成分を蒸留水１００ｍ
ｌに溶解した後、アンプルに１ｍｌずつ分注して、注射
剤１０００本を製造した。

【００６２】

【発明の効果】本発明は、ＦＲ９０１４８４物質を提供
するものであるが、この物質は従来未知の新規物質であ
って、すぐれた血管新生阻害作用及び抗腫瘍作用を有
し、各種の医薬品に利用することができる。また、本発
明によって、微生物を利用する上記物質の工業的製法も
確立された。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＲ９０１４８４物質の¹Ｈ核磁気共鳴スペク
トルを示すチャートである。

【図２】ＦＲ９０１４８４物質の¹³Ｃ核磁気共鳴スペク
トルを示すチャートである。

【図３】ＦＲ９０１４８４物質の血管新生阻害活性を示
した図面である。

【図４】ＦＲ９０１４８４物質の抗腫瘍活性を示した図
面であって、マウス固形癌ＭｅｔｈＡに対する本物質の
作用を図示したグラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記表１に示される物性を有することを
   特徴とするＦＲ９０１４８４物質。 【表１】
2. 【請求項２】 ＦＲ９０１４８４物質生産菌を培養して
   ＦＲ９０１４８４物質を生成せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とするＦＲ９０１４８４物質の製造方法。
3. 【請求項３】 ＦＲ９０１４８４物質生産菌がシュード
   モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物で
   あることを特徴とする請求項２の製造方法。
4. 【請求項４】 ＦＲ９０１４８４物質を有効成分とする
   血管新生阻害剤。
5. 【請求項５】 ＦＲ９０１４８４物質を有効成分とする
   抗腫瘍剤。