JPH0510949A - 新規なモノクローナル抗体固定粒状物、それを用いたメタンフエタミン測定用キツトおよび測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】メタンフェタミン測定用キット中にメタンフェ
タミンを使用しなくても、簡単かつ正確にメタンフェタ
ミンを検知できるメタンフェタミン測定用キットの提供
およびそのキットに使用する新規モノクローナル抗体の
開発。 【構成】 （Ａ）メタンフェタミンおよびＮ，Ｎ′−ジ
ベンジルエチレンジアミンの両者に対して特異的な免疫
反応を示すモノクローナル抗体を固定した粒子状物と、
（Ｂ）Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンと支持蛋
白質との複合体を固定した粒子状物とを含有するメタン
フェタミン測定用キットおよびその利用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、メタンフェタミンとＮ，Ｎ′−
ジベンジルエチレンジアミンの両者に対して、特異的に
認識するモノクローナル抗体、それを担体上に担持した
固定粒子状物、それを利用したメタンフェタミンの測定
用キットおよび測定方法に関する。

【０００２】

【従来技術】覚醒剤に関連する事件の増加に伴い、メタ
ンフェタミン（以下ＭＡと略称することがある）の使用
者を簡便、迅速かつ正確に認知する必要性が高まり、簡
便、高感度、高選択的にメタンフェタミンを測定する方
法および測定用キットが望まれている。特開平１−９６
１９８号公報には、動物に免疫して得られた細胞株を培
養することによって、覚醒剤であるメタンフェタミン
（ＭＡ）に対して非常に高い特異的な反応性を示すモノ
クローナル抗体を得ることが提案されている。そして、
現在、ＭＡだけを特異的に認識するモノクローナル抗体
を用いた測定システムには、ＥＬＩＳＡ法を基本にした
競合法によるものが商品化されている。しかし、この測
定システム法では製品の中にＭＡそのものを使用する必
要があり、日本の覚醒剤取締り法により、これらの製品
は製造、販売、使用が認められていないのが実情であ
る。

【０００３】

【目的】本発明の目的は、ＭＡに対するモノクローナル
抗体を誘導する時にＭＡ以外に日本の法律に抵触しない
特定物質を選択特異的に認識する新規なモノクローナル
抗体を用いた新しいタイプのＭＡ測定用キットおよび測
定法を提供する点にある。

【０００４】

【構成】本発明の第１は、メタンフェタミンおよびＮ，
Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンの両者に対して特異
的な免疫反応を示すモノクローナル抗体を粒子状担体上
に固定したことを特徴とするモノクローナル抗体固定粒
子状物に関する。本発明の第２は、 （Ａ）請求項１記載のモノクローナル抗体固定粒子状物
と （Ｂ）Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンと支持蛋
白質との複合体を粒子状担体上に固定したＮ，Ｎ′−ジ
ベンジルエチレンジアミン固定粒子状物とを含有するメ
タンフェタミン測定用キットに関する。 本発明の第３は、 （Ａ）請求項１記載のモノクローナル抗体固定粒子状物
と （Ｂ）Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンと支持蛋
白質との複合体を粒子状担体上に固定したＮ，Ｎ′−ジ
ベンジルエチレンジアミン固定粒子状物とを含有する懸
濁液と （Ｃ）尿もしくは唾液とを混合し、固定粒子状物の凝集
により尿もしくは唾液中のメタンフェタミンの存在を確
認することを特徴とするメタンフェタミンの測定法に関
する。 本発明の第４は、 （Ａ）請求項１記載のモノクローナル抗体固定粒子状物
と （Ｂ）Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンと支持蛋
白質との複合体を（Ａ）で用いる粒子状物とその粒径お
よび色彩を異にする粒子状担体上に固定したＮ，Ｎ′−
ジベンジルエチレンジアミン固定粒子状物とを含有する
懸濁液、 （Ｃ）尿もしくは唾液とを混合反応後、前記（Ａ）と
（Ｂ）のいずれか小さい方の粒子状物のみを濾過するサ
イズのフィルター上に注ぎ、フィルター上に残った粒子
状物の色によりメタンフェタミンの存否を検知すること
を特徴とするメタンフェタミンの測定法に関する。前記
粒子状担体としては、不活性な無機材料や有機材料で、
蛋白質が付着する性質をもち、粒径がコントロールでき
るものであれば、なんでも使用できる。なかでも、合成
樹脂が便利であり、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリメチルメタクリレート、スチレン系共
重体などを例示することができる。無機材料としては、
ガラス、シリカ等を例示することができ、他の有機材料
としては、セルローズ、ニトロセルローズなどを挙げる
ことができる。濾過による測定法にかぎらず、（Ａ）と
（Ｂ）の粒子状物は、それぞれ異った色彩、とくに区別
しやすい色彩をもつことが好ましく、そのためには、あ
らかじめ着色しておくこともできる。粒子状担体の大き
さは、径が約０．１〜１０μｍ程度のものが好ましい。
フィルターの材質としては、セルロース、ニトロセルロ
ース、ポリフッ化ビニリデン、ポリプロピレン、ポリエ
チレン等を挙げることができる。また、フィルターの孔
の径は０．１〜１μｍ程度のものが好ましい。本発明方
法において（Ａ）と（Ｂ）の粒子状物を懸濁させるのに
用いる媒体としては、ｐＨが６〜８のリン酸緩衝液、グ
リシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、生理食塩水等が挙げ
られる。

【０００５】〔モノクローナル抗体の製造プロセス〕 Ａ．免疫用抗原の調整 メタンフェタミン（ＭＡ）をアミノブチル化またはカル
ボキシメチル化してアミノブチル化またはカルボキシメ
チル化メタンフェタミンをつくり、これに任意の支持タ
ンパク質を結合させて複合体を得、これを免疫用抗原と
した。前記支持タンパク質としては、ウシ血清アルブミ
ン、卵白アルブミン、陣笠貝ヘモシアニン、サイログロ
ブリン、γ−グロブリン等を挙げることができる。ま
た、アミノブチル化もしくはカルボキシメチル化メタン
フェタミンと支持タンパク質を結合させる架橋剤として
は、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド、ジメチルホルム
アミド、マレインイミドベンゾイルオキシサクシンイミ
ド等が用いられる。 Ｂ．リンパ細胞の調整 前記免疫用抗原を哺乳動物（例えば、マウス、ラット
等）に１週間おきに３〜５回投与し、抗原に対する抗体
が充分生成しているのを確認後、その動物の血液リンパ
節、脾臓等からリンパ細胞を得る。この時、免疫賦活剤
としてアジュバンド（ミュウバン、結核死菌、核酸等を
含む）を抗原物質と共にエマルジョンとして動物に投与
することが好ましい。抗体の生成を確認する手段として
は、免疫した動物から静脈血を採取し、後述するII.
（３）のハイブリドーマの選択の項にあるＥＬＩＳＡ法
を用いることにより判定する手段があげられる。 Ｃ．細胞融合とハイブリドーマ株の選択 細胞融合に用いたミエローマ細胞としては、例えばマウ
ス由来のＰ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）、Ｓ
Ｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）、Ｐ３−ＮＳ１／１−
Ａｇ４．１（ＮＳ−１）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５
３（６５３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＭＰ
Ｃ−１１、ラット由来の２１０、ＲＣＹ３、ＡＧ１、
２、３（Ｙ３）、ヒト由来のＳＫＯ−００７、ＧＨ１５
００６ＴＧ−Ａ１２などを挙げることができる。細胞融
合は、前述したような免疫された動物のリンパ球とミエ
ローマ細胞を約２〜１０：１になるように混合し、これ
を遠心分離してリンパ球とミエローマ細胞の混合沈殿物
を得、これにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または
センダイウィルス（ＨＶＪ）を含む細胞培養用培地（Ｒ
ＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等）を加え、懸濁す
ることにより行うことができるが、操作上の点から、３
０％〜６０％のＰＥＧ（分子量１０００〜８０００）を
用いることが好ましい。ハイブリドーマ株の選択は、融
合後の細胞懸濁液を遠心して上清を除き、これにヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）と１０
％〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む細胞培養用
培地に再懸濁して、この懸濁液を培養用プレートに分注
することにより行うことができる。この操作により選択
されたハイブリドーマ細胞をさらにヒポキサンチン、ア
ミノプテリン（ＨＴ）と１０％〜２０％のウシ胎児血清
（ＦＣＳ）を含む細胞培養用培地で培養し、最終的には
１０％〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む細胞培
養用培地で培養する。この間、増殖したハイブリドーマ
細胞は培地上清中に抗体を産生するため、ＥＬＩＳＡ
（酵素免疫測定）法、ＲＩＡ（ラジオアイソトープ免疫
測定）法、プラーク測定法、凝集反応法等を用いて目的
の抗体の有無を調べることができるが、ＥＬＩＳＡ法を
用いることが望ましい。このＥＬＩＳＡ法は以下のよう
にして行なうことができる。Ａ．で調整した免疫用抗原
をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに固定化して、次にブ
ロッキング剤としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵
白アルブミン（ＯＶＡ）、陣笠貝ヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）、免疫グロブリン等の生体高分子タンパク質を各ウ
ェルに固定化する。これは次の操作中、ハイブリドーマ
細胞の産生した抗体がウェルに非特異的に吸着するのを
防ぐためである。一定時間静置した後、上清液を捨て洗
浄液（リン酸緩衝液と生理食塩水溶液の混合液、界面活
性剤を含む場合もある）で各ウェルを洗浄する。これ
に、ハイブリドーマ細胞培養上清液を添加し一定時間静
置する。同様に洗浄液で各ウェルを洗浄し、次に酵素標
識抗体、例えばマウスを用いた場合には抗マウスＩｇＧ
抗体にアルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、βガラクトシダーゼ等の酵素が結合したもの
を各ウェルに添加し、一定時間静置する。洗浄液で各ウ
ェルを洗浄し、次に、用いた酵素に各々対応した基質溶
液を添加し反応させる。培養上清液中に目的とする抗体
が存在していた場合、酵素反応により生じた基質の色の
変化を、肉眼かもしくはプレートリーダーにより確認す
ることができる。このようにして、抗体を産生している
ハイブリドーマ細胞を得ることができる。 Ｄ．ハイブリドーマ細胞のクローニング Ｃ．で確認されたウェル中には、遺伝的に異なるハイブ
リドーマ細胞の混合物である可能性があるため、クロー
ニング操作により単一な遺伝子からなるハイブリドーマ
細胞群を得る必要がある。この方法には限界希釈法、シ
ングルセルマニュピュレーション法、軟寒天上のコロニ
ーを一つずつ拾い上げる方法、ＦＡＣＳ法（Fluorecent
Activated Cell Sorter)が挙げられるが、特別な装置
を使わない点で、限界希釈法を用いることが望ましい。
この限界希釈法は以下のようにして行なうことができ
る。上記ハイブリドーマ細胞を２００個／ｍｌ、５０個
／ｍｌ、１０個／ｍｌとなるように０〜２０％ＦＣＳを
含む細胞培養用培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭ
ＥＭ等）で調整し、各々の調整液を９６ウェルプレート
上の３、４５、４８ウェルに０．１ｍｌずつ分注する。
このプレートをＣＯ₂インキュベータ中で培養し、一つ
のコロニーが一つのハイブリドーマ細胞由来であること
が確認されるようなウェルを選択する。これらのウェル
の上清液中に存在するモノクローナル抗体がＭＡを認識
するかどうかを、Ｃ．のＥＬＩＳＡ法により再検討す
る。このようにして、単一な遺伝子からなるハイブリド
ーマ細胞群が得られ、この細胞から産生された抗体はモ
ノクローナル抗体であるといえる。 Ｅ．モノクローナル抗体の調整 ＭＡに対するモノクローナル抗体の調整には、Ｄ．で得
たハイブリドーマ細胞をフラスコ内、もしくは腹腔内で
培養することにより行なうことができる。ハイブリドー
マ細胞のフラスコ内での培養は、０〜２０％のＦＣＳを
含む細胞培養用培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭ
ＥＭ等）を用いて行なう。この時、ハイブリドーマ細胞
を最大限増殖させ、その後遠心分離を行えば、分泌され
たモノクローナル抗体が上清中に得られる。ハイブリド
ーマ細胞の腹腔内での培養は、１〜１０×１０⁶個の細
胞を、プリスタン等の鉱物油を投与した動物の腹腔内に
注入する。この時用いる動物種は、ハイブリドーマ細胞
の作成に用いたミエローマ細胞が増殖し易いように、由
来となっているミエローマ細胞と同種、同系の動物を用
いることが望ましい。例えばマウスを用いた場合、この
操作により１〜２週間後から腹腔内にハイブリドーマ細
胞の増殖が認められ、それにともない腹腔内に腹水が蓄
積する。目的のモノクローナル抗体は腹水中に存在して
いるため腹腔より腹水を回収し、さらに、塩析、透析、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー等の操作によりモノクローナル抗体を分離精
製することができる。 Ｆ．ＤＢＥＤ−支持蛋白質複合体とその固定粒子状担体
の調整 （１） ＤＢＥＤ−支持蛋白質複合体の合成 ＤＢＥＤを実施例１の方法にそってアミノブチル化また
はカルボキシメチル化してアミノブチル化またはカルボ
キシメチル化ＤＢＥＤを合成する。ついで、これに任意
の支持蛋白質を結合させてＤＢＥＤ−支持蛋白質複合体
をえる。使用できる支持蛋白質としては、前記Ａで述べ
た支持蛋白質と同様なものが使用できる。 （２） ＤＢＥＤ−支持蛋白質複合体の担体への固定 （ａ）担体粒子への吸着による結合方法 ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメ
チルメタクリレート、スチレン等の合成樹脂は、物理的
に蛋白質を吸着するため、これらを材質とする直径０．
１〜１０μｍの粒子の表面上に前記ＤＢＥＤ−支持蛋白
質複合体やモノクローナル抗体を効率よく結合させるこ
とができる。この時の担体粒子は、一般に透明か、曇り
ガラス様であるが、青、黄、紫、赤等の着色を施してあ
るものもある。しかし、視認性に優れているという点で
着色を施してある担体の方が望ましい。また、この反応
は室温、１〜１０時間で終了するが、反応終了後グルタ
ールアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド、ジメチルホルムアミド、
マレイミドベンゾイルオキシサクシンイミド等の架橋剤
を用いることにより、複合体あるいはモノクローナル抗
体が粒子から剥離しないように、また複合体あるいはモ
ノクローナル抗体がより多く粒子に吸着するように調整
することもできる。 （ｂ）担体粒子への架橋による結合方法 前記合成樹脂製の担体粒子の表面上にカルボキシル基、
アミノ基が付与されている粒子を用いた場合、これらの
官能基を利用して、前記ＤＢＥＤ−支持蛋白質複合体や
モノクローナル抗体を前記架橋剤を用いて共有結合させ
ることができる。また担体粒子と複合体あるいはモノク
ローナル抗体との間に、ジアミノブタン、ジアミノヘキ
サン、５−アミノカプロン酸等のスペーサーを挿入する
ことにより、担体粒子と複合体あるいはモノクローナル
抗体との距離を任意に変化させることもできる。 （３）凝集法を用いたＭＡ測定実験 （１）や（２）で調整したＤＢＥＤ−支持蛋白質複合体
結合粒子と抗ＭＡ、ＤＢＥＤモノクローナル抗体結合粒
子とを０．００１〜０．１％の濃度、１０〜４０℃、３
０分〜８時間、前記した媒体中で反応させると、抗原抗
体反応により粒子上のＤＢＥＤと粒子上のモノクローナ
ル抗体が結合する。これにより、粒子同士のランダムな
凝集が肉眼でも観察される。反応容器としてはガラスや
プラスチック製のプレートあるいは試験管が使用できる
が、視認性に優れているという点で９６ウェルのＶ底あ
るいはＵ底プレートが望ましい。本法におけるＭＡの測
定原理を以下に示す。測定しようとするサンプル中にＭ
Ａが含まれていない場合（陰性）は、上記反応により粒
子同士の凝集が確認できるが、サンプル中にＭＡが含ま
れている場合（陽性）はこのＭＡがモノクローナル抗体
と結合してしまうため、モノクローナル抗体とＤＢＥＤ
の結合、すなわち粒子の凝集が阻害される。この阻害は
ＭＡの濃度の増加とともに大きくなるので、サンプル中
のＭＡ濃度が高ければ高いほど、粒子の凝集が観察でき
なくなる。 （４）フィルター法を用いたＭＡ測定実験 この方法は（３）で示した凝集法にフィルターを組み込
むことにより、さらに高感度にサンプル中のＭＡを測定
することを目的としている。例えば直径の大きな（１〜
１０μｍ）着色した粒子（大径粒子）にＤＢＥＤ−支持
蛋白質複合体を、一方直径の小さな（０．１〜０．５μ
ｍ）着色した粒子（大径の粒子とは色を変える小径粒
子）に抗ＭＡ、ＤＢＥＤモノクローナル抗体を、それぞ
れ（２）（ａ）（ｂ）の手法を用いて結合させる。これ
により調整されたＤＢＥＤ−支持蛋白質複合体結合粒子
と抗ＭＡ、ＤＢＥＤモノクローナル抗体結合粒子とを
０．００１〜０．１％の濃度、１０〜４０℃、５〜２０
分、前記した媒体中で反応させると、抗原抗体反応によ
り粒子上のＤＢＥＤと粒子上のモノクローナル抗体が結
合する。これにより、粒子同士の凝集が起こり、この反
応液を全量、底面にフィルターのある反応器に注ぎ、媒
体液を吸引により除く。この時フィルターのポアサイズ
を大径粒子と同じか、やや小さめにしておけば凝集した
粒子はフィルター上に留まり、大径粒子と小径粒子の中
間色が肉眼にて確認される。例えば青色の大径粒子と黄
色の小径粒子を用いれば、凝集した粒子同士が緑色にな
るのが観察できる。本法におけるＭＡの測定原理を以下
に示す。測定しようとするサンプル中にＭＡが含まれて
いない場合（陰性）は、上記反応により粒子同士の凝集
がおこり、フィルター上に色の変化として確認できる
が、サンプル中にＭＡが含まれている場合（陽性）はこ
のＭＡがモノクローナル抗体と結合してしまうため、モ
ノクローナル抗体とＤＢＥＤの結合、すなわち粒子の凝
集が阻害される。この状態の反応液をフィルターに注ぎ
媒体液を除くと、大径粒子のみがフィルターに留まり、
小径粒子はフィルターを透過する。従ってフィルター上
には大径粒子の色のみが確認されることになる。この阻
害はＭＡの濃度の増加とともに大きくなるので、サンプ
ル中のＭＡ濃度が高いほど、フィルター上の粒子の色は
大径粒子の色に近くなる。

【０００６】

【実施例】以下に、本発明の実施例を具体的に説明す
る。尚、これらの実施例は本発明を例示するためのもの
であって、本発明の範囲を限定するものではない。 実施例１ Ｉ．免疫用抗原の調整 １．アミノブチル化メタンフェタミンの調整 メタンフェタミン（ＭＡ）を適当なタンパク質に結合さ
せるために、例えばChengらの方法〔FEBS LETTERS 36,3
39(1973)〕に準じ、ＭＡにアミノ基の導入を行なった。
４００ｍｇのメタンフェタミン（ＭＡ）を４０ｍｌの脱
水したエタノールに溶解し、２．２７２ｇのＮ−（４−
ブロモブチル）フタルイミドと８５２ｍｇの炭酸ナトリ
ウムを添加して４日間還流した。次に０．５ｍｌの８５
％含水ヒドラジンを添加して２日間撹拌した。反応液に
１Ｎの塩酸を添加し酸性にした後、生じた沈殿物を濾過
により除いた。濾液を５０ｍｌのクロロホルムを用いて
３回抽出し、さらに水層を１Ｎの水酸化ナトリウムを用
いてｐＨを１０に調整後、５０ｍｌのクロロホルムを用
いて４回抽出した。クロロホルム層をあわせ、硫酸マグ
ネシウムで脱水し、クロロホルムを減圧留去した。この
ようにして、１．２７ｇのＮ−（４−アミノブチル）メ
タンフェタミンを得た。

【化１】 ２．カルボキシメチル化メタンフェタミンの調整 ＭＡを適当なタンパク質に結合させるために、例えばIn
ayamaらの方法〔Chem.Pharm. Bull 28,2779(1980)〕に
準じ、ＭＡにカルボキシル基の導入を行なった。以下の
反応は全て室温で行なった。６００ｍｇのメタンフェタ
ミン、８５２ｍｇの炭酸ナトリウム、１．５ｍｌのエチ
ルブロモ酢酸を４０ｍｌのエタノール中に溶解し、窒素
ガス充填下で５日間還流した。反応終了後、濾過により
沈殿物を除き、濾液を減圧濃縮した。次に、３０ｍｌの
５％の水酸化カリウム−メタノール溶液を添加し、窒素
ガス充填下で２日間撹拌した。反応終了後、反応液を２
Ｎの塩酸で酸性にし、約１ｍｌにまで減圧濃縮した。こ
れに５ｍｌの飽和塩化ナトリウム水溶液を添加し、２５
ｍｌのクロロホルムで５回抽出した。このクロロホルム
層を硫酸マグネシウムで脱水し、減圧濃縮した。このよ
うにして６９１．１ｍｇのＮ−カルボキシメチルメタン
フェタミンを得た。

【化２】 ３．免疫用抗原もしくは酵素免疫測定法（以下ＥＬＩＳ
Ａと略）に用いた抗原の調整は、上記のアミノブチル
化、もしくはカルボキシメチル化メタンフェタミンを用
いて行った。２５ｍｇのＮ−（４−アミノブチル）メタ
ンフェタミンを１ｍｌのＰＢＳ（１０ｍＭ−リン酸緩衝
液、１５０ｍＭ−塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に溶解
後、１Ｎの塩酸を用いてｐＨを６．５〜７．０に調整し
た。一方、５０ｍｇのＢＳＡを１ｍｌのＰＢＳに溶解
後、撹拌しながら上記溶液に滴下した。これに、２〜５
μｌの２５％グルタールアルデビトＰＢＳ溶液を添加
し、室温で９０分間撹拌した。次ぎに全溶液を４℃、２
４時間、ＰＢＳに対して透析した。これにより７０ｍｇ
のＮ−（４−アミノブチル）メタンフェタミン−ウシ血
清アルブミン−グルタールアルデヒド複合体（ＭＡ−Ａ
Ｂ−ＢＳＡ−ＧＡ）が得られた。または、２５ｍｇのＫ
ＬＨを１ｍｌの蒸留水に溶解し、０．５ｍｌのジメチル
ホルムアミドに溶かした１５ｍｇのＮ−（４−アミノブ
チル）メタンフェタミンを滴下し、撹拌した。これに１
ｍｌの蒸留水に溶かした５００ｍｇの１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤ
Ｃ）を添加し、室温で６時間撹拌した。全反応液を４
℃、２日間、蒸留水に対して透析してＥＤＣを除き、３
４ｍｇのＮ−（４−アミノブチル）メタンフェタミン−
陣笠貝ヘモシアニン（ＭＡ−ＡＢ−ＫＬＨ−ＥＤＣ）を
得た。また、同様の操作で、ＫＬＨの代わりに卵白アル
ブミン（ＯＶＡ）やＢＳＡを用いてＭＡ−ＡＢ−ＯＶＡ
−ＥＤＣ、ＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＥＤＣをそれぞれ得
た。更に、Ｎ−（４−アミノブチル）メタンフェタミン
の代わりにＮ−カルボキシメチルメタンフェタミンとＢ
ＳＡ、ＫＬＨを用いて、ＭＡ−ＣＭ−ＢＳＡ−ＥＤＣ、
ＭＡ−ＣＭ−ＫＬＨ−ＥＤＣをそれぞれ得た。 II．ＭＡに対するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ株の作製 （１）マウスへの抗原の投与と脾臓細胞の調整 Ｉ．で調製したメタンフェタミンと支持タンパク質との
複合体を、４匹のマウスに投与した。例えば、０．１ｍ
ｇのＭＡ−ＣＭ−ＫＬＨ−ＧＡを０．１ｍｌのＰＢＳに
溶かし０．１ｍｌのフロイント完全アジュバンドとよく
混合し、この乳化混合液０．２ｍｌをＢＡＬＢ／ｃ系、
♀、７週齢のマウス腹腔内に投与した。投与後の各々の
マウスから無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０組
織培養用培地中で洗浄し、余分な脂肪組織を除いた。次
に、新しいＲＰＭＩ１６４０培地に移してハサミで細断
後、ゴム栓を用いて脾臓内のリンパ細胞を押しだした。
浮遊しているリンパ細胞を遠心し（１，０００ｒｐｍ、
５分間、室温）集め、ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁
し、次の細胞融合に用いた。この操作により、マウス一
匹から約１×１０⁸個のリンパ細胞が得られた。 （２）細胞融合 約４×１０⁷個の対数増殖期にあるミエローマ細胞（６
５３株）と（１）で得られた約１×１０⁸個リンパ細胞
をＲＰＭＩ１６４０培地中で混合し、遠心後（１，００
０ｒｐｍ、５分間、室温）上清液を除いた。沈降したミ
エローマ細胞とリンパ細胞に、１ｍｌの５０％ポリエチ
レングリコール（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ社）−ＲＰＭＩ１６４０培地を１ｍｌ容ピペットを用
いて、３０秒間徐々に加えながら激しく振とうし混合し
た。次に、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を１分間かけ
て添加しながら激しく振とうし、更に、８ｍｌのＲＰＭ
Ｉ１６４０培地を３分間かけて添加し、遠心後、上清液
を除いた。３０ｍｌのＨＡＴ選択培地（１×１０^-4Ｍヒ
ポキサンチン、４×１０^-7Ｍアミノプテリン、１．６×
１０^-5Ｍチミジン、２０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ
１６４０培地）を添加し、細胞をよく懸濁した後、９６
ウェルの培養プレート３枚に分注した。すなわち、１ウ
ェルあたり約４．７×１０⁵個の細胞を分注し、ＣＯ₂イ
ンキュベータ（５％ＣＯ₂、９５％空気、３７℃、湿度
１００％）を用いて培養した。 （３）ハイブリドーマの選択 各ウェルに細胞が増殖しているかどうかを肉眼にて確認
し、更に、このウェルの上清液中にメタンフェタミンを
認識する抗体が存在しているかどうかを、次に示すＥＬ
ＩＳＡ法を用いて検討した。９６ウェルのＥＬＩＳＡ用
プレート（ポリスチレン製、ＩｍｍｕｎｏｌｏｎＤｙｎ
ａｔｅｃｈ社）に、Ｉ．で調整した０．１ｍｇのＭＡ−
ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡを１０ｍｌの５０ｍＭ炭酸緩衡液
（ｐＨ９．６）に溶解させ、各ウェルに０．１ｍｌずつ
分注し、４℃で一晩静置した。すなわち、１ウェルあた
り１μｇのＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡが存在しているこ
とになり、この操作によりウェルの内壁に吸着する。次
に、このプレートの各ウェルを洗浄用ＰＢＳ（ｐＨ７．
２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）を用いて４回洗
浄し、未吸着のＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡを除いた。更
に、各ウェルに０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを０．１ｍ
ｌずつ分注し、３７℃で１時間静置した。各ウェルを洗
浄用ＰＢＳで４回洗浄し、細胞の増殖が確認されたウェ
ルの上清液を０．１ｍｌ添加した。３７℃、２時間静置
した後、各ウェルを洗浄用ＰＢＳで４回洗浄し、マウス
免疫グロブリンに対する抗体溶液（アルカリフォスファ
ターゼ結合、Ｓｉｇｍａ社、０．５％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓに１／５００になるように希釈した）を０．１ｍｌ添
加し、３７℃、１時間静置した。各ウェルを洗浄用ＰＢ
Ｓで４回洗浄し、Ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム
・６Ｈ₂Ｏを１ｍｇ／ｍｌに調整した基質溶液を０．１
ｍｌずつ添加後、室温で３０分間静置した。陽性ウェル
はアルカリフォスファターゼの酵素活性により、Ｐ−ニ
トロフェニルリン酸ナトリウムが分解され、黄色発色を
呈する。各ウェルに５０μｌの３Ｍ ＮａＯＨを添加し
て反応を停止し、マイクロプレート用吸光度測定器を用
いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。次に、陽性ウェル
の上清液を、ＭＡを用いた競合阻害試験（先述の各ウェ
ルの上清と共に、１μｇ／ｍｌになるようにＭＡを添加
した）を行った。これらのＥＬＩＳＡ法により、抗体を
産生している５１個の陽性ウェルが得られた。 （４）ハイブリドーマのクローニング （３）で得られた５１個の陽性ウェル中のハイブリドー
マ細胞を、限界希釈法を用いてモノクローン化した。す
なわち、ハイブリドーマ細胞を２００個／ｍｌ、５０個
／ｍｌ、１０個／ｍｌとなるように２０％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し、各々の希釈液を９６ウ
ェルプレート上の３、４５、４８ウェルに０．１ｍｌず
つ分注した。このプレートをＣＯ₂インキュベータ中で
培養し、一つのコロニーが一つのハイブリドーマ細胞由
来であることが確認されるようなウェルを選択した。こ
れらのウェルの上清液中に存在する抗体（モノクローナ
ル抗体）がＭＡを認識するかどうかを、先述のＥＬＩＳ
Ａ法により再検討した。この操作により、ＭＡに対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が、
２４個得られた。 III．ＭＡの類似化合物に対する抗ＭＡモノクローナル
抗体の選択性の検討およびＭＡとＤＢＥＤの両者に特異
的免疫反応を示す請求項１のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ株（請求項２の選別）２４種のハイ
ブリドーマ細胞の産生する抗ＭＡモノクローナル抗体
が、ＭＡの構造類似化合物に対してどの様な反応性を有
するかについて、II．の（３）の工程で用いたＥＬＩＳ
Ａ法により検討した。すなわち、各ハイブリドーマの産
生するモノクローナル抗体を添加するときに、多段階に
希釈した類似化合物を添加し、プレート上のＭＡとモノ
クローナル抗体の抗原抗体反応に対して、この類似化合
物がどの程度、競合的に阻害反応を起すかを調べたもの
である。その結果、２４種のハイブリドーマ株から得ら
れるモノクローナル抗体のうちＭＡとＤＢＥＤのみに反
応する４Ｂ２株または２Ｈ３株で表わされるモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ株を選別した。表１
にＭＡに対する反応性を１００として、他の類似化合物
に対する反応性について各々示した。 表中 ＭＡは、メタンフェタミン ＤＢＥＤは、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン Ａは、アンフェタミン ＭＰＡは、メトキシフェナミン ＮＯＲ−ＥＰ（＋）は、ノルエフェドリン（＋） ＯＨ−ＭＡは、Ｐ−ヒドロキシメタンフェタミン ＯＨ−ＮＯＲＥＰは、Ｐ−ヒドロキシノルエフェドリン ＯＨ−ＥＰは、Ｐ−ヒドロキシエフェドリン ＯＨ−Ａは、Ｐ−ヒドロキシアンフェタミン ＭＥは、メチルエフェドリン ＮＯＲ−ＥＰ（−）は、ノルエフェドリン（−） ＥＰは、エフェドリン ＰＨＥは、フェンテルミン ＭＥＳは、メスカリン である。

【表１】

【表２】 IV．マウス腹腔内での請求項２のハイブリドーマ細胞の
培養と請求項１のモノクローナル抗体の精製 一週間前にプリスタン処理をしたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ
系、♀、６週齢）に、II．で得られたハイブリドーマ細
胞を腹腔内に１×１０⁷個注入した。１−２週間後、ハ
イブリドーマ細胞の増殖とともに、マウス腹部の肥大化
が確認され、シリンジを用いて腹腔中より腹水を採取し
た。この操作を１日おきに１−２週間程度行なうことに
より、一匹のマウスから１０−２０ｍｌの腹水が得られ
た。この腹水に飽和硫酸アンモニウム溶液を４０％にな
るように添加し、ＩｇＧを含むタンパク質画分を沈澱さ
せた。この沈澱物を遠心（１２，０００ｒｐｍ、４℃、
２０分間）により回収し、２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し
た。懸濁液をＰＢＳに対して一晩透析し、硫酸アンモニ
ウムを除いた。この状態で、７−８ｍｇのモノクローナ
ル抗体が得られ、ＭＡの判定、定量に十分使用できる
が、更にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換樹
脂、Ｇ−１５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘゲル濾過樹脂等を用
いて精製することもできる。 Ｖ．ポリスチレンビーズ凝集法を用いたＭＡ測定法 （１）ＤＢＥＤ支持蛋白質、もしくはモノクローナル抗
体のビーズへの結合 ａ，吸着法 例えば、ＤＢＥＤにアミノブチル基（ＡＢ）を導入し、
これにＢＳＡをグルタールアルデヒド（ＧＡ）を用いて
結合させた（ＤＢＥＤ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡ）。１ｍｇ
のＤＢＥＤ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡを５ｍｇの直径１．０
２μｍの青色ポリスチレンビーズ、２ｍｇのＥＤＣと２
ｍｌのＰＢＳ中で、室温、２時間反応させ、ＢＳＡがポ
リスチレンに非特異的に吸着し、更にＥＤＣによりＢＳ
Ａ同志が架橋されることを利用してＤＢＥＤをビーズ表
面に結合させた。遠心（１２，０００ｒｐｍ、４℃、５
分間）した後、ＰＢＳでビーズを２回洗浄してＥＤＣを
除き、最終的に１ｍｌのグリシン緩衡液（５０ｍＭグリ
シン、ｐＨ７．６）に懸濁し、４℃で保存した。この操
作により、０．５％のＤＢＥＤ結合青色ビーズ懸濁液が
１ｍｌ得られた。また、同様な手法により、１ｍｇの抗
ＭＡ、ＤＢＥＤモノクローナル抗体をＤＢＥＤ−ＡＢ−
ＢＳＡ−ＧＡの代わりに添加することにより、０．５％
のモノクローナル抗体結合青色ビーズが得られた。 ｂ，架橋法 表面にカルボキシル基の付与してあるポリスチレン製ビ
ーズ（直径０．８９９μｍ、黄色）を５ｍｇと、２ｍｇ
のＥＤＣ、３ｍｇのジアミノブタン（ＤＡＢ）を２ｍｌ
のＰＢＳ中で、室温、２時間反応させ、ビーズの表面上
のカルボキシル基とＤＡＢをＥＤＣを用いて架橋した。
遠心（１２，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）した後、Ｐ
ＢＳでビーズを２回洗浄してＥＤＣと未反応のＤＡＢを
除いた。次に、２ｍｇのＥＤＣと１ｍｇの前述したＤＢ
ＥＤ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡを２ｍｌのＰＢＳ中で、室
温、２時間反応させ、ＤＡＢとＢＳＡを結合させた。遠
心（１２，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）した後、ＰＢ
Ｓでビーズを２回洗浄してＥＤＣを除き、最終的に１ｍ
ｌのグリシン緩衡液に懸濁し、４℃で保存した。この操
作により、０．５％のＤＢＥＤ結合黄色ビーズ懸濁液が
１ｍｌ得られた。また、同様な操作により１ｍｇの抗Ｍ
Ａ，ＤＢＥＤモノクローナル抗体をＤＢＥＤ−ＡＢ−Ｂ
ＳＡ−ＧＡの代わりに添加することにより、０．５％の
モノクローナル抗体結合黄色ビーズ懸濁液が得られた。 （２）Ｖ底プレートを用いた凝集実験 （１）で調製した０．５％のＤＢＥＤ結合黄色ビーズ懸
濁液を４μｌ（最終濃度０．０２％）と０．５％抗Ｍ
Ａ、ＤＢＥＤモノクローナル抗体結合青色ビーズ懸濁液
を１．２μｌ（最終濃度０．００６％）とを、１００μ
ｌのグリシン緩衡液中で混合した。混合液を９６ウェル
Ｖ底プレート中に移し、室温で６時間反応させた。両方
のビーズは抗原抗体反応により凝集反応を起こし、Ｖ底
プレートの中央に緑色状のものが凝集するのを肉眼で確
認できた。この操作において、反応液中に多段階に希釈
したＭＡを添加し、モノクローナル抗体に対するビーズ
上のＤＢＥＤとの競合阻害実験を行なった。その結果、
５０ｎｇ／ｍｌ以上のＭＡ（５ｎｇ／ウェル）の添加に
よりビーズの凝集阻害が確認された。 （３）フィルターを用いた透過実験 （１）で示した操作と同様に、ＤＢＥＤを直径が１．０
２μｍで青色のビーズに、抗ＭＡ、ＤＢＥＤモノクロー
ナル抗体を直径が０．３２７μｍで黄色のビーズに各々
結合させた。次に、この０．５％のＤＢＥＤ結合青色ビ
ーズ懸濁液を０．４６μｌ（最終濃度０．００２３％）
と０．５％の抗ＭＡ，ＤＢＥＤモノクローナル抗体結合
黄色ビーズ懸濁液を１μｌ（最終濃度０．００５％）と
を、１００μｌのグリシン緩衡液中で混合した。室温で
１０分間の反応の後、全量を４８ウェルのＢＩＯ−ＤＯ
Ｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）上のＰＯＲＥ ＳＩＺＥが１μ
ｍのフィルターに注ぎ、緩衡液及び未反応のモノクロー
ナル抗体結合ビーズを除いた。その結果、フィルター上
に青色と黄色の混合色、すなわち緑色が確認された。こ
の操作において、反応液中に多段階に希釈したＭＡを添
加し、ビーズ上のモノクローナル抗体に対するビーズ上
のＤＢＥＤとの競合阻害実験を行なった。ＭＡが凝集反
応を十分阻害すれば、直径１μｍのＤＢＥＤ結合ビーズ
はフィルター上に留まるものの、ＭＡが結合したためＤ
ＢＥＤビーズとは結合できなかった遊離の直径０．３２
７μｍのモノクローナル抗体結合黄色ビーズはフィルタ
ーを通過する。従って、フィルター上にはＤＢＥＤ結合
ビーズの青色のみが確認されることになる。この実験で
は、５００ｎｇ／ｍｌ以上のＭＡ（５０ｎｇ／ウェル）
の添加によりビーズの凝集反応が阻害され、ＭＡ非存在
下での緑色と比較して色の変化（青色）が確認できた。

【０００７】

【効果】本発明は新規なモノクローナル抗体を利用する
ことにより、ＭＡ測定用キット中にＭＡを使用する必要
がないので、国内でも使用が可能であり、しかも簡単な
キットにより短時間で適確にＭＡを検知することができ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 メタンフェタミンおよびＮ，Ｎ′−ジベ
   ンジルエチレンジアミンの両者に対して特異的な免疫反
   応を示すモノクローナル抗体を粒子状担体上に固定した
   ことを特徴とするモノクローナル抗体固定粒子状物。
2. 【請求項２】 （Ａ）請求項１記載のモノクローナル抗
   体固定粒子状物と、 （Ｂ）Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンと支持蛋
   白質との複合体を粒子状担体上に固定したＮ，Ｎ′−ジ
   ベンジルエチレンジアミン固定粒子状物とを含有するメ
   タンフェタミン測定用キット。
3. 【請求項３】 （Ａ）請求項１記載のモノクローナル抗
   体固定粒子状物と （Ｂ）Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンと支持蛋
   白質との複合体を粒子状担体上に固定したＮ，Ｎ′−ジ
   ベンジルエチレンジアミン固定粒子状物とを含有する懸
   濁液、 （Ｃ）尿もしくは唾液とを混合し、固定粒子状物の凝集
   により尿もしくは唾液中のメタンフェタミンの存在を確
   認することを特徴とするメタンフェタミンの測定法。
4. 【請求項４】 （Ａ）請求項１記載のモノクローナル抗
   体固定粒子状物と （Ｂ）Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンと支持蛋
   白質との複合体を（Ａ）で用いる粒子状物とその粒径お
   よび色彩を異にする粒子状担体上に固定したＮ，Ｎ′−
   ジベンジルエチレンジアミン固定粒子状物とを含有する
   懸濁液、 （Ｃ）尿もしくは唾液とを混合反応後、前記（Ａ）と
   （Ｂ）のいずれが小さい方の粒子状物のみを濾過するサ
   イズのフィルター上に注ぎ、フイルター上に残った粒子
   状物の色によりメタンフェタミンの存否を検知すること
   を特徴とするメタンフェタミンの測定法。