JPH051097A - アンジオテンシンｉ変換酵素阻害ペンタぺプチドとそれを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 安価に入手でき、副作用が少ないアンジオテ
ンシンＩ変換酵素阻害ペプチド、およびその適切な製造
法を提供する。 【構成】 Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎの
構造を持つアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドで
あって、魚介類の内臓、筋肉の抽出液から分離、精製し
て製造し、また、Ｆｍｏｃ−イソロイシン、Ｆｍｏｃ−
アルギニン、Ｆｍｏｃ−プロリン、Ｆｍｏｃ−バリン、
Ｆｍｏｃ−グルタミンを用い、化学合成法により製造す
る。 【効果】 Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎは
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害能を持つので血圧を下
げる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アンジオテンシンＩ変
換酵素阻害ペプチドとその製造法に関する。より詳しく
は、本発明は、血圧を上昇させる働きのあるアンジオテ
ンシンIIをアンジオテンシンＩから変換する酵素である
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドとその製造法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】高血圧症は、最大血圧が１６０mmHg以上
か、最小血圧が９５mmHg以上または両者がそれ以上の状
態である。わが国では患者数が約２０００万人であると
いわれ、罹患率の高い疾病である。

【０００３】高血圧症は、脳出血、脳梗塞、クモ膜下出
血、狭心症、心筋梗塞、腎硬化症、腎不全、網膜静脈閉
塞症など広範囲の臓器にわたって、さまざまな合併症を
生じることが知られており、有効な治療薬が望まれてい
る。

【０００４】生体内において血圧を調節するメカニズム
の一つとして、昇圧系であるレニン・アンジオテンシン
系と、降圧系であるカリクレイン・キニン系がある。レ
ニン・アンジオテンシン系では、酵素レニンが腎臓の旁
糸球体細胞（Ｊ．Ｇ細胞）で生成され、血管でレニン基
質であるところのアンジオテシノーゲンに作用してアン
ジオテンシンＩを生成する。このアンジオテンシンＩを
アンジオテンシンIIに変換する酵素がアンジオテンシン
Ｉ変換酵素であり、生じたアンジオテンシンIIは細動脈
に作用して収縮を起こさせる。

【０００５】また、アンジオテンシンIIは副腎皮質にも
作用してアルドステロンの合成と分泌を促し、腎臓での
ナトリウムの再吸収を促進し、体液量を保持する働きも
ある。このようにして、アンジオテンシンIIによって血
圧が上昇する。

【０００６】一方、カリクレイン・キニン系では、蛋白
分解酵素であるカリクレインが、基質であるところのキ
ニノーゲンに作用してキニンを生じる。キニンは血管を
拡張させ、血圧を下げる働きを有するが、キニナーゼII
によって分解を受ける。キニナーゼIIはアンジオテンシ
ンＩ変換酵素と同一物質であることが知られている。

【０００７】以上のことから、アンジオテンシンＩ変換
酵素を阻害することによる高血圧の治療が考えられ、現
在までにカプトプリル、エナラプリル、アラセプリル、
デラプリル等が開発されている。また、カゼインやツエ
イン、ゼラチン、魚肉などに由来するペプチドも、アン
ジオテンシンＩ変換酵素を阻害する働きがあることが知
られている（特開昭５９−４４３２４号、特開昭６４−
５４９７号、特開平１−３１３４９８号）。

【０００８】しかし、カプトプリルは強力な血圧降下作
用を有するが、合成法で作られるので高価であり、安易
に入手することは難しい。その上、用量が不適当である
と腎機能障害や低血圧をもたらす。また、分子内に存在
するＳＨ基のため、発疹や味覚異常を引き起こすともい
われている。カゼインやツエイン、魚肉などに由来する
ペプチドは、天然物を原料とするものであり、製造工程
で多くの未利用物を生成し、その処理に莫大な費用がか
かるだけでなく、廃棄による環境汚染の心配がある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、安価に入手
でき、副作用が少なく、製造にともない新たに未利用物
を生成しないようなアンジオテンシンＩ変換酵素阻害
物、さらには、その適切な製造法を提供することを目的
とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために種々検討した結果、本発明を完成する
に至った。すなわち、本発明は、魚介類加工において副
生する魚介類内臓由来のＩｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｎの構造を持つアンジオテンシンＩ変換酵素阻
害ペプチドである。

【００１１】また、本発明は、上記アンジオテンシンＩ
変換酵素阻害ペプチドを、魚介類の内臓、筋肉より抽出
するか、さらには、Ｆｍｏｃ−イソロイシン、Ｆｍｏｃ
−アルギニン、Ｆｍｏｃ−プロリン、Ｆｍｏｃ−バリ
ン、Ｆｍｏｃ−グルタミンを用い固相合成して製造する
方法である。本ペプチドは、魚介類の内臓、筋肉から水
抽出、加熱した後、抽出したペプチド含有物を各種クロ
マトグラフィーの手法を用いて分離することにより得ら
れる。

【００１２】本ペプチドは、水抽出液中のペプチドを逆
相クロマト用充填剤Ｃ₁₈（シリカ担体にオクタデシル基
を結合させたもの）に吸着させ、水洗浄後、アセトニト
リル１５％液で溶出した画分を弱陽イオン交換体ＣＭ
（担体にカルボキシメチル基を結合させたもの）に吸着
させ、段階的溶出法で得た画分のうちアンジオテンシン
Ｉ変換酵素阻害画分をさらに、逆相ＨＰＬＣで分離し、
活性画分をさらに、ゲル濾過ＨＰＬＣで分離することに
より得られる。

【００１３】本発明で使用できる魚種は、カツオ、マグ
ロ、アジ、サバ、イワシ、サンマ、ブリ、タイ、ヒラ
メ、カレイ、スズキ、サケ、ニシン、イカ、タコ等の如
何なる魚種でも使用できる。内臓としては、胃、幽門
垂、腸、肝臓、精巣、卵巣、心臓等のいずれを使用して
もよい。また、魚介類の筋肉も使用することができる。

【００１４】また、本ペプチドは、Ｆｍｏｃ−イソロイ
シン、Ｆｍｏｃ−アルギニン、Ｆｍｏｃ−プロリン、Ｆ
ｍｏｃ−バリン、Ｆｍｏｃ−グルタミンを用いた固相合
成法のような化学合成法で製造することもできる。

【００１５】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例１ カツオの腸１０６．３ｇに４倍量の水を加え、ホモジナ
イザー（ニッセイＡＭ−１型）を用いて、氷冷下１０，
０００rpm で５分間ホモジナイズした。

【００１６】１２０℃で５分間オートクレーブで処理し
た後、４０，０００Ｇで４０分間４℃で遠心分離し、そ
の上清を濃縮後、Ｃ₁₈充填剤（ Waters 社 Bulk C₁₈
５５〜１０５μｍ）１００ｇを詰めた簡易カラムに吸着
させた。このカラムを蒸留水１４３５mlで洗浄後、アセ
トニトリル１５％溶液でペプチドを溶出した。この操作
で４．２ｇのペプチド画分を得た。

【００１７】本ペプチド画分は、１０ｍＭリン酸バッフ
ァー（ｐＨ６．０）で平衡化したアクセルＣＭ（ Water
s 社）７５ｇを詰めた簡易カラムに添加し、１０ｍＭリ
ン酸バッファー（ｐＨ６．０）７５０ml、（ｐＨ７．
０）７５０ml、（ｐＨ８．０）７５０ml、（ｐＨ９．
０）７５０mlで溶出した。このうちアンジオテンシンＩ
変換酵素阻害能の強いｐＨ８．０溶出画分をさらに精製
するため、逆相ＨＰＬＣで分離を行った。このＨＰＬＣ
条件は下記ＨＰＬＣ条件１に示した。

【００１８】ＨＰＬＣ条件１ カラム ＲＰ−１８（ｅ） １×２５cm メルク社 検 出 ＵＶ ２１０ｎｍ 流 速 ４ml／min 溶離液 Ａ： ０．０５％ ＴＦＡ Ｂ： ０．０５％ ＴＦＡ ５０％アセトニトリル Ａ１００％から８００min 後、Ａ５０％、Ｂ５０％にな
るような直線グラジエント

【００１９】上記条件１では、アンジオテンシンＩ変換
酵素阻害能を持つペプチドは、リテンションタイム１３
３分に溶出された。このペプチドをさらに精製するた
め、さらにＨＰＬＣで精製した。このときの条件を下記
ＨＰＬＣ条件２に示した。

【００２０】ＨＰＬＣ条件２ カラム ＲＰ−１８（ｅ） ４mm×２５cm メルク社 検 出 ＵＶ ２１０ｎｍ 流 速 １．０ml／min 溶離液 Ａ： ０．０５％ ＴＦＡ Ｂ： ０．０５％ ＴＦＡ ２５％アセトニトリル Ａ１００％から８００min 後、Ａ５０％、Ｂ５０％にな
るような直線グラジエント

【００２１】上記条件２では、リテンションタイム２６
２分（図１に示すチャートのピーク１）に強いアンジオ
テンシンＩ変換酵素阻害能が認められた。このピークを
さらに精製するため、下記ＨＰＬＣ条件３で分離を行っ
た。

【００２２】ＨＰＬＣ条件３ カラム アサヒパック ＧＳ−３２０ ７．５mm×５
０cm 旭化成工業株式会社 検 出 ＵＶ ２１０ｎｍ 流 速 １．０ml／min 溶離液 ５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液

【００２３】この条件では、アンジオテンシンＩ変換酵
素阻害能を持つペプチドは、リテンションタイム１６．
６分に溶出された（図２に示すチャート２のピーク
２）。本ピークをＨＰＬＣ条件３でさらにＨＰＬＣに供
し、シングルピークをリテンションタイム１６．６分に
得た。よってこのピークを AppliedBiosystem社の気相
プロテイン・シーケンサー（ Model-470A ) とオンライ
ンの高速液体クロマトグラフィーを用いてＥｄｍａｎ分
解反応を行い、各サイクルで得られるＰＴＨアミノ酸を
同定した。その結果、配列番号１（配列：Ｉｌｅ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ）の構造をもつことがわか
った。

【００２４】アンジオテンシンＩ変換酵素阻害の測定
は、カッシュマンらの方法〔バイオケミカル・ファーマ
コロジー２０巻、１６３７〜１６４８頁（１９７１）〕
を改良した丸山らの方法〔アグリカリチュアル・バイオ
ロジカル・ケミストリー４６巻、５号、１３９３〜１３
９４頁（１９８２）〕に従った。

【００２５】すなわち、試験管に本発明のペプチド水溶
液３０μｌと、酵素基質としてＬ−ヒプリルヒスチジル
ロイシン（シグマ製）とＮａＣｌを含有したｐＨ８．３
のホウ酸バッファー２５０mlを加え、３７℃で１０分間
プレインキュベーションした。その後、アンジオテンシ
ンＩ変換酵素含有液１００μｌを加え、酵素反応を開始
した。この時、ホウ酸バッファーの濃度は０．１Ｍ、Ｌ
−ヒプリルヒスチジルロイシン濃度は５ｍＭ、ＮａＣｌ
３００ｍＭであり、阻害がかからない場合の酵素活性
は８ｍＵである。３７℃、ｐＨ８．３で３０分間振動し
つつ反応せしめた後、１Ｎ ＨＣｌ ２５０mlを加え、
反応を停止させた。酢酸エチル１．５mlを加え、１５秒
間振盪させて酵素反応で生じた馬尿酸を抽出し、２００
０rpm 、１０分間遠心分離して、酢酸エチル層１．０ml
を試験管に採取した。酢酸エチルをホットドライバスの
中で１２０℃、３０分間加温して完全に除去した後、室
温で５分間放置した。そして、Ｈ₂ Ｏ １．０mlを加
え、生成した馬尿酸の量を２２８ｎｍの吸光度を測定し
て求めた。酵素反応に使用したアンジオテンシンＩ変換
酵素含有液は、ラビットアセトンパウダー（シグマ製）
１ｇを０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）１０ml
に溶かし、よく攪拌した後、４℃、４００００Ｇで４０
分間遠心分離した上清を０．１Ｍホウ酸バッファーで希
釈して作成した。

【００２６】阻害率は下記の式を使用して求めた。 Ａ：蒸留水添加時の吸光度 （２２８ｎｍ） Ｂ：阻害剤添加時の吸光度 （２２８ｎｍ） この方法で上記ペプチドは、タンパク質１．０μｇ当り
アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を４７％阻害した。

【００２７】実施例２ 本発明のペプチドは、Ｆｍｏｃ−（９−フルオレニルメ
チルオキシカルボニル）アミノ酸（Ｆｍｏｃ−イソロイ
シン、Ｆｍｏｃ−アルギニン、Ｆｍｏｃ−プロリン、Ｆ
ｍｏｃ−バリン、Ｆｍｏｃ−グルタミン）を用いる固相
合成法で合成した。このペプチドは、ＹＭＣ−ＯＤＳ−
Ｒ５カラム（株式会社ワイエムシイ製）で、０．１％Ｔ
ＦＡ（トリフルオロ酢酸）水溶液のイニシャル液から
０．１％ＴＦＡの７０％アセトニトリル溶液をファイナ
ル液とする２５分の直線グラジエントで分析（流速１．
０ml／min 、検出ＵＶ２１０ｎｍ）した結果、９８％の
純度を示した。この物質を用いてアンジオテンシンＩ変
換酵素阻害能を測定した結果、カツオの腸から抽出した
ものと同じ値になった。

【００２８】

【発明の効果】本発明によれば、従来廃棄されていた魚
介類内臓から、血圧上昇を抑える作用を有するアンジオ
テンシンＩ変換酵素阻害ペプチドが得られる。

【配列表】

【００２９】配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状（ linear ) 配列の種類：ペプチド( peptide ) 起 源 生物名：カツオナス ペラミス （ Katsuwonas pelami
s ) 配 列 Ile Arg Pro Val Gln 1

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において、アンジオテンシンＩ変換酵
素阻害能の強い画分をＨＰＬＣ条件２で分離したチャー
トを示す。

【図２】図１のピーク１をさらにＨＰＬＣ条件３で分離
したチャートを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌ
   ｎの構造を持つアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチ
   ド。ただし、Ｉｌｅはイソロイシン、Ａｒｇはアルギニ
   ン、Ｐｒｏはプロリン、Ｖａｌはバリン、Ｇｌｎはグル
   タミン残基を示す。
2. 【請求項２】 魚介類の内臓、筋肉より、溶媒を用いて
   抽出して得られる抽出液を分離、精製することを特徴と
   するＩｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎの構造を
   持つアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドを製造す
   る方法。
3. 【請求項３】 Ｆｍｏｃ−イソロイシン、Ｆｍｏｃ−ア
   ルギニン、Ｆｍｏｃ−プロリン、Ｆｍｏｃ−バリン、Ｆ
   ｍｏｃ−グルタミンを用いて固相合成することを特徴と
   するＩｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎの構造を
   持つアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドの製造
   法。