JPH07313185A - ぺプチドの製造方法 - Google Patents
ぺプチドの製造方法Info
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- JPH07313185A JPH07313185A JP4242554A JP24255492A JPH07313185A JP H07313185 A JPH07313185 A JP H07313185A JP 4242554 A JP4242554 A JP 4242554A JP 24255492 A JP24255492 A JP 24255492A JP H07313185 A JPH07313185 A JP H07313185A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 高血圧を抑制するために、レニン・アンジオ
テンシン系で昇圧作用を有するアンジオテンシンＩ変換
酵素を阻害するペプチドを開発する。 【構成】 魚類を自己消化させ、クロマト分離を行うこ
とにより、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの構造を有するペプ
チド、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏの構造を有するペプチド
およびＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの構造を有するペプチド
を精製した。これらのペプチドは、高いアンジオテンシ
ンＩ変換酵素阻害作用を示した。 【効果】 容易な方法で天然物由来の血圧低下ペプチド
を提供できる。
テンシン系で昇圧作用を有するアンジオテンシンＩ変換
酵素を阻害するペプチドを開発する。 【構成】 魚類を自己消化させ、クロマト分離を行うこ
とにより、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの構造を有するペプ
チド、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏの構造を有するペプチド
およびＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの構造を有するペプチド
を精製した。これらのペプチドは、高いアンジオテンシ
ンＩ変換酵素阻害作用を示した。 【効果】 容易な方法で天然物由来の血圧低下ペプチド
を提供できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アンジオテンシンＩ変
換酵素阻害ペプチドの製造法に関する。より詳しくは、
血圧を上昇させる働きのあるアンジオテンシンＩＩをア
ンジオテンシンＩから変換する酵素であるアンジオテン
シンＩ変換酵素の阻害ペプチドに関する。
換酵素阻害ペプチドの製造法に関する。より詳しくは、
血圧を上昇させる働きのあるアンジオテンシンＩＩをア
ンジオテンシンＩから変換する酵素であるアンジオテン
シンＩ変換酵素の阻害ペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】高血圧症は、最高血圧が１６０ｍｍＨｇ
以上か、最少血圧が９５ｍｍＨｇ以上または両者がそれ
以上の状態である。わが国では患者数が約２０００万人
であるといわれ、り患率の高い疾病である。高血圧症
は、脳出血、脳梗塞、クモ膜下出血、狭心症、心筋梗
塞、腎硬化症、腎不全、網膜静脈閉塞症など広範囲の臓
器にわたってさまざまな合併症を生じることが知られて
おり、有効な治療薬が望まれている。
以上か、最少血圧が９５ｍｍＨｇ以上または両者がそれ
以上の状態である。わが国では患者数が約２０００万人
であるといわれ、り患率の高い疾病である。高血圧症
は、脳出血、脳梗塞、クモ膜下出血、狭心症、心筋梗
塞、腎硬化症、腎不全、網膜静脈閉塞症など広範囲の臓
器にわたってさまざまな合併症を生じることが知られて
おり、有効な治療薬が望まれている。
【０００３】生体内において血圧を調節するメカニズム
の一つとして、昇圧系であるレニン・アンジオテンシン
系と、降圧系であるカリクレイン・キニン系がある。レ
ニン・アンジオテンシン系では酵素レニンが腎臓の旁糸
球体細胞（Ｊ．Ｇ細胞）で生成され、血管でレニン基質
であるところのアンジオテンシノーゲンに作用してアン
ジオテンシンＩを生成する。このアンジオテンシンＩを
アンジオテンシンＩＩに変換する酵素がアンジオテンシ
ンＩ変換酵素であり、生じたアンジオテンシンＩＩは細
動脈に作用して収縮を起こさせる。
の一つとして、昇圧系であるレニン・アンジオテンシン
系と、降圧系であるカリクレイン・キニン系がある。レ
ニン・アンジオテンシン系では酵素レニンが腎臓の旁糸
球体細胞（Ｊ．Ｇ細胞）で生成され、血管でレニン基質
であるところのアンジオテンシノーゲンに作用してアン
ジオテンシンＩを生成する。このアンジオテンシンＩを
アンジオテンシンＩＩに変換する酵素がアンジオテンシ
ンＩ変換酵素であり、生じたアンジオテンシンＩＩは細
動脈に作用して収縮を起こさせる。
【０００４】また、アンジオテンシンＩＩは副腎皮質に
も作用してアルドステロンの合成と分泌を促し、腎臓で
のナトリウムの再吸収を促進し、体液量を保持する働き
もある。このようにしてアンジオテンシンＩＩによって
血圧が上昇する。一方、カリクレイン・キニン系では、
蛋白分解酵素であるカリクレインが、基質であるところ
のキニノーゲンに作用してキニンを生じる。キニンは血
管を拡張させ、血圧を下げる働きを有するが、キニナー
ゼＩＩによって分解を受ける。キニナーゼＩＩはアンジ
オテンシンＩ変換酵素と同一物質であることが知られて
いる。
も作用してアルドステロンの合成と分泌を促し、腎臓で
のナトリウムの再吸収を促進し、体液量を保持する働き
もある。このようにしてアンジオテンシンＩＩによって
血圧が上昇する。一方、カリクレイン・キニン系では、
蛋白分解酵素であるカリクレインが、基質であるところ
のキニノーゲンに作用してキニンを生じる。キニンは血
管を拡張させ、血圧を下げる働きを有するが、キニナー
ゼＩＩによって分解を受ける。キニナーゼＩＩはアンジ
オテンシンＩ変換酵素と同一物質であることが知られて
いる。
【０００５】以上のことから、アンジオテンシンＩ変換
酵素を阻害することによる高血圧の治療が考えられ、現
在までにカプトプリル、エナラプリル、アラセプリル、
デラプリル等が開発されている。しかし、カプトプリル
は強力な血圧降下作用を有するが、高価であり、安易に
入手することは難しい。その上、用量が不適当であると
腎機能障害や低血圧をもたらす。また、分子内に存在す
るＳＨ基のため、発疹や、味覚異常を引き起こすともい
われている。
酵素を阻害することによる高血圧の治療が考えられ、現
在までにカプトプリル、エナラプリル、アラセプリル、
デラプリル等が開発されている。しかし、カプトプリル
は強力な血圧降下作用を有するが、高価であり、安易に
入手することは難しい。その上、用量が不適当であると
腎機能障害や低血圧をもたらす。また、分子内に存在す
るＳＨ基のため、発疹や、味覚異常を引き起こすともい
われている。
【０００６】一方、食品タンパク質に由来するペプチド
も、アンジオテンシンＩ変換酵素を阻害する働きがある
ことが知られている。例えば、トウモロコシゼインのサ
ーモライシンによる加水分解物からＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｐ
ｒｏの構造をもつペプチドが（Ｍｉｙｏｓｉら、Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第５５巻、第５号、１３１
３〜１３１８頁（１９９１））、また、カツオブシのサ
ーモライシン分解物からＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏの構造
を有するペプチドが（特開平４−６９３９６号公報）分
離されている。しかし、これらのペプチドは食品タンパ
ク質の酵素による加水分解により得られたものであるた
め、製造に高価な蛋白分解酵素を添加する必要がある。
また、ヒトκ−カゼインのアミノ酸配列を含む合成ペプ
チドＶａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏにも強いアンジオテンシン
Ｉ変換酵素阻害作用のあることが報告されている（Ｋｏ
ｈｍｕｒａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第５
４巻、第３号、８３５〜８３６頁（１９９０））。しか
し、合成ペプチドは、多数の試薬類を用いて合成される
ため、人体に投与する前にこれら残留試薬を除去する必
要があり、ペプチドの精製に多大の労力を必要とする。
も、アンジオテンシンＩ変換酵素を阻害する働きがある
ことが知られている。例えば、トウモロコシゼインのサ
ーモライシンによる加水分解物からＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｐ
ｒｏの構造をもつペプチドが（Ｍｉｙｏｓｉら、Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第５５巻、第５号、１３１
３〜１３１８頁（１９９１））、また、カツオブシのサ
ーモライシン分解物からＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏの構造
を有するペプチドが（特開平４−６９３９６号公報）分
離されている。しかし、これらのペプチドは食品タンパ
ク質の酵素による加水分解により得られたものであるた
め、製造に高価な蛋白分解酵素を添加する必要がある。
また、ヒトκ−カゼインのアミノ酸配列を含む合成ペプ
チドＶａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏにも強いアンジオテンシン
Ｉ変換酵素阻害作用のあることが報告されている（Ｋｏ
ｈｍｕｒａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第５
４巻、第３号、８３５〜８３６頁（１９９０））。しか
し、合成ペプチドは、多数の試薬類を用いて合成される
ため、人体に投与する前にこれら残留試薬を除去する必
要があり、ペプチドの精製に多大の労力を必要とする。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、天然
物に由来するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド
を魚介類の内臓等未利用資源から安価に製造する方法を
提供することである。
物に由来するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド
を魚介類の内臓等未利用資源から安価に製造する方法を
提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討した結果、本発明を完成させ
るに至った。すなわち、本発明により、安価で簡単に調
製できるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドの製
造方法が提供されるに至った。強いアンジオテンシンＩ
変換酵素阻害作用を有するペプチドＶａｌ−Ａｒｇ−Ｐ
ｒｏ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−ＰｒｏやＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒ
ｏは魚介類の頭や内臓の自己消化物に含まれており、以
下の方法で容易に精製することができる。水産加工業な
どで生成する魚介類の頭や内臓をクラッシャーで粉砕
し、２０〜７０℃で自己消化を行わせる。反応時間は１
〜６時間が適当である。蛋白質の消化を助けるために、
パパイン等の食品用蛋白分解酵素剤をこの際に加えて反
応を行うことも可能である。蛋白分解酵素は９０℃以上
に加熱することにより失活させ、遠心分離または濾過に
より固形分を除去する。この自己消化液をオクタデシル
シリル基を官能基とする充填剤（例えば、セップパック
Ｃ18、ウォーターズ社製）に吸着させて水洗後、アセト
ニトリル等の極性溶媒を含む水溶液で溶出させる。溶出
液を陽イオン交換体（例えば、トヨパックＳＰ、東ソー
社製）に吸着させ、ｐＨ６の緩衝液で洗浄後、ｐＨ８の
緩衝液で溶出させる。その後、逆相系クロマトグラフィ
ーおよび・またはゲル濾過クロマトグラフィーにてペプ
チドを精製することにより、目的とするペプチドを回収
することができる。本発明で使用できる魚種は、鰹節工
業で大量に内臓が生成するカツオが利用し易いが、イワ
シやマグロ等他の魚種の魚も使用できる。
を解決するために鋭意検討した結果、本発明を完成させ
るに至った。すなわち、本発明により、安価で簡単に調
製できるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドの製
造方法が提供されるに至った。強いアンジオテンシンＩ
変換酵素阻害作用を有するペプチドＶａｌ−Ａｒｇ−Ｐ
ｒｏ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−ＰｒｏやＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒ
ｏは魚介類の頭や内臓の自己消化物に含まれており、以
下の方法で容易に精製することができる。水産加工業な
どで生成する魚介類の頭や内臓をクラッシャーで粉砕
し、２０〜７０℃で自己消化を行わせる。反応時間は１
〜６時間が適当である。蛋白質の消化を助けるために、
パパイン等の食品用蛋白分解酵素剤をこの際に加えて反
応を行うことも可能である。蛋白分解酵素は９０℃以上
に加熱することにより失活させ、遠心分離または濾過に
より固形分を除去する。この自己消化液をオクタデシル
シリル基を官能基とする充填剤（例えば、セップパック
Ｃ18、ウォーターズ社製）に吸着させて水洗後、アセト
ニトリル等の極性溶媒を含む水溶液で溶出させる。溶出
液を陽イオン交換体（例えば、トヨパックＳＰ、東ソー
社製）に吸着させ、ｐＨ６の緩衝液で洗浄後、ｐＨ８の
緩衝液で溶出させる。その後、逆相系クロマトグラフィ
ーおよび・またはゲル濾過クロマトグラフィーにてペプ
チドを精製することにより、目的とするペプチドを回収
することができる。本発明で使用できる魚種は、鰹節工
業で大量に内臓が生成するカツオが利用し易いが、イワ
シやマグロ等他の魚種の魚も使用できる。
【０００９】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例１ カツオの内臓１ｋｇをクラッシャーで粉砕し、５００ｇ
の水を加え、緩やかに撹拌しながら５０℃で３時間自己
消化反応を行わせた。その後、２０分間煮沸し、遠心分
離により固形分を除去し、旭化成工業（株）製のラボモ
ジュール限外濾過システムＳＩＰ−１０１３を用いて限
外濾過を行った。濾液のペプチドを逆相系前処理カート
リッジ、セップパックＣ18ＥＮＶ（ウォーターズ社製）
に吸着させ、蒸留水８ｍｌで洗浄後、アセトニトリル１
５％水溶液８ｍｌで溶出させた。この処理を４回繰り返
して、アセトニトリル溶出液を混合した。この液を減圧
下で溶媒を除去し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したイオン交換前処理カートリッジ、トヨ
パックＩＣ−ＳＰ（Ｍ）（東ソー社製）に吸着させた
後、同じ緩衝液４ｍｌで洗浄し、１０ｍＭリン酸水素二
カリウム溶液４ｍｌで溶出させた。その後、ＨＰＬＣ条
件１で示した条件で、逆相系高速液体クロマトグラフィ
ーで分離を行った。この時の結果を図１に示した。チャ
ート１の画分１をさらにＨＰＬＣ条件２に示す条件で、
逆相系高速液体クロマトグラフィーで分離した。この結
果を図２に示した。図２の画分１−１をさらにＨＰＬＣ
条件３のゲル濾過クロマトグラフィーで分離した。この
結果を図３に示した。図３の画分１−２をさらにＨＰＬ
Ｃ条件４のゲル濾過クロマトグラフィーで分離した。こ
の結果を図４に示した。図４の画分１−３に強いアンジ
オテンシンＩ変換酵素阻害作用が認められたので、アプ
ライドバイオシステム社製気相プロテインシーケンサ４
７０Ａで構造解析を行ったところ、Ｖａｒ−Ａｒｇ−Ｐ
ｒｏの構造であることが判明した。
る。 実施例１ カツオの内臓１ｋｇをクラッシャーで粉砕し、５００ｇ
の水を加え、緩やかに撹拌しながら５０℃で３時間自己
消化反応を行わせた。その後、２０分間煮沸し、遠心分
離により固形分を除去し、旭化成工業（株）製のラボモ
ジュール限外濾過システムＳＩＰ−１０１３を用いて限
外濾過を行った。濾液のペプチドを逆相系前処理カート
リッジ、セップパックＣ18ＥＮＶ（ウォーターズ社製）
に吸着させ、蒸留水８ｍｌで洗浄後、アセトニトリル１
５％水溶液８ｍｌで溶出させた。この処理を４回繰り返
して、アセトニトリル溶出液を混合した。この液を減圧
下で溶媒を除去し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したイオン交換前処理カートリッジ、トヨ
パックＩＣ−ＳＰ（Ｍ）（東ソー社製）に吸着させた
後、同じ緩衝液４ｍｌで洗浄し、１０ｍＭリン酸水素二
カリウム溶液４ｍｌで溶出させた。その後、ＨＰＬＣ条
件１で示した条件で、逆相系高速液体クロマトグラフィ
ーで分離を行った。この時の結果を図１に示した。チャ
ート１の画分１をさらにＨＰＬＣ条件２に示す条件で、
逆相系高速液体クロマトグラフィーで分離した。この結
果を図２に示した。図２の画分１−１をさらにＨＰＬＣ
条件３のゲル濾過クロマトグラフィーで分離した。この
結果を図３に示した。図３の画分１−２をさらにＨＰＬ
Ｃ条件４のゲル濾過クロマトグラフィーで分離した。こ
の結果を図４に示した。図４の画分１−３に強いアンジ
オテンシンＩ変換酵素阻害作用が認められたので、アプ
ライドバイオシステム社製気相プロテインシーケンサ４
７０Ａで構造解析を行ったところ、Ｖａｒ−Ａｒｇ−Ｐ
ｒｏの構造であることが判明した。
【００１０】アンジオテンシンＩ変換酵素阻害の測定
は、カシュマンらの方法（バイオケミカル・ファーマコ
ロジー２０巻１６３７〜１６４８頁（１９７１））を改
良した丸山らの方法（アグリカルチュラル・バイオロジ
カル・ケミストリー４６巻５号１３９３〜１３９４（１
９８２））に従った。すなわち、試験管に本発明ペプチ
ド水溶液３０μｌと、酵素基質としてＬ−ヒプリルヒス
チジルロイシン（シグマ社製）と塩化ナトリウムを含有
したｐＨ８．３のホウ酸緩衝液２５０μｌを加え、３７
℃で１０分間プレインキュベーションした。その後、ア
ンジオテンシンＩ変換酵素含有液１００μｌを加え、酵
素反応を開始した。この時のホウ酸緩衝液の濃度は０．
１Ｍ、Ｌ−ヒプリルヒスチジルロイシン濃度は５ｍＭ、
塩化ナトリウム３００ｍＭであり、阻害がかからない場
合の酵素活性は８ｍＵである。３７℃、ｐＨ８．３で３
０分間振動しつつ反応せしめた後、１Ｎ塩酸２５０μｌ
を加え、反応を停止させた。酢酸エチル１．５ｍｌを加
え、１５秒間振とうさせて酵素反応で生じた馬尿酸を抽
出し、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して酢酸エチ
ル層１．０を試験管に回収した。酢酸エチルをホットド
ライバス中で１２０℃、３０分間加温して完全に除去し
た後、室温で５分間放置した。そして、３ｍｌの蒸留水
を加え、生成した馬尿酸の量を２２８ｎｍ吸光度を測定
して求めた。酵素反応に使用したアンジオテンシンＩ変
換酵素含有液は、ラビットラングアセトンパウダー（シ
グマ社製）１ｇを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）
１０ｍｌに溶かし、よく撹拌した後、４℃、４００００
×ｇで４０分間遠心分離した上清を０．１Ｍホウ酸緩衝
液で希釈して作成した。また、酵素反応開始前に塩酸を
添加して、同様な操作を施したものの測定結果をブラン
クとした。反応液中に本ペプチドが２．２μＭ添加され
た時に、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性が５０％阻
害された。
は、カシュマンらの方法（バイオケミカル・ファーマコ
ロジー２０巻１６３７〜１６４８頁（１９７１））を改
良した丸山らの方法（アグリカルチュラル・バイオロジ
カル・ケミストリー４６巻５号１３９３〜１３９４（１
９８２））に従った。すなわち、試験管に本発明ペプチ
ド水溶液３０μｌと、酵素基質としてＬ−ヒプリルヒス
チジルロイシン（シグマ社製）と塩化ナトリウムを含有
したｐＨ８．３のホウ酸緩衝液２５０μｌを加え、３７
℃で１０分間プレインキュベーションした。その後、ア
ンジオテンシンＩ変換酵素含有液１００μｌを加え、酵
素反応を開始した。この時のホウ酸緩衝液の濃度は０．
１Ｍ、Ｌ−ヒプリルヒスチジルロイシン濃度は５ｍＭ、
塩化ナトリウム３００ｍＭであり、阻害がかからない場
合の酵素活性は８ｍＵである。３７℃、ｐＨ８．３で３
０分間振動しつつ反応せしめた後、１Ｎ塩酸２５０μｌ
を加え、反応を停止させた。酢酸エチル１．５ｍｌを加
え、１５秒間振とうさせて酵素反応で生じた馬尿酸を抽
出し、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して酢酸エチ
ル層１．０を試験管に回収した。酢酸エチルをホットド
ライバス中で１２０℃、３０分間加温して完全に除去し
た後、室温で５分間放置した。そして、３ｍｌの蒸留水
を加え、生成した馬尿酸の量を２２８ｎｍ吸光度を測定
して求めた。酵素反応に使用したアンジオテンシンＩ変
換酵素含有液は、ラビットラングアセトンパウダー（シ
グマ社製）１ｇを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）
１０ｍｌに溶かし、よく撹拌した後、４℃、４００００
×ｇで４０分間遠心分離した上清を０．１Ｍホウ酸緩衝
液で希釈して作成した。また、酵素反応開始前に塩酸を
添加して、同様な操作を施したものの測定結果をブラン
クとした。反応液中に本ペプチドが２．２μＭ添加され
た時に、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性が５０％阻
害された。
【００１１】実施例２ 実施例１の逆相クロマトグラフィーで得られた画分２
（図１）をさらにＨＰＬＣ条件２の条件で分離した。そ
の結果を図５に示した。図５の画分２−１をさらにＨＰ
ＬＣ条件３のゲル濾過クロマトグラフィーで分離した。
この結果を図６に示した。図６の画分２−２をさらにＨ
ＰＬＣ条件４のゲル濾過クロマトグラフィーで分離し
た。この結果を図７に示した。図７の画分２−３をさら
にＨＰＬＣ条件５でイオン交換分離を行い、図８に示す
画分２−４を得た。この画分を最後にＨＰＬＣ条件６で
逆相系分離を行い、図９に示す画分２−５を得た。画分
２−５には強いアンジオテンシンＩ変換酵素阻害作用が
認められたので、脱塩後、アプライドバイオシステム社
製気相プロテインシーケンサ４７０Ａで構造解析を行っ
たところ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏの構造であることが
判明した。前記実施例１に記載の方法で本ペプチドのア
ンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を測定したところ、
反応液中に本ペプチドが２．５μＭ添加された時に、ア
ンジオテンシンＩ変換酵素の活性が５０％阻害された。
（図１）をさらにＨＰＬＣ条件２の条件で分離した。そ
の結果を図５に示した。図５の画分２−１をさらにＨＰ
ＬＣ条件３のゲル濾過クロマトグラフィーで分離した。
この結果を図６に示した。図６の画分２−２をさらにＨ
ＰＬＣ条件４のゲル濾過クロマトグラフィーで分離し
た。この結果を図７に示した。図７の画分２−３をさら
にＨＰＬＣ条件５でイオン交換分離を行い、図８に示す
画分２−４を得た。この画分を最後にＨＰＬＣ条件６で
逆相系分離を行い、図９に示す画分２−５を得た。画分
２−５には強いアンジオテンシンＩ変換酵素阻害作用が
認められたので、脱塩後、アプライドバイオシステム社
製気相プロテインシーケンサ４７０Ａで構造解析を行っ
たところ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏの構造であることが
判明した。前記実施例１に記載の方法で本ペプチドのア
ンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を測定したところ、
反応液中に本ペプチドが２．５μＭ添加された時に、ア
ンジオテンシンＩ変換酵素の活性が５０％阻害された。
【００１２】実施例３ 実施例１の逆相クロマトグラフィーで得られた画分３
（図１）をさらにＨＰＬＣ条件２の条件で分離した。そ
の結果を図１０に示した。図１０の画分３−１をさらに
ＨＰＬＣ条件３のゲル濾過クロマトグラフィーで分離し
た。この結果を図１１に示した。図１１の画分３−２を
さらにＨＰＬＣ条件４のゲル濾過クロマトグラフィーで
分離した。この結果を図１２に示した。図１２の画分３
−３をさらにＨＰＬＣ条件５でイオン交換分離を行い、
図１３に示す画分３−４を得た。この画分を最後にＨＰ
ＬＣ条件６で逆相系分離を行い、図１４に示す画分３−
５を得た。画分３−５には強いアンジオテンシンＩ変換
酵素阻害作用が認められたので、脱塩後、アプライドバ
イオシステム社製気相プロテインシーケンサ４７０Ａで
構造解析を行ったところ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの構
造であることが判明した。前記実施例１に記載の方法で
本ペプチドのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を測
定したところ、反応液中に本ペプチドが１．０μＭ添加
された時に、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性が５０
％阻害された。
（図１）をさらにＨＰＬＣ条件２の条件で分離した。そ
の結果を図１０に示した。図１０の画分３−１をさらに
ＨＰＬＣ条件３のゲル濾過クロマトグラフィーで分離し
た。この結果を図１１に示した。図１１の画分３−２を
さらにＨＰＬＣ条件４のゲル濾過クロマトグラフィーで
分離した。この結果を図１２に示した。図１２の画分３
−３をさらにＨＰＬＣ条件５でイオン交換分離を行い、
図１３に示す画分３−４を得た。この画分を最後にＨＰ
ＬＣ条件６で逆相系分離を行い、図１４に示す画分３−
５を得た。画分３−５には強いアンジオテンシンＩ変換
酵素阻害作用が認められたので、脱塩後、アプライドバ
イオシステム社製気相プロテインシーケンサ４７０Ａで
構造解析を行ったところ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの構
造であることが判明した。前記実施例１に記載の方法で
本ペプチドのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を測
定したところ、反応液中に本ペプチドが１．０μＭ添加
された時に、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性が５０
％阻害された。
【００１３】ＨＰＬＣ条件１ カラム：ＲＰ−１８（ｅ） １０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ
Ｌ（メルク社製） 移動相：Ａ ０．０５％トリフルオロ酢酸液 Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸、３０％アセトニトリ
ル液 グラジエントはＡ液１００％から１２０分後にＢ液１０
０％になる直線グラジエント 流速：４．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
Ｌ（メルク社製） 移動相：Ａ ０．０５％トリフルオロ酢酸液 Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸、３０％アセトニトリ
ル液 グラジエントはＡ液１００％から１２０分後にＢ液１０
０％になる直線グラジエント 流速：４．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【００１４】ＨＰＬＣ条件２ カラム：ＲＰ−１８（ｅ） ４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍ
ｍＬ（メルク社製） 移動相：Ａ ０．０５％トリフルオロ酢酸液 Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸、３０％アセトニトリ
ル液 グラジエントはＡ液１００％から１２０分後にＢ液１０
０％になる直線グラジエント 流速：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
ｍＬ（メルク社製） 移動相：Ａ ０．０５％トリフルオロ酢酸液 Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸、３０％アセトニトリ
ル液 グラジエントはＡ液１００％から１２０分後にＢ液１０
０％になる直線グラジエント 流速：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【００１５】ＨＰＬＣ条件３ カラム：ＧＳ−２２０ ７．６ｍｍＩＤ×５００ｍｍＬ
（旭化成工業社製） 移動相：５０ｍＭ酢酸アンモニウム 流速：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
（旭化成工業社製） 移動相：５０ｍＭ酢酸アンモニウム 流速：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【００１６】ＨＰＬＣ条件４ カラム：ＧＳ−３２０ ７．６ｍｍＩＤ×５００ｍｍＬ
（旭化成工業社製） 移動相：５０ｍＭ酢酸アンモニウム 流速：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
（旭化成工業社製） 移動相：５０ｍＭ酢酸アンモニウム 流速：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【００１７】ＨＰＬＣ条件５ カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−２ＳＷ ４．６ｍｍＩＤ
×２５０ｍｍＬ （東ソー社製） 移動相：Ａ ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０） Ｂ ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）＋
０．５Ｍ塩化ナトリウム Ａ１００％で１０分流した後４０分後にＢ液１００％と
なるような直線グラジエント 流速：０．８ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
×２５０ｍｍＬ （東ソー社製） 移動相：Ａ ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０） Ｂ ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）＋
０．５Ｍ塩化ナトリウム Ａ１００％で１０分流した後４０分後にＢ液１００％と
なるような直線グラジエント 流速：０．８ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【００１８】ＨＰＬＣ条件６ カラム：ＲＰ−１８（ｅ） ４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍ
ｍＬ（メルク社製） 移動相：０．０５％トリフルオロ酢酸、７％アセトニト
リル液 流速：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
ｍＬ（メルク社製） 移動相：０．０５％トリフルオロ酢酸、７％アセトニト
リル液 流速：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【００１９】
【発明の効果】以上説明したとおり、本発明によれば、
血圧上昇を抑える作用を有するアンジオテンシンＩ変換
酵素阻害ペプチドが蛋白分解酵素剤を添加することなく
容易に得られる。
血圧上昇を抑える作用を有するアンジオテンシンＩ変換
酵素阻害ペプチドが蛋白分解酵素剤を添加することなく
容易に得られる。
【００２０】配列番号：１ 配列の長さ：３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド
【００２１】配列番号：２ 配列の長さ：３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド
【００２２】配列番号：３ 配列の長さ：３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１】カツオ自己消化物由来のペプチド液をＲＰ−１
８（ｅ）カラム（１０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍＬ）で分離
した際の溶出パターン。
８（ｅ）カラム（１０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍＬ）で分離
した際の溶出パターン。
【図２】図１の画分１をＨＰＬＣ条件２で分離した際の
溶出パターン。
溶出パターン。
【図３】図２の画分１−１をＨＰＬＣ条件３で分離した
際の溶出パターン。
際の溶出パターン。
【図４】図３の画分１−２をＨＰＬＣ条件４で分離した
際の溶出パターン。
際の溶出パターン。
【図５】図１の画分２をＨＰＬＣ条件２で分離した際の
溶出パターン。
溶出パターン。
【図６】図５の画分２−１をＨＰＬＣ条件３で分離した
際の溶出パターン。
際の溶出パターン。
【図７】図６の画分２−２をＨＰＬＣ条件４で分離した
際の溶出パターン。
際の溶出パターン。
【図８】図７の画分２−３をＨＰＬＣ条件５で分離した
際の溶出パターン。
際の溶出パターン。
【図９】図８の画分２−４をＨＰＬＣ条件６で分離した
際の溶出パターン。
際の溶出パターン。
【図１０】図１の画分３をＨＰＬＣ条件２で分離した際
の溶出パターン。
の溶出パターン。
【図１１】図１０の画分３−１をＨＰＬＣ条件３で分離
した際の溶出パターン。
した際の溶出パターン。
【図１２】図１１の画分３−２をＨＰＬＣ条件４で分離
した際の溶出パターン。
した際の溶出パターン。
【図１３】図１２の画分３−３をＨＰＬＣ条件５で分離
した際の溶出パターン。
した際の溶出パターン。
【図１４】図１３の画分３−４をＨＰＬＣ条件６で分離
した際の溶出パターン。
した際の溶出パターン。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/55 ＡＥＱ Ｃ０７Ｋ 123:00
Claims (3)
- 【請求項１】 魚介類を自己消化し、該自己消化物より
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの構造を持つペプチドを分離回
収することを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻
害ペプチドの製造方法。 - 【請求項２】 魚介類を自己消化し、該自己消化物より
Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏの構造を持つペプチドを分離回
収することを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻
害ペプチドの製造方法。 - 【請求項３】魚介類を自己消化し、該自己消化物よりＬ
ｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの構造を持つペプチドを分離回収
することを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害
ペプチドの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4242554A JPH07313185A (ja) | 1992-08-20 | 1992-08-20 | ぺプチドの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4242554A JPH07313185A (ja) | 1992-08-20 | 1992-08-20 | ぺプチドの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07313185A true JPH07313185A (ja) | 1995-12-05 |
Family
ID=17090830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4242554A Pending JPH07313185A (ja) | 1992-08-20 | 1992-08-20 | ぺプチドの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07313185A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002247955A (ja) * | 2001-02-23 | 2002-09-03 | Takashi Okazaki | アンギオテンシン変換酵素阻害活性の高い分解物及びその製造方法並びに機能性食品 |
| WO2003044044A1 (en) * | 2001-11-21 | 2003-05-30 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Novel peptide having angiotensin convertase inhibitory effect |
-
1992
- 1992-08-20 JP JP4242554A patent/JPH07313185A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002247955A (ja) * | 2001-02-23 | 2002-09-03 | Takashi Okazaki | アンギオテンシン変換酵素阻害活性の高い分解物及びその製造方法並びに機能性食品 |
| WO2003044044A1 (en) * | 2001-11-21 | 2003-05-30 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Novel peptide having angiotensin convertase inhibitory effect |
| US7022676B2 (en) | 2001-11-21 | 2006-04-04 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Peptide having angiotensin converting enzyme inhibitory effect |
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